Einfluss von Interleukin-18 auf das Th 1 /Th 2 -Zytokingleichgewicht mononukleärer Nabelschnurblutzellen in vitro

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1 Aus dem Zentrum für Kinderheilkunde und Jugendmedizin der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i. Br. Einfluss von Interleukin-18 auf das Th 1 /Th 2 -Zytokingleichgewicht mononukleärer Nabelschnurblutzellen in vitro INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades der Medizinischen Fakultät der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i. Br. Vorgelegt 2005 von Dörte Schaefer geboren in Hannover

2 Dekan: Prof. Dr. C. Peters 1. Gutachter: PD Dr. M. Kopp 2. Gutachter: PD Dr. C. Schempp Jahr der Promotion: 2005

3 Für meine Eltern

4 I Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung Immunologische Grundlagen der Atopieentstehung Antigenpräsentierende Zellen T-Lymphozyten B-Lymphozyten Mastzellen Zytokine der Th 1 /Th 2 -Immunantwort Interleukin Interleukin Interferon-γ Interleukin Th 1 /Th 2 -Immunität und Schwangerschaft Das neonatale Immunsystem Fragestellung Material und Methoden Studienpopulation Abnahme des Nabelschnurblutes Dichtegradientenzentrifugation Zell-Zählung Einfrieren von CBMC Auftauen von CBMC Magnetic Activated Cell Sorting (MACS) zur Anreicherung CD4 + Zellen Durchflusszytometrie mittels Fluorescence Activated Cell Sorter (FACS) Zellstimulation Quantitative Zytokinbestimmung mittels ELISA für IFN-γ und IL

5 II 3. Ergebnisse Nachweis der IL-18-Sekretion mononukleärer Nabelschnurblutzellen Ermittlung optimaler Stimulationsbedingungen für die Stimulation mononukleärer Zellen mit IL Wirkung von IL-18 auf die Zytokinfreisetzung BLG- oder PHA stimulierter CBMCs Effekt der Präinkubation auf die Zytokinsekretion von CBMC Wirkung von IL-18 auf die Zytokinsekretion stimulierter CD4 + Zellen Diskussion Nachweis der IL-18-Sekretion durch CBMC Einfluss von IL-18 auf das Th 1 /Th 2 -Zytokinprofil mononukleärer Nabelschnurblutzellen Einfluss der Präinkubation auf das Th 1 /Th 2 -Zytokinprofil mononukleärer Nabelschnurblutzellen Wirkung von IL-18 auf die Zytokinsekretion von CD4 + Zellen Neonatale Immunität und Th 2 -Immunantwort Zusammenfassung 73

6 III 6. Anhang Materialübersicht Daten Literaturverzeichnis Publikation Danksagung Lebenslauf

7 IV Abbildungsverzeichnis Abb Pathopysiologie atopischer Erkrankungen.. 3 Abb IL-18-Konzentration in den Zellüberständen von CBMC Abb IFN-γ-Konzentration in den Zellüberständen von CBMC nach Stimulation mit 100, 200 oder 400 ng/ml IL-18 und PHA oder BLG Abb IL-13-Konzentration in den Zellüberständen von CBMC nach Stimulation mit 100, 200 oder 400 ng/ml IL-18 und PHA oder BLG Abb IFN-γ-Konzentration in den Zellüberständen von CBMC nach Stimulation mit PHA, IL-18 oder PHA und IL Abb IFN-γ-Konzentration in den Zellüberständen von CBMC nach Stimulation mit BLG, IL-18 oder BLG und IL Abb IL-13-Konzentration in den Zellüberständen von CBMC nach Stimulation mit PHA, IL-18 oder PHA und IL Abb IL-13-Konzentration in den Zellüberständen von CBMC nach Stimulation mit BLG, IL-18 oder BLG und IL Abb IFN-γ-Konzentration in den Zellüberständen von CBMC nach Präinkubation mit IL-18, IL-4 oder IL-18 und IL-4 und anschließender Stimulation mit PHA. 48 Abb IL-13-Konzentration in den Zellüberständen von CBMC nach Präinkubation IL-18, IL-4 oder IL-18 und IL-4 und anschließender Stimulation mit PHA 49 Abb Durchflusszytometrische Immunotypisierung von CBMC mittels FACS.. 51 Abb Durchflusszytometrische Immunotypisierung von CD4 + Zellen mittels FACS. 52 Abb IFN-γ-Konzentration in den Zellüberständen von CD4 + Zellen nach Präinkubation mit IL-18, IL-4 oder IL-18 und IL-4 und anschließender Stimulation mit PHA oder BLG 53 Abb IL-13-Konzentration in den Zellüberständen von CD4 + Zellen nach Präinkubation mit IL-18, IL-4 oder IL-18 und IL-4 und anschließender Stimulation mit PHA oder BLG... 55

8 V Tabellenverzeichnis Tab Tab IFN-γ- und IL-13-Konzentrationen in Zellüberständen von CBMC nach Stimulation mit PHA, IL-18 oder PHA und IL-18 für 48 Stunden IFN-γ- und IL-13-Konzentrationen in Zellüberständen von CBMC nach Stimulation mit BLG, IL-18 oder BLG und IL-18 für fünf Tage... 42

9 VI Abkürzungsverzeichnis Abb. Abbildung APC Antigen präsentierende Zelle BLG Betalaktoglobulin bzw. beziehungsweise CB Nabelschnurblut CBMC(s) Cord blood mononuclear cell(s) CD Cluster of differentiation d Tag DC Dendritic cells DMSO Dimethylsulfoxid FACS Fluorescence Activated Cell Sorter FCS Fetal Calf Serum FITC Fluorescein-Isothocyanat FL Fluorescenz FSC Forward Scatter g Erdbeschleunigung (9,81 m/s 2 ) GM-CSF Granulocyte macrophage colony stimulating factor h Stunde IFN Interferon Ig Immunglobulin IGIF Interferon gamma inducing factor IL Interleukin LPS Lipopolysaccharid MACS Magnetic Activated Cell Sorter MHC Major hiscompatibility complex min Minute Neg. Negativ (-kontrolle) NK-Zellen Natürliche Killlerzellen PAF Platelet activating factor PBMC(s) Peripheral blood mononuclear cell(s) PBS Phosphate Buffered Saline PE Phycoerythrin PHA Phytohämagglutinin pos. positiv SSC Sideward Scatter St.-Abw. Standardabweichung Tab. Tabelle TGF Transforming growth factor Th-Zellen T- Helferzellen TLR Toll-like-receptors TNF Tumor necrosis factor U Units, Einheiten VCAM Vascular adhesion molecule

