Qualitätssicherung im medizinischen Laboratorium am Beispiel der Hepatitis B Grundlage für eine erfolgreiche Impfung, Therapie und Prävention

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1 Zweites Symposium des Instand und der DGQML, Berlin 17. Juni 2005 Qualitätssicherung im medizinischen Laboratorium Qualitätssicherung im medizinischen Laboratorium am Beispiel der Hepatitis B Grundlage für eine erfolgreiche Impfung, Therapie und Prävention Wolfram H. Gerlich Institut für Medizinische Virologie Universitätsklinikum Gießen Nationales Konsiliarlabor für Hepatitis B und D

2 Qualitätskriterium: Klare Fragestellung Screening ohne Erkrankung Blutspende Einstellungsuntersuchung Infektionsrisiko, Umgebungsuntersuchung Immunstatus, vor und nach Impfung Erkrankung, bzw bekannte Infektion Akut Chronisch Verdacht Asymptomatisch Infektiösität Möglichkeit der Reaktivierung

3 Pathogene Wirkungen von Viren: Zytopathogenität Bei Hepatitisviren meist gering ausgeprägt Immunpathogenese Bei Hepatitisviren vorherrschend Onkogenese Bei chronischer Hepatitis häufig

4 Verlaufsformen der Hepatitis-Virus-Infektionen Immunabwehr Starke Vermehrung Geringe Vermehrung Immuntoleranz Immunabwehr Inapparent Inapparent akut fulminant Immunität Chronischer Verlauf Leberzirrhose Ausheilung Leberkrebs Tod

5 Verlaufsformen der Hepatitis-Virus-Infektionen Immunabwehr Starke Vermehrung Geringe Vermehrung Immuntoleranz Immunabwehr Inapparent Inapparent akut fulminant Immunität Chronischer Verlauf Leberzirrhose Ausheilung Leberkrebs Tod

6 Verlaufsformen der Hepatitis-Virus-Infektionen Immunabwehr Starke Vermehrung Geringe Vermehrung Immuntoleranz Immunabwehr Inapparent Inapparent akut fulminant Immunität Chronischer Verlauf Ausheilung Leberzirrhose Leberkrebs Tod

7 Klinischer Verlauf der Hepatitis B Infektion Akute Hepatitis Persistierende Infektion asymptomatisch Fulminante Hepatitis Tod Asymptomatische Träger Chronische Hepatitis Chronische Aktive Hepatitis Heilung Leberkrebs Zirrhose

8 Hepatitis B Virus David S. Dane 1970

9

10

11 Serologische Marker der HBV-Infektion HBsAg Hepatitis B surface Antigen aktive Infektion Anti-HBs Antikörper gegen HBsAg Immunität HBcAg Hepatitis B core Antigen in der Leber Anti-HBc Antikörper gegen HBcAg infiziert od. immun HBeAg Nichtstrukturprotein Immunmodulator Anti-HBe Antikörper gegen HBeAg Immunabwehr

12 HBV DNA PCR disease

13 disease HBsAg

14 HBV DNA PCR Krankheit HBsAg Anti-HBs Low level persistance

15 HBV DNA PCR disease Anti-HBc HBsAg Anti-HBs Low level persistance

16 Zwei Phasen der chronischen HBV-Infektion HBeAg positiv Notabene: HBeAg ist Schwache T-Zell-Antwort kein Infektiositätsmarker Immuntoleranz Keine Selektion von Mutationen Moderate Pathogenese HBeAg negativ Verstärkte Immunabwehr Selektion von T- und B-Zell-Escape-Mutanten Vorliegen von stärker replizierenden Varianten Variable Pathogenität und Virämie Niedrig bei (fast) gesundem HBsAg-Träger Hoch bei chronischer Hepatitis B Gehäuft bei fulminanter Hepatitis B

17 Nosocomial transmission of fatal hepatitis B Two patients die in one county of fulminant hepatitis B within one month Notification to public health office Both patients were operated 3 months earlier at the same day in the same hospital A known HBV carrier with 2x10 8 ge/ml was operated just before them All threehavethesamerare HBeAg-negative HBV variant of genotype D HBeAg-negative variants are highly pathogenic Communicated by Dr. Hoelscher, Hildesheim

