Elucigene TRP Gebrauchsanleitung

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1 Elucigene TRP Gebrauchsanleitung Bestellnummer: TH003B2 50 Tests Til in vitrodiagnostisk brug Hergestellt von: Elucigene Diagnostics Greenheys House Pencroft Way Manchester Science Park Manchester M15 6JJ For Sales, Customer Service and Technical Support:- T: +44 (0) F: +44 (0) E: E: Elucigene Diagnostics is the trading name of Delta Diagnostics (UK) Limited., a company registered in England and Wales, registration number TH003BYDE 001 Jul-2014 Seite 1 von 12

2 Elucigene TRP (Thromboserisiko-Panel) Verwendungszweck Traditional HGVS Nomenclature cdna name Protein name Factor V Leiden R506Q F2 NM_ :c.1601G>A Protein name p.arg534gln Factor II 20210G>A F2 AF :g21538G>A (c.-97g>a) MTHFR 677C>T MTHFR NM_ :c.665C>T p.ala222val Für den gleichzeitigen qualitativen In-vitro-Nachweis von Mutationen im Faktor V Leiden (R506Q), Prothrombin (Faktor II 20210A) und der Methylentetrahydrofolatreduktase (MTHFR C677T) in aus Vollblut (mit EDTA als Konservierungsmittel) oder Trockenblutproben extrahierter DNA. Zusammenfassung und Erläuterung Venenthrombosen verursachen in den USA geschätzte Todesfälle/Jahr und haben eine jährliche Inzidenz von 1 pro Für eine Thrombose gibt es eine ganze Reihe bekannter Risikofaktoren, so beispielsweise Operationen, Schwangerschaft, Anwendung oraler Empfängnisverhütungsmittel und längerer Bewegungsmangel (Unterschenkelthrombose oder Economy-Class-Syndrom) 2. Außerdem wird das empfindliche Gleichgewicht des Vorgangs der Blutgerinnung genetisch beeinflusst. Der biochemische Gerinnungsweg ist komplex und beinhaltet viele Faktoren, die den Vorgang entweder fördern oder hemmen, sodass die Blutgerinnung entweder defekt (Hämophilie) oder zu stark ist (Thrombophilie). Von diesen Faktoren haben sich 3 als besonders wichtig erwiesen und spielen bei den meisten Fällen von erblicher Thrombophilie eine Rolle 3,4,5. Mutationen in den Genen dieser Faktoren sind geeignete Marker für ein erhöhtes Venenthrombose-Risiko. Hierbei handelt es sich um Faktor V Leiden (R506Q), Faktor II (Prothrombin 20210A) und MTHFR (677C>T). MTHFR (Methylentetrahydrofolatreduktase) ist für die Erhaltung des Homocysteinspiegels, der Einfluss auf die Blutgerinnung hat, von zentraler Bedeutung. Faktor V Leiden ist die häufigste vererbte Form von Thrombophilie. In der Allgemeinbevölkerung in den USA und in Europa sind 3 bis 8 % in Bezug auf Faktor V Leiden heterozygot 6. Die Häufigkeit einer Homozygosität für eine Mutation im Faktor V Leiden liegt bei etwa 1 in 5000, wenngleich die Prävalenz in verschiedenen Personengruppen erheblich schwankt. Das Risiko einer venösen Thromboembolie ist sowohl von genetischen als auch von erworbenen Faktoren abhängig. Alter ist ein wichtiger Faktor, wobei das Risiko bei Personen mit einer Mutation im Faktor V Leiden in überproportionalem Maß ansteigt. Bei einer Person, die in Bezug auf eine Mutation im Faktor V Leiden heterozygot ist, ist die Wahrscheinlichkeit der Entwicklung einer venösen Thromboembolie um das 7-Fache und bei einer Faktor V Leiden-homozygoten Person um das 80-Fache (Achtzigfache) erhöht 7. Andere genetische Risikofaktoren (Prothrombin 20210A und MTHFR 677C) erhöhen das Risiko weiter, z. B. ist das Risiko bei einer Faktor V Leiden-heterozygoten Person um das 20-Fache erhöht, wenn sie außerdem 20210Aheterozygot ist 8. Bei Frauen, die orale Empfängnisverhütungsmittel anwenden, ist das Risiko einer Venenthrombose bei Vorliegen einer Heterozygosität in Bezug auf den Faktor V Leiden 30 Mal höher und bei Vorliegen einer Faktor-V-Homozygosität mehrere hundert Mal höher 9. TH003BYDE 001 Jul-2014 Seite 2 von 12

3 Tests werden hauptsächlich bei Patienten unter 50 Jahren mit Venenthrombose und bei Patienten oder Verwandten mit einer familiären Vorgeschichte einer thrombolytischen Krankheit durchgeführt. Außerdem wären Tests auch bei Verwandten von Personen mit bestätigtem Vorliegen von Faktor V Leiden sowie bei Frauen mit rekurrierenden Aborten und schwerer Präeklampsie oder Totgeburt gerechtfertigt. Die Kenntnis des Status in Bezug auf Faktor V Leiden kann die medizinische Begleitung einer Schwangerschaft oder den Vorgang der Entscheidungsfindung in Bezug auf die Anwendung oraler Empfängnisverhütungsmittel beeinflussen 10. Wenn Faktor V Leiden identifiziert worden ist, sind Tests auf die anderen Thromboserisikofaktoren wie etwa Prothrombin (Faktor II) und MTHFR sehr aufschlussreich. Der Nachweis von Mutationen im Faktor V Leiden bei Patienten mit Venenthrombose hat den Vorteil, dass asymptomatische Familienmitglieder ggf. feststellen lassen können, ob bei ihnen ebenfalls ein erhöhtes Risiko besteht. Das Ergebnis solcher Tests könnte Einfluss auf deren antithrombolytische Behandlung in Situationen haben, in denen das Risiko am größten ist, also beispielsweise bei einer Operation, einer Schwangerschaft, bei Anwendung oraler Empfängnisverhütungsmittel oder bei längerem Bewegungsmangel, z. B. bei Langstreckenflügen 11. Testprinzip Die Methode des Elucigene TRP-Tests basiert auf dem Amplification Refractory Mutation System (ARMS), einer allelspezifischen PCR-Amplifikationstechnologie, mit der Punktmutationen oder kleine Deletionen in Desoxyribonukleinsäure (DNA) nachgewiesen werden können 12. Der Test enthält zwei komplementäre Reaktionsgemische. Das erste Reaktionsgemisch amplifiziert spezifisch alle TRP-Allele, die nicht von Mutationen im Faktor V Leiden (R506Q), Faktor II (Prothrombin 20210A) und in MTHFR (677C>T) betroffen sind, d. h. den Wildtyp. Das zweite Reaktionsgemisch enthält dagegen Primer, die spezifisch nur die Mutationsallele R506Q, 20210A und 677C>T amplifizieren. Jedes Reaktionsgemisch enthält außerdem Primer zur Amplifizierung von Nicht-Faktor V Leiden-, Prothrombin- und MTHFR-DNA-Sequenzen als interne Amplifikationskontrolle des Tests zur Bestätigung einer erfolgreichen Amplifikation. Amplifizierte Produkte (Amplikons) der beiden Reaktionen werden elektrophoretisch in einem Agarosegel getrennt. Vorhandensein bzw. Nichtvorhandensein von Banden im Gel geben den Status der Allele von Faktor V Leiden (R506Q), Faktor II (Prothrombin 20210A) und MTHFR (677C>T) an. Warnhinweise und Vorsichtsmaßnahmen 1. Die in diesem Kit enthaltene DNA-Kontrolle ist menschlicher Herkunft und hat sich in unabhängigen Tests auf PCR-Basis als negativ auf Hepatitis B-Virus (HBV), Hepatitis C-Virus (HCV) und das Humane Immundefizienzvirus 1 (HIV1) erwiesen. 