10 Einleitung 1 1. Einleitung Die Prävalenz der atopischen Erkrankungen Asthma bronchiale, atopische Dermatitis und allergische Rhinitis ist in den letzten Jahrzehnten signifikant angestiegen (Vollmer, Osborne et al. 1998). Insbesondere im Kindesalter ist eine starke Zunahme der Atopieprävalenz zu verzeichnen (Omran, Russell et al. 1996; Maziak, Behrens et al. 2003). Im Rahmen der International Study of Asthma and Allergies in Childhood (ISAAC) wurden mittels standardisierter Fragebögen weltweit die Prävalenzen atopischer Erkrankungen bei Schulkindern erhoben (ISAAC 1998). Für Westdeutschland ergab sich bei jährigen Kindern eine Prävalenz des Asthma bronchiale von 13,1%, der allergischen Rhinitis von 14,7% und der atopischen Dermatitis von 7,3% (Duhme, Weiland et al. 1998). Die ISAAC- Studie zeigte sowohl eine signifikant größere Prävalenz atopischer Erkrankungen in West- im Vergleich zu Ostdeutschland als auch eine grosse Variabilität der Prävalenz atopischer Erkrankungen weltweit (Duhme, Weiland et al. 1998). Bis zu 20-fache Unterschiede wurden zwischen Regionen hoher und niedriger Atopieprävalenz festgestellt. Großbritannien, Australien, Neuseeland und Irland stellten die Länder mit der höchsten Atopieprävalenz dar. Innerhalb Europas besteht ein Ost-West-Gefälle mit signifikant niedrigeren Erkrankungsraten in Osteuropa (ISAAC 1998). Hinsichtlich der Ursachen für den Anstieg der Prävalenz atopischer Erkrankungen werden zahlreiche Einflussfaktoren diskutiert. In Anbetracht des starken Prävalenzanstiegs innerhalb der letzten Jahrzehnte, der weltweit grossen Variabilität der Prävalenz atopischer Erkrankungen (ISAAC 1998) sowie der signifikanten Prävalenzunterschiede zwischen Ostund Westeuropa (ISAAC 1998) sowie Ost- und Westdeutschland (Duhme, Weiland et al. 1998), werden insbesondere Umweltfaktoren bezüglich eines Einflusses auf die Atopieneigung untersucht. Diese schliessen Veränderungen in der Anzahl und Art frühkindlicher Infektionen (de Marco, Pattaro et al. 2004) beziehungsweise der kindlichen Exposition gegenüber mikrobiellen Strukturen (Braun-Fahrlander, Riedler et al. 2002), Veränderungen der gastrointestinalen Mikroflora (Kalliomaki, Salminen et al. 2001) und der Ernährung, wie beispielsweise der Aufnahme von Antioxidantien und Fettsäuren (Black and Sharpe 1997; Bodner, Godden et al. 1999; Devereux, Barker et al. 2002), mit ein. Hinsichtlich des Atopierisikos bei familiärer Atopieanamnese besteht bei Neonaten mit mütterlicher Atopieanamnese ein höheres Risiko für die Entwicklung einer Atopie in der

11 Einleitung 2 frühen Kindheit, als bei Neonaten mit väterlicher atopischer Erkrankung (Litonjua, Carey et al. 1998). Als Ursachen für eine allergische Sensibilisierung des Feten werden maternale Antikörper, das intrauterine Zytokinmilieu und der transplazentare Transfer von Antigenen diskutiert (Jones, Miles et al. 1996; Warner, Jones et al. 1997; Litonjua, Carey et al. 1998). Neben den umweltbedingten Einflussfaktoren in der frühen Kindheit scheinen genetische Faktoren für die Atopieentwicklung von maßgeblicher Bedeutung zu sein (Donovan and Finn 1999). Das Verständnis immunologischer Zusammenhänge bei Neonaten und im frühen Kindesalter ist von zentraler Bedeutung, um neben den pathophysiologischen Vorgängen der Atopieentstehung auch prädisponierende Faktoren für die Genese atopischer Erkrankungen aufzeigen zu können. Die Kenntnis dieser immunologischen Zusammenhänge könnte langfristig für die Entwicklung neuer Ansätze einer ursachenbezogenen Atopieprävention von Bedeutung sein Immunologische Grundlagen der Atopieentstehung In der Pathogenese atopischer Erkrankungen erfolgt eine komplexe Interaktion zwischen T- Zellen, B-Zellen und antigenpräsentierenden Zellen (APC). Das Resultat dieser Interaktion stellt die Entwicklung einer Entzündungsreaktion dar, die mit Zytokinfreisetzung, IgE- Sekretion und bronchialer Hyperreagibilität einhergeht.

12 Einleitung 3 Allergen Antigenpräsentierende Zelle TH2-Zelle Naive T-Zelle TH1-Zelle Viren, Bakterien IL-5 B-Zelle F Y F Y F Y Y Y IL-4 IL-13 IgE F F Reg.T-Zelle IL-10 TGF-β IL-2 IL-12 IFN-γ Eosinophiler Mastzelle Basophiler Allergische Reaktion Zytotoxische Immunantwort Abb. 1.1.: Pathopysiologie atopischer Erkrankungen Antigenpräsentierende Zellen Bei der Induktion einer Immunantwort erfolgt zunächst die Darbietung des Fremdantigens durch antigenpräsentierende Zellen (Steinman 1991; Holt and Jones 2000). Potente antigenpräsentierende Zellen (APC) stellen dendritische Zellen, Makrophagen, Langerhans- Zellen und Kupffer-Zellen dar (Trombetta and Mellman 2005). Nach Phagozytose extrazellulärer Antigene erfolgt die proteolytische Spaltung der aufgenommenen Antigene in lineare Peptide im Phagolysosom (Turley, Inaba et al. 2000). Durch das endoplasmatische Retikulum werden MHC II-Moleküle generiert, die in MHC II-loading Kompartimente freigesetzt werden und bis zu ihrer Beladung mit Peptidfragmenten durch eine invariante Kette blockiert sind (Ceman and Sant 1995). Nach Abspaltung der invarianten Kette wird diese durch das antigene Peptid ersetzt (Stebbins, Peterson et al. 1996). Das mit dem

13 Einleitung 4 Antigenfragment versehene MHC II-Molekül wird auf der Zelloberfläche der antigenpräsentierenden Zelle exprimiert. MHC Moleküle der Klasse II bestehen aus einer α- und einer β-kette. Beide Ketten weisen einen zytoplasmatischen Anteil, eine transmembranäre Domäne und zwei extrazelluläre Domänen auf. Die extrazellulären Domänen α 1 und β 1 bilden eine Vertiefung, über die die Bindung des antigenen Peptids erfolgt (Chaplin 2003). Die β 2 -Domäne des MHC II- Komplexes interagiert mit CD4-Molekülen, wodurch die Antigenerkennung von Antigenen, die durch MHC II-Moleküle präsentiert werden, auf CD4 + Zellen beschränkt wird (Konig, Huang et al. 1992). MHC II-Moleküle werden auf B-Zellen, Dendritischen Zellen, Monozyten und Makrophagen exprimiert (Chaplin 2003). Dendritische Zellen sind antigenpräsentierende Zellen, die für die Initiation einer Immunantwort von zentraler Bedeutung sind (Langrish, Buddle et al. 2002). Nach Vieira et al. können zwei Subpopulationen dendritischer Zellen unterschieden werden. Naive dendritische Zellen differenzieren in Anwesenheit von IFN-γ zu dendritischen Zellen Typ1 und setzen bei Kontakt mit naiven T-Zellen IL-12(p70) frei, das die Induktion einer Th 1 -Immunantwort vermittelt. PGE 2 und IL-10 induzieren demgegenüber die Reifung naiver DCs zu dendritischen Zellen Typ2, welche die Differenzierung naiver T-Zellen zu Th 2 -Zellen stimulieren. Dementsprechend können in Abhängigkeit von dem umgebenden Zytokinmilieu naive dendritische Zellen sowohl zu Th 1 - als auch zu Th 2 -induzierenden dendritischen Zellen heranreifen (Vieira, de Jong et al. 2000). Durch Langenkamp et al. konnte aufgezeigt werden, dass hinsichtlich der Induktion verschiedener Immunantworten durch DCs die Kinetik der Reifung dendritischer Zellen von Bedeutung ist. Nach LPS-Stimulation weisen aktivierte dendritische Zellen in den ersten Stunden eine ausgeprägte IL-12-Sekretion auf, einhergehend mit einer starken Th 1 -induzierenden Wirkung, wohingegen Zellen des selben Stimulationsansatzes zu einem späteren Zeitpunkt einen überwiegend Th 2 -induzierenden Effekt aufzeigen (Langenkamp, Messi et al. 2000)