18 Fragestellung Screening ohne Erkrankung Blutspende Einstellungsuntersuchung Infektionsrisiko Immunstatus Vor Impfung Nach Impfung Erkrankung Akut Chronisch Verdacht Asymptomatisch Infektiösität Möglichkeit der Reaktivierung Suchtest HBsAg, anti-hbc HBsAg, anti-hbc HBsAg, anti-hbc anti-hbc anti-hbs quant. HBsAg, IgM ahbc quant. HBsAg, anti-hbc HBsAg, anti-hbc HBsAg, anti-hbc HBV DNA quant. anti-hbc, anti-hbs

19 These 1 Anti-HBc ist ein ausreichender, universeller Marker früherer und bestehender HBV- Infektionen

20 Nosokomiale HBV-Übertragung Giessen 1983 bis Patienten der onkologischen Station der Kinderklinik werden unter Chemotherapie ausgehend von einem unerkannten Träger unter den Patienten aus Lybien mit HBV infiziert Fast alle werden immuntolerante chronische HBV- Träger mit HBeAg, HBV DNA ca 10 9 ge/ml 12 bleiben Anti-HBc negativ Alle blieben klinisch inapparent Fast normale Histologie Akute Hepatitis B bei Angehörigen und Pflegepersonal Habil. Diss. Reinald Repp

21 HBV outbreak in a home for senior citizens Dreesmann, Baillot, Hamschmidt, Monazahian, Gerlich, in revision Several cases of acute hepatitis B within one month Public health office starts investigation 20 patients of ca 300 HBV infected, HBsAg positive 17 recently infected 3 in incubation phase, anti-hbc negative 14 in acute phase, anti-hbc IgM positive 3 HBV carriers, anti-hbc pos., IgM anti-hbc neg. One highly viremic, 10 9 ge/ml, HBeAg pos. Same sequence as the acute patients The other two were low viremic, different sequence Transmission through inadequate capillary blood taking by one nurse. Too much diagnostic?

22 A vaccinated anti-hbs positive thrombapheresis donor a seroconverts to anti-hbc: viremia? Date vaccination Anti-HBc b Anti-HBc c Anti-HBs PCR 1 PCR 2 d PCR 3 e +/ > (+) /- ++ +/ / (+) / (+) /- - a) Donor was always HBsAg negative (AxSym) b) AxSym (Abbott) c) Enzygnost (Dade Behring ) d) Detection limit >50 ge/ml e) with ultracentrifugation > 3 ge/ml

23 Seroconversion of anti-hbc in an anti-hbs positive, HBsAg-vaccinated thrombocyte donor June 2000 Anti-HBs > 1000 May 2003 HBV DNA pos S/CO 2,5 2,0 1,5 negative AxSym 1,0 Cutoff positive Enzygnost 0,5 0,0 Mrz 00 Sep 00 Mrz 01 Sep 01 Mrz 02 Sep 02 Mrz 03 Sep 03 Mar 00 Sep 00 Mar 01 Sep 01 Mar 02 Sep 02 Mar 03

24 Anti-HBc negative chronic HBV infection after reactivation in a leukemia patient Patient is anti-hbc and anti-hbs positive Needs bone marrow transplantation Under transient immune suppression Appears HBV DNA in Serum Disappears anti-hbs and anti-hbc Although immune system reconstitutes completely Patient becomes highly viremic HBV carrier HBsAg, HBeAg positive, wildtype Virus Anti-HBc remains negative Almost normal transaminases B. Gärtner et al., submitted

25 Anti-HBc negative HBV carriers 2 cases of lymphoma in remission 4 peri- or connatally infected 2, 4, 10 and 20 years old 1 adult HIV/HBV coinfected person All have The ability to produce other antiviral antibodies Normal HBc gene sequences High virusload>10 9 ge/ml No or little hepatitis HBeAg Selective immune tolerance, B cell depletion?

26 * Escape mutant Anti-HBc negative HBV infection HBV DNA HBsAg anti-hbs Incubation phase ++ ++/- - Low level infection + +/- -/+ Reactivation ++ ++/-* -/+* Immunotolerance

27 Comparison of two anti-hbc assays N=6000 population Both positive Divergent Both negative High risk 99.4% 0.6% 0 infected High risk not infected? 17.7% 9.1%* 73.2% Blood donors 0.2% 0.5% 99.3% * Test A 3%, test B 6% positive

28 Anti-HBc assays Specificity improved >99% Sensitivity in low level infection insufficient Divergent results in two different assays do not necessarily mean false positivity Standardisation and comparability unsatisfactory Do not communicate a single positive anti-hbc result without additional confirmation Do not rely completely on anti-hbc for screening

