Nutzung von Bioinformatik - Sequenzanalyse. in molekularer Ökologie und Systematik Dirk Krüger

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1 Nutzung von Bioinformatik - Sequenzanalyse in molekularer Ökologie und Systematik Dirk Krüger

2 1. Rohdaten

3 nach Sanger vs. next generation pyrosequencing Bei der Sanger-Sequenzierung oder Kettenabbruchsmethode werden modifizierte Nuleotide verwendet, um die polymerasekatalysierte Kettenverlängerung gezielt abzubrechen. Die DNA-Fragmente werden dann in einer Kapillare separiert und die Sequenz wird an Hand der vier verschiedenen, basenspezifischen Farbstoffe identifiziert. Die GS (454/Roche) Technik basiert auf der Pyrosequencing-Methode. Die Sequenz wird dabei in Zyklen generiert. In jedem Zyklus wird nur ein spezifisches Nukleotid angeboten. Wird ein Nukleotid eingebaut, so wird ein Lichtblitz von einer Digitalkamera registriert. Cycle-Sequencing ist eine Modifikation der traditionellen Sanger-Sequenziermethode. Die Komponenten sind DNA, Primer, hitzebeständige DNA-Polymerase, 4 dntp s, 4 ddntp s (dideoxy Terminatoren in bestimmtem Konzentrationsverhältnis) jeweils fluoreszenzmarkiert mit vier verschiedenen Farbstoffen und Puffer mit Mg++ und K+ Ionen. Der einzelne Primer bindet an den komplementären DNA-Strang und wird in linearer Form verlängert. Diese Verlängerung wird so lange fortgeführt, bis sich zufälligerweise und abhängig von der komplementären Base ein bestimmtes ddntp bindet. Durch die Dideoxy-Beschaffenheit kann die Polymerase keine weitere Base mehr an dieses Fragment hinzufügen und die Verlängerung bricht ab. Auf diese Weise erhält man am Ende einer definierten Anzahl von Zyklen eine Vielzahl an Fragmenten mit unterschiedlichen Längen und mit farbstoffmarkierten Enden. Nach der Aufreinigung der Sequenzierreaktion werden die Proben elektrokinetisch in die Kapillaren des 96-Kapillar Sequenzierers injiziert und die Sequenz wird an Hand der vier verschiedenen, basenspezifischen Farbstoffe identifiziert. Elektropherogramme stellen dies dar.

4 ABI 3730xl 96 Capillary DNA Sequencer Bei der Sequencing-PCR (immer nur 1 Primer) kommt es zum zufälligen Abbruch der Elongation wegen modifizierter und fluorescenter Nukleotide, so daß alle Fragmentlängen entstehen und aufgetrennt werden können. Fluorescenz An electropherogram (trace file) is a plot of fluorescence units over time. Zeit (wenn Laser Fragment erfaßt) entspricht Fragmentlänge

5 Mögliche Ursachen, warum die Sequenz nicht sauber aussieht.

6 Typische zu behebende Fehler (entweder durch Editieren/Ausschluss von Daten, oder Wiederholung von Laborarbeiten) Dye Blob (of T, typisch bei Reinigung Primerbereich ist meist nicht lesbar, mit Alkohol) am Anfang ist die Maschine noch nicht kalibriert egal weil Primersequenz vom Experimentator vorgegeben ist und daher nicht berücksichtigt werden sollte EtOH- oder Kochsalzkontamination

7 Optimale Sequenz Typische zu behebende Fehler Schon mehr Rauschen wirkliches Signal zunehmend schwächer Typischer unterschiedlicher Abstand, oft G/A Abfolge, G oft auch kleiner (Dropouts) Hier fehlerhaft als N interpretiert Heterozygot ( SNP ) oder PCR-Fehler

8 Gegen Ende hin werden Peaks schwächer, und Mehrfachinstanzen gleicher Peaks verschmelzen aber werden noch erkannt Hier werden Peaks schon nicht mehr gut erkannt, potentiell nicht mehr nutzbar Gemischtes Template oder Slippage der Polymerase (letzteres oft wenn es wie ein Echo - versetzt - aussieht) Plötzlicher Abfall - evtl. Sekundärstruktureffekt im Template