14 Einleitung T-Lymphozyten T-Zellen sind durch die Expression des T-Zell-Rezeptors gekennzeichnet (Chaplin 2003). Dieser vermittelt die Erkennung von Peptidantigenen, die über MHC-Komplexe der Klasse I oder II dargeboten werden. Die antigenspezifischen α- und β-ketten des T-Zell-Rezeptors sind mit invarianten Ketten assoziiert, die als CD3 bezeichnet werden. Durch CD3 wird die Signaltransduktion nach Bindung des T-Zell-Rezeptors an einen Antigen-MHC-Komplex vermittelt (Chaplin 2003). Für die vollständige T-Zellaktivierung ist neben der Bindung des T-Zell-Rezeptors an den Antigen-MHC-Komplex die Interaktion kostimulatorischer Moleküle wie CD28 bzw. CD154 (CD40L) auf der T-Zelloberfläche und CD80/CD86 (Synonym B7.1/B7.2) bzw. CD40 auf der Oberfläche antigenpräsentierender Zellen von Bedeutung (Lenschow, Walunas et al. 1996; Van Kooten and Banchereau 1996). Anhand ihrer Effektorfunktionen werden verschiedene T-Zell-Subpopulationen unterschieden: CD8 + T-Zellen vermitteln einen zytotoxischen Effekt gegenüber Zellen, die mit intrazellulären Bakterien oder Viren infiziert sind oder infolge von Mutationen veränderte Proteine auf der Oberfläche präsentieren (Mescher 1995). CD4 + T-Zellen regulieren als sogenannte T-Helfer-Zellen zelluläre und humorale Immunreaktionen (Williams, Chang et al. 1991). Dabei weisen CD4 + T-Zellen unterschiedliche Differenzierungen auf, die jeweils durch eine charakteristische Zytokinsekretion gekennzeichnet sind: Th 0 -Zellen: Nach antigenspezifischer Stimulation naiver CD4 + T-Zellen differenzieren diese zu Th 0 -Zellen, welche insbesondere durch die Freisetzung von IL-2 gekennzeichnet sind (Chaplin 2003). Darüber hinaus sezernieren Th 0 -Zellen sowohl Th 1 - als auch Th 2 -spezifische Zytokine wie Interferon-γ (IFN-γ), Lymphotoxin (LT), IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-3, GM-CSF und TNF-α (Mosmann and Sad 1996). Nach Stimulation differenzieren Th 0 -Zellen in Abhängigkeit von dem umgebenden Zytokinmilieu zu Th 1 - oder Th 2 -Zellen (Mosmann and Coffman 1989). Th 1 -Zellen: Th 1 -Zellen führen zu einer Aktivierung von Makrophagen und sind dadurch an der intrazellulären Erregerabtötung beteiligt (Janeway, C.A. et al. 1999). Zudem sind Th 1 -spezifische Zytokine bei der Induktion zellvermittelter Entzündungsreaktionen von zentraler Bedeutung (Mosmann and Coffman

15 Einleitung ). Die Immunreaktion vom verzögerten Typ wird durch Th 1 -Zellen vermittelt und ist durch eine erhöhte Expression von IFN-γ gekennzeichnet (Yamamura, Uyemura et al. 1991; Tsicopoulos, Hamid et al. 1992). Th 1 -Zellen sezernieren unter anderem die Zytokine IL-2, IFN-γ, LT, IL-3, TNF-α und GM-CSF (Mosmann and Sad 1996). Th 2 -Zellen: Th 2 -Zellen führen zu einer Aktivierung von B-Zellen und stimulieren deren Differenzierung zu Antikörper-produzierenden Zellen (Janeway, C.A. et al. 1999). Th 2 -Lymphozyten sind unter anderem durch die Sekretion von IL-4, IL- 5, IL-6, IL-9, IL-10 und IL-13 sowie IL-3, TNF-α und GM-CSF gekennzeichnet (Mosmann and Sad 1996; Wills-Karp, Luyimbazi et al. 1998). IL-4 und IL-13 induzieren im Rahmen der Immunglobulinsynthese den Immunglobulinklassenwechsel der B-Zelle zu IgE (Mosmann and Coffman 1989; Zhang, Clark et al. 1991). Th 2 -Lymphozyten sind daher bei den atopischen Erkrankungen Asthma bronchiale, allergische Rhinitis und atopische Dermatitis von zentraler Bedeutung (Wierenga, Snoek et al. 1990; Robinson, Hamid et al. 1992). Die für die Th 1 - beziehungsweise Th 2 -Immunantwort charakteristischen Zytokine führen zu einer Inhibition der Ausreifung und Funktion des jeweils anderen Phänotyps. IFN-γ hemmt die Proliferation von Th 2 -Zellen sowie die IgE-Synthese humaner PBMC in vitro (Pene, Rousset et al. 1988; Fiorentino, Bond et al. 1989). IL-4 induziert eine verminderte Expression der ß 2 -Untereinheit des IL-12-Rezeptors auf Th 2 -Zellen und wirkt damit der Th 1 - induzierenden Wirkung von IL-12 entgegen (Szabo, Dighe et al. 1997). Demgegenüber stimuliert IL-4 die Differenzierung naiver T-Zellen zu Th 2 -Zellen, während IFN-γ, IL-12 und TGF-β die Entwicklung einer Th 1 -Immunantwort induzieren (Kamogawa, Minasi et al. 1993; Mosmann and Sad 1996; Szabo, Dighe et al. 1997). Neben den Th 1 - und Th 2 -Zellen existieren weitere, spezifische T-Zell-Populationen wie zum Beispiel Th 3 -Zellen und regulatorische T-Zellen (CD4 + CD25 + ), denen eine immunmodulatorische Funktion in der Th 1 -/ Th 2 -Balance zukommt. Th 3 -Zellen sezernieren TGF-β (Fukaura, Kent et al. 1996). Regulatorische T-Zellen sind unter anderem durch die Freisetzung von IL-10 und TGF-β (Chen, Kuchroo et al. 1994; Kronenberg and Rudensky 2005) gekennzeichnet.

16 Einleitung B-Lymphozyten B-Zellen sind durch die Synthese von Immunglobulinen (Ig) gekennzeichnet (Chaplin 2003). Immunglobuline setzen sich aus zwei identischen schweren Ketten und zwei identischen leichten Ketten zusammen (Chaplin 2003). Die aminoterminalen Enden der schweren und leichten Ketten stellen variable Regionen dar, an denen die Antigenbindung erfolgt (Chaplin 2003). Jedes Immunglobulin weist zwei identische antigenbindende Regionen auf. Das carboxyterminle Ende der leichten Ketten und der schweren Ketten ist innerhalb der Immunglobulin-Subklassen konstant. Die konstanten Regionen der schweren Ketten bilden die Fc-Domäne des Immunglobulins, über die die Bindung von Antikörpern an Fc-Rezeptoren vermittelt wird (Chaplin 2003). Naive B-Zellen exprimieren IgM und IgD auf der Zelloberfläche. Nach der Antigenbindung an die auf der Zelloberfläche exprimierten Immunglobuline, erfolgt die Internalisierung und Prozessierung des Antigens, sowie die nachfolgende Präsentation der Antigenfragmente über MHC II-Komplexe auf der B-Zelloberfläche. Antigenaufnahme durch naive B-Zellen resultiert in einer gesteigerten Expression von MHC II und der Kostimulatoren CD80 und CD86. Aktivierte T-Helfer-Zellen vermitteln über die Interaktion von CD40-Ligand auf der T-Zelloberfläche und CD40 auf der Oberfläche der B-Zellen eine B-Zellaktivierung. Der Immunglobulinklassenwechsel wird durch Zytokine, die unter anderem von T-Helfer-Zellen freigesetzt werden, vermittelt. IL-4 und IL-13 induzieren den Klassenwechsel der Immunglobuline zu IgE, IL-10 stimuliert die Expression von IgG 1 und IgG 3 und IFN-γ induziert die Expression von IgG 2. Durch TGF-β wird der Immunglobulinklassenwechsel zu IgA vermittelt (Chaplin 2003).

