BLOCK 9. Dengue Fieber/ ELISA. N.Brandl 2008

Transkript

1 BLOCK 9 Dengue Fieber/ ELISA N.Brandl 2008

2 Versuchsaufbau Coaten und Blocken 2. Waschen (3x) 3. Patientenserum (30min) 4. Waschen (3x) 5. Detektionsantikörper (30min) 6. Waschen (3x) 7. Farbsubstrat 8. Farbentwicklung beobachten und Reaktion stoppen

3 Sandwich-ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)

4 Dengue-Ak-ELISA (Antibody capture ELISA)

5 Kompetitiver ELISA

6 WesternBlot (Immunoblot) 1. Gelelektrophorese und Transfer auf Membran 2. Immunodetektion

7 Zellen fixiert auf Objektträger Immunfluoreszenz

8 Dengue Fieber (DHF) klassisches Dengue- Fieber: Dengue Trias: Fieber, Ausschlag und Kopf-, Glieder-, Gelenk- oder Muskelschmerzen. Denguehämorrhagisches Fieber (DHF) und Dengue- Schock-Syndrom (DSS) Stechmücken der Arten Aedes aegypti (Gelbfiebermücke) oder Aedes albopictus (Asiatische Tigermücke)

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10 Antikörperstruktur

11 Durch die 3-dimensionale Faltung der Aminosäuresequenz entstandene Ladungsverteilung formen Epitope blau: Asr. mit neg. geladenen Seitenketten rot: Asr. mit positiv geladenen Seitenketten Epitope sind Antigen-Strukturen die von 6 14 Aminosäuren gebildet werden

12 Klassen der Immunglobuline

13 Antikörperproduktion

14 Funktion der Antikörper

15 Affinität Die Summe aller nichtkovalenten Interaktionen zwischen Antigen- Bindungsstellen auf einem Antikörper und Epitop definiert die Affinität des Antikörpers für das Epitop. :je koordinierter sich bindende Gruppen nähern und abstossende Gruppen auf Distanz sind, desto höher (Verstärkung bis 10 8 fach) die Affinität

16 Affinität-Avidität Hohe Avidität kompensiert niedrige Affinität (pentameres IgM)

17 Affinität (Rechenbeispiel) KA = [AkAg]/ [Ak][Ag] (Affinitätskonstante K)A Beispiel zur Affinität von IgG: Das Molekulargewicht eines IgG beträgt 150kDa. 1,5 µg/ml ist daher eine Lösung von 10-8 mol/l. Angenommen dieses IgG bindet ein Protein mit einer Affinität von K= /(mol/L), dann ist das Verhältnis gebundener/ungebundener Ak laut Massenwirkungsgesetz: [AkAg] / [Ag] = K [Ak] = 10 7 * 10-8 = 10-1 Der Antikörper bindet im Gleichgewicht ein Antigen und lässt 10 Ungebunden. Das Beispiel mit K = ergibt 100 gebundene zu 1 ungebundenen.

18 Phasen der Immunantwort

19 Produktion monoklonaler Antikörper 1. Maus mit Antigen immunisiert 2. Aus der entnommenen Milz werden die B-Lymphozyten isoliert. 3. / 4. Mit Zellen einer aus einem Myelom (Plasmozytom) gewonnenen Zelllinie fusioniert. 5. Hybridomzelllinien 6. die Hybridomzelllinie ausgewählt, die am besten das gewünschte Epitop auf dem Antigen bindet 7. Zellüberstand wird regelmäßig bei Bedarf geerntet

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21 Arbeitsanleitung ELISA Block 9 was bisher geschah Coaten (über Nacht) mit Antigen Waschen Blocken (über Nacht) mit 0,1% BSA in 1x PBS wie es weitergeht 1. Waschen: Blocking-Buffer entfernen (Platte umdrehen) und alle Wells 3x mit jeweils 150µl Waschlösung waschen (8- Kanalpipette). 2. Probe auftragen (s. Pipettierschema): jede/r StudentIn pipettiert jeweils 100µl Standard bzw. Patientenserum (im Duplikat) in eine Spalte. Platte abdecken und 30 Minuten inkubieren lassen. 3. Waschen: Proben entfernen (Platte umdrehen) und alle verwendeten Wells 3x mit jeweils 150µl Waschlösung waschen. 4. Detektionsantikörper: alle verwendeten Wells werden mit jeweils 100µl Detektionsantikörper (8-Kanalpipette) für 30 Minuten inkubiert. 5. Waschen: wie bei Farbsubstrat: jeweils 100µl Farbsubstrat in alle verwendeten Wells pipettieren (8-Kanalpipette) und die Farbentwicklung beobachten. 7. Stopplösung: nach erfolgter Farbentwicklung, die Reaktion durch Zugabe von jeweils 100µl Stopplösung beenden. (Achtung: zwischen Farbsubstrat und Stopplösung nicht waschen. Stopplösung wird direkt zum Farbsubstrat zugesetzt.) 8. Plattenleerwert: für den Plattenleerwert eine leere Spalte mit Waschlösung füllen (100µl). 9. Extinktion messen bei 415nm im Plattenphotometer. 10. Auswertung (s. Auswerteschema im Praktikumssaal)

22 AUSWERTUNG: Platten in Klammern der Reader-Kammer einspannen Deckel schließen Start drücken Platte wird geschüttelt und gemessen Ausdruck abreissen Die Extinktionswerte der Patientenproben werden mit den Extinktionen der Kontrollseren korreliert. Es gibt mehrere gängige Auswertemethoden vom einfachen visuellen Vergleich einer Negativprobe mit der Patientenprobe bis zur Konstruktion einer Standardgerade. Die jeweilig für einen Test anzuwendende Vorschrift findet man im Beipacktext. Eine der folgenden Auswertemöglichkeiten wird in der Arbeitsanleitung eines kommerziellen ELISA-Kits zur Verwendung kommen. (Versuchen Sie im Praktikum 1,3 und 4 zu Vergleichen): 1. Cutoff-Quotienten Auswertung Cutoff-Quotient: Die Extinktion des Standardserums (hier Standardserum-3 verwenden) wird durch die Extinktion des Patientenserums dividiert (Mittelwert der Std3 auf einer Platte verwenden). Ist der Quotient <0,9 dann ist der Befund positiv, zwischen 0,9-1,1 unbestimmt und bei Werten >1,1 negativ (d.h. es kann eine Infektion ausgeschlossen werden) 2. Cutoff-Titer: Ohne Kontrollserum kann eine Titerbestimmung zur Beurteilung durchgeführt werden Patientenserum wird in 2-er Schritten verdünnt, ist keine positive Farbreaktion bei z.b. Verdünnung 1/1024 nachweisbar (= Stufe des Cutoff Titers, die in der Beschreibung mitgeliefert wird) wird das Serum negativ (o.b.) beurteilt. 3. Zeichnen der Standardkurve und des Bereiches in dem Testwiederholung nötig ist ( wie in Abbildung unten, schattierter Bereich ist die Zone in der keine Aussage möglich ist) 4. Vergleichsauswertung (kann auch visuell erfolgen): Ist die Extinktion über dem Wert von Standardserum-2 dann ist eine Infektion anzunehmen. Ist die Extinktion unter dem Wert von Standardserum-4 dann ist eine Infektion auszuschließen. Liegen die Extinktionen zwischen den Werten von Standardserum-2 und -3 ist eine Infektion möglich muss aber durch weitere Tests bestätigt werden. Ist die Extinktion zwischen Standardserum-3 und -4 ist eine Infektion fraglich und es sollte die Bestimmung in einem Speziallabor wiederholt werden. 1