Enzymimmunoassay zur quantitativen Bestimmung von Haptoglobin (Schwein) Enzyme immunoassay for the quantitative analysis of Haptoglobin (pigs)

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1 RIDASCREEN Haptoglobin Enzymimmunoassay zur quantitativen Bestimmung von Haptoglobin (Schwein) Enzyme immunoassay for the quantitative analysis of Haptoglobin (pigs) Art. No.: R7501 In vitro Test Lagerung bei 2-8 C Storage at 2-8 C R-Biopharm AG, Darmstadt, Germany Tel.: +49 (0) / Telefax: +49 (0)

2 Anschrift: R-Biopharm AG Landwehrstraße 54 D Darmstadt Für weitere Fragen stehen Ihnen gerne zur Verfügung: Telefon: Zentrale / Auftragsannahme ( ) Sekretariat Marketing ( ) Telefax / Auftragsannahme ( ) orders@r-biopharm.de Marketing ( ) info@r-biopharm.de RIDA und RIDASCREEN sind eingetragene Warenzeichen der R-Biopharm AG Hersteller: R-Biopharm AG, Darmstadt, Deutschland RIDA and RIDASCREEN are registered trademarks of R-Biopharm AG Manufacturer: R-Biopharm AG, Darmstadt, Germany 2 RIDASCREEN Haptoglobin

3 Inhaltsverzeichnis Seite Kurzinformation Verwendungszweck Allgemeines Testprinzip Packungsinhalt Zusätzlich benötigte Reagenzien - erforderliches Zubehör Vorsichtsmaßnahmen Reagenzien und ihre Lagerung Anzeichen für Reagenzienverfall Probenvorbereitung Testdurchführung Auswertung Sensitivität Reproduzierbarkeit Contents Page Brief information Intended use General Test principle Reagents provided Materials required but not provided Warnings and precautions for the users Storage instructions Indication of instability or deterioration of reagents Preparation of samples Test implementation Results Sensitivity Reproducibility Appendix Literature RIDASCREEN Haptoglobin

4 Kurzinformation RIDASCREEN Haptoglobin (Art. Nr.: R7501) Kompetitiver Enzymimmunoassay zur quantitativen Bestimmung von Haptoglobin in Serum und Fleischsaft von Schweinen. Alle Reagenzien für die Durchführung des Enzymimmunoassays - inkl. Standards - sind im Testkit enthalten. Ein Testkit ist ausreichend für 96 Bestimmungen (einschl. Standardbestimmungen). Zur Auswertung benötigt man ein Mikrotiterplatten-Photometer. Für die Durchführung des Tests ist keine spezielle über die eines Laboranten / Technikers hinausgehende Ausbildung notwendig. Falls erforderlich, wird jedoch auf Anfrage eine kostenlose Einarbeitung angeboten. Probenvorbereitung: Zeitbedarf: Nachweisgrenze: Serum, Fleischsaft: verdünnen Probenvorbereitung (für 10 Proben)... ca. 10 min Testdurchführung...2 h (unabhängig von der Probenzahl) Serum, Fleischsaft...0,033 mg/ml 4 RIDASCREEN Haptoglobin