17 Einleitung Mastzellen Basophile und Mastzellen stellen die wichtigsten Effektorzellen im Rahmen der allergischen Entzündungsreaktion dar und sind durch die Expression hochaffiner IgE-Rezeptoren (FcεRI) auf der Zelloberfläche gekennzeichnet (Kinet 1989; Beaven and Metzger 1993; Costa, Weller et al. 1997). Die Antigenbindung an mastzellständige Immunglobuline der Klasse IgE führt zur Degranulation der Mastzellen mit Freisetzung bzw. de-novo Synthese von zahlreichen Entzündungsmediatoren. Hierzu zählen Histamin, Tryptase und Serotonin sowie Lipidmediatoren (Leukotriene, PAF) und Zytokine wie IL-4, IL-5, IL-6, IL-13 (Paul, Seder et al. 1993; Costa, Weller et al. 1997; Chaplin 2003) Zytokine der Th 1 /Th 2 -Immunantwort Interleukin-4 Interleukin-4 ist ein monomeres Proteinmolekül, welches als Precursor-Molekül synthetisiert wird (Kruse, Lehrnbecher et al. 1991). Der humane IL-4-Rezeptor setzt sich aus einer IL-4- spezifischen α-kette und der γ-kette des IL-2 Rezeptors zusammen (Kondo, Takeshita et al. 1993; Galizzi, Zuber et al. 1990). Durch das Vorliegen der IL-2Rγ-Kette wird die Affinität der Bindung von IL-4 an den IL-4Rα signifikant erhöht (Russell, Keegan et al. 1993). IL-4 wird vornehmlich durch T-Lymphozyten, Mastzellen sowie basophile- und eosinophile Granulozyten freigesetzt. Insbesondere CD4 + T-Gedächtniszellen setzen große Mengen an IL- 4 frei (DeKruyff, Fang et al. 1995), wohingegen CD8 + T-Zellen nur in geringem Umfang IL-4 sezernieren (Seder, Boulay et al. 1992). Die IL-4-Freisetzung durch T-Zellen wird über den T-Zell-Rezeptor vermittelt. Die Freisetzung von IL-4 durch Mastzellen wird durch die Quervernetzung hochaffiner Fc-Rezeptoren induziert (Tunon de Lara, Okayama et al. 1994). Die Wirkung von IL-4 besteht in einer Induktion der Expression von Oberflächen-IgM, CD23, CD40 und MHC II auf ruhenden B-Zellen (Shields, Armitage et al. 1989). Zudem übt IL-4 eine chemotaktische Wirkung auf B-Zellen aus (Komai-Koma, Liew et al. 1995). IL-4 wirkt kostimulatorisch auf die antigenvermittelte B-Zellproliferation (Llorente, Mitjavila et al.

18 Einleitung ). In Anwesenheit mononukleärer Zellen oder CD4 + T-Zellen kann IL-4 die Sekretion von IgE durch B-Zellen induzieren. Der Immunglobulinklassenwechsel von IgM zu IgG 1 und IgE wird ebenfalls durch IL-4 stimuliert (Schultz, Rothman et al. 1992). IL-4 stimuliert die Proliferation von CD8 + und CD4 + T-Zellen (Mitchell, Davis et al. 1989). Die zytotoxische Aktivität von CD8 + T-Zellen, NK- und monozytären Zellen wird durch IL-4 inhibiert. Daneben führt IL-4 zu einer Reduktion der Zytokinexpression von NK- und monozytären Zellen (Hayakawa, Salmeron et al. 1991; Yu, Kirken et al. 1998). Im Gegensatz zu IL-4 wird die zytotoxische Wirkung von T-Lymphozyten durch die p40- Untereinheit von IL-12 verstärkt (Abdi and Herrmann 1997). Demgegenüber supprimiert IL-4 die Expression von IL-12Rβ auf der T-Zelloberfläche (Szabo, Dighe et al. 1997). IL-4 führt zu einer Aktivierung von Mastzellen und eosinophilen Granulozyten (Romagnani 1994). Im Rahmen des Asthma bronchiale, der allergischen Rhinitis und der atopischen Dermatitis wurde eine erhöhte IL-4-Sekretion durch T-Lymphozyten festgestellt (Corrigan 1995) Interleukin-13 Ist ein monomeres Protein von 112 Aminosäuren, welches als Precursor-Molekül mit 132 Aminosäuren synthetisiert wird (Minty, Chalon et al. 1993). Der humane IL-13-Rezeptor ist als Heterodimer aus der IL-4Rα-Kette sowie der IL-13-spezifischen IL-13Rα1-Kette aufgebaut (Callard, Matthews et al. 1996; Wills-Karp and Chiaramonte 2003). Für IL-13 konnte keine Bindung an den IL-4Rα nachgewiesen werden (Zurawski, Vega et al. 1993). IL- 4Rα-Antikörper inhibieren jedoch die Wirkung von IL-13 (Lin, Migone et al. 1995). IL-4Rα scheint die Affinität von IL-13 gegenüber dem IL-13R zu erhöhen (Hilton, Zhang et al. 1996) und für die Signaltransduktion von entscheidender Bedeutung zu sein (Keegan, Johnston et al. 1995). Über die IL-4Rα-Kette kann zudem eine Bindung von IL-4 an den IL-13-Rezeptor erfolgen (de Vries 1998). Die Ähnlichkeit des Effektes von IL-4 und IL-13 könnte auf der gemeinsamen Rezeptorkomponente IL-4Rα basieren. Humanes IL-13 wird unter anderem durch aktivierte CD4 + - und CD8 + T-Zellen freigesetzt (de Waal Malefyt, Abrams et al. 1995; de Vries 1996). Die IL-13-Sekretion durch CD4 + T-Zellen erfolgt durch T-Zellen der Differenzierung Th 0, Th 1 oder Th 2 (de Vries and Zurawski 1995). IL-13 wird, im Gegensatz zu IL-4, durch naive CD45RA + T-Zellen produziert, was auf die

19 Einleitung 10 Bedeutung von IL-13 für die Initiation der IgE-Synthese hindeuten könnte (de Vries 1998). Die IL-13-Synthese und -Sekretion durch humane B-Zellen konnte mit Hilfe EBVtransformierter B-Zellen nachgewiesen werden (de Waal Malefyt, Abrams et al. 1995). Basophile Granulozyten und Mastzellen produzieren IL-13 nach IgE-Rezeptor-vermittelter Zellaktivierung (Burd, Thompson et al. 1995). Eosinophile Granulozyten setzen IL-13 nach Stimulation mit GM-CSF oder IL-5 frei (Schmid-Grendelmeier, Altznauer et al. 2002). T-Zellen exprimieren keinen IL-13R, so dass IL-13 im Gegensatz zu IL-4 keine Th 2 - induzierende Wirkung auf T-Zellen zukommt (de Waal Malefyt, Abrams et al. 1995; Sornasse, Larenas et al. 1996; de Vries 1998). IL-13 stimuliert die Proliferation und Differenzierung humaner B-Zellen (Defrance, Carayon et al. 1994). IL-13 induziert die Expression von CD23, CD71, CD72, IgM und MHC II auf der B-Zelloberfläche (Punnonen, Aversa et al. 1993; Defrance, Carayon et al. 1994; de Waal Malefyt, Abrams et al. 1995; de Vries 1996). Die IgE-Synthese sowie der Immunglobulinklassenwechsel zu IgG 4 und IgE können durch IL-13 induziert werden (Punnonen, Aversa et al. 1993; Punnonen and de Vries 1994; de Waal Malefyt, Abrams et al. 1995; de Vries 1996). Auch für unreife, humane, fetale B-Zellen konnte die Synthese von IgM, IgG 4 und IgE nach Stimulation mit IL-13 und aktivierten CD4 + T-Zellen nachgewiesen werden (Punnonen and de Vries 1994). Somit kommt IL-13 eine dem Effekt von IL-4 vergleichbare, in der Intensität jedoch geringer ausgeprägte Wirkung auf B-Zellen zu. IL-13 inhibiert die Sekretion proinflammatorischer Zytokine sowie die zytotoxische Aktivität von Monozyten, Makrophagen und NK-Zellen (Hayakawa, Salmeron et al. 1991; Yu, Kirken et al. 1998). Diesbezüglich kommt IL-13 eine antagonistische Wirkung gegenüber IL-10 und IFN-γ zu (Cosentino, Soprana et al. 1995). IL-13 induziert die Expression von MHC II, CD80 und CD86 auf der Monozytenoberfläche, einhergehend mit einer gesteigerten Kapazität der Aktivierung antigenspezifischer T-Zellen (Zurawski and de Vries 1994). Des weiteren wird durch IL-13 die Expression des niedrig affinen IgE-Rezeptors CD23 induziert, welcher durch die Darbietung von Antigen-IgE-Komplexen eine allergenspezifische T-Zellaktivierung vermittelt (de Vries 1998). In Abhängigkeit von IL-5 und Eotaxin hat IL-13 eine chemotaktische Wirkung und einen aktivierenden Effekt auf eosinophile Granulozyten (Pope, Brandt et al. 2001). Darüber hinaus induziert IL-13 über die Stimulation der endothelialen Expression von VCAM-1 die Monozyten- und Eosinophilenadhäsion sowie die nachfolgende Extravasation (Bochner, Klunk et al. 1995). IL-13 reguliert die Freisetzung von Faktoren, die die Kontraktion der glatten Muskulatur der Atemwege beeinflussen. Durch die Inhibition der NO-Synthetase