9 Typische zu behebende Fehler Signal/Noise Ratio extrem niedrig: komplette Nicht-Elongation des Sequenzprimers oder Verlust beim Reinigen (Noise kommt z.b. von vorherigen Sequenzierungen, Reste in Kapillare) Overload: zu viel Fluorescenz bei kurzen Fragmenten wird gar nicht erfaßt Spike: Luftblase in Kapillare, wenn niedriger auch Kompression wegen Sekundärstruktur Zu viel Template, nicht mehr genug Primer am Ende der Sequenzreaktion

10 Ergo: wir müssen Elektropherogram visuell inspizieren / reinigen und die korrigierte / brauchbare Sequenz exportieren Dazu benötigen wir Kenntnis des IUPAC Nucleotide Codes für die Ambiguitäten:

11 Erste Schritte zum Sequence Editing (hier am Beispiel Ridom TraceEdit). Eine Gruppe macht dies mit der kommerziellen Software Sequencher.

12 1. Ridom TraceEdit öffnen. 2. AB1 Elektropherogramme anwählen und ins Programm ziehen 3. Autotrimm Präferenzen ändern

13 4. Edit> Cut by Autotrimm 5. Manuelles Editieren Gerade bearbeitete Sequenz erscheint blau. Klick auf eine zu editierende Base. Tippe eine andere Base drauf. Einfügen von Basen: mit rechter Maustaste auf einen Punkt klicken und vom Menü auswählen. Ganz ähnlich mit rechter Maustaste: trim left oder trim right sowie Entfernen von Basen.

14 6. File> Export in den gleichen Ordner Nenne die Datei als.fas für FASTA Das FASTA-Format oder Pearson-Format (für fast-all) ist ein einfaches textbasiertes Format zur Darstellung und Speicherung der Primärstruktur von Nukleinsäuren (Nukleinsäuresequenz) und Proteinen (Proteinsequenz) in der Bioinformatik. Kennung erfolgt durch das Symbol >, gefolgt vom Titel, Zeilenumbruch und dann die Sequenz. Mehrere Sequenzen, mit oder ohne indels (Symbol -) können in einer FASTA-Datei sein. Geöffnet in einem Texteditor sieht eine Sequenz dann so aus: Achtung: Titelzeilen von Sequenzen sollten letzlich keine Leer- oder Sonderzeichen enthalten nur Underscore _

15 2. Erstellen einer Datenbank und Hinzufügen von ähnlichen Daten aus GenBank

16 Wir bauen unsere Datenbank auf in dem multifunktionalen Programmpaket BioEdit.

17 1. BioEdit öffnen und Symbol für neue Datei klicken. 2. File> Import> Sequence Alignment File es werden alle unsere einzelnen voreditierten FASTA-Dateien importiert. Dann abspeichern unter Sequenzen-voreditiert.fas.

18 Abschneiden von Klonierungsvektorsequenz und evtl. Primersequenz: Erstmal finden! Reverse-Complement kann man hier auch gut machen Original Primer Sequenzen (5-3 ) alles nur Beispiele ITS5: GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG (reverse-compl.: CCTTGTTACGACTTTTACTTCC) ITS4: TCCTCCGCTTATTGATATGC (reverse-compl.: GCATATCAATAAGCGGAGGA) * = Vector Insert Site (5-3 ) CGAATTCGCCCTT*AAGGGCGAATTCGCGGC Die Sequenz befindet sich hier in einem TOPO-TA-PCR Cloning Vector von Invitrogen. In unserem Beispiel-Elektropherogram suchen wir also Übergang Vektor zu Primer: CGAATTCGCCCTT - GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG oder TCCTCCGCTTATTGATAT Ende Vector Anfang Insert (Sequencher macht es auch automatisch) Vector und Primer abschneiden

19 BLAST BLAST (Abk. für engl. Basic Local Alignment Search Tool) ist der Überbegriff für eine Gruppe der weltweit am meisten genutzten Programme zur Analyse biologischer Sequenzdaten. BLAST wird dazu verwendet, experimentell ermittelte Nukleotid- oder Aminosäure-Sequenzen mit bereits in einer Datenbank vorhandenen Sequenzen zu vergleichen. Als Ergebnis liefert das Programm eine Reihe lokaler Alignments, d.h. Gegenüberstellungen von Stücken der gesuchten Sequenz mit ähnlichen Stücken aus der Datenbank. Darüber hinaus gibt BLAST an, wie signifikant die gefundenen Treffer sind. BLASTn = NCBI-BLAST Nukleotide gegen die nichtredundante Nukleinsäuredatenbank, z.b. von NCBI-GenBank, EMBL oder eigene. 3. In BioEdit Sequenzitel anwählen und dann Edit> Copy Sequence to Clipboard (FASTA format) 4. In Nucleotide BLAST auswählen 5. Sequenzen einfügen 6. Parameter auswählen, Fun bei Organismen eintippen, wählen

20 BLAST Ergebnisse Liste der Query-Sequenzen bester hit: Expect e-value niedrig graphisch (= Wahrscheinlichkeit eines besseren Hits) tabellarisch bester hit Alle Werte sollten möglichst hoch sein, hängt auch davon ab welche Sequenzlängen in der Datenbank vorliegen.