5 1. Verwendungszweck Der RIDASCREEN Haptoglobin Test ist ein kompetitiver Enzymimmunoassay zur quantitativen Bestimmung von Haptoglobin in Serum und Fleischsaft von Schweinen. 2. Allgemeines Haptoglobin ist ein α2-glykoprotein, das in den meisten Körperflüssigkeiten von Säugetieren vorkommt. Die Aufgabe von Haptoglobin ist die Bindung von Hämoglobin, das beim Erythrozytenverfall frei wird. Dieser hochmolekulare Komplex kann über die Nieren nicht ausgeschieden werden und verhindert somit einen Eisenverlust. Gleichzeitig stellt er auch einen Schutzmechanismus gegenüber der Nephrotoxizität des freien Hämoglobins dar. Haptoglobin ist ein Akut-Phase-Protein, das im Zuge der Akut-Phase-Reaktion (APR) vermehrt synthetisiert wird. Die APR ist eine unspezifische Reaktion des Körpers auf Störungen der Homöostase durch Infektionen, Gewebeverletzungen, Entzündungen oder Neoplasien. Dieses Protein ist stabiler als zelluläre Komponenten (Leukozyten) und weniger anfällig gegenüber kurzzeitigen Stimuli wie z.b. Aufregung. Die Erhöhung der Haptoglobinkonzentration bei Entzündungen, Infektionen etc. wird als Screening-Parameter im Rahmen der fleischerzeugenden Kette diskutiert. Damit ist die Bestimmung von APR (Haptoglobin) eine Möglichkeit den Gesundheitsstatus von landwirtschaftlichen Nutztieren bis hin zur Fleischuntersuchung zu überwachen. 3. Testprinzip Grundlage ist die Antigen-Antikörper-Reaktion. Die Vertiefungen der Mikrotiterstreifen sind mit Fänger-Antikörpern gegen Anti-Haptoglobin-Antikörper beschichtet. Zugegeben werden Standards bzw. Probelösung, biotiniliertes Haptoglobin und anti-haptoglobin-antikörper. Freies und biotiniliertes Haptoglobin konkurrieren um die Haptoglobin-Antikörperbindungsstellen (kompetitiver Enzymimmunoassay). Gleichzeitig werden auch die anti-haptoglobin-antikörper von den immobilisierten Fänger-Antikörpern gebunden. Nicht gebundenes, biotiniliertes Haptoglobin wird anschließend in einem Waschschritt wieder entfernt. Im Anschluss wird Peroxidase-markiertes Streptavidin hinzugegeben, dass an gebundenes biotiniliertes Haptoglobin bindet. Nicht gebundenes Enzymkonjugat wird anschließend in einem Waschschritt wieder entfernt. Hinzugegeben wird Chromogen/Substrat und das gebundene Enzymkonjugat wandelt das Chromogen in ein blaues Endprodukt um. Die Zugabe des Stopp-Reagenzes führt zu einem Farbumschlag von blau nach gelb. Die Messung erfolgt photometrisch RIDASCREEN Haptoglobin

6 bei 450 nm; die Extinktion der Lösung ist umgekehrt proportional zur Haptoglobin- Konzentration in der Probe. 4. Packungsinhalt Mit den Reagenzien einer Packung können 90 Bestimmungen durchgeführt werden (plus 6 Standardbestimmungen). Jeder Testkit enthält: 1 x Mikrotiterplatte mit 96 Kavitäten (12 Streifen à 8 Einzelkavitäten) beschichtet mit Fänger-Antikörpern 6 x Standardlösungen, je 1,3 ml 0 µg/ml (Nullstandard), 0,033 µg/ml, 0,1 µg/ml, 0,3 µg/ml, 0,9 µg/ml, 2,7 µg/ml Haptoglobin in wässriger Lösung gebrauchsfertig 1 x Biotin-Konjugat (6 ml)... weißer Verschluss gebrauchsfertig 1 x Anti-Haptoglobin-Antikörper (6 ml)...schwarzer Verschluss gebrauchsfertig 1 x Streptavidin-Konjugat (12 ml)...roter Verschluss Peroxidase-konjugiertes Streptavidin gebrauchsfertig 1 x Substrat-/Chromogenlösung (10 ml)... blauer Verschluss enthält Tetramethylbenzidin rötlich gefärbt 1 x Stopp-Reagenz (14 ml)... gelber Verschluss enthält 1 N Schwefelsäure 1 x Waschpuffer (Salz) zur Herstellung eines 10 mm Phosphatpuffers (ph 7,4) enthält 0,05 % Tween 20 1 x Probenpuffer (100 ml) gebrauchsfertig 5. Zusätzlich benötigte Reagenzien erforderliches Zubehör 5.1. Geräte: Mikrotiterplatten-Photometer (450 nm) 10 µl, 50 µl, 100 µl und 1000 µl Mikropipetten Mikrotiterplattenschüttler (Rotationsschüttler 500 U / min) 6 RIDASCREEN Haptoglobin