2. Bei der Arbeit mit Humanmaterial vorsichtig vorgehen. Alle Proben sind als potenziell infektiös zu betrachten. Keine Testmethode kann das Vorhandensein von HBV, HCV, HIV-1 oder anderen infektiösen Erregern mit absoluter Sicherheit ausschließen. 3. Die Handhabung der Proben und Testkomponenten, sowie deren Gebrauch, Lagerung und Entsorgung muss gemäß der durch nationale Richtlinien und Verordnungen definierten Verfahren für infektiöses Material erfolgen. 4. Im Einklang mit der aktuellen guten Laborpraxis sollten Labore eigene interne Qualitätskontrollproben bekannten Genotyps in jedem Assay mitführen, damit die Validität des Verfahrens beurteilt werden kann. 5. Bei Schäden an der Kitverpackung kann auch der Inhalt beschädigt sein. Das Kit nicht verwenden und den Kundendienst verständigen. TH003BYDE 001 Jul-2014 Seite 3 von 12

4 Symbole auf den Etiketten Die verwendeten Symbole auf allen Etiketten und Verpackungen entsprechen dem harmonisierten Standard ISO15223 Hersteller Anzahl der Tests Gebrauchsanweisung beachten X Unterhalb der angegebenen Temperatur lagern Nicht mehr nach dem angegebenen Datum verwenden Bestellnummer Los- oder Chargennummer In-vitro-Diagnostikum TH003BYDE 001 Jul-2014 Seite 4 von 12

5 Im Lieferumfang enthaltene Materialien Die Reagenzien sollten in einer Umgebung, die frei von kontaminierenden DNA- und PCR- Produkten ist, aufbewahrt werden. Alle Reagenzien werden in gebrauchsfertigem Zustand geliefert. Verschlossene und geöffnete Reagenzien bei -20 C lagern. Geöffnete Reagenzien können bis zu 3 Monate aufbewahrt werden. Das mitgelieferte Material reicht für 50 Tests aus: 1. 2 Gefäße x 450 µl Primer-Gemisch A (TA) mit spezifischen Primern zur Amplifikation von Allelen, die nicht von den Faktor V-, Faktor II- oder MTHFR-Mutationen betroffen sind, Kontrollprimern und Desoxynukleotidtriphosphaten in Puffer (404502) Gefäße x 450 µl Primergemisch B (TB) mit spezifischen Primern zur Amplifikation von Allelen, die von den Faktor V-, Faktor II- oder MTHFR-Mutationen betroffen sind, Kontrollprimern und Desoxynukleotidtriphosphaten in Puffer (404503) Gefäß x 600 µl Loading-Farbstoff (LD). (404481) 4. 1 Gefäß x 200 µl Verdünnungspuffer (DB). (404482) 5. 1 Gefäß x 50 µl DNA-Kontrolle (DC), normal in Bezug auf die Faktor V Leiden-R506Q- Mutation und die Prothrombin-20210A-Mutation und homozygot für die MTHFR- Allelvariante 677C. (404487) Erforderliche, nicht mitgelieferte Materialien Laborverbrauchsartikel - Handschuhe; Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschluss; Pipettenspitzen; dünnwandige 0,2 ml oder 0,5 ml PCR-Gefäße (Verwendung von Gefäßen mit zwei verschiedenen Farben erleichtert die Identifizierung der Primergemische). DNA-Isolierung - Steriles entionisiertes Wasser guter Qualität; Natriumchlorid (NaCl); Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)-Dinatriumsalz; Natriumhydroxid-Pellets (NaOH); 2- Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propandiol (Tris-Base), kristallisiert; Salzsäure 36 % sp.gr.1,18 (HCl); Ammoniumchlorid (NH 4Cl). PCR-Amplifikation - Sigma leichtes weißes