W? Be.6. Time-Resolved Fluorescence Measurement. in Flow Cytometry. Dipl. El. Ing. ETH. accepted on the recommendation of
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1 W? Be.6 Diss. ETH Nr Time-Resolved Fluorescence Measurement in Flow Cytometry A dissertation submitted to the SWISS FEDERAL INSTITUTE OF TECHNOLOGY ZURICH, SWITZERLAND For the degree of Doctor of the Technical Sciences Presented by Marc Anton Condrau Dipl. El. Ing. ETH bom May 1, 1960 citizen of Disentis and Zurich, Switzerland accepted on the recommendation of Prof. Dr. P. Niederer, examiner Prof. Dr. M. Anliker. co-exammer Prof. Dr. H. Hengartner, co-examiner ETHICS ETH-BIB
2 Abstract Flow cytometry has developed into a sophisticated analytical tool for the rapid quantification of multiple physical and chemical properties of single biological cells. In a flow cytometer, light scattered by individual cells flowing through a focused beam of light is measured to assess parameters related to cellular morphology, such as size and cytoplasmic granularity. Highly specific staining methods permit the selective tagging of cellular molecules with fluorescent dyes to characterize their biochemical composition. By addition of appropriate deflection mechanisms, flow cytometry has been expanded to a cell separation technique permitting the sorting of single cells at high purity. The method is referred to as Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). The sensitivity of conventional flow cytometry, in terms of the smallest detectable number of fluorophore molecules per cell, is often limited by cellular autofluorescence and by background emission generated by residual spectral overlap in multicolor experiments. In this work, the spectroscopic features of intrinsic cellular fluorescence are elaborated. The detection limit of conventional flow cytometry is shown to be increased by autofluorescence to several thousand fluorescein molecules per cell. As a consequence, the expression of various molecules of biological interest, such as the interferon-y or the interleukin-1 receptor, can not be quantified due to their sparse presence on the cell surface. Therefore, a new method has been devised for the elimination of cellular autofluorescence, or any background emission with a fluorescence decay time in the nanosecond range, as is typical of most organic molecules. The technique is based on the time-resolved measurement of lanthanide chelate luminescence. Lanthanide chelates display unique spectroscopic properties, having a fluorescence decay time in the range of 30 \is to 2 ms, and exceptionally well separated excitation and emission spectra. Time-resolved flow cytometry (TR-FCM) is based on the measurement of slowly decaying lanthanide chelate luminescence after a cell has left the laser intersection point decaying background fluorescence has vanished. and fast The detection limit of this new technique is evaluated theoretically, and it is shown that about 30 appropriately labeled cellular molecules are detectable in the presence of a fast decaying background emission. The influence of the exceptionally long fluorescence detection time on cell coincidence, i.e. on the 11
3 probability that more than one cell is present in the luminescence detection region, is discussed. Based on statistical considerations, the influence of particle coincidence on cell loss, introduced by cells passing through the instrument without being detected, and on the sorting performance of the TR-FCM Instrument is quantified. It was found that for typical fluorescence detection periods of 500 us to 1 ms, average particle - cells per second lead to flow rates of a detection probability of more than 90 % and a sorting performance comparable to conventional flow cytometry. The instrument designed and constructed for the experimental verification of the TR-FCM concept is presented and discussed. It features a photon counting detection of the lanthanide chelate fluorescence over a selectable time period of 10 us to 1 ms. A nonimaging optical system with an average geometrical light collection efficiency of 35 % was designed for the detection of the slowly decaying luminescence. An acoustooptic deflector turns the continuous-wave laser beam off during the fluorescence detection period. In this manner, fast decaying background luminescence excited by residual scattered laser light is eliminated. The data is acquired by a transputer-based pulse processing system computer for analysis and display. and transferred to a host Finally, experimental data demonstrating the quantification of europium chelate luminescence associated with a cell surface antigen on human lymphocytes is presented, and the elimination of an intense, DNA-associated background fluorescence is shown. 12