21 BLAST Ergebnisse Einzelnes Alignment (was dies ist, später). Achtung: die Sequenz in GenBank ist hier in anderer Orientierung. Später diese Info nutzen! Und was machen wir jetzt alles mit den BLAST-Ergebnissen?

22 Einfügen von Fremdsequenzen in BioEdit: 1. Einzelsequenz aus Liste im BLAST-Ergebnis anklicken. GenBank-Format Accession-Nummer zur eindeutigen Identifizierung der Sequenz Artname mit systematischer Stellung Autor der Sequenz (mit Adresse) und ggf. zugehörige Publikation Herkunft der sequenzierten DNA: möglichst Kulturen/Herbarbelege wählen Informationen zum sequenzierten DNA-Abschnitt 2. Auswählen und kopieren vom Wort LOCUS bis zu //. 3. In BioEdit: File> Import from Clipboard. Hinterlegte Sequenz

23 Umdrehen von Sequenzen, die gegenläufig zu GenBank sind: Sequenzen anwählen, dann Sequence> Nucleic Acid> Reverse Complement Dann die Datei mit eingefügten und den umgedrehten Sequenzen speichern und BioEdit schliessen. Nun in einem Texteditor wie EditPad Lite oder Notepad öffnen.

24 1. Alle Leerzeichen mit Underscore _ ersetzen. 2. Alle anderen Sonderzeichen und überflüssiges in Titeln entfernen. Auch evtl. Indel-Sonderzeichen wie und : aus Sequenzen tilgen. 3. Nach den BLAST Ergebnissen und Herkunft der Sequenzen zusätzlich Infos in die FASTA-Sequenztitel einbauen z.b. ersetzen von _Glomus_sp_ mit _Glomus_Glomales_Birkenwurzel_ 4. Datei speichern.

25 3. Alignment

26 Alignment = tabellarische Ordnung der homolog angesehenen Charaktere (also hier Nukleotide), Basis für Phylogenie und Phylotyp-Definition

27 über Webserver wie z.b. bei EMBL (europäische GenBank-Kopie ) verlangt andere Algorithmen output FASTA unsere Sequenzen

28 1. Wir öffnen hier lieber das Programm SeaView. 2. File> Open FASTA und damit unsere Sequenzen-voreditiert.fas öffnen. 3. Align> MUSCLE und dann Align> Align all (Statusfenster öffnet sich)

29 ein Beispiel-Alignment offen in BioEdit variabler Bereich konservierter Bereich 4. Abspeichern (z.b. via Copy/Paste) der Ergebnisse als Sequenzengrobalignment.fas, und dann in BioEdit und/oder in einem Texteditor - Ungenauigkeiten manuell beheben - schlecht alignbare (zu variable)teile entfernen - zu kurze Sequenzen evtl. entfernen - überflüssige Indels (-) entfernen - zu lange Überhänge entfernen 5. Abspeichern unter Sequenzen-analysealignment.fas. Überhang

30 4. Einfache Phylogenetik

31 Phylogenetik Darwin sequenzierte Genome Haeckel W. Hennig

32 Phylogenetik Monophyletisches Clade Wissenschaft von der Stammesgeschichte und evolutionärer Verwandtschaft (Phylogenese) Stammbaum (Phylogramm oder Dendrogramm) Graphentheorie: minimum spanning tree Verknüpfung von Tip-Punkten (hier Taxa, Clone etc.) über kürzeste Linien graphische Repräsentierung der abgeleiteten Hypothese und ihrer Wahrscheinlichkeiten qua Ähnlichkeiten, den Verwandtschaften, Ursprüngen und Ableitungen, von Einheiten (in der Systematik zumeist Taxa, bzw. Genen oder Proteinen) Node Tip Branch innerhalb einer taxonomischen Studie oder innerhalb eines ökologischen Untersuchungsgebietes.

