SCHLUSSBERICHT BMBF FORSCHUNGSVORHABEN FÖRDERKENNZEICHEN 02WA0700

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1 Fakultät Mathematik und Naturwissenschaften Institut für Mikrobiologie Professur für Angewandte Mikrobiologie SCHLUSSBERICHT BMBF FORSCHUNGSVORHABEN FÖRDERKENNZEICHEN 02WA0700 IDENTIFIZIERUNG UND QUANTIFIZIERUNG PHOSPHATAKKUMULIERENDER ORGANISMEN (PAO) IN BELEBTSCHLÄMMEN VERSCHIEDENER KOMMUNALER KLÄRANLAGEN (KA) Auftragnehmer: Technische Universität Dresden Fakultät Mathematik-Naturwissenschaften Lehrstuhl für Angewandte Mikrobiologie Bearbeiter: Prof Dr. Isolde Röske, Dr. Martin Eschenhagen Projektlaufzeit: 01. Mai 2006 bis 30. April 2009, kostenneutral verlängert bis 30. November 2009 Datum: Dresden, Mai 2010 Postadresse Besuchersdresse: TU T Dresden Telefon: Neubau Biologische Institute Fakultät Mathematik und Naturwissenschaften Fax : Zellescher Weg 20b Institut für Mikrobiologie Isolde.Roeske@tu-dresden.de Zi.124 (Sekretariat) Dresden Dresden

2 Abschlussbericht gemäß Anlage 2 zu Nr. 3.2 BNBest BMBF 98 INHALTSVERZEICHNIS I. KURZE DARSTELLUNG I.1. AUFGABENSTELLUNG I.2. VORAUSSETZUNGEN, UNTER DENEN DAS VORHABEN DURCHGEFÜHRT WURDE I.3. PLANUNG UND ABLAUF DES VORHABENS I.4. ANKNÜPFUNG AN DEN WISSENSCHAFTLICHEN UND TECHNISCHEN STAND I.4.1. Wissenschftlicher Stand I Mikrobiologische Erkenntnisse I Verfahrenstechnische Erkenntnisse I.4.2. Technischer Stand I Mikroskopische Verfahren I Batch-Versuche I Molekularbiologische Verfahren I Durchflusszytometrie und cell sorting I.5. Zusammenarbeit mit anderen Stellen II. EINGEHENDE DARSTELLUNG II.1. VERWENDUNG DER ZUWENDUNGEN IM EINZELNEN UND ERZIELTE RESULTATE II.1.1. Verwendung der Zuwendungen II.1.2. Resultate des Forschungsvorhabens A Charakterisierung der Belebtschlämme A-1 Chemische und verfahrenstechnische Charakterisierung der kommunalen Kläranlagen A-2 Phylogenetische Charakterisierung der Belebtschlämme A-3 Charakterisierung der Gruppe der phosphatakkumulierenden Bakterien A-3a Quantifizierung der Bakterien mit eingelagerten Polyphosphaten - Vergleich zwischen FACS/Tetracyclin und FISH/DAPI A-3b Phylogenetische Zuordnung der Bakterien mit eingelagerten Polyphosphaten mit Hilfe von FISH und DAPI A-3c Differenzierung der Rhodocyclus related PAOs A-3d Isolierung und Charakterisierung der Gruppe der TC positiven Bakterien mit Hilfe der Fluorescence activated cell sorting (FACS) B Bestimmung biochemischer Potentiale B-1 Biochemische Enzymtest C Untersuchungen der Phosphatakkumlation in Batch-Versuchen C-1 Charakterisierung der kommunalen Kläranlagen (KA) aufgrund der P-Freisetzung und Akkumulation der Belebtschlämme C-2 Physiologische Charakterisierung der Gruppe der Polyphosphat akkumulierenden Bakterien (PAO) C-2a Physiologische Charakterisierung der PAOs in einem Bioreaktor C-2b Physiologische Charakterisierung der PAOs in kommunalen Kläranlagen D-1a Etablierung von ppk-spezifischen Primersystemen

3 D-1b Nachweis der Ppk I auf Basis der mrna am Beispiel ausgewählter Isolate E Etablierung der Fluorescence activated cell sorting (FACS) für die Belebtschlammanalyse F Modellierung der einzelnen Schritte der biologischen Phosphatelimination auf Grundlage von Batch- und in situ- Untersuchungen F 1 Implementierung der ASM2 und ASM3 EAWAG Bio-P Modelle in Berkley-Madonna und Matlab/Simulink F 2 Erarbeitung von Parameterschätzroutinen F 3 Testung des Modells anhand von Daten aus kommunalen Kläranlagen F 3.1 Sensitivitätsanalyse des erstellten parametrisierten Modells F 3.2 Etablierung der Image Cytometry für die halbautomatischer Datenauswertung mikroskopischer Bilder in situ hybridisierter Proben F 3.3. Versuchsaufbau und Messprotokolle der SBR Langzeitexperimente F 3.4. Image Cytomtry gestützte Modellierung der Langzeitversuche F Integration mikrobiologischer Daten in Daten des ASM Kontext F Modellierung der Populationsdynamik Modellkalibrierung der Teilsprozesse F Modellierung der PAO auf DAPI-Basis F Modellierung der Populationsdynamik Kalibrierung auf Populationsbasis F Modellierung der Populationsdynamik auf Basis der Ergebnisse der Fluoreszenz in-situ Hybridisierung II.2. DIE WICHTIGSTEN POSITIONEN DES ZAHLENMÄßIGEN NACHWEISES II.3. NOTWENDIGKEIT UND ANGEMESSENHEIT DER GELEISTETEN ARBEIT II.4. DARSTELLUNG DES VORAUSSICHTLICHEN NUTZENS II.5. FORTSCHRITTE AU DEM GEBIET DES VORHABENS BEI ANDEREN STELLEN II.6. ERFOLGTE ODER GEPLANTE VERÖFFENTLICHUNGEN DER ERGEBNISSE II.6.1. Diplomarbeiten/Bachelorarbeiten II.6.2. Dissertationen II.6.3. Tagungsbeiträge II.6.4. Publikationen in wissenschaftlichen Zeitschriften II.6.5. weitere Präsentationen III. ERFOLGSKONTROLLBERICHT IV. KURZFASSUNG - BERICHTSBLATT V. DOCUMENT CONTROL SHEET VI. LITERATUR VII. ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS VIII. ABBILDUNGSVERZEICHNIS IX. TABELLENVERZEICHNIS