20 Einleitung 11 erfolgt eine Reduktion der Synthese des bronchodilatatorisch wirksamen NO durch Makrophagen (Doherty, Kastelein et al. 1993). Die IL-13-vermittelte Induktion der Freisetzung von Komplementfaktor C3 durch bronchiale Epithelzellen resultiert nach Spaltung zu C3a ebenfalls in einer Kontraktion der glatten Muskulatur der Atemwege (Bautsch, Hoymann et al. 2000; Humbles, Lu et al. 2000; Wills-Karp 2004). Patienten mit Asthma bronchiale oder allergischer Rhinitis weisen gegenüber Nichtatopikern eine gesteigerten IL-13-Sekretion aus mittels bronchoalveolärer Lavage gewonnenen mononukleären Zellen auf. Allergenexposition führt bei diesen Patienten zu einer signifikanten Induktion der IL-13-Freisetzung (Huang, Xiao et al. 1995). Durch Wong et al. wurde zudem eine erhöhte plasmale IL-13-Konzentration bei Asthmatikern gegenüber der nichtatopischen Kontrollgruppe aufgewiesen (Wong, Ho et al. 2001) Interferon-γ Interferon-γ ist ein homodimeres Protein, welches als Precursor-Protein synthetisiert wird (Ealick, Cook et al. 1991). Der IFN-γ-Rezeptor ist aus je einer α- und einer β-kette (IFN-γRα und IFN-γRβ) aufgebaut (Soh, Donnelly et al. 1994). IFN-γ wird vornehmlich durch T-Zellen und NK-Zellen sythetisiert. Antigenspezifische CD8 + zytotoxische T-Zellen setzten nach Exposition gegenüber viralen Antigenen große Mengen IFN-γ frei (Celis, Miller et al. 1986). IFN-γ stimuliert die Ausbildung einer Th 1 -Immunantwort, während die Proliferation von Th 2 - Zellen inhibiert wird. Th 1 -Zellen sind durch die Sekretion von IFN-γ, IL-2, IL-3 und TNF-β gekennzeichnet und führen zu einer Aktivierung von Makrophagen (Janeway, C.A. et al. 1999; Nathan and Tsunawaki 1986; Mosmann, Cherwinski et al. 1986). IFN-γ besitzt eine antivirale und antiparasitäre Wirkung. Makrophagen werden durch IFN-γ aktiviert. Diese Aktivierung resultiert in einer Stimulation der Synthese reaktiver Sauerstoffmoleküle und Wasserstoffperoxid, was eine Steigerung der Fähigkeit zur intrazellulären Erregerabtötung von Makrophagen bewirkt (Nathan and Tsunawaki 1986). Weiterhin induziert IFN-γ die NO-Synthetase in Makrophagen, was einen Schlüsselmechanismus der IFN-γ-gesteuerten Inhibition der Virusreplikation darstellen könnte (Karupiah, Xie et al. 1993). Die Induktion der NO-Synthetase könnte daher eine Erklärung für die antivirale, antibakterielle und antiparasitäre Wirkung von IFN-γ darstellen

21 Einleitung 12 (Karupiah, Xie et al. 1993). Die zytotoxische Aktivität von NK-Zellen wird durch IFN-γ, wie auch durch IFN-α und -β, stimuliert. IFN-γ kommt zudem eine regulatorische Wirkung auf die Immunglobulinsynthese zu. Während die Expression von IgG 2 durch IFN-γ stimuliert wird, erfolgt eine Hemmung der Synthese von IgG 1, IgG 2b, IgG 3 und IgE (Snapper and Paul 1987) Interleukin-18 IL-18 ist ein monomeres 18 kda-protein, welches als 24 kda-precursor-molekül synthetisiert wird. Die enzymatische Spaltung des Pro-IL-18 zu IL-18 erfolgt vornehmlich durch die intrazelluläre Protease Caspase-1, auch bezeichnet als IL-1β-converting-enzyme (Gu, Kuida et al. 1997; Fantuzzi and Dinarello 1999). NO führt zu einer Inhibition der Caspase-1 und könnte dementsprechend zu einer Protektion vor IL-18- oder IL-1β-vermittelter entzündlicher Gewebsschädigung beitragen (Kim, Talanian et al. 1998). IL-18 zeigt hinsichtlich der Aminosäuresequenz eine Homologie von 15% beziehungsweise 18% mit IL-1α beziehungsweise IL-1β. Aufgrund der Ähnlichkeit der dreidimensionalen Struktur zwischen IL-1β und IL-18 und der daraus resultierenden Rezeptoraffinität gegenüber dem zur IL-1R- Familie gehörigen IL-18R, ist IL-18 als Mitglied der IL-1-Familie zu betrachten (Dinarello 1999). Der IL-18-Rezeptor ist aus zwei Komponenten aufgebaut. Die IL-18-Bindung erfolgt über die α-untereinheit des IL-18R (IL-1 receptor-related protein, IL-1Rrp) während die Signaltransduktion durch die β-untereinheit des IL-18R (IL-1 receptor accessory-protein like protein, AcPL) vermittelt wird (Torigoe, Ushio et al. 1997; Born, Thomassen et al. 1998). IL-12 induziert die Expression von IL-18Rα auf naiven T-Zellen, Th 1 -Zellen und B-Zellen. Demgegenüber stimuliert IL-18 die Expression von IL-12Rβ (Tomura, Maruo et al. 1998; Yoshimoto, Takeda et al. 1998; Chang, Segal et al. 2000). Auf diese Weise wirken IL-18 und IL-12 synergistisch auf die IFN-γ-Synthese von T- und NK-Zellen. Humanes IL-18 binding protein (IL-18 BP) stellt ein lösliches Protein dar, welches durch die Bindung von IL-18 dessen Rezeptorbindung verhindert und somit die Wirkung von freiem IL- 18 reguliert (Novick, Kim et al. 1999). IL-18 wird durch ein weites Spektrum unterschiedlicher Zellen exprimiert, das unter anderem Makrophagen (Shibata, Foster et al. 1998), Kupffer-Zellen, T-Zellen, B-Zellen, dendritische Zellen (Stoll, Jonuleit et al. 1998), Osteoblasten (Udagawa, Horwood et al. 1997),