33 Auch Netzwerke (Reticulogramme), da Gene auch heterolog übertragen werden und Individuen und Taxa sich kreuzen. Stammbäume unterscheiden sich nach Philosophie hinter der Generierung (Cladogramm in Cladistik, Phänogramm in Phänetik), ob alle möglichen Hypothesen evaluiert werden konnten oder nicht (z.b. in Maximum-Parsimonie: exhaustive oder heuristic tree space searches mit verschiedensten Methoden, UPGMA oder NJ: one alignment = one possible tree mit random tie breaks bei gleichen Distanzen, star decomposition trees) Form (2-dimensional, 3-dimensional, rechteckig, schräg, geschwungen, rund) Bedeutung der Längen der Verzweigungen (z.b. Zeit, Distanz, character changes), statistischen Bewertungen des Gesamtbaumes und der Verzweigungen, Einzelne, Konsenzbäume, Supertrees (Zusammenfassung verschiedenster Datensätze) bewurzelt (Wurzel, benachbart/basal und damit Richtung der Evolution anzeigend) oder nicht,

34 In der Phylogenetik kann man grundsätzlich unterscheiden zwischen phänetischen Methoden (Distanz-basierend Maß der Unähnlichkeit) z.b. mit Neighbor-Joining Algorithmus (sich ähnlichste zusammenfassend), Optimalitätskriterum: Balanced Minimum-Evolution (Summe der Distanzen im Baum klein) und cladistischen Methoden (Charakter-Unterschied-basierend) mit den Optimalitätskriterien: Maximum-Parsimonie (Summe der Änderungen im Baum klein), Maximum-Likelihood (Summe der Wahrscheinlichkeiten im Baum hoch), u.v.a.). Zudem werden die Verzweigungen des Stammbaumes statistisch evaluiert mit verschiedensten Wahrscheinlichkeiten, z.b. frequentistische (Bootstrap, Jackknife) oder Bayesian Posterior Probabilities aufbauend auf Maximum-Likelihood (Konsens aus einer zufälligen Auswahl bester Lösungen nach der Optimierung der Wahrscheinlichkeiten der Baumtopologie).

35 Bootstrap = Daten werden resampled, und jeder neue Datensatz wird separat analysiert, und die Verzweigungen im phylogenetischen Baum in einer Prozentzahl angezeigt. z.b. Bootstrap Support 76 = in ca. 760 der Phylogramme von 1000 Bootstrap-Pseudoreplikaten kommt diese Verzweigung vor. Signifikant ist z.b. > 95. Man kann auch einen Konsensbaum machen, dort kollabiert z.b. alles unter 50% (majority rule consensus).

36 Neighbor-Joining (NJ): die genetische Distanz wird benutzt. Die einander die nächstliegende Distanz habenden Sequenzen werden in einem Zweig zusammengefaßt und so Stück für Stück der Baum aufgebaut. 1 Alignment = 1 Baum keine Optimierung. 1. Öffnen der letzten Datei Sequenzen-analysealignment.fas in SeaView. 2. Starten einer einfachen phylogenetischen Analyse mit dem Algorithmus BioNJ und 100 Bootstrap- Pseudoreplikaten.

37 3. Sich öffnendes Baumfenster speichern als Sequenzen-analysealignment-BioNJ-K2P-100boot.tre Bootstrap Support So sieht im Newick-Format die den Baum beschreibende.tre Textdatei aus: (((VonGenBank_Glomus_79: ,SEG_Glomus_Weide: )79: ,VonGenBank_Glomus _122: )83: ,(VonGenBank_Ultraglomus_XXXX40: ,SEG_Ultraglomus_Weide2: )100: ,(VonGenBank_Ultraglomus_XXXX22: ,(SEG_Ultraglomus_Wiese: , SEG_Glomus_Weide2: )68: )100: );

38 4. Sequenzen-analysealignment-BioNJ-K2P-100boot.tre im Programm FigTree öffnen. 5. Farbiges Markieren nach Suchbegriffen im Sequenztitel. (Befehl Colour) In anderen Darstellungen kann man auch Blöcke mit Highlight markieren. 6. Screenshot als Graphikdatei (z.b..tif) für Editieren und Publizieren speichern.