4 I. KURZE DARSTELLUNG I.1. AUFGABENSTELLUNG Im Gegensatz zu den Ergebnissen älterer Untersuchungen, die meist an Laboranlagen durchgeführt wurden, die mit synthetischen Abwasser beschickt wurden, deuten die Publikationen der letzten fünf Jahre auf eine deutlich höhere Diversität innerhalb der Gruppe der phosphatakkumulierenden Organismen (PAO) hin. Zudem konnte Kong et al. [2004,2005] mittels MAR-FISH nachweisen, dass, entgegen der bisher vertretenen Meinung und publizierten Modelle zur erhöhten biologischen Phosphatelimination (enhanced biological phosphorus removal, EBPR), die verschiedenen PAOs sehr unterschiedliche Substratspektren besitzen. Desweiteren zeigten Untersuchungen zur Zusammensetzung der PAO-Populationen in den kommunalen Kläranlagen, dass die Abundanzen der favorisierten Rhodocyclales-verwandten PAOs (RPAOs) in den untersuchten Anlagen sehr unterschiedlich (Kong et al. [2005], Oehmen et al. [2007], He et al. [2007], López-Vázquez et al. [2008]) sind und kein direkter Zusammenhang zu der ermittelten Phosphatelimination besteht. Auf Basis mikroskopischer Analysen konnte zudem gezeigt werden, dass nicht alle Bakterienzellen der R-PAOs Polyphosphatgranula besitzen und somit an der EBPR beteiligt sind. Auf Basis dieser neuen Ergebnisse sollte im Rahmen des vorliegenden Projektes ein Vergleich der PAO-Populationen von Kläranlagen mit unterschiedlichen Verfahren zur Phosphatelimination erfolgen. Hierzu wurden acht Kläranlagen mit unterschiedlichen Verfahren zur Phosphatelimination ausgewählt, d.h. Anlagen mit einer etablierten EBPR, einer Kombination aus EBPR und chemischer Fällung und ohne eine weitergehende Phosphatelimination. Das EBPR-Potential der Belebtschlämme dieser Kläranlagen sollte auf Basis der verfahrenstechnischen Daten der Kläranlagen und auf Basis von Batch-Versuchen ermittelt und wenn möglich in Abhängigkeit von unterschiedlichen C- Quellen quantifiziert werden. Des Weiteren sollte der Belebtschlamm, speziell die Gruppe der PAOs, mit Hilfe von modernen molekularbiologischen Methoden phylogenetisch und physiologisch charakterisiert werden. Hierzu sollte zum ersten Mal die Durchflusszytometrie in Verbindung mit cell sorting zur Separation von Bakterien mit eingelagerten Polyphosphateinschlüssen genutzt werden. Die so isolierten Bakterienzellen sollten mittels molekularbiologischer Methoden identifiziert und physiologisch charakterisiert werden. Dafür war es notwendig sowohl spezifische Primersysteme für die 16S rdna als phylogenetische Marker als auch spezifische Enzyme als physiologische Marker einzusetzen. Durch die Kombination mit Fingerprintmethoden, wie z.b. der DGGE, sollte dann ein Vergleich der verschiedenen Belebtschlammbiozönosen ermöglicht werden. Aufgrund der großen Anzahl an unterschiedlichen Kläranlagen konnte ein weites Spektrum an Belebtschlammbiozönosen in die Untersuchungen aufgenommen werden. Im Rahmen von mrna-analysen sollte zudem untersucht werden, in wie weit die Polyphosphatkinase I (ppki), ein zentrales Enzym des Phosphatstoffwechsels, als Marker für die EBPR eingesetzt werden könnte. Da dieses Enzym direkt an der Synthese von Polyphosphat beteiligt ist, könnte dieses Enzym als mögliches Testsystem für die Stabilität der EBPR in kommunale Kläranlagen in Betracht gezogen werden. In einem letzten Schritt können dann, die chemischen und biologischen Daten der kommunalen Kläranlagen und der Batchversuche zur Modellierung der EBPR genutzt werden. Da die bisherigen Modelle meist nur die chemischen Daten nutzen, sollte in diesem Arbeitspaket untersucht werden, ob durch die Nutzung der zusätzlichen Parameter eine Verbesserung der Modellierung erzielt werden kann

5 I.2. VORAUSSETZUNGEN, UNTER DENEN DAS VORHABEN DURCHGEFÜHRT WURDE Der Antragsteller verfügt über eine langjährige Erfahrung auf dem Gebiet der biologischen Abwasserbehandlung, speziell der biologischen Phosphatelimination. Es wurde schon bereits in den Jahren 1986 bis 1991 Untersuchungen sowohl im Labormaßstab als auch im Rahmen halb- und großtechnischer Anlagen durchgeführt. Auf Grundlage von Arbeiten des Antragstellers wurden drei der fünf großen Ostberliner Klärwerke bereits seit 1986 nach dem aerob/anaerob-verfahren betrieben. Eine Anzahl entsprechender Veröffentlichungen in Fachzeitschriften liegt vor. Aufgrund früherer und aktueller Projekte und Gutachten im Bereich der Abwasserreinigung, besonders auf den Gebieten der biologischen Phosphatelimination, der dezentralen Abwasserreinigung und der Schwimmschlammproblematik, bestehen eine Vielzahl von Kontakten zu verschiedenen Abwasserzweckverbänden in Sachsen und Brandenburg. Durch eine Vielzahl an Forschungsvorhaben in den Bereichen der angewandten Mikrobiologie wurde am Lehrstuhl eine Kompetenz für die Analyse von natürlichen und anthropogen beeinflussten mikrobiellen Biozönosen etabliert. Das Methodenspektrum umfasst neben den klassischen, kultivierungsabhängigen mikrobiologischen Methoden eine großes Spektrum an modernen molekular-biologischen Verfahren, wie z.b: FISH, CARD-FISH, PCR, realtime PCR und DGGE. Des Weiteren verfügt der Antragsteller über gute Kontakte zu Instituten, die Möglichkeiten für weitergehende mikroskopische und chemische Analysen bieten. Der Kooperationspartner, das Institut für Lebensmittel- und Bioverfahrenstechnik, verfügt ebenfalls über langjährige Erfahrungen auf dem Gebiet der Modellierung und Konzeption von biotechnologischen Produktionsverfahren. So laufen am Institut seit 1991 verschiedene Forschungsarbeiten zur Untersuchung der physiologischen Eigenschaften und Leistungen von Mikroorganismen, die verstärkt fettspaltende Enzyme (Lipasen) produzieren und somit auf den Fettabbau spezialisiert sind. Zielstellung war es, deren Wachstumskinetik sowie die optimalen Wachstums-bedingungen, bezüglich Nährstoffangebot, Sauerstoffzufuhr, Temperatur und ph-optimum mittels verschiedener Software zu modellieren. Das UfZ Leipzig, Auftragnehmer für die flowcytometrischen Analysen konnte in den vergangenen Jahren wesentliche Beiträge für die Etablierung der Flow Cytometry als Informationsübermittler der physiologischen Zustände der mikrobiellen Leistungsträger biotechnischer Prozesse leisten (Müller et al. [1997, a/b, 2004], Vogt et al. [2005]). Die Nutzung Flow Cytometry für die Ausarbeitung von Steuerungsstrategien für biotechnische Prozesse ist bisher nicht verbreitet und für die Abwasserbehandlung nicht bekannt, wäre aber basierend auf die bisherigen Ergebnisse des Auftragnehmers ein interessantes Verfahren zur Kontrolle der EBPR in Kläranlagen. I.3. PLANUNG UND ABLAUF DES VORHABENS Die Planung und Durchführung der Untersuchungen gliederten sich entsprechend des Projektantrages in die unten genannten Arbeitspakete. Änderungen in der Durchführung der Arbeitspakete ergaben sich nur in den Punkten B-2 und D-2. Da anhand der Betriebsdaten der Kläranlagen ersichtlich war, dass alle Anlagen, mit Ausnahme der Kläranlage Augustusburg, eine ähnliche Stickstoffelimination, d.h. vergleichbare Nitrifikations und Denitrifikationsleistung, aufweisen, wurde der Punkt B-2 nur stellvertretend an einigen Anlagen bearbeitet. Der Punkt D1 (mrna-card-fish) wurde ebenfalls nicht weiter bearbeitet, da sich die ppki in den mrna-basierenden Untersuchungen als nicht EBPR-spezifisch herausstellte. Somit waren weitere Etablierungsschritte einer mrna-card- FISH nicht sinnvoll. Für eine bessere Strukturierung im Teil Erfolgskontrollbericht wurden zwei zusätzliche Arbeitspakete, E und F, hinzugefügt. Diese Arbeitspakete beschäftigen sich zum Einem mit der Etablierung der FACS für die Belebtschlammanalyse, zum Anderen mit der Sensitivitätsanalyse und Parameteranpassung bei der Modellierung der wichtigsten Prozesse der EBPR