7 5.2. Reagenzien: destilliertes oder deionisiertes Wasser 6. Vorsichtsmaßnahmen Das Stopp-Reagenz enthält 1 N Schwefelsäure. Hautkontakt mit dem Reagenz vermeiden. Nach Ablauf des Verfallsdatums (siehe Außenetikett unter Expiration) kann keine Qualitätsgarantie mehr übernommen werden. Ein Austausch von Einzelreagenzien zwischen Kits verschiedener Chargennummern ist nicht möglich. 7. Reagenzien und ihre Lagerung Die Reagenzien bei 2-8 C lagern. Den Testkit auf keinen Fall einfrieren. Nicht benötigte Kavitäten zusammen mit dem Trockenmittel im Folienbeutel gut verschlossen aufbewahren und weiterhin bei 2-8 C lagern. Der Test kann bei entsprechender Lagerung mindestens bis zum Verfallsdatum (angegeben auf der Kitpackung) für eine ordnungsgemäße Analyse eingesetzt werden. Die Substrat-/Chromogenlösung ist lichtempfindlich, deshalb direkte Lichteinwirkung vermeiden. 8. Anzeichen für Reagenzienverfall Eine bläuliche Färbung der rötlichen Substrat-/Chromogenlösung vor Zugabe in die Kavitäten weist auf einen Reagenzienverfall hin. Eine Extinktion kleiner 0,6 (E 450 nm < 0,6) für den Nullstandard weist ebenfalls auf einen Reagenzienverfall hin. RIDASCREEN Haptoglobin

8 9. Probenvorbereitung Die Proben kühl und lichtgeschützt lagern Fleischsaft von Schweinen / Schweinefleisch die Probe 1:1000 (1+999) verdünnen die Verdünnung sollte in zwei Schritten erfolgen: zuerst eine 1:100 (1+99) Verdünnung mit dem gebrauchsfertigen Waschpuffer (siehe / z.b. 10 µl Probe in 1 ml Waschpuffer) der 2. Verdünnungsschritt sollte mit Probenpuffer (siehe 4.) erfolgen die 1:100 verdünnte Lösung 1:10 (1+9) mit Probenpuffer verdünnen (z.b. 100 µl von der 1:100 Verdünnung µl Probenpuffer) je 50 µl pro Kavität im Test einsetzen 9.2. Serum von Schweinen / Schweinefleisch die Probe 1:3000 (1+2999) verdünnen die Verdünnung sollte in zwei Schritten erfolgen: zuerst eine 1:100 (1+99) Verdünnung mit dem gebrauchsfertigen Waschpuffer (siehe / z.b. 10 µl Probe in 1 ml Waschpuffer) der 2. Verdünnungsschritt sollte mit Probenpuffer (siehe 4.) erfolgen die 1:100 verdünnte Lösung 1:30 (1+29) mit Probenpuffer verdünnen (z.b. 30 µl von der 1:100 Verdünnung µl Probenpuffer) je 50 µl pro Kavität im Test einsetzen 10. Testdurchführung Testvorbereitungen 1. Alle Reagenzien vor Gebrauch auf Raumtemperatur (20-25 C) bringen. 2. Nicht verwendete Reagenzien sofort wieder bei 2-8 C lagern. 3. Ein Eintrocknen der Kavitäten zwischen den Arbeitsschritten vermeiden. 4. Die Testergebnisse und die Reproduzierbarkeit hängen in starkem Maße vom kräftigen Schütteln in Punkt 4 ab 5. Die Reproduzierbarkeit der Testergebnisse hängt in starkem Maße vom gleichmäßigen Waschen der Kavitäten ab. Die beschriebenen Waschsequenzen deshalb immer einhalten. 6. Bei allen Inkubationen direkte Sonneneinstrahlung vermeiden und deshalb die Mikrotiterplatten abdecken. 8 RIDASCREEN Haptoglobin