39 4. Rarefaction

40 Phylotypbegrenzung und Rarefactionanalyse Biodiversität anhand molekularbiologisch begrenzter Phylotypen (Operational Taxonomic Units, OTUs) OTU Identität muß nicht identisch mit biologischer Art sein. Oft wissen wir nur Namen anhand BLAST-Ähnlichkeiten. Wird berechnet basierend auf einer wie auch immer berechneten Distanz, und einer festgelegten Cutoff-Grenze. Diese sollte sich unterscheiden je nach Sequenzabschnitt und Gruppe. Bei recht diverser ITS meist 97%. Man kann Anzahl und Diversität zwischen Plots, Proben vergleichen. Rarefaction dient zusätzlich dazu, zu entscheiden ob weiter beprobt werden muß. Die Anzahl der Singletons, also sehr selten und eher zufällig getroffenen OTUs spielt auch eine Rolle dabei, ob und mit welchem Primer weiter gearbeitet werden sollte.

41 gewünschte Ergebnisse hier aligned FASTA einfügen Kein Trimmen, kein neues Alignen 97% cutoff ohne Indels (wie auch bei SeaView BioNJ Phylogenie)

42 Phylotypbegrenzung und Rarefactionanalyse Zusammensetzung der Phylotypen einer Klondatenbank nach BLAST-bestimmten taxonomischen Zuordnungen.

43 Phylotypbegrenzung und Rarefactionanalyse Vergleich der Diversität zweier Proben Wald2 ist bereits auf Plateau (mehr sequenzieren fügt nicht viele neue Phylotypen hinzu): Number of phylotypes at 97% cutoff singletons Rarefaction (FastGroupII) Wald1 Wald ,92 1,86 3 2,77 2,61 4 3,56 3,26 5 4,3 3,83 6 4,99 4,33 7 5,64 4,78 8 6,26 5,18 9 6,85 5, ,4 5, ,94 6, ,45 6, ,95 6, ,42 6, ,89 7, ,33 7, ,77 7, ,19 7, ,61 7, ,01 8, ,4 8, ,79 8, ,17 8, ,54 8, ,91 8, ,27 8, ,62 9, ,97 9, ,31 9, ,65 9, ,98 9, ,31 9, ,64 9, ,96 9, ,28 9, ,59 10, ,91 10, ,21 10, ,52 10, ,82 10, ,12 10, ,42 10, ,71 10, ,88 Wald1 Wald Sampled clones

44 5. Fingerprint mit automatisierten Fragmentanalysen

45 Beispiele: LH-PCR, (A)RISA, (T-)RFLP, RAPD, DGGE, TGGE, CGGE, SSCP, ARDRA, AFLP Nukleinsäure-Fingerprints (Fragmentanalyse) Es ist zu teuer, alles zu sequenzieren. Die Präsenz spezifischer Gruppen, Unterschiede und die Diversität können auch mit Hochdurchsatzmethoden wie Microarray (rdna- Phylochips), real-time PCR oder mit Fingerprints beobachtet werden. Für das Design der Methoden (z.b. Primer- und Sondendesign) und zur Kenntnis der detektierten Gruppen sind zunächst Sequenzen wichtig. Fingerprints via Fragmentanalyse sind sehr verschiedenartig. Sie können automatisiert auf Kapillarsequenzierern oder auf Elektrophoresegelen laufen. Die Herstellung, Markierung und Detektion der Fragmente geschieht auf verschiedenste Weisen. Trennung der Fragmente basiert auf unterschiedlicher Länge, Sekundärstruktur/Tertiärstruktur, Primärsequenz und damit Gewicht und Ladung.

46 Fingerprint auf einem Gel T-RFLP Prinzip Fingerprint-Elektropherogram (Wikipedia)

47 Nukleinsäure-Fingerprints (Fragmentanalyse) Die Fragmentlängen der T-RFLP/RFLP lassen sich vorhersagen anhand bekannter Sequenzen. Dazu gibt es Desktop (z.b. FastPCR)- und Webserver- Softwareapplikation (TACG4, WatCut, NEBcutter, WebCutter).

48 Nukleinsäure-Fingerprints (Fragmentanalyse) == Pseudo-Gel Map of Digestions: *Maximum* Hits: 3 # frags AccI 2 2 ArsI 2 2 ArsI 2 2 BanI BarI 2 2 BarI 2 2 BbvI 2 2 BseMII BsgI 2 2 BspCNI 2 2 BstXI 2 2 BstYI BtgI 2 2 DraI 2 2 MboII 2 2 MspA1I PshAI 2 2 SacII 2 2 TaqII 2 2 TspGWI AlwI 2 3 BsrI 2 3 HphI 2 3 HpyAV MslI 2 3 BccI TspDTI 2 4

49 Danke!!!