22 Einleitung 13 Keratinozyten (Stoll, Muller et al. 1997), Epithelien der Atemwege (Cameron, Taha et al. 1999) und Mikrogliazellen (Prinz and Hanisch 1999) einschließt. Die Wirkung von IL-18 wurde ursprünglich vorwiegend im Zusammenhang mit IL-12 untersucht, wonach IL-18 die Bezeichnung als IFN-γ induzierender Faktor (IGIF) zukam. IL- 18 induziert die Freisetzung von IFN-γ durch Th 1 -Zellen, nicht polarisierte T-Zellen, B- Zellen, NK-Zellen und dendritische Zellen. Für diesen Effekt liegt ein Synergismus mit IL-12 vor (Yoshimoto, Okamura et al. 1997; Okamura, Kashiwamura et al. 1998; Okamura, Tsutsui et al. 1998; Yoshimoto, Takeda et al. 1998). Während die Freisetzung von IFN-γ durch T- Lymphozyten für gewöhnlich von einer T-Zell-Rezeptor-vermittelten T-Zell-Aktivierung abhängig ist, führen IL-18 und IL-12 synergistisch zu einer T-Zell-Rezeptor unabhängigen Induktion der IFN-γ-Sekretion (Ahn, Maruo et al. 1997; Yoshimoto, Okamura et al. 1997; Yoshimoto, Takeda et al. 1998; Yang, Murphy et al. 1999; Tominaga, Yoshimoto et al. 2000). Diese synergistische Wirkung von IL-18 und IL-12 ist unter anderem auf die Induktion des IL-18Rα auf CD4 + T-Lymphozyten nach Stimulation mit IL-12 zurückzuführen. Die Ligation des IL-18Rα auf T-Zellen führt zu einer vermehrten Sekretion von IFN-γ (Kunikata, Torigoe et al. 1998; Tominaga, Yoshimoto et al. 2000). Obgleich IL-18 eine Stimulation der IFN-γ- Freisetzung hervorruft ist für IL-18 alleine, im Gegensatz zu IL-12, keine Th 1 -induzierende Wirkung nachweisbar (Robinson, Shibuya et al. 1997; Okamura, Kashiwamura et al. 1998). Während die Proliferation antigenstimulierter Th 1 -Zellen durch IL-18 gesteigert wird (Kohno, Kataoka et al. 1997), hat IL-18 auf Th 2 -Zellen keinen Effekt (Yoshimoto, Takeda et al. 1998). Naive CD45RA + T-Lymphozyten aus Nabelschnurblut exprimieren den IL-18Rα (Bofill, Almirall et al. 2004). Während der Differenzierung von naiven T-Zellen zu Th 1 -Zellen erfolgt eine Reduktion der IL-18R-Expression, die zu einer reduzierten Ansprechbarkeit auf IL-18 führt (Yoshimoto, Takeda et al. 1998). Auf der Oberfläche von Th 1 -Zellen wird der IL-18R demnach weiterhin exprimiert, wohingegen auf der Th 2 -Zelloberfläche eine vollständige Herunterregulation des IL-18R erfolgt (Xu, Chan et al. 1998). Für IL-18 ist daher keine direkte Wirkung auf Th 2 -Zellen nachweisbar (Yoshimoto, Takeda et al. 1998). Auf zytotoxischen T-Lymphozyten induziert IL-18 die Expression des Fas-Liganden und steigert auf diese Weise die Fas-vermittelte zytotoxische Aktivität (Dao, Ohashi et al. 1996; Dinarello 1997; Dinarello 1998). IL-18 stimuliert die zytotoxische Aktivität von NK-Zellen durch Induktion der Perforinvermittelten Zytotoxizität und Stimulation der Fas-Ligand-Expression (Tsutsui, Nakanishi et al. 1996; Hyodo, Matsui et al. 1999). NK-Zellen zeigen eine Expression des IL-18R und des IL-12Rβ 2. IL-18 und IL-12 führen synergistisch zu einer Induktion der IFN-γ-Sekretion durch

23 Einleitung 14 NK-Zellen (Hunter, Timans et al. 1997). Die Bedeutung von IL-18 und IL-12 für die NK- Zell-Aktivität zeigt sich besonders in knock-out Mäusen für diese beiden Zytokine, welche eine signifikant niedrigere NK-Zell-Aktivität und IFN-γ-Freisetzung aufweisen (Takeda, Tsutsui et al. 1998). Dementsprechend sind IL-18 und IL-12 für die Entwicklung einer suffizienten NK-Zell-Aktivität von großer Bedeutung (Takeda, Tsutsui et al. 1998). B-Zellen sezernieren IgG 1 und IgE nach Stimulation mit anti-cd40 und IL-4. Die Stimulation aktivierter muriner B-Zellen mit IL-12 und IL-18 resultiert in einer Induktion der IFN-γ- Freisetzung und IgG 2 -Produktion bei gleichzeitiger Inhibition der IL-4-vermittelten IgE- und IgG 1 -Synthese (Yoshimoto, Okamura et al. 1997). Basophile Granulozyten sezernieren nach Stimulation mit IL-3 und IL-18 die Zytokine IL-4- und IL-13 (Yoshimoto, Tsutsui et al. 1999). Die Stimulation basophiler Granulozyten mit IL- 12 und IL-18 führt demgegenüber zu einer Induktion der IFN-γ-Freisetzung, welche die IL-4- und IL-13-Sekretion basophiler Granulozyten inhibiert (Yoshimoto, Okamura et al. 1997; Yoshimoto, Tsutsui et al. 1999). Makrophagen sezernieren nach LPS-Stimulation IL-12 und IL-18, welche zu einer Induktion der IFN-γ-Freisetzung durch T-Zellen, B-Zellen und NK-Zellen führt (Yoshimoto, Nagai et al. 1998). Dadurch wird die Entstehung einer Th 2 -Immunreaktion supprimiert. Neben der Th 1 -induzierenden Wirkung kommt IL-18 unter bestimmten Stimulationsbedingungen auch eine Th 2 -induzierende Wirkung zu, welche im folgenden erläutert werden soll. Die Stimulation naiver CD4 + T-Zellen mit IL-2 und IL-18 bei gleichzeitiger T-Zell- Rezeptoraktivierung durch anti-cd3 resultiert in einer Induktion der IL-4-Expression. Anti- IL-4-Antikörper führen zu einer vollständigen Inhibition der IL-18-vermittelten IL-4- Freisetzung bei gleichzeitiger Induktion der IFN-γ-Sekretion. Dementsprechend führt IL-18 zu einer IL-4-abhängigen Th 2 -Induktion (Yoshimoto, Mizutani et al. 2000). Naive CD4 + T- Zellen exprimieren nach Stimulation mit IL-2 und IL-18 CD40L und induzieren die IgE- Sekretion durch B-Zellen (Yoshimoto, Mizutani et al. 2000). Basophile Granulozyten und Mastzellen exprimieren nach Inkubation mit IL-3 den IL-18Rα. Nach Stimulation mit IL-3 und IL-18 setzen basophile Granulozyten große Mengen IL-4 und IL-13 frei, wohingegen Mastzellen bei gleicher Stimulation lediglich geringe Mengen IL-13 sezernieren. IL-12 und IL-18 führen über die Induktion von IFN-γ zu einer Inhibition der Sekretion von IL-4 und IL-13 durch basophile Granulozyten (Yoshimoto, Tsutsui et al. 1999). Histamin, das durch Mastzellen und basophile Granulozyten sezerniert wird, führt zu einer