9 10.2. Antikörper-beschichtete Mikrotiterstreifen Den Folienbeutel an der Querseite entlang der Verschlussleiste aufschneiden. Die benötigten Kavitäten zusammen mit dem Halterahmen entnehmen. Die nicht benötigten Kavitäten zusammen mit dem Trockenmittel im Folienbeutel gut verschlossen aufbewahren und weiterhin bei 2-8 C lagern Waschpuffer Zum Waschen der Kavitäten wird ein PBS-Tween-Puffer benötigt, benutzen Sie dazu bitte das beiliegende Pufferbriefchen (siehe 4.). Zur Herstellung des Puffers wird der gesamte Inhalt des Beutels in 1 Liter destilliertem Wasser gelöst. Der gelöste Waschpuffer ist bei 4 C vier Wochen haltbar. Alternativ: Inhalt des Beutels in 100 ml dest. Wasser lösen (10fach Konzentrat). Dieses Puffer-Konzentrat nur bei Raumtemperatur (20-25 C) lagern! Das Puffer-Konzentrat ist ca. 8 Wochen haltbar. Um die gebrauchsfertige Lösung herzustellen 1 Teil des 10fach Konzentrats mit 9 Teilen dest. Wasser mischen Testdurchführung 1. So viele Kavitäten in den Halterahmen einsetzen, wie für alle Standards und Proben benötigt werden. Die Positionen der Standards und der Proben protokollieren. 2. Je 50 µl Standard oder vorbereitete Probe in die entsprechenden Kavitäten pipettieren; für jeden Standard oder Probe neue Pipettenspitzen benutzen. 3. Je 50 µl Biotin-Konjugat (weisser Verschluss) in die entsprechenden Kavitäten pipettieren µl der anti-haptoglobin-antikörperlösung (schwarzer Verschluss) in jede Kavität pipettieren und 60 min bei Raumtemperatur (20-25 C) auf einem Mikrotiterplattenschüttler (Rotationsschüttler 500 U / min) inkubieren. 5. Die Kavitäten durch Ausschlagen der Flüssigkeit leeren und die Restflüssigkeit durch kräftiges Ausklopfen (dreimal hintereinander) auf sauberen, saugfähigen Labortüchern entfernen. Die Kavitäten mit Hilfe einer Multikanal-Pipette mit 250 µl Waschpuffer (siehe 10.3.) pro Kavität waschen, die Kavitäten leeren und die Restflüssigkeit entfernen. Diesen Waschvorgang noch zweimal wiederholen µl Peroxidase-konjugiertes Streptavidin (roter Verschluss) in jede Kavität pipettieren. Vorsichtig manuell mischen und 30 min bei Raumtemperatur (20-25 C) im Dunkeln inkubieren. RIDASCREEN Haptoglobin

10 7. Die Kavitäten durch Ausschlagen der Flüssigkeit leeren und die Restflüssigkeit durch kräftiges Ausklopfen (dreimal hintereinander) auf sauberen, saugfähigen Labortüchern entfernen. Die Kavitäten mit Hilfe einer Multikanal-Pipette mit 250 µl Waschpuffer (siehe 10.3.) pro Kavität waschen, die Kavitäten leeren und die Restflüssigkeit entfernen. Diesen Waschvorgang noch zweimal wiederholen µl Substrat/Chromogen (blauer Verschluss) in jede Kavität pipettieren. Vorsichtig manuell mischen und 15 min bei Raumtemperatur (20-25 C) im Dunkeln inkubieren µl Stopp-Reagenz (gelber Verschluss) in jede Kavität pipettieren. Vorsichtig manuell mischen und die Extinktion bei 450 nm innerhalb von 10 min nach Zugabe des Stopp-Reagenzes messen. Der Abgleich des Nullwertes erfolgt gegen Luft. 11. Auswertung Die Mittelwerte der erhaltenen Extinktionswerte der Standards bzw. der Proben durch den Extinktionswert ersten Standards (Nullstandard) teilen und mit 100 multiplizieren. Den Nullstandard somit gleich 100 % setzen und die Extinktionswerte in Prozent angeben. Extinktion Standard (bzw. Probe) Extinktion Nullstandard x 100 = % Extinktion Die errechneten Werte für die Standards in einem Koordinatensystem auf halblogarithmischem Millimeterpapier gegen die Haptoglobin-Konzentration in [µg/ml] auftragen. Die Haptoglobin-Konzentration in µg/ml kann entsprechend der Extinktion der jeweiligen Proben aus der Eichkurve abgelesen werden. Um die in einer Probe enthaltene tatsächliche Haptoglobin-Konzentration in µg/ml zu erhalten, muss die aus der Eichkurve abgelesene Konzentration noch mit dem entsprechenden Verdünnungsfaktor multipliziert werden. Beim Arbeiten nach der angegebenen Vorschrift gilt folgender Verdünnungsfaktor: Fleischsaft Serum Alternativ kann kommerzielle Software zur Auswertung herangezogen werden. Wir empfehlen die Auswertung mit Cubic Spline. 10 RIDASCREEN Haptoglobin