6 Gliederung der Arbeiten: A Charakterisierung der Belebtschlämme A-1 Chemische und verfahrenstechnische Charakterisierung der kommunalen Kläranlagen (KA) A-2 Phylogenetische Charakterisierung der Belebtschlämme A-3 Charakterisierung der Gruppe der phosphatakkumulierenden Bakterien B Bestimmung biochemischer Potenziale B-1 Biochemische Enzymtests B-2 Bestimmung des Nitrifikations- und Denitrifikationspotentials C Untersuchungen der Phosphatakkumulation in Batch-Ansätzen C-1 Charakterisierung der kommunalen Kläranlagen (KA) aufgrund der Phosphatfreisetzung und akkumulation der Belebtschlämme C-2 Physiologische Charakterisierung der Gruppe der phosphatakkumulierenden Bakterien (PAO) D Molekularer Nachweis spez. Enzyme D-1 Molekularer Nachweis spezifischer Enzyme D-2 mrna-card-fish E Etablierung der Fluorescence activated cell sorting (FACS) für die Belebtschlammanalyse F Modellierung der EBPR -Sensitivitätsanalyse und Parameteranpassung I.4. ANKNÜPFUNG AN DEN WISSENSCHAFTLICHEN UND TECHNISCHEN STAND I.4.1. I Wissenschftlicher Stand Mikrobiologische Erkenntnisse Aufgrund neuerer Untersuchungen können verschiedene Gattungen bzw. Spezies mit der EBPR in Bezug gebracht werden. Zu den wichtigsten PAO-Kandidaten zählen Vertreter der Rhodocyclus-Gruppe (RPAO) und Vertreter der Actinobakterien (APAO). Als erstes wurden Vertreter der RPAO von BOND et al. [1995] als potentielle PAO beschrieben. Mittlerweile konnte ihre Beteiligung an der EBPR durch zahlreiche Untersuchungen (HESSELMANN et al. [1999], CROCETTI et al. [2000], ZILLES et al. [2002]) bestätigt werden. Es handelt sich dabei um derzeit unkultivierbare Mikroorganismen, die in die Familie der Rhodocyclaceae gehören und mit der Gattung Propionivibrio nah verwandt sind. In der Gruppe der Actinobacteria wurden ebenfalls potentielle PAO vermutet. Zu dieser Gruppe gehören z.b. die Spezies Microlunatus phosphovorus (SANTOS et al. [1999]) und Tetrasphaera elongata (ONDA et al. [2002]). KONG et al. [2005] fanden in EBPR-Anlagen zwei verschiedene Morphotypen von Vertretern der Familie Intrasporangiaceae, für die sie mittels MAR-FISH eine Polyphosphatspeicherung nachweisen konnten. Zu diesen unkultivierbaren Bakterien gehören zum Einen Kokken (Gattung Tetrasphaera) und kurze Stäbchen, die zu einer anderen Gattung innerhalb derselben Familie gehören. Diese Actinobacterien verwandte PAOs (APAO) weisen einige Unterschiede im Vergleich zu den RPAO auf. In der anaeroben Phase verstoffwechseln sie anstelle von kurzkettigen Fettsäuren Aminosäuren (KONG et al. [2005]) und es ist zudem unklar, ob und wie sie die aus der Substrataufnahme gewonnene Energie speichern, da sie keinen PHA-Aufbau zeigen (KONG et al., [2005])

7 Neben diesen beiden Gruppen, die zurzeit favorisiert werden, gibt es weitere mögliche PAOs aus den Gruppen der γ- Proteobacteria (NIELSEN et al., [1999], Liu et al., [2001]), der Cytophaga-Flavobacteria-Gruppe (DABERT et al., [2001]) und sogar Vertreter innerhalb der Eukarioten (MELASNIEMI und HERNESMAA [2000]). Trotz vieler Untersuchungen kann bis heute keiner speziellen Gattung bzw. Gruppe die erhöhte Phosphatelimination in kommunalen Kläranlagen alleine zugeordnet werden. Vielmehr wird davon ausgegangen, dass sich verschiedene phylogenetisch unterschiedliche Gruppen daran beteiligen [debashan, 2004]. Zudem ist es bisher noch nicht gelungen, alle potentiellen PAOs aus dem Belebtschlamm zu isolieren. So konnte Vertreter der favorisierte PAO-Gruppe Candidatus Accumulibacter nur mittels einer Metagenomanalyse charakterisiert werden, da sich diese trotz einer Dominanz von ca. 80% nicht aus einem Belebtschlamm isolieren ließen. Die meisten der älteren Untersuchungen wurden an Labor- oder Pilotanlagen durchgeführt, die mit synthetischem Abwasser betrieben wurden. Vergleichbar zu den Problemen mit der Isolierung von Reinkulturen kommt es bei Verwendung von künstlichem Abwasser zu einer Verschiebung innerhalb der mikrobiellen Biozönose der untersuchten Belebtschlämme. So stammen viele Datensätze, die sich durch eine starke Dominanz einzelner PAOs, wie z.b. von Vertretern der Rhodocyclales, auszeichnen, aus Untersuchungen an kleinen Anlagen, die mit künstlichem Abwasser beschickt wurden. Erst in den letzten fünf Jahren wurden mehrere Arbeiten publiziert, die sich mit dem Nachweis von PAOs in kommunalen Kläranlagen beschäftigen. Auf Basis dieser Ergebnisse zeigte sich, dass in solchen Systemen der Anteil an potentiellen PAOs deutlich geringer ist und sich zudem die Zusammensetzung der PAOs zwischen den verschiedenen Anlagen unterscheidet. Jedoch konnte bis jetzt kein Zusammenhang zwischen der Verfahrensweise der Kläranlage und der Zusammensetzung der PAO-Biozönose nachgewiesen werden. I Verfahrenstechnische Erkenntnisse Das Belebungsverfahren in Kombination mit der EBPR wird schon seit vielen Jahren erfolgreich eingesetzt. Jedoch erfolgt die Modellierung und Planung solcher Anlagen meist auf chemischen Daten, die die biologischen Vorgänge nur als black box betrachten und somit nur unvollkommen beschreiben. Zudem beruhen die meisten Modelle noch auf der Grundlage, dass die PAOs nur kurzkettige Fettsäuren als C-Quelle nutzen, was durch die Arbeiten von Kong et al. [2005] eindeutig widerlegt werden konnte. Daher sollte im Rahmen des Projektes versucht werden, weitere C-Quellen und biologische Daten in bestehende Modelle zu integrieren. I.4.2. Technischer Stand Aufgrund der langjährigen Arbeit auf dem Gebiet der mikrobiellen Diversität stehen am Lehrstuhl die verschiedensten klassischen und modernen, molekularbiologischen Verfahren zum Nachweis unterschiedlicher physiologischer Gruppen von Mikroorganismen zur Verfügung. I Mikroskopische Verfahren Dem Lehrstuhl für Angewandte Mikrobiologie stehen drei moderne Forschungs-mikroskope der Firma Zeiss für die mikroskopische Auswertung zur Verfügung. Diese werden neben der routinemäßigen Hellfeldmikroskopie vor allem für moderne fluoreszenzbasierende Analysenverfahren genutzt. Zu diesen Verfahren gehören neben der Detektion von zellulären Inhaltsstoffen mit spezifischen Fluoreszenzfarbstoffen (z.b. DAPI) vor allem verschiedene kultivierungsunabhängige phylogenetische Verfahren, wie z.b. FISH und CARD-FISH. Diese werden heute routinemäßig zur Charakterisierung von mikrobiellen Ökosystemen genutzt