29 These 2 HBsAg ist der beste Marker für aktive HBV-Infektionen

30 These 3 HBsAg wird in riesigem Überschuss gegenüber den kompletten Viren gebildet

31 HBV DNA PCR disease HBsAg Anti-HBs Low level persistance

32 HBsAg-negative, HBV-infectious blood donation from early phase I 16th July 2002 HBsAg in AxSym negative, but infectious HBV DNA ca 2000 genomes/ml 17 Sept 2002 borderline HBsAg positive (AxSym +) Donor was >60 days infectious, but HBsAg negative He would have been detectable by minipool NAT Meisel et al, 2003

33 HBsAg-negative, infectious blood donation from early phase of HBV infection II 22. June Donor gets HBV-infected from an asymptomatic unrecognised HBV carrier who was operated before him 28. July Donates blood HBsAg negative, < 0.1ng/mL minipool NAT HBV DNA neg. (<250 genomes/ml) 12. Nov Acute hepatitis B (ALAT 2020 IU/L) Follow-up Recipient develops asymptomatic, chronic HBV infection Same sequence as donor: genotype D, wildtype Communicated by Dr. Scharberg, DRK BSD BW

34 Sind unsere Hepatitis-B- Impfstoffe optimal?

35 HB vaccine failure in a blood donor : HBsAg-negative, infectious blood donation from early phase of HBV infection after 2 doses of vaccine 12.5 and Two vaccinations with Twinrix (HAV and HBsAg) Donor gets HBV-infected during an operation Blood donation contains infectious HBV HBsAg negative, < 0.1ng/mL minipool NAT for HBV DNA negative Diagnosis of acute hepatitis B (ALAT 2020 IU/L)

36 Are our hepatitis B vaccines optimal? No Nonresponders up to 40% Breakthroughs Escape mutants Neglect of HBV genotypes

37 Labordiagnostik bei Hepatitis B Impfung Voruntersuchung Auf anti-hbc Bei hohem Risiko auch HBsAg Nachuntersuchung Auf anti-hbs quantitativ Quantität nur grössenordnungsmäßig wichtig Bei Negativität bzw <10 IU/L Anti-HBc und HBsAg nachholen Bei inkonsistentem Muster HBV DNA Weiterimpfen

38 Generation of HBV escape mutants HBsAg is highly variable under immune selection after post exposure immunisation during infection after vaccination with anti-hbs during reactivation in presence of anti-hbs during low-level persistent infection with anti-hbs

39 Reactivation of HBV escape mutation during immunosuppressive lymphoma therapy Patient from Lebanon 15 years ago resolved hepatitis B Before therapy: anti-hbs >1000 IU/L, HBsAg neg. Receives for four months chemotherapy (CHOP) T and B cells are suppressed Latent HBV reactivates, infects entire liver Thereafter 2 months anti-b cell mab Rituximab T cellsrecover Immune pathogenesis develops Patient develops acute hepatitis B dies inspite of Lamivudine therapy University Clinics B. Franklin, Berlin T.Westhoff et.al, Blood 102:1930

40 Reactivation of hepatitis B during immunosuppressive lymphoma therapy Patient from Lebanon with reactivated HBV 4x10 9 /ml HBV genomes, anti-hbs 880 IU/L HBeAg-negative, precore-negative variant HBsAg in AxSym highly positive in VIDAS (old version) negative PEI finds 3 further out of 6 tests which fail HBsAg sequence shows 4 escape mutations L109R, R122K, Y134S, P142L, D144A Same mutant present with 50 ge/ml in year 2000

41 HBV escape mutations in blood donor I Donor is negative in Ortho s HBsAg assay Plasma is given to a large pool for fractionation Pool turns out to be strongly positive in Abbott s HBsAg assay Look back identifies false negative HBsAg result with Ortho s assay Donor is an asymptomatic HBV carrier 24 IU/L anti-hbs and anti-hbc-igg 200 genomes /ml HBV DNA Escape mutations in S gene: L109V; M133T; D144G; W182L; T189I; I190A Look back 3 recipients not infected, 1 probably immune Communicated by Dr. Ullum, DK

42 HBV escape mutations in blood donor II Donor is negative in Abbott s HBsAg assay But positive in minipool NAT for HBV DNA 800 genomes/ml in Giessen <300 copies/ml in routine laboratory HBV genotypea2 Anti-HBs positive, 15 IU/L Anti-HBc-IgG positive Escape mutations P105L; T125M; D144E; Q181R; L216F Communicated by Abbott Lab.