11 Anmerkung: Für die Auswertung ELISA-Tests ist bei R-Biopharm eine speziell für die RIDASCREEN Tests entwickelte Software, die RIDA SOFT Win, erhältlich. 12. Sensitivität Die mittlere untere Nachweisgrenze des RIDASCREEN Haptoglobin-Tests liegt bei 0,033 µg/ml. Das ist die Haptoglobin-Konzentration, welche sich signifikant vom Nullstandard unterscheidet. Bezogen auf das Probenvorbereitungsprotokoll resultiert daraus eine Nachweisgrenze von 0,033 mg/ml für Serum und Fleischsaft von Schweinen (Schweinefleisch). 100 % maximum absorbance Haptoglobin [µg/ml] Abb. 1: Eichkurve eines RIDASCREEN Haptoglobin Testkits RIDASCREEN Haptoglobin

12 13. Reproduzierbarkeit Die Präzision innerhalb einer Serie wurde aus den Resultaten von drei verschiedenen Experimenten ermittelt. Abbildung 2 zeigt das Inter-Assay-Präzisionsprofil von RIDASCREEN Haptoglobin. Die Variationskoeffizienten (% CV) der Extinktionen, ermittelt mit den Standards, sind gegen die entsprechenden Konzentrationen der Standards aufgetragen. Die Variationskoeffizienten sind über den gesamten Bereich der Kurve konstant und so niedrig, dass eine hohe Reproduzierbarkeit der Messergebnisse gewährleistet ist % CV Haptoglobin [µg/ml] Abb. 2: Inter-Assay-Präzisionsprofil von RIDASCREEN Haptoglobin Diese Angaben entsprechen dem heutigen Stand unserer Kenntnisse und sollen über unsere Produkte und deren Anwendungsmöglichkeiten informieren. Sie haben somit nicht die Bedeutung, bestimmte Eigenschaften der Produkte oder deren Eignung für einen konkreten Einsatzzweck zuzusichern. R-Biopharm übernimmt keine Gewährleistung, außer für die standardisierte Qualität der Reagenzien. Defekte Produkte werden ersetzt. Darüber hinaus gehende Ansprüche für direkte oder indirekte Schäden oder Kosten aus der Nutzung der Produkte entstehen nicht. 12 RIDASCREEN Haptoglobin

13 RIDASCREEN Haptoglobin Enzyme immunoassay for the quantitative analysis of haptoglobin (pigs) Brief information RIDASCREEN Haptoglobin (Art. No.: R7501) Competitive enzyme immunoassay for the quantitative analysis of haptoglobin in serum and meat juice from pigs. All reagents required for the enzyme immunoassay - including standards - are contained in the test kit. The test kit is sufficient for 96 determinations (including standards). A microtiter plate spectrophotometer is required for quantification. Technicians need no specialized training to perform the RIDASCREEN Haptoglobin test, however, free support is offered from the distributor on request, if necessary. Sample preparation: Time requirement: Detection limit: serum, meat juice: dilution sample preparation (for 10 samples)...approx. 10 min test implementation...2 h (regardless of the number of samples) serum, meat juice mg/ml RIDASCREEN Haptoglobin