Mineralöl*; steriles destilliertes Wasser guter Qualität; AmpliTaq Gold (Applied Biosystems). Elektrophorese - Gelelektrophorese-Material, einschließlich NuSieve 3:1 Agarose (Lonza); 50-Basenpaar-Größenmarker (Base-Pair Ladder); Ethidiumbromid. * Zur Amplifikation in 0,5-ml-PCR-Gefäßen oder Thermocyclern ohne beheizte Deckel Erforderliche Ausrüstung Laborausstattung Präzisionspipetten (2 Sätze: je 1 für Prä- und Postamplifikationsbereich, vorzugsweise Verdrängungspipetten); Glasware; Schutzkleidung; Vortex-Mischer; Mikrozentrifuge; Waage, Röhrchenständer. DNA-Isolierung - Heizblock (Erwärmung auf 100 C). Amplifikation - Thermocycler für 0,5-ml- oder 0,2-ml-Gefäße (Temperaturgenauigkeit +/-1 C zwischen 33 C und 100 C und statische Temperaturgleichheit +/-1 C), beheizter Deckel optional. Elektrophorese - Tank zum Komplettüberschichten des Flachgels mit Puffer; Netzteil; Mikrowelle; Wasserbad zum Abkühlen der Agarose; UV-Transilluminator; Photographiesystem. TH003BYDE 001 Jul-2014 Seite 5 von 12

6 Entnahme und Lagerung der Proben Es müssen Vollblut- (EDTA) oder Trockenblutproben verwendet werden. Wie gelegentlich beobachtet, können sich Probenentnahmehilfen nachteilig auf die Unversehrtheit bestimmter Analyte auswirken und einige Verfahrenstechnologien beeinträchtigen 13. Es wird daher jedem Anwender empfohlen, sicherzustellen, dass das gewählte Instrument gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet wird und dass Probenentnahmehilfen und alternative DNA-Präparationsmethoden mit diesem Test kompatibel sind. Blutproben sollten vor der Aufbereitung der DNA bei -20 C gelagert werden. Wiederholtes Auftauen und Einfrieren vermeiden. DNA-Isolierung aus Vollblutproben (EDTA) µl von jeder Blutprobe in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschluss pipettieren. 2. In jedes Gefäß 320 µl der 170 mm (9,09 g/l) NH 4Cl-Lösung pipettieren Minuten durch leichtes Schwenken und Kippen mischen. Kräftiges Schütteln und Schaumbildung vermeiden. 4. Jedes Gefäß 2 Minuten lang bei x g zentrifugieren, bis sich ein Zellpellet gebildet hat. 5. Den Überstand mit einer Pipette abnehmen und verwerfen 6. In jedes Gefäß 300 µl von 10 mm (0,58 g/l) NaCl/10 mm (3,72 g/l) EDTA pipettieren und die Zellen durch Mischen auf dem Vortex resuspendieren. 7. Jedes Gefäß 1 Minute lang bei x g zentrifugieren, bis sich ein Zellpellet gebildet hat. 8. Schritte 5 bis 7 mindestens noch zweimal wiederholen, bis keine rote Färbung mehr im Überstand sichtbar ist. 9. Den Überstand mit einer Pipette abnehmen und verwerfen. 10. In jedes Gefäß 200 µl der 50 mm (2 g/l) NaOH-Lösung pipettieren und die Zellen durch Mischen auf dem Vortex resuspendieren. 11. In einem Heizblock 10 Minuten bei 100 C inkubieren. 12. In jedes Gefäß 40 µl von 1 M (121,1 g/l) Tris-Base/HCl (ph 7,5) pipettieren und auf dem Vortex mischen ml steriles entionisiertes Wasser in jedes Mikrozentrifugenröhrchen geben, sodass ein Gesamtvolumen der DNA-Probe von 1,24 ml vorliegt. 14. Jedes Gefäß 1 Minute lang bei x g zentrifugieren, bis sich ein Pellet aus den Zelltrümmern gebildet hat. Die DNA ist im Überstand enthalten. DNA-Isolierung aus Trockenblutproben 1. Aus der Probenkarte 2 x 3 mm Plättchen (b) in ein 1,5-ml-Gefäß mit Schraubverschluss drücken. Die Spots müssen aus einem komplett mit Blut gesättigten Bereich der Karte stammen. Vorab mehrere saubere Plättchen herausdrücken und verwerfen, um einen Verschleppungseffekt zu vermeiden. TH003BYDE 001 Jul-2014 Seite 6 von 12