8 I Batch-Versuche Batch-Versuche bieten die Möglichkeit, P-Rücklöse- und Aufnahmeprozesse von Belebtschlämmen unter definierten Bedingungen (Temperatur, Substratangebot, Sauerstoffkonzentration) zu verfolgen. Mit Hilfe dieser Analysen, durchgeführt nach Scheer (1996), sollen erste Aussagen zu dem EBPR-Potential der verschiedenen Belebtschlämmen getroffen werden. Zudem lassen sich durch den Einsatz verschiedener C-Quellen zusätzliche Informationen über das Substratspektrum der PAOs und vielleicht, in Hinblick auf die Ergebnisse von Kong et al. [2004], auch erste Erkenntnisse zu der Zusammensetzung der PAOs gewinnen. I Molekularbiologische Verfahren In den letzten Jahren wurden am Lehrstuhl für Angewandte Mikrobiologie eine Reihe von modernen molekularbiologischen Verfahren etabliert. Zu diesen gehören neben der routinemäßig eingesetzten PCR die Erstellung von Genbibliotheken und verschiedene Fingerprintverfahren (RFLP, DGGE, t-rflp), die zum Vergleich von natürlichen und anthropogen beeinflussten Ökosystemen genutzt werden. Dabei werden von den eingesetzten Primer-Systemen sowohl phylogenetisch relevante Regionen (z.b. die 16S rdna) als auch Gene habitatsrelevanter Enzyme, wie z.b. die Ammoniummonooxigense (amoa), Arsenatreduktase (arsc), Polyphosphatkinase (ppk), als Zielregion genutzt. Zudem stehen dem Lehrstuhl aufgrund einer langjährigen Zusammenarbeit mit dem Institut für Genetik verschiedene Verfahren für den Nachweis und die Quantifizierung der Expression einzelner Enzyme zur Verfügung. So sollte im Rahmen des Projektes die Expression der Polyphosphatkinase (ppki) auf Basis der mrna untersucht werden. I Durchflusszytometrie und cell sorting Mit der Arbeitsgruppe von Frau Dr. Müller, Department of Environmental Microbiology des UFZ Halle-Leipzig, wurde über einen Forschungs- und Entwicklungsvertrag ein Projektpartner gefunden, der sich intensiv mit der Integration der Flow Cytometry zur verfahrenstechnischen Optimierung biotechnologischer Prozesse und der Analyse von biologischen Systemen beschäftigt. I.5. Zusammenarbeit mit anderen Stellen Frau Dr. Müller, Department of Environmental Microbiology Umweltforschungs-zentrum Leipzig-Halle GmbH (über Forschungs- und Entwicklungsvertrag) Institut für Lebensmittel- und Bioverfahrenstechnik, TU Dresden Institut für Genetik, TU Dresden; Durchführung von Expressionsanalysen Institut für Werkstoffwissenschaften, TU Dresden; Durchführung von REM-Analysen TU Dresden, Fachrichtung Chemie, Bioanalytische Chemie Kurt-Schwabe-Institut für Mess- und Sensortechnik e.v.; Testung einer P-sensitiven Elektrode - 8 -

9 II. EINGEHENDE DARSTELLUNG II.1. VERWENDUNG DER ZUWENDUNGEN IM EINZELNEN UND ERZIELTE RESULTATE II.1.1. Verwendung der Zuwendungen Die Zuwendungen wurden entsprechend der Zielsetzung im Projektantrag eingesetzt. Im Folgenden sollen am Beispiel einzelner Arbeitspakete die Verwendung der Zuwendungen dargelegt werden. AP-A AP-B AP-C Für die phylogenetische Charakterisierung der Belebtschlämme, die als Grundlage der mikrobiologischen Vergleiches diente, wurden die einzelnen Kläranlagen mehrfach beprobt und die Belebtschlammaliquots zur weiteren Analyse zum UfZ Halle-Leipzig (siehe AP-E) und zur TU Dresden gekühlt transportiert. Am Institut für Angewandte Mikrobiologie wurde im Rahmen dieses AP zur Differenzierung der mikrobiellen Biozönose molekularbiologische Methoden (FISH, Klonierung/Sequenzierung und DGGE genutzt. Die zeitaufwendigen mikrokopischen FISH-Analysen wurden mit Unterstützung von studentischen Hilfskräften durchgeführt. Die Ergebnisse beruhen auf mindestens drei Probennahmen. Für die molekularbiologischen Methoden mussten im Vorfeld verschiedene Polymerase-Kits getestet werden, da aufgrund der verwendeten bakterien-spezifischen Primer eine Kontamination der PCR-Produkte durch Fremd-DNA ausgeschlossen werden musste. Auf Basis dieser Voruntersuchungen wurde ein Kit der Firma Eppendorf/5Prime verwendet. Vergleichbar zu den physiologischen Ergebnissen (AP-B) konnten mittels FISH auf Gruppenniveau nur geringe phylogenetische Unterschiede zwischen den Belebtschlämmen nachgewiesen werden. Bei Verwendung spezifischerer Methoden (PCR in Kombination von Genbibliotheken und DGGE) zeigten sich große Unterschiede in der phylogenetischen Zusammensetzung, die auf eine sehr hohe Diversität hindeutet. Für die Bestimmung und den Vergleich der physiologischen Eigenschaften der untersuchten Belebtschlämme wurde das BIOLOG-Verfahren, welches routinemäßig für die Analyse der Abbaupotentiale von Umweltproben genutzt wird, verwendet. Im Rahmen der BIOLOG-Versuche konnte gezeigt werden, dass alle Belebtschlämme aufgrund ihrer mikrobiellen Heterogenität ein ähnlich hohes physiologisches Potential besitzen. Erst bei größeren Verdünnungsstufen konnten klare Unterschiede zwischen den Belebtschlämmen erkannt werden, was darauf hin deutet, dass spezifische Umsätze nur durch kleinere physiologische Gruppen repräsentiert werden, die in unterschiedlichen Abundanzen in den Belebtschlämmen vorkommen. Als wichtigster Parameter für den physiologischen Vergleich der Belebtschlammproben diente, neben der Verfahrensführung der Kläranlagen, das Potential zur EBPR. Dieses wurde unter definierten Bedingungen (Sauerstoff, Temperatur, C-Quelle) durch Ermittlung der Phosphatfreisetzung- und Aufnahmeraten in Batchversuchen bestimmt. Aufgrund der vielen, parallel durchzuführenden chemischen Analysen konnten nur zwei Versuche parallel pro Tag durchgeführt werden. Da vier verschiedene C-Quellen getestet wurden, mussten bis zu drei Tage für die Batchversuche einer Kläranlage eingeplant werden. Des Weiteren mussten für eine statistische Auswertung Proben bei verschiedenen Jahreszeiten genommen werden. Die Durchführung der Batch- Versuche (bis zu 16h) wurde durch die Unterstützung von studentischen Hilfskräften ermöglicht. Im Rahmen der Batchversuche konnte zum Einen deutlich gezeigt werden, dass mit Ausnahme der - 9 -