14 1. Intended use The RIDASCREEN Haptoglobin assay is a competitive enzyme immunoassay for the quantitative analysis of haptoglobin in serum and meat juice from pigs. 2. General Haptoglobin is an α2-glykoprotein that occurs in most body fluids of mammals. The task of haptoglobin is to bind the haemoglobin that is freed by erythrocytes decomposition. This high-molecular complex cannot be excreted through the kidneys and therefore prevents loss of iron (Fe). On the other hand this complex also protects against the nephrotoxicity of free haemoglobin. Acute-Phase-Proteins such as haptoglobin are increasingly synthesized during an Acute-Phase-Reaction (APR). The APR is an unspecific reaction of the body to disturbances of homeostasis through infections, tissue-lesions, inflammations or neoplasia. This protein is a much more stable parameter than cell components (leukocytes) and less susceptible to short-term stimuli such as excitement. This sensitive parameter is therefore suitable for early recognition of deficiencies in swine breeders practices, such as poor hygiene, and to prevent productivity losses such as inferior weight gain or increased costs of medication. Therefore, the determination of haptoglobin is a possibility to monitor the health status of farm animals. 3. Test principle The basis of the test is the antigen-antibody reaction. The microtiter wells are coated with capture antibodies directed against anti-haptoglobin antibodies. Haptoglobin standards or sample solutions, biotinilated haptoglobin and antihaptoglobin antibodies are added. Free haptoglobin and biotinilated haptoglobin compete for the haptoglobin antibody binding sites (competitive enzyme immunoassay). At the same time, the anti-haptoglobin antibodies are also bound by the immobilized capture antibodies. Unbound biotinilated haptoglobin is then removed in a washing step. In the next step peroxidase conjugated streptavidin is added, and binds to the bound biotinilated haptoglobin. Any unbound enzyme conjugate is then removed in a washing step. After substrate/chromogen is added to the wells, bound enzyme conjugate converts the chromogen into a blue product. The addition of the stop solution leads to a color change from blue to yellow. The measurement is made photometrically at 450 nm. The absorbance is inversely proportional to the haptoglobin concentration in the sample. 14 RIDASCREEN Haptoglobin

15 4. Reagents provided Each kit contains sufficient materials for as many as 90 analyses (plus 6 standard analyses). Each test kit contains: 1 x Microtiter plate with 96 wells (12 strips with 8 removable wells each) coated with capture antibodies 6 x Standard solutions, 1.3 ml each 0 µg/ml (zero standard), µg/ml, 0.1 µg/ml, 0.3 µg/ml, 0.9 µg/ml, 2.7 µg/ml Haptoglobin in aqueous solution ready to use 1 x Biotin conjugate (6 ml)... white cap ready to use 1 x Anti-haptoglobin antibody (6 ml)... black cap ready to use 1 x Streptavidin conjugate (12 ml)... red cap peroxidase conjugated streptavidin ready to use 1 x Substrate/Chromogen, (10 ml)...blue cap contains tetramethylbenzidine stained red 1 x Stop solution (14 ml)... yellow cap contains 1 N sulfuric acid 1 x Washing buffer (salt) for preparation of a 10 mm phosphate buffer (ph 7.4) contains 0.05 % Tween 20 1 x Sample buffer (100 ml), ready to use 5. Materials required but not provided 5.1. Equipment: microtiter plate spectrophotometer (450 nm) 10 µl, 50 µl, 100 µl and 1000 µl micropipettes microtiterplate shaker (rotation shaker 500 rpm) 5.2. Reagents: distilled or deionized water RIDASCREEN Haptoglobin

16 6. Warnings and precautions for the users The stop solution contains 1 N sulfuric acid. Avoid contact of the reagent with the skin. Do not use RIDASCREEN Haptoglobin kit past the expiration date on the kit label. Dilution or adulteration of these reagents may result in loss of sensitivity. Do not interchange individual reagents between kits of different lot numbers. 7. Storage instructions Store the kit at 2-8 C (36-46 F). DO NOT FREEZE. Return any unused microwells to their original foil bag and reseal them together with the desiccant provided. The test kit can be regularly used at least up to the expiry date (indicated on the kit package), if stored correctly. The substrate/chromogen solution is light sensitive, therefore, avoid exposure to direct light. 8. Indication of instability or deterioration of reagents Any bluish coloration of the reddish substrate/chromogen solution is indicative of deterioration and the reagent should be discarded. A value of less than 0.6 absorbance units (A 450 nm < 0.6) for the zero standard may indicate deterioration of reagents. 16 RIDASCREEN Haptoglobin