7 2. 1 ml 10 mm (0,58 g/l) NaCl/10 mm (3,72 g/l) EDTA zugebenund auf dem Rotationsmixer 15 bis 20 Minuten mischen. Wenn kein Rotationsmixer zur Hand ist, können die Waschschritte jeweils auf 30 Minuten ausgedehnt werden. 3. Waschlösung entnehmen und entsorgen. 4. Schritte 2 und 3 nochmals wiederholen. 5. Danach sollte der Großteil des Häm aus den Plättchen herausgelöst sein. Eine ausgeblichene rotbraune Färbung der Blutspots ist bei diesem Schritt häufig. 6. Kurz zentrifugieren (3 Sekunden), um verbliebene Waschlösung auf dem Boden des Röhrchens zu sammeln. Mit einer Pipette soviel Waschlösung wie möglich entfernen und verwerfen, ohne die Spots zu beschädigen. 7. Diese kurze Zentrifugierung entfernt normalerweise weiteres Häm aus den Blutspots. 8. In jedes Gefäß 150 µl 50 mm (2 g/l) NaOH pipettieren. Zum Mischen mit dem Finger vorsichtig an das Gefäß schnippen. 9. Im Heizblock 10 Minuten kochen. Der Heizblock sollte bei 100 C äquilibriert sein. 10. Kurz zentrifugieren, um Überstand auf dem Boden des Gefäßes zu sammeln. 11. Zum Neutralisieren in jedes Gefäß 30 µl 1 M (121,1 g/l) Tris-Base/HCl (ph 7,5) pipettieren und sorgfältig mischen. 12. In jede DNA-Probe 420 µl steriles Sigma-Wasser geben, um ein Gesamtvolumen von 600 µl herzustellen. 13. Proben gut mischen und durch Zentrifugieren in der Mikrozentrifuge auf dem Gefäßboden sammeln. 14. Überstand in ein neu etikettiertes Gefäß mit Schraubverschluss transferieren. Extrahierte DNA bei -20 C aufbewahren. (b) Die Gesamtgröße der verwendeten Blutprobe muss mindestens einer 2 x 3 mm Trockenblutprobe entsprechen. Es können z. B. auch 1 x 6 mm Plättchen verwendet werden. Zur DNA-Isolierung aus flüssigem Vollblut wurde auch das QIAamp DNA Blood Kit (Qiagen) verwendet, mit dem reproduzierbare und auswertbare Ergebnisse erzielt wurden. Die oben beschriebenen Verfahren der DNA-Isolierung werden von Elucigene Diagnostics empfohlen und haben nachweislich zu einheitlichen und zuverlässigen Ergebnissen geführt. DNA, die mit anderen Verfahren oder aus anderen Probentypen isoliert wird, kann u.u. nicht ideal für den Elucigene TRP-Test sein und zu suboptimalen Ergebnissen führen. Die Hauptkriterien für alternative Verfahren der DNA-Isolierung sind die DNA-Konzentration und das Fehlen von PCR-Hemmern. Es wird empfohlen, alternative Verfahren und Probentypen auf die Verwendung mit dem Elucigene TRP-Test gründlich zu prüfen, bevor die Ergebnisse für diagnostische Zwecke genutzt werden. Tests von DNA-Proben mit Konzentrationen <10 ng/5 µl werden nicht empfohlen. Unter idealen PCR-Bedingungen werden mit DNA-Konzentrationen zwischen 10 und 100 ng/5 µl einheitliche Ergebnisse erzielt. Hinweis: Aufgrund von Schwankungen der Qualität und Ausbeute der DNA ist es u.u. manchmal erforderlich, die zuletzt erhaltene DNA-Lösung nochmals um das 5-Fache zu verdünnen, um eine effiziente Amplifikation sicherzustellen. TH003BYDE 001 Jul-2014 Seite 7 von 12