10 Kläranlage Augustusburg alle Anlagen ein klares Potential zur erhöhten biologischen Phosphatelimination besitzen, auch Anlagen mit einer Kombination aus chemischer und biologischer oder einer reinen chemischen Phosphatelimination. Die höchste P-Freisetzung konnte jedoch, wie zu erwarten war, in den Kläranlagen mit einer stabilen EBPR nachgewiesen werden. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass in den meisten Anlagen mit einer Denitrifikation diese Belüftungsintervalle für die Etablierung einer EBPR ausreichten und somit die chemische Fällung in den meisten Fällen durch eine EBPR unterstützt wird. Des Weiteren konnte durch den Einsatz der verschiedenen C-Quellen gezeigt werden, dass alle untersuchten Kläranlagen ein spezifisches C-Quellenmuster besitzen, welches wahrscheinlich auf der Zusammensetzung des Abwassers beruht. Zudem deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass eben nicht nur eine Organismengruppe für die gemessene EBPR verantwortlich ist. Dies bedeutet einerseits, dass die EBPR durch die Zusammenarbeit verschiedener Gruppen stabiler gegenüber äußeren Einflüssen ist, aber aufgrund der heterogenen Zusammensetzung auch schwieriger zu steuern ist. AP-D AP-E AP-F Da die Polyphosphatkinase I (ppki) ein zentrales Enzym des Polyphosphatstoffwechsels ist, sollte im Rahmen dieses Arbeitspaketes versucht werden, die gemessenen Potentiale zur EBPR auf Basis der Zusammensetzung der ppki zu erklären. Bisher wurde die Heterogenität der ppki nur innerhalb der Rhodocyclales-Gruppe zur Erklärung der EBPR untersucht. Zu Beginn der Untersuchung wurden auf Basis von großen Datenbankrecherchen verschiedene Primer für den molekularbiologischen Nachweis der ppki etabliert, zuerst auf Basis von Reinkulturen dann anhand der Belebtschlämme. Hierzu waren verschiedene PCR-Reaktionen und Klonierungen/Sequenzierungen anzuwenden. Durch den Versuch, die Enzym-Gruppe der ppki mit Hilfe von molekularen Methoden nachzuweisen, wurde ersichtlich, dass zum Einem viele Mikroorganismen diese Enzym besitzen und somit das Potential zur Polyphosphatspeicherung besitzen. Es zeigte sich, dass diese Enzymgruppe auf DNA-Basis sehr heterogen ist und somit ein allgemeiner Vergleich der Heterogenität innerhalb der untersuchten Belebtschlämme schwierig ist. Des Weiteren deuten die Ergebnisse auf einen horizontalen Gentransfer hin, da die ppki innerhalb einzelner phylogenetischer Gruppen deutliche Unterschiede aufweisen. Im Rahmen eines FE-Vertrages sollte eine Methode zur Anfärbung und Separation von Bakterien mit eingelagerten Polyphosphaten etabliert werden, um in situ, d.h. direkt in den Belebtschlämmen, eine Quantifizierung und Identifizierung der PAOs zu ermöglichen. Durchführung: Zu Beginn wurden verschiedene Fixierungsverfahren getestet, die eine längere Lagerung der Belebtschlammproben ermöglichen, ohne Artefakte bei der DNA-Messung und der FACS-Analyse zu erhalten. Anschließend wurde mit Tetracyclin ein spezifischer Farbstoff gefunden und für die flowcytometrische Analyse etabiert. Im Rahmen der Zusammenarbeit mit dem UfZ Halle-Leipzig wurde mit Tetracyclin ein neuer polyphosphatspezifischer Farbstoff etabliert. Des Weiteren wurde in Kombination mit der cell sorting in ersten Versuchen eine Trennung von Bakterien erzielt, die mittels molekularbiologischen Methoden den Rhodocyclales und den Actinobacterien zugeordnet werden konnten. Zusätzlich wurde versucht, sowohl in Batchversuchen als auch in Belebtschlämmen eine P-Freisetzung auf Basis dieser Ergebnisse zu erklären. Die Resultate waren jedoch nicht eindeutig. Hierzu müssten noch weitere Versuche durchgeführt werden. Für die Modellierung der Populationsdynamik werden in der Literatur bisher keine Messdaten aufgeführt, was die Zusammensetzung der Population über den Simulationszeitraum bzw. den experimentellen Zeitraum betrifft. D.h. alle abwasserrelevanten chemischen Parameter werden während der Versuche

11 erfasst, jedoch wird der zeitliche Verlauf der beteiligten Organismengruppen nicht durch Messdaten gestützt und somit nur als aus den chemischen Analysen und stöchiometrischer Gleichungen errechneten, theoretischen Werten ausgegeben. Für die Modellierung der Populationsdynamik sollten daher chemischen Daten mit mikrobiologischen Daten in praktischer Weise verknüpft werden, um mit den vorhandenen Modellen die tatsächliche, messbare Populationsdynamik abbilden zu können. Die Nutzung von Daten aus Kläranlagen gestaltete sich insofern schwierig als dass analytische Daten nur im Rahmen der Qualitätssicherung der Ablaufwerte von den Betreibern erfasst wurden. Zusätzlich hätten unter erheblichen, logistischem Aufwand zusätzlich mehrmals täglich Proben genommen werden müssen. Für die Etablierung neuer Modellansätze ist jedoch eine ausreichende Datenmenge erforderlich. Daher wurde Langzeitversuche im Labormaßstab durchgeführt und in regelmäßigen Abständen relevante chemische Parameter bestimmt und die Zusammensetzung der Population auf Gruppenniveau mit Hilfe der FISH untersucht. Es konnte erfolgreich gezeigt werden, dass sowohl die chemischen Daten als auch Daten aus mikrobiologischen Untersuchungen durch ein entsprechendes Modell abgebildet werden können. II.1.2. Resultate des Forschungsvorhabens A Charakterisierung der Belebtschlämme A-1 Chemische und verfahrenstechnische Charakterisierung der kommunalen Kläranlagen Auf Basis der Ergebnisse der chemischen Analysen, die uns durch die Betreiber zur Verfügung gestellt wurden, und in Bezug auf das eingesetzte Verfahren zur P-Elimination wurden die untersuchten Kläranlagen chemisch und verfahrenstechnisch näher klassifiziert (Tabelle 1). Tabelle 1: Verband, Größe und Abwassertyp der untersuchten Kläranlagen Verband Kläranlage Größenklasse Ausbau (EW) Abwassertyp Auslastung ZV Mittleres Niederwiesa kommunal 80% Erzgebirge Mittweida kommunal 83% Frankenberg kommunal/ 100% 50% industriell Hainichen kommunal 62% Augustusburg kommunal 60% (Ox.-Graben) Envia Elsterwerda kommunal/ 90% Molkerei Bad Liebenwerda kommunal 80% Gelsenwasser AG Kaditz kommunal 80%