17 9. Preparation of Samples The samples should be stored in a cool place, protected against light Meat juice from pigs / pork dilute the sample 1:1000 (1+999) the dilution should be done in two steps: first a 1:100 (1+99) dilution with the ready to use washing buffer (see 10.3.) has to be done (e.g. 10 µl sample in 1 ml washing buffer) the second dilution step should be done with sample buffer (see 4.) dilute the 1:100 diluted solution 1:10 (1+9) with sample buffer (e.g. 100 µl of the 1:100 dilution µl sample buffer) use 50 µl per well in the assay 9.2. Serum from pigs / pork dilute the sample 1:3000 (1+2999) the dilution should be done in two steps: first a 1:100 (1+99) dilution with the ready to use washing buffer (see 10.3.) has to be done (e.g. 10 µl sample in 1 ml washing buffer) the second dilution step should be done with sample buffer (see 4.) dilute the 1:100 diluted solution 1:30 (1+29) with sample buffer (e.g. 30 µl of the 1:100 dilution µl sample buffer) use 50 µl per well in the assay 10. Test implementation Preliminary comments 1. Bring all reagents to room temperature (20-25 C / F) before use. 2. Return all reagents to 2-8 C (36-46 F) immediately after use. 3. Do not allow microwells to dry between working steps. 4. Test results and reproducibility are largely depending upon vigorous shaking in point 4 5. Reproducibility in any EIA is largely dependent upon the consistency with which the microwells are washed. Carefully follow the recommended washing sequence as outlined in the EIA test procedure. 6. Avoid direct sunlight during all incubations. Covering the microtiter plates is recommended. RIDASCREEN Haptoglobin

18 10.2. Antibody-coated microtiter strips The foil bag is cut open along the transverse side beyond the zip. The required wells are extracted together with the frame. Those wells not required are kept together with the drying agent, well sealed in the foil bag and should continuously be stored at 2-8 C (36-46 F) Washing buffer Washing buffer salt (envelope) is contained in the kit (see 4.). The contents should be dissolved in one liter of distilled water. The ready to use washing buffer expires after 4 weeks at 4 C (39 F). Alternatively: Dissolve the contents of the envelope in only 100 ml of distilled water to obtain a 10fold concentrated washing buffer. Store this buffer concentrate only at room temperature (20-25 C / F)! The buffer concentrate can be used for 8 weeks. To obtain the ready to use washing buffer, 1 part of the concentrate has to be diluted with 9 parts of dist. water Test procedure 1. Insert a sufficient number of wells into the microwell holder for all standards and samples to be run. Record standard and sample positions. 2. Pipet 50 µl of standard or prepared sample to separate wells; use a new pipette tip for each standard or sample. 3. Add 50 µl of biotin conjugate (white cap) to each well. 4. Add 50 µl of the anti-haptoglobin antibody (black cap) to each well and incubate for 60 min at room temperature (20-25 C / F) on a microtiterplate shaker (rotation shaker 500 rpm). 5. Dump the liquid out of the wells into a sink. Tap the microwell holder upside down onto a clean filter towel (three times in a row) to remove all remaining liquid from the wells. Using a multichannel pipette, fill the wells with 250 µl per well of washing buffer (see 10.3.). Empty the wells again and remove all remaining liquid. Repeat the washing step two more times. 6. Add 100 µl of the peroxidase conjugated streptavidin (red cap) to each well. Mix gently by rocking the plate manually and incubate for 30 min at room temperature (20-25 C / F) in the dark. 7. Dump the liquid out of the wells into a sink. Tap the microwell holder upside down onto a clean filter towel (three times in a row) to remove all remaining liquid from the wells. Using a multichannel pipette, fill the wells with 250 µl 18 RIDASCREEN Haptoglobin