8 Testprotokoll Amplifikationsverfahren Die in den Tabellen 1 und 2 enthaltenen Zahlen können für eine größere Anzahl von Tests proportional erhöht werden. Da jedoch nur kleine Mengen erforderlich sind, empfiehlt, Elucigene Diagnostics die gleichzeitige Durchführung von mindestens 5 Tests. 1. Den Thermocycler auf eine 20-minütige Vorstufe bei 94 C zur Aktivierung von AmpliTaq Gold in Verbindung mit einem zyklischen Amplifikationsprogramm (35 Zyklen) von 30 Sekunden bei 94 C (Denaturierung), 2 Minuten bei 58 C (Annealing) und 1 Minute bei 72 C (Extension) programmieren. Zusätzlich muss eine 20-minütige Verlängerung der Extension bei 72 C im letzten Zyklus eingegeben werden. Hinweis: Für eine PCR in 0,5 ml Gefäßen am Thermocycler die Option Block wählen. 2. Gefäße mit Primergemisch A (TA) und B (TB), AmpliTaq Gold (nicht im Lieferumfang enthalten), Loading-Farbstoff (LD) und Verdünnungspuffer (DB) auftauen und 10 Sekunden lang bei x g zentrifugieren, vorsichtig mit dem Vortexmixer mischen und noch einmal 10 Sekunden lang zentrifugieren. Hinweis: Schritt 3-6 müssen in einem DNA-freien Bereich durchgeführt werden 3. Entsprechend der Tabelle 1 eine ausreichende Verdünnung von AmpliTaq Gold mit mitgeliefertem Verdünnungspuffer und Loading-Farbstoff und sterilem destillierten Wasser für die zu testenden Proben und Kontrollen vorbereiten. Durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren gründlich mischen. Tabelle 1. Verdünnung der AmpliTaq Gold Anzahl der erforderlichen Tests Steriles destilliertes Wasser (µl) Loading-Farbstoff (µl) Verdünnungspuffer (µl) AmpliTaq Gold (µl) Gesamtvolumen (µl) Entsprechend Tabelle 2 Reaktionsgemische A und B herstellen. Aus Primergemisch A ein passendes Aliquot entnehmen und in ein beschriftetes Mikrozentrifugenröhrchen geben. Mit Primergemisch B und einem zweiten beschrifteten Gefäß wiederholen. Unter Verwendung verschiedener Pipettenspitzen die jeweils erforderliche Menge AmpliTaq Gold Verdünnung (aus Schritt 3) in jedes Mikrozentrifugenröhrchen geben. Mit dem Vortexmixer vorsichtig mischen und bei x g für 10 Sekunden zentrifugieren. Tabelle 2. Herstellung der Reaktionsgemische A und B Anzahl der erforderlichen Tests A B A B A B A B Primergemisch A (µl) 82, Primergemisch B (µl) 82, Verdünntes Enzym (µl) 27,5 27, Gesamtvolumen (µl) Für jede Probe jeweils ein Gefäß mit A und eines mit B beschriften oder, falls bunte Gefäße verwendet werden, für jedes Primergemisch ein andersfarbiges Gefäß verwenden. TH003BYDE 001 Jul-2014 Seite 8 von 12

9 6. Jeweils 20 µl des hergestellten Reaktionsgemisches A auf den Boden der entsprechenden Zahl der mit A beschrifteten PCR-Gefäße pipettieren. Dasselbe mit Reaktionsgemisch B und der entsprechenden Zahl der mit B beschrifteten PCR-Gefäße wiederholen. 7. Jeweils separate Pipettenspitzen verwenden und 5 µl der DNA-Testprobe in jedes A- und B-Gefäßepaar geben. Einen Tropfen Sigma leichtes weißes Mineralöl hinzufügen, um die wässrige Phase zu bedecken*. Fest verschließen. 8. Für die Negativkontrolle keine DNA in das A- und B-Gefäßepaar geben. Einen Tropfen Sigma leichtes weißes Mineralöl hinzufügen, um die wässrige Phase zu bedecken*. Fest