24 Einleitung 15 Stimulation der IL-18-Expression durch PBMC (Kohka, Nishibori et al. 2000). IL-18 und IL- 3 stimulieren zudem die Freisetzung von Histamin durch basophile Granulozyten und Mastzellen (Yoshimoto, Tsutsui et al. 1999). Dieser Zusammenhang könnte auf das Vorliegen eines Feedback Mechanismus zwischen IL-18 und Histamin hinweisen. In NK- und T-Zellen führt IL-18 in Kombination mit IL-2 zur Sekretion von IL-13. Die NKund T-Zellen IFN-γ-defizienter Mäuse weisen im Vergleich zu Kontrollmäusen eine signifikant höhere IL-13-Synthese nach Stimulation mit IL-18 und IL-2 auf (Hoshino, Wiltrout et al. 1999). Dies weist auf eine Regulation der IL-18- und IL-2-vermittelten IL-13- Sekretion durch IFN-γ hin (Hoshino, Wiltrout et al. 1999). IL-18 induziert zudem die IgE-Produktion durch Induktion der Freisetzung von IL-4 und IL- 13 sowie Steigerung der CD40 Ligand-Expression auf CD4 + Zellen (Hoshino, Yagita et al. 2000; Yoshimoto, Mizutani et al. 2000). Die gesteigerte IgE-Sekretion nach IL-18- Stimulation ist von der Anwesenheit von CD4 + Zellen abhängig und kann durch anti-cd4- Antikörper inhibiert werden (Hoshino, Yagita et al. 2000; Yoshimoto, Mizutani et al. 2000). IL-4-defiziente BALB/c Mäuse weisen nach IL-18-Stimulation keine IgE-Sekretion auf. Hingegen resultiert die Inhibition von IL-13 durch löslichen IL-13-Rezeptor (sil-13rα2-fc) in einer unveränderten IgE-Freisetzung. Nach diesen Ergebnissen sind CD4 + T-Zellen und IL- 4 für die IL-18-vermittelte Induktion der IgE-Expression essentiell (Yoshimoto, Mizutani et al. 2000). Zusammenfassend zeigen die bisher dargestellten Ergebnisse, dass IL-18 in Abhängigkeit des umgebenden Zytokinmilieus eine Th 2 -induzierenden Wirkung aufweist. Demnach könnte IL- 18 eine Bedeutung im Rahmen allergischer Reaktionen zukommen. Epithelzellen der Atemwege (Cameron, Taha et al. 1999) und Keratinozyten (Stoll, Muller et al. 1997), die im Rahmen des Asthma bronchiale und der atopischen Dermatitis von zentraler Bedeutung sind, exprimieren IL-18. Die Initiation einer allergischen Entzündungsreaktion könnte durch Induktion von Caspase-1 mit einer gesteigerten Sekretion von IL-18 und einer nachfolgenden IgE-unabhängigen Stimulation der IL-4- und IL-13-Freisetzung in Atemwegen oder Haut einhergehen (Yoshimoto, Mizutani et al. 2000). Durch Tanaka et al. wurde bei Patienten mit akutem Asthma bronchiale eine erhöhte Serum IL-18-Konzentration gegenüber der gesunden Kontrollgruppe nachgewiesen. Nach intravenöser Steroidtherapie konnte bei Patienten mit akutem Asthma bronchiale neben der Besserung der Lungenfunktion ein signifikanter Abfall der Serum-IL-18-Konzentration aufgezeigt werden (Tanaka, Miyazaki et al. 2001). Patienten mit atopischer Dermatitis weisen gegenüber der Kontrollgruppe ebenfalls erhöhte Serum-IL-18-Konzentrationen auf. Die

25 Einleitung 16 Serum-IL-18-Konzentration korreliert hierbei mit der Schwere der Erkrankung und der Eosinophilenzahl im peripheren Blut (Yoshizawa, Nomaguchi et al. 2002). Die in vitro IL-18- Sekretion durch PBMC ist bei Patienten mit Asthma bronchiale oder atopischer Dermatitis gegenüber der nichtatopischen Kontrollgruppe signifikant erhöht (El-Mezzein, Matsumoto et al. 2001). Bei Patienten mit allergischer Rhinitis konnten gegenüber der Kontrollgruppe erhöhte IL-18-Konzentrationen im Nasensekret nachgewiesen werden (Verhaeghe, Gevaert et al. 2002). Darüber hinaus konnte für Polymorphismen des IL-18-Gens (11q ) eine signifikante Assoziation mit erhöhtem Serum-IgE, allergischer Rhinitis oder allergenspezifischer Sensibilisierung aufgezeigt werden (Kruse, Kuehr et al. 2003). Im Mausmodell entwickeln Caspase-1 transgene Mäuse mit erhöhter IL-18-Expression spontan eine atopische Dermatitis, begleitet von erhöhten Serum-IgE-Konzentrationen und einer Th 2 -Deviation der murinen T-Zellen. Durch die Depletion von IL-18 (IL-18 -/- KCASP1Tg Mäuse) konnte die Entwicklung der atopischen Dermatitis verhindert werden. Diese Zusammenhänge stellen die Bedeutung von IL-18 im Rahmen der atopischen Dermatitis im Mausmodell dar (Tsutsui, Yoshimoto et al. 2004) Th 1 /Th 2 -Immunität und Schwangerschaft Während der Schwangerschaft ist die mütterliche Immunantwort zugunsten einer Th 2 - vermittelten Immunreaktion ausgerichtet. Schwangere weisen eine reduzierte zellvermittelte Immunität (Weinberg 1984) und eine verminderte Lymphozytenproliferation auf (Matthiesen, Berg et al. 1996). Durch die Plazenta werden grosse Mengen an IL-4, IL-10 (Roth, Corry et al. 1996), PGE 2 (Hilkens, Vermeulen et al. 1995) und Progesteron (Piccinni, Giudizi et al. 1995) produziert, wodurch Th 2 -Immunantworten induziert und Th 1 -Immunantworten inhibiert werden. Insbesondere IL-10 ist für eine intakte Gravidität von maßgeblicher Bedeutung. IL- 10 führt zu einer Inhibition der Freisetzung der inflammatorischen Zytokine IFN-γ und TNF-α und supprimiert dadurch die Th 1 -Immunantwort (Lin, H. et al. 1993). Ein intrauterines Überwiegen der Th 1 -Immunantwort, gekennzeichnet durch ausgeprägte IFNγ-Sekretion, geht mit einer plazentatoxischen Wirkung einher. Diese kann zum intrauterinen Fruchttod oder zur Frühgeburtlichkeit führen (Wegmann, Lin et al. 1993).

26 Einleitung Das neonatale Immunsystem Humane neonatale T-Lymphozyten weisen nach Stimulation mit Antigenen bereits eine Proliferationsantwort sowie eine spezifische Zytokinfreisetzung auf (Taylor and Bryson 1985; Gabrielsson, Soderlund et al. 2001). Zudem ist der Nachweis von Antigen-spezifischem IgE in Nabelschnurblut Hinweis auf eine Interaktion neonataler T- und B-Zellen (King, Malhotra et al. 1998). Dennoch gibt es sowohl qualitative, als auch quantitative Unterschiede zwischen der antigenspezifischen neonatalen Immunantwort und der Immunantwort älterer Kinder oder Erwachsener. Hinsichtlich der Ursachen werden verschiedene Faktoren diskutiert. Diese schliessen das geringe Ausmaß der Antigenexposition, einhergehend mit der verminderten Reifung neonataler antigenpräsentierender Zellen (APC) und einer reduzierten Freisetzung Th 1 -induzierender Zytokine durch neonatale APC ein (Delespesse, Yang et al. 1998). Weiterhin wird der intrauterinen Exposition gegenüber Progesteron und Zytokinen wie IL-4, welche die Genese einer Th 2 -Immunantwort stimulieren, diesbezüglich eine Bedeutung beigemessen (Delespesse, Yang et al. 1998). Neonatale mononukleäre Zellen beinhalten überwiegend naive, CD45RA + T-Lymphozyten, sowie in geringem Ausmaß sensibilisierte, CD45RO + T-Zellen. CD45RO + T-Zellen stellen 10% der neonatalen T-Zellpopulation dar, wohingegen T-Zellen adulter Individuen zu etwa 50% CD45RO exprimieren (Harris, Schumacher et al. 1992). Naive neonatale T-Zellen weisen gegenüber aktivierten adulten T-Zellen eine reduzierte Proliferationsneigung und Zytokinproduktion auf. Naive neonatale CD4 + T-Zellen setzen bei der Stimulation durch dendritische Zellen hohe Konzentrationen der Th 1 -Zytokine IFN-γ und IL-2 sowie geringe Mengen der Th 2 -Zytokine IL-4 und IL-13 frei. Durch naive CD4 + T-Zellen freigesetzte Zytokine können sowohl autokrin, als auch durch Beeinflussung der Funktion dendritischer Zellen, die Reifung naiver T-Zellen regulieren (Delespesse, Yang et al. 1998). Auf diese Weise kann die Differenzierung von Th 0 -Zellen sowohl zu Th 1 -, als auch zu Th 2 -Zellen stimuliert werden. Die Differenzierung naiver T-Zellen wird beeinflusst durch die Intensität des T-Zellrezeptor vermittelten antigenspezifischen Signals, durch APC-vermittelte kostimulatorische Signale sowie das umgebende hormonelle- und Zytokinmilieu. Insbesondere dem Zytokinmilieu scheint bei der Induktion der T-Zelldifferenzierung eine zentrale Bedeutung zuzukommen (Delespesse, Yang et al. 1998).