12 Da neben der technischen Verfahrensweise auch die Abwasserzusammensetzung einen großen Einfluss auf die mikrobielle Struktur der Belebtschlämme und die biologische Phosphateliminationsleistung besitzt, wurde die Abwasserzusammensetzung der einzelnen Kläranlagen näher untersucht. Die Daten sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Mit Ausnahme der Kläranlagen (KA) Elsterwerda und Kaditz, deren Abwasser im Vergleich zum Phosphor eine deutlich höhere BSB 5 - und Stickstoffkonzentration aufweist, besitzen die Abwässer der anderen KA ein BSB 5 :N:P-Verhältnis im Bereich von 24:5:1. Somit weisen diese kommunalen Abwässer im Vergleich zum durchschnittlichen Massenverhältnis von Biomasse [106:16:1 (C:N:P)] einen deutlich erhöhten Phosphorgehalt auf. Die hohe C-Belastung der Abwässer der KA Elsterwerda und Kaditz lässt sich durch einen erhöhten Anteil an Industrie (z.b. Molkereiabwasser [vgl. Tabelle 1]) erklären. Alle untersuchten KA erzielten die für die entsprechenden Größenklassen vorgeschriebenen Grenzwerte. Die KA Augustusburg stellt aufgrund ihrer Größe und der fehlenden Reinigungsstufe, speziell der Phosphatelimination, eine Sonderrolle dar und wird in den folgenden Diskussionen als Referenzkläranlage ohne biologische Phosphatelimination verwendet. Die Eliminationsleitungen und das ermittelte Schlammalter sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Tabelle 2: Kläranlage Schlammalter und Reinigungsleistung der untersuchten Kläranlagen im Untersuchungszeitraum techn. Schlammalter CSB [%] BSB5 [%] N [%] P [%] Verfahrensw. [Tage] Elsterwerda Bio-P 18 98,5 99,6 98,2 96,0 Bad Liebenwerda C / N / D 20 95,9 99,1 98,1 96,1 Niederwiesa 38 92,6 97,1 83,3 91,9 Mittweida Bio-P ,1 97,0 77,1 88,2 Frankenberg chem. Fällung 29 91,5 97,5 88,0 94,8 Kaditz chem. Fällung 12 91,3 96,5 69,3 76,6 Hainichen C / N / DeNi 50 97,3 98,6 92,9 92,4 Augustusburg C / N 21 91,8 95,9 59,8 61,2 A-2 Phylogenetische Charakterisierung der Belebtschlämme Für die Differenzierung der mikrobiellen Zusammensetzungen der Belebtschlämme der untersuchten Kläranlagen wurden PCR basierende Methoden und die kultivierungs-unabhängige Methode der Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) eingesetzt. Die Ergebnisse der PCR basierenden Verfahren werden in Zusammenhang mit den Ergebnissen der flow cytometry vorgestellt. Mit Hilfe der FISH kann durch den Einsatz von gruppen- und gattungsspezifischen, fluoreszenzmarkierten Oligonukleotidsonden eine direkte Markierung der Bakterien-zellen auf Basis der 16S rdna erfolgen. Durch diese direkte, d.h. in situ Zählung können Fehler, verursacht durch eine selektive Kultivierung bzw. methodische Fehler bei der DNA- Isolierung bzw. bei der PCR, ausgeschlossen werden. FISH: Gruppenspezifische Sonden Im ersten Arbeitsabschnitt wurden gruppenspezifische Oligonukleotidsonden eingesetzt. Hierdurch war es möglich, die Belebtschlämme auf Basis der vier dominanten phylogenetischen Gruppen, d.h. die α-, β- und γ-proteobakterien und die gram-positiven Bakterien mit einem hohen GC-Gehalt (HGC69a), zu vergleichen. Mit Hilfe der FISH konnten ca

13 90% der hybridisierbaren Zellen bzw % der Gesamtzellzahl diesen Gruppen zugeordnet werden. Die Ergebnisse sind in der Abbildung 1 zusammengestellt. Abbildung 1: Prozentualer Anteil der Alpha- (ALF-1b), Beta- (BET42a), Gamma-(GAM42a) Proteobacteria und der Actinobakterien (HGC69a) im Belebtschlamm der verschiedenen Kläranlagen. Die untersuchten Kläranlagen waren meist durch Vertreter der α -Proteobacteria dominiert (10-20%). Im Vergleich dazu besaßen die Actinobacteria und die β-proteobacteria eine etwas niedrigere Abundanz. Die γ-proteobacteria, zu denen auch die Gattung Acinetobacter gehört, spielten in den untersuchten Belebtschlämmen dagegen zumeist nur eine untergeordnete Rolle. Auf Basis der verwendeten Sonden konnten keine großen Unterschiede in der Zusammensetzung der mikrobiellen Biozönosen gefunden werden, auch nicht in Zusammenhang mit der Verfahrensweise der einzelnen Kläranlagen. Daher wurden in weiterführenden Untersuchungen spezifische Gensonden zum Nachweis einzelner Gattungen bzw. Spezies, die mit der EBPR in Verbindung gebracht werden, eingesetzt. FISH: PAO-spezifische Sonden Insgesamt wurden sechs verschiedene Sonden für zwei potentielle PAO-Gruppen, denen eine maßgebliche Beteiligung an der EBPR zugesprochen wird, ausgewählt. Dies wären zum einem die Vertreter der Rhodocyclus-Gruppe (R-PAO, Sonden: PAO462, PAO651 und PAO846) und zum anderen PAOs, die phylogenetisch mit der Gattung Tetrasphaera verwandt sind (A-PAO; Sonden: Actino1011, Actino221 und Actino658). Im Gegensatz zu den Sonden PAO462 und PAO651 (beide zeigten Abundanzen von nur ca. 1%) konnten mit den anderen PAO spezifischen Sonden (R-PAO und A-PAO) signifikante Abundanzen nachgewiesen werden. Der Anteil der R-PAOs (PAO846) lag zwischen 3 und 11%. Damit besaß diese Gruppe einen hohen Anteil (25% bis 80%) an der β2-gruppe der Proteobakterien (Sonde BTWO663). Auch in der KA Augustusburg, die keine weitergehende P-Elimination besitzt, weder EBPR noch chemische Fällung, konnte eine signifikante Abundanz an R-PAOs (ca. 4%) nachgewiesen werden. Wie aus der Abbildung 2 zu ersehen ist, besteht keine Korrelation zwischen der Abundanz der R-PAO und dem Verfahren zur P-Elimination. Zudem konnte auch keine Korrelation zwischen Ergebnissen der Batch-Versuchen mit Acetat als C- Quelle (AP 3-1) und der Abundanz der R-PAO nachgewiesen werden, die laut den MAR-FISH-Analysen von Kong et al. [2005] vor allem Acetat als C-Quelle nutzen. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass die untersuchten PAOs entweder zur natürlichen Biozönose der Belebtschlämme gehören und diese nur unter bestimmten Bedingungen ihren Stoffwechsel in Richtung EBPR ändern. Zum anderen könnte es bedeuten, dass nur einzelne Vertreter dieser PAO-Gruppen an der gemessenen EBPR beteiligt sind

14 Abbildung 2: Prozentualer Anteil der Vertreter der β-proteobakterien (Sonde Bet42a), der β2-proteobakterien (BTWO663) und der Rhodocyclus verwandten PAO (Sonde PAO846) in den untersuchten Belebtschlämmen. Auf den ersten Blick scheint die Abundanz der A-PAO mit 1-6% ( Abbildung 3) deutlich niedriger zu sein, als die der R- PAO. Da jedoch die Sonden Actino-221 (kokkoide Typus) und Actino-658 (stäbchenförmiger Typus) unterschiedliche Gruppen der A-PAO erfassen, müssen die Ergebnisse addiert werden. So ergibt sich als Summe für die beiden Sonden ein prozentualer Anteil von 4-11%, der in einem vergleichbaren Rahmen zu den R-PAO liegt. Dagegen hybridisierten mit der Sonde Actino-1011, die hauptsächlich kultivierbare Vertreter der Gattung Tetrasphaera erfasst, mit 1-6% nur wenige Bakterien. Etwas höher lag die Zahl der hybridisierbaren Zellen nur im Belebtschlamm der KA Kaditz (7-9%). Abbildung 3: Prozentualer Anteil der Vertreter der Actinobakterien (Sonde HGC69a) und verschiedener A-PAO (Sonden Actino1011, Actino221 und Actino658)