19 per well of washing buffer (see 10.3.). Empty the wells again and remove all remaining liquid. Repeat the washing step two more times. 8. Add 100 µl of substrate/chromogen (blue cap) to each well. Mix gently by rocking the plate manually and incubate for 15 min at room temperature (20-25 C / F) in the dark. 9. Add 100 µl of stop (yellow cap) solution to each well. Mix gently by rocking the plate manually and measure the absorbance at 450 nm against an air blank. Read within 10 minutes. 11. Results The mean values of the absorbance values obtained for the standards and the samples are divided by the absorbance value of the first standard (zero standard) and multiplied by 100. The zero standard is thus made equal to 100 % and the absorbance values are quoted in percentages. absorbance standard (or sample) absorbance zero standard x 100 = % absorbance The values calculated for the standards are entered in a system of coordinates on semilogarithmic graph paper against the haptoglobin concentration in [µg/ml]. The haptoglobin concentration in µg/ml corresponding to the extinction of each sample can be read from the calibration curve. In order to obtain the haptoglobin concentration in µg/ml actually contained in a sample, the concentration read from the calibration curve must be further multiplied by the corresponding dilution factor. When working in accordance with the regulation stated, the dilution factor is as follows: Meat juice Serum Alternatively, commercial software can be used for data reduction. We recommend cubic spline for the evaluation. Please note: For evaluation of the ELISA kits special software for the RIDASCREEN tests has been developed by R-Biopharm. RIDA SOFT Win can be ordered by your local distributor. RIDASCREEN Haptoglobin

20 12. Sensitivity The mean lower detection limit of the RIDASCREEN Haptoglobin test is about µg/ml. This is the haptoglobin concentration, which is significantly different from the zero-standard. According to the test preparation record, the detection limit for serum and meat juice from pigs (pork) is mg/ml. 100 % maximum absorbance Haptoglobin [µg/ml] Fig. 1: Calibration curve of a RIDASCREEN Haptoglobin kit 13. Reproducibility The precision within a series was determined from the results of three different experiments. Fig. 2 shows the interassay precision profile of RIDA- SCREEN Haptoglobin. The coefficients of variation (% CV) obtained for the absorption values of the standards are entered against the corresponding haptoglobin concentrations. The coefficients of variation are so low with respect to the whole range of the figure that a high reproducibility of the results is ensured. 20 RIDASCREEN Haptoglobin

21 12 9 % CV Haptoglobin [µg/ml] Abb. 2: Interassay precision profile of RIDASCREEN Haptoglobin R-Biopharm makes no warranty of any kind, either expressed or implied, except that the materials from which its products are made are of standard quality. If any materials are defective, R-Biopharm will provide a replacement product. There is no warranty of merchantability of this product, or of the fitness of the product for any purpose. R-Biopharm shall not be liable for any damages, including special or consequential damage, or expense arising directly or indirectly from the use of this product. RIDASCREEN Haptoglobin

22 Literatur/Literature Appendix 1. Hiss, S. et al.; Vet. Immunol. Immunopathol. 96/1-2, (2003): Development of an enzyme immunoassay for the determination of porcine haptoglobin in various body fluids: testing the significance of meat juice measurements for quality monitoring programs 2. Gymnich, S.; Diss. agr., Bonn, 2001: Haptoglobin als Screeningparamter im Gesundheitsmanagement von Ferkelaufzuchtbetrieben 3. Eckersall, P.D.; J. Am. Vet. Med. Assoc. 199, (1991): Acute phase reactants 4. Gruys, E., Obwolo, M.J., Toussaint M.; Vet. Bull. 64, (1994): Diagnostic significance of the major acute phase proteins in veterinary clinical chemistry: A review 5. Knura-Deszczka, S.; Diss. med. vet, Hannover (2000): Bewertung von Haptoglobin als Parameter zur Einschätzung des Gesundheitsstatus von Mastschweinen 6. Toussaint M., van Ederen, A.M., Gruys, E.; Comp. Haem. Int. 5, (1995): Implication of clinical pathology in assessment of animal health and in animal production and meat inspection 22 RIDASCREEN Haptoglobin