27 Einleitung 18 Makrophagen, NK-Zellen und dendritische Zellen führen im Rahmen der unspezifischen Immunität nach Antigenkontakt zu einer frühen Freisetzung von IL-12 und IFN-γ und stimulieren dadurch die Differenzierung naiver CD4 + T-Zellen zu Th 1 -Zellen (Trinchieri 1995) (Ohshima and Delespesse 1997). Das Ausmaß der IL-12-Freisetzung durch DCs ist von Zytokinmileu und Differenzierungsgrad der dendritischen Zellen abhängig (Koch, Stanzl et al. 1996). Naive CD4 + T-Lyphozyten, die in Anwesenheit von IL-4 und IL-6 aktiviert werden differenzieren zu Th 2 -Zellen (Janeway, C.A. et al. 1999). CD4 + T-Zellen, welche den Oberflächenmarker NK1.1 exprimieren, produzieren nach Stimulation grosse Mengen IL-4 (Janeway, C.A. et al. 1999). Darüber hinaus setzen naive T-Zellen nach antigenspezifischer Stimulation mittels antigenpräsentierender Zellen IL-4 frei, welches zu einer autokrinen Induktion der Th 2 -Differenzierung führen kann (Ohshima and Delespesse 1997). Die Freisetzung von IL-4 wird bei der Interaktion zwischen dendritischen Zellen und T-Zellen durch costimulatorische Signale wie B7.1 und B7.2 reguliert (Yang, Demeure et al. 1995). Die durch dendritische Zellen, Makrophagen, NK Zellen, NK 1.1 CD4 + T-Zellen und naive T- Lymphozyten freigesetzten Zytokine beeinflussen somit das Zytokinmilieu während der Aktivierung naiver T-Lymphozyten und nehmen dadurch Einfluss auf die nachfolgende Entwicklung einer Th 1 - oder Th 2 -Immunantwort. Ab der elften Gestationswoche ist die fetale Synthese von IgE nachweisbar (Miller, Hiravonen et al. 1973). Nabelschnurblut weist sehr niedrige Gesamt-IgE-Spiegel auf. Neonatale B-Zellen können nach in vitro-stimulation mit IL-4 IgE freisetzen. Im Vergleich zu adulten B-Zellen werden jedoch wesentlich höhere Konzentrationen von IL-4 benötigt, um eine IgE-Synthese durch neonatale B-Zellen zu stimulieren (Pastorelli, Rousset et al. 1990). Bei allen Kindern ist, unabhängig von einer späteren Atopieentwicklung, eine Th 2 - Gewichtung der Zytokinsekretion stimulierter CBMC nachweisbar (Holt and Macaubas 1997; Prescott, Macaubas et al. 1998). Innerhalb der ersten Lebensjahre erfolgt die Reifung der Th 1 - Immunantwort, erkennbar an einer zunehmenden IFN-γ-Freisetzung nach polyklonaler Lymphozytenstimulation (Miyawaki, Seki et al. 1985). Bei Kindern mit frühkindlicher Atopieentwicklung kann eine postnatal verminderte Reifung der zellulären Immunität, einhergehend mit einer reduzierten IFN-γ-Freisetzung und dem fortlaufenden Überwiegen der Th 2 -Immunantwort zugrunde liegen (Tang, Kemp et al. 1994; Warner, Miles et al. 1994; Liao, Liao et al. 1996; Kondo, Kobayashi et al. 1998).

28 Einleitung 19 Nach allergenspezifischer Stimulation von PBMCs resultiert im Vergleich zu CBMCs eine deutlich höhere IFN-γ-Sekretion. Nach Stimulation mit PHA ist hingegen bei CBMCs eine große Anzahl IFN-γ-produzierender Zellen nachweisbar. Als Ursache für die reduzierte IFNγ-Freisetzung nach allergenspezifischer Stimulation kommt ein Defekt neonataler antigenpräsentierender Zellen in Betracht (Taylor and Bryson 1985; Gabrielsson, Soderlund et al. 2001). Antigenpräsentierende Zellen (APC) sind für die Aktivierung von T-Lymphozyten und die Entwicklung einer Th 1 - beziehungsweise Th 2 -Immunantwort von zentraler Bedeutung. Dendritische Zellen sind als APC maßgeblich an der Stimulation naiver T-Zellen beteiligt (Banchereau and Steinman 1998). Neben der Vermittlung kostimulatorischer Signale über Oberflächenmoleküle wie CD40/CD40L und CD80/86 setzen APC die Zytokine IL-12, IFN-α und IL-18 frei und beeinflussen dadurch das Zytokinprofil aktivierter T-Zellen. Die Freisetzung des Zytokins IL-12, welches unter anderem die Induktion einer Th 1 - Immunantwort initiert, ist bei neonatalen gegenüber adulten APC reduziert. Neonatale dendritische Zellen (DC) setzen, infolge verminderter IL-12(p35) Genexpression, signifikant niedrigere Mengen des bioaktiven Heterodimers IL-12(p70) frei als adulte DCs. Demzufolge führen neonatale DCs gegenüber adulten DCs zu einer deutlich reduzierten Induktion der IFN-γ-Freisetzung durch naive CD4 + T-Zellen (Goriely, Vincart et al. 2001; Langrish, Buddle et al. 2002). Während die reduzierte IL-12(p70)-Freisetzung der APC für die Neonatalperiode charakteristisch ist, könnte bei Kindern die eine Entwicklung atopischer Erkrankungen aufweisen, ein verstärkter und über die Neonatalperiode hinaus nachweisbarer Defekt der IL- 12-Sekretion durch APC zugrunde liegen, welcher in einer Th 2 -gewichteten Immunantwort resultiert (Prescott, Taylor et al. 2003)..

29 Einleitung Fragestellung 1. Ist IL-18 im Zellüberstand mononukleärer Nabelschnurblutzellen nachweisbar? 2. Induziert IL-18 die Freisetzung von IL-13 und IFN-γ in den Zellüberstand antigenspezifisch oder polyklonal stimulierter CBMCs? 3. Welche Wirkung haben IL-18 und IL-4 auf die IL-13- und IFN-γ-Konzentration im Zellüberstand antigenspezifisch oder polyklonal stimulierter CBMCs? Können superadditive Effekte der Stimulation mit IL-4 und IL-18 gegenüber der Stimulation mit IL-18 oder IL-4 alleine dargestellt werden? 4. Welche Wirkung haben IL-18 und IL-4 im Rahmen von Präinkubationsversuchen mit CBMCs sowie CD4 + Zellen auf die Zytokinkonzentrationen von IL-13- und IFN-γ im Zellüberstand?