4 Zusammenfassung Die Durchflusszytometrie erlaubt die schnelle und quantitative Erfassung der physikalischen und biochemischen Eigenschaften von biologischen Zellen, welche einzeln durch einen fokussierten Laserstrahl fliessen. Das von der Zelle gestreute Licht gibt Aufschluss iiber die ZeUmorphologie. Hochselektive Farbemethoden ermoglichen die spezifische Markierung bestimmter zellularer Molekule mit Fluoreszenzfarbstoffen, was die Ermittlung von biochemischen ZeUeigenschaften erlaubt. Mit geeigneten Deflektionseinrichtungen konnen diese Instrumente auch fur die Sortierung einzelner Zellen zur Gewinnung reiner Zellpopulationen eingesetzt werden (FACS, Fluorescence Activated Cell Sorting). Die Empfindlichkeit eines Durchflusszytometers wird ublicherweise in Form der kleinsten Anzahl von Farbstoffmolekulen, die pro Zelle nachgewiesen werden kann, angegeben. Sie wird oft durch zellulare Aulqfluoreszenz, sowie durch die Hintergrundfluoreszenz, die durch spektrale Uberlappung verschiedener Farbstoffemissionen In der Mehrfarbenanalyse entsteht, begrenzt. In der vorliegenden Arbeit werden die spektroskopischen Eigenschaften der zellularen Eigenfluoreszenz erortert. Es wird gezeigt, dass diese Strahlungsemisslon die Detektionslimite der konventionellen Durchflusszytometrie bei bestimmten Zelltypen auf mehrere tausend Fluoresceinmolekule erhoht. Der Nachweis von wichtigen zellularen Molekulen, die nur schwach exprimiert werden, wie etwa des Interferon-y oder des Interleukin-1 Rezeptors, wird dadurch verunmoglicht. Daher wurde eine neue Methode zur Eliminierung zellularer Autofluoreszenz, bzw. einer beliebigen, schnell abklingenden Hintergrundfluoreszenz, entwickelt, die zeitaufgeloste Durchflusszytometrie. Sie beruht auf der zeitaufgelosten Messung der Fluoreszenzemission von Lanthanid-Chelaten. Diese Verbindungen weisen eine Fluoreszenzabkllngzeit von 30 is bis 2 ms auf. Im Gegensatz dazu klingt die Fluoreszenz der meisten organischen Substanzen innerhalb einiger Nanosekunden ab. Die Lanthanid-Fluoreszenz wird gemessen nachdem die Zelle den Laserstrahl verlassen hat und die zellulare Autofluoreszenz abgeklungen ist, womit die zellgekoppelte Farbstofffluoreszenz ohne die iiberlagerte Hintergrundfluoreszenz quantiflziert werden kann. 13
5 Aufgrund theoretischer Betrachtungen wird gezeigt, dass etwa 30 geeignet markierte Molekule auf der Zelloberflache mit dieser Methode nachgewiesen werden konnen. Der Einfluss der langen Fluoreszenzdetektionszeit auf die Zellkoinzidenz, d.h. auf die Wahrscheinlichkeit, dass eine Zelle durch das Instrument fliesst ohne detektiert zu werden, wurde statistisch anarysiert. Aufgrund dieser Betrachtungen wurde der Einfluss der Zelldurchflussrate auf den Zellverlust und die Sortien-einheit ermittelt. Bei typischen Detektionszeiten von 500 lis bis 1 ms, die fur die gegenwartig verfugbaren Lanthanid-Chelate benotigt werden, ergibt sich bei mittleren Zelldurchflussraten von 100 bis 200 Zellen pro Sekunde eine Detektionswahrscheinlichkeit von uber 90 % und eine Sortierreinheit, derjenigen der konventionellen Durchflusszytometrie entspricht. die Das Instrument, das fur die experimentelle Verifikation des Verfahrens entwickelt wurde, wird vorgestellt und erlautert. Zu den Merkmalen des Gerates gehort die Detektion der langsam abklingenden Lanthanid-Fluoreszenz mit einer Einzelphotonenzahleinheit uber einen wahlbaren Zeitraum von 10 us bis 1 ms. Die Lumineszenz wird von einem optischen System mit einer geometrischem Lichtsammlungsefflzienz von 35 % erfasst. Ein akustooptischer Deflektor, der als schneller optischer Schalter eingesetzt wird um den Dauerstrich-Laserstrahl wahrend der Fluoreszenzmessung zu unterbrechen, eliminiert schnell abklingende Hintergrundfluoreszenz, die durch parasitares Streulicht angeregt werden k6nnte. Die Messwerte werden von einem digitalen Datenverarbeitungsmodul, basierend auf einem Transputersystem, erfasst und an einen Computer fur die weitere Analyse ubermittelt. Schliesslich wird die Quantifizierung der Fluoreszenz von Europium-Chelaten gezeigt, die mit einer geeigneten Farbemethode an Oberflachenmolekule menschlicher Lymphozyten gekoppelt wurden. Die Elimination einer starken, schnell abklingenden Hintergrundfluoreszenz wird anhand einer DNA Farbung mit einem konventionellen Fluoreszenzfarbstoff nachgewiesen. 14
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