43 HBsAg negative HBV variant in healthy anti-hbs-negative HBsAg carriers Screening with Ortho s HBsAg assay Clearly negative Clearly positive with Abbott s HBsAg assay 20,000 genomes HBV DNA genotype D2 Wildtype HBsAg subtype ayw2 except for mutation T143L No anti-hbs Anti-HBc-IgG positive Variant present in 2 further European donors One case published by Levicnik-Stezinar Clin Lab 2004; 50:49 Two cases from Croatia communicated by Abbott Lab.

44 Diagnostic problems caused by HBsAg mutants - a consensus report of an expert meeting Summary I HBsAg assays should reliably detect 0.1 IU/mL of all genotypes All major variants WHO plans to provide a Genotype and Variant Panel Intervirology 2004;47:310

45 Diagnostic problems caused by HBsAg mutants - a consensus report of an expert meeting II Detection of HBsAg mutants by PCR of HBV DNA and sequencing of the is suggested in samples with anti-hbconly both HBsAg and anti-hbs discordant HBsAg results in different assays HBeAgbutwithoutHBsAg Anti-HBs from immunosuppressed patients without vaccination Intervirology 2004;47:310

46 Probleme der quantitativen HBV DNA Bestimmung Ergebnis des Instand Ringversuchs unbefriedigend Verluste bei der Extraktion aus HBV wegen der kovalent gebunden DNA-Polymerase von Test zu Test verschieden Eichung erfolgt aber mit geklonter DNA Variable Umrechnungsfaktoren je nach Test von Copies oder Genome Equivalents in Internationale Einheiten (IU/ml) Daher: nur IU verwenden! Absoluteichung des WHO-Standards 1 IU = 5,4 Genome (Heermann et al 1998, 95 % K.I. 4 7)

47 Realtime PCR, z.b. im Lightcycler-System

48 Dilutions of HBV reference serum, genomes per run

49 Bewertung von eigenen quantitativen HBV DNA Messungen Titer g.e./ml Schwankungen* >10 5 < Faktor ca Faktor 3 <10 3 ca Faktor 10 * 95% Konfidenz Intervall innerhalb eines Jahres

50 Empfohlene Tätigkeitseinschränkung bei operativ tätigem HBV-positivem Personal Grenzwerte der HBV DNA 2004 BMG/DVV/GfV, gegenwärtiger Stand - Bei HBV-DNA-Werten (g.e./ml) von -> 10 5 generell einschränken individueller Kommissionsentscheid -< 10 3 keine Restriktionen - Kontrollen - zunächst alle 3 Monate -später bei <10 3 /ml einmal jährlich - Bei Therapie alle drei Monate - bis 6 Monate lang HBV DNA negativ ist

51 Therapie der chronischen Hepatitis B Interferon 3 bis 6 Monate Nur bei starker Entzündung (ALT >200) wirksam Schwere Nebenwirkungen Nicht bei fortgeschrittener Zirrhose anwendbar Nur bei ca 35% dauerhafte Heilung Erfolg Genotyp-abhängig Günstiger bei HBV Genotyp A und B Ungünstiger bei C und D Hemmstoffe der Reversen Transkriptase Zugelassen sind Lamivudin und Adefovir Müssen langfristig gegeben werden Resistenzentwicklung (Lamivudin) Manchmal primär unwirksam (Adefovir) Quantitatives Monitoring der HBV DNA unerlässlich

52 Genotyping and resistance testing of HBV infections Inhouse realtime PCR DNA extraction with proteinase K at high temperature Conservedprimerscoveringthe S protein 80 to 226 reverse transcription domaine 120 to 280 No probes, semi-quantitation with SYBR green Gel purification of amplified DNA Direct sequencing in both directions: HBV genotype (relevant for interferon therapy) Vaccine escape mutations Drug resistance (Lamivudine, Adefovir) Elucidation of infection chains Cheaper and more informative than Innolipa assays But less sensitive in presence of wildype

53 Adefovir resistant but Tenofovir sensitive HBV Variant Schildgen et al, N Engl J Med, in revision

54 Lamivudin-Therapie bei mäßig virämischem HBsAg-Träger ohne ALT-Erh. Afrikaner, Chirurg mit Langzeitstipendium, Anti-HBe neg., Genotype E

55 Vielen Dank! Dank auch an Ulrike C. Wend Und Dr. Wulf Willems

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