15 A-3 Charakterisierung der Gruppe der phosphatakkumulierenden Bakterien A-3a Quantifizierung der Bakterien mit eingelagerten Polyphosphaten - Vergleich zwischen FACS/Tetracyclin und FISH/DAPI Nach der Etablierung der polyphosphatspezifischen Tetracyclin-Färbung wurde mit Hilfe der Durchflusszytometrie in allen Belebtschlämmen die Tetracyclin-positiven (TC positiven) Zellen quantifiziert. In Abbildung 4 sind die mittels FACS ermittelten PAO-Abundanzen den Ergebnissen der FISH/DAPI-Analyse gegenübergestellt. Wie deutlich zu erkennen ist, ergeben sich aufgrund der unterschiedlichen Methoden deutliche Unterschiede in der Abundanz der PAOs in den verschiedenen Kläranlagen. Zudem erstaunt die hohe PAO-Abundanz, die mittels FACS im Belebtschlamm der Kläranlage Augustusburg nachgewiesen wurde. Dieser Belebtschlamm zeigte in den Batchversuchen keine P-Freisetzung. Auf der Grundlage, dass bei der Durchflusszytometrie eine deutlich höhere Zellzahl ausgewertet wird, stellt dieses Verfahren statistisch gesehen, die bessere Methode dar. Jedoch muss hier erwähnt werden, dass vor der Analyse mittels cell sorting die Proben nach der Homogenisierung mittels Ultraschall filtriert werden müssen, um ein Verstopfen der Mess-Kapillare zu verhindern. Hierdurch kann eine Selektion von Bakterien aus bestimmten Flockenarealen des Belebtschlamms nicht ausgeschlossen werden. Abbildung 4: Abundanz der PAOs basierend auf der TC-Färbung und einer anschließenden Flow-Auswertung bzw. einer DAPI-Färbung mit anschließender mikroskopischer Zählung. Leider lassen sich auf Basis der bisher ermittelten flow cytometrischen Ergebnisse keine Korrelation bzw. Tendenzen zwischen den verwendeten Methoden ermitteln, so dass eine zusätzlich Bestätigung der Spezifität der TC und der DAPI Färbung erfolgen sollte. Beide Verfahren haben aber die methodische Einschränkung, dass eine Quantifizierung der zellulären Polyphosphateinlagerung nicht möglich ist, d.h. eine Phosphatfreisetzung auf Basis eines partiellen Abbaus der zellulären Polyphosphateinlagerung ist mit beiden Verfahren nicht messbar. Zudem zeigt die hohe Abundanz der TC positiven Bakterien im Belebtschlamm der Kläranlage Augustusburg, dass das Vorhandensein von Polyphosphatgranula kein Hinweis auf eine etablierte biologische Phosphatsakkumulation ist

16 A-3b Phylogenetische Zuordnung der Bakterien mit eingelagerten Polyphosphaten mit Hilfe von FISH und DAPI In einem weiteren Versuch wurde versucht, die DAPI-positiven Zellen auf Basis der FISH einzelnen phylogenetischen Gruppen zuzuordnen (Abbildung 5). Auf Basis der Ergebnisse wird die hohe phylogenetischen Diversität der Bakterien mit eingelagerten Polyphosphaten deutlich. Es konnten in allen untersuchten phylogenetischen Gruppen Zellen mit eingelagerten Polyphosphat-Granula nachgewiesen werden. Dieses Ergebnis steht in Einklang mit den Ergebnissen der direkten phylogenetischen Analyse der TC-positiven Zellen. Auch hier konnte eine hohe phylogenetischen Diversität nachgewiesen werden. Zudem zeigte sich, dass es keine signifikanten Unterschiede in der phylogenetischen Zusammensetzung der PAOs zwischen den verschiedenen Kläranlagen gibt. Zudem konnte anhand des Vergleiches der Ergebnisse für die aeroben und anaeroben Proben keine Aussage über einen Abbau von Polyphosphaten bzw. einer ortho-phosphat-freisetzung durch einzelne phylogenetsiche Gruppen gemacht werden. Ein Grund hierfür ist methodisch bedingt, da mit diesem Verfahren nur eine Abnahme der DAPI-positiven Zellen, d.h. Bakterien mit eingelagerten Polyphosphaten, quantifiziert wird, aber keine Abnahme der Fluoreszenzintensität, bedingt durch einen teilweisen Abbau der Polyphosphate. 14 Anteil poly-p tragender Zellen in % EW aerob EW anaerob BL aerob BL anaerob NW aerob NW anaerob MW aerob MW anaerob FB aerob FB anaerob HN aerob HN anaerob KD aerob KD anaerob AB aerob AB anaerob Alpha Beta Gamma HGC andere Abbildung 5: In situ Charakterisierung der Polyphosphat akkumulierenden Bakterien auf Basis einer Kombination von FISH und DAPI-Färbung. [aerob: Probenentnahme am Ende der belüfteten Phase; anaerob: Probenentnahme aus der anaeroben Phase]

17 A-3c Differenzierung der Rhodocyclus related PAOs Da Vertreter der Rhodocyclus-Gruppe, speziell die Gruppe Candidatus Accumulibacter Phosphatis, in der Literatur als mögliche PAOs beschrieben werden, sollte diese in den verschiedenen Belebtschlämmen detaillierter mittels Klonierung/Sequenzierung und DGGE untersucht werden Als Primer wurden die Oligonukleotidsonden, die bei der FISH spezifisch zum Nachweis dieser Gruppe eingesetzt wurden (Kap. A-2), in Kombination mit universell 16S rdna-amplifizierenden Primern eingesetzt. Im Folgenden werden die drei verwendeten Primersysteme besprochen. Aufgrund der Spezifität der Oligonukleotidsonden besitzen diese Primersysteme unterschiedliche Erfassungsspektren. In Abbildung 6 sind die theoretischen Erfassungsspektrum auf Basis des Programmes ProbeBase ( gezeigt. Die Bio-P assoziierten Rhodocyclus-Vertreter, speziell Candidatus Accumulibacter Phosphatis, gehören hierbei zum Genus Propionivibrio. TPU1-PAO462 TPU2-PAO f-PAO846 Abbildung 6: Erfassungsspektrum der PAO-spezifischen Primer-Systeme Um das tatsächliche Erfassungsspektrum der einzelnen Primersysteme in den Belebtschlämmen zu charakterisieren, wurden in einem ersten Schritt für die verschiedenen Primersysteme Genbiblioteken erstellt. Als DNA-Template wurde isolierte DNA der verschiedenen Belebtschlämme eingesetzt. Um die Diversität der einzelnen Belebtschlämme besser vergleichen zu können, wurden zusätzlich DGGE-Analysen durchgeführt. Auf Basis der Bandenmuster wurde anschließend mit Hilfe der Bionumerics-Software versucht, eine Ähnlichkeitsanalyse zwischen den verschiedenen KAs durchzuführen. Für eine Identifizierung der dominanten Mikroorganismen wurden zudem einzelne Banden aus dem Gel ausgeschnitten und sequenziert. Primersystem TPU1-PAO462 Dieses Primersystem besitzt im Vergleich zu den anderen verwendeten Systemen das kleinste Erfassunsgspektrum (Quelle: ProbeBase) und ist am spezifischsten für den die Gruppe Candidatus Accumulibacter phosphatis. Insgesamt werden demnach nur 53 Sequenzen aus der Datenbank mit der Oligonukleotidsonde PAO462 erfasst. In einem ersten Ansatz wurde das Erfassungsspektrum des Primersystem auf Basis der erstellten Genbibliothek untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die Spezifität des TPU1/PAO462-Primersystems nicht so hoch ist, wie man auf Grundlage der ProbeBase-Datenbank vermuten konnte. So wurden Sequenzen von Vertretern weiterer Genera

18 innerhalb der Rhodocyclales, wie z.b. Azospira spec. und Dechloromonas spec., in der Genbibliothek nachgewiesen. Der Anteil der Sequenzen, die eine große Ähnlichkeit zum Candidatus Accumulibacter phosphatis haben, war relativ gering. In Abbildung 8 wurden die Sequenzen aus den Genbibliotheken in einem phylogenetischen Stammbaum mit verschiedenen Referenzsequenzen (roter Rahmen) dargestellt. Zusätzlich sind die Sequenzen, die aus dem DGGE-Gel ausgeschnitten und reamplifiziert wurden, hinzugefügt worden. Um eine schnellere Zuordnung zu ermöglichen, wurden diese mit unterschiedlichen Rahmen markiert. Die Sequenzen der KAs verteilen sich gleichmäßig über den phylogenetischen Baum. Zum Teil kann eine Clusterbildung, d.h. viele ähnliche Sequenzen einer KA, für die KA Niederwiesa und Bad Liebenwerda nachgewiesen werden, aber eine Differenzierung der nachgewiesenen Sequenzen aufgrund der Verfahren der Phosphatelimination auf den KAs kann anhand dieser Daten nicht gezeigt werden. Des Weiteren wurde das Primer-System für die Differenzierung der verschiedenen Belebtschlämme mit Hilfe der DGGE eingesetzt. Bei diesem System findet eine Trennung der PCR-Produkte auf Basis einer elektrischen Spannung und eines denaturierenden Gradienten statt. Im Gegensatz zu einer einfachen eletrophoretischen DNA-Analyse spielt bei diesem Verfahren die Zusammensetzung der Nukleotide eine entschiedenen Rolle bei der Auftrennung der PCR-Produkte im Gel. Ziel war es, Unterschiede im Bandenmuster der einzelnen Kläranlagen nachzuweisen und zudem dominante Banden (= dominante Sequenzen) zu identifizieren. Dominante Banden wurden ausgeschnitten (siehe Abbildung 7 reamplifiziert und sequenziert. Für einen besseren Überblick wurden diese im Stammbaum(Abbildung 8) mit einem farbigen Rahmen markiert D_NW_1 D_NW_2 D_NW_4 D_NW_5 D_HA_9 DGGE_8 DGGE_7 D_MW_2 D_FB_7 D_MW_3 D_MW_5 D_FB_6 DGGE_10 D_BL_8 D_MW_6 DGGE_28 Abbildung 7: DGGE-Analyse der Belebtschlämme mit dem Primersystem TPU1/PAO462 und Vergleich der Bandenmuster mit Hilfe der Bionumerics-Software.(1: Augustusburg; 2: Niederwiesa; 3: Frankenberg; 4:Hainichen; 5: Mittweida; 6: Bad Liebenwerda; 7: Elsterwerda) Wie in Abbildung 7 zu erkennen ist, konnten anhand der Bandenmuster deutliche Unterschiede zwischen den Kläranlagen aufgezeigt werden. Die Laufspuren der Proben aus den Kläranlagen Niederwiesa, Frankenberg und Mittweida zeigten dabei die meisten Banden, d.h. die höchste Diversität bezogen auf die Bandenanzahl. Ein Bezug zwischen der Diversität und dem EBPR-Potential (siehe Kapitel C1) konnte nicht gezeigt werden. Um einen direkten Zusammenhang zwischen Phosphatspeicherung und DGGE.Muster untersuchen zu können, wurde die DGGE-Methode in weiterführenden Versuchen in Kombination mit der flow cytometry genutzt

19 Dechloromonas Rhodocyclus Rhodocyclus Dechloromonas Abbildung 8: Phylogenetische Zuordnung der Sequenzen, die mit dem Primer-System TPU1-PAO462 amplifiziert wurden. Referenzsequenzen sind mit einem roten Rahmen gekennzeichnet. Sequenzen, die aus dem DGGE-Gel ausgeschnitten wurden, sind mit farbigen Rahmen gekennzeichnet [violett: Bad Liebenwerda; grün Hainichen; blau: Mittweida grau: Niederwiesa]

20 Primersystem TPU2-PAO651 Dieses Primersystem besitzt mit 86 Datenbankeinträgen aus der Gruppe der Rhodocyclales und 92 Datenbankeinträgen aus der Gruppe der β-proteobakterien ein deutlich breiteres Erfassungsspektrum als das Primersystem TPU1/PAO462. Dies ist auch am phylogenetischen Stammbaum zu erkennen, in dem die Sequenzen der verschiedenen Genbibliotheken und der DGGE zusammengefasst wurden. Es zeigt sich im Vergleich zum Primersystem TPU1/PAO462 eine deutlich heterogenere Clusterung der Sequenzen, die auf eine geringe phylogenetische Ähnlichkeit hindeutet. Auch anhand der Daten aus den durchgeführten DGGE-Analysen ist das größere Erfassungsspektrum zu erkennen, da deutlich mehr Banden auftreten. Die größere Diversität lässt sich zudem an dem stärkeren Hintergrund ableiten. Trotz der höheren Bandendiversität besitzen alle Kläranlagen ihr spezifisches Bandenmuster. Vergleichbar zum Primersystem TPU1/PAO462 zeigte das Spektrum der Kläranlagen Niederwiesa, Frankenberg und Mittweida die größte Anzahl an dominanten Banden. Ein direkter Bezug zwischen DGGE-Muster und EBPR-Potential konnte jedoch nicht nachgewiesen werden D_NW4 DGGE_1 D_EW_11 D_AB_1 DGGE_4 D_FB_5 D_AB_3 D_FB_6 D_MW_8 D_MW_9 D_EW_12 D_EW-13 D_EW_14 D_EW-15 D_MW_10 Abbildung 9: DGGE-Analyse der Belebtschlämme mit dem Primersystem TPU1/PAO651 und Vergleich der Bandenmuster mit Hilfe der Bionumerics-Software (1:Augustusburg; 2: Niederwiesa; 3: Frankenberg; 4: Hainichen; 5: Mittweida; 6: Bad Liebenwerda; 7: Elsterwerda)

21 Rubrivax spec. Rhodocyclus spec. Rhodocyclus spec. Abbildung 10: Pylogenetische Zuordnung der Sequenzen, die mit dem Primer-System TPU2-PAO651 amplifiziert wurden. Referenzsequenzen sind mit einem roten Rahmen gekennzeichnet. Sequenzen, die aus dem DGGE-Gel ausgeschnitten wurden, sind mit farbigen Rahmen gekennzeichnet [blau: Mittweida; rosa: Elsterwerda; Türkis: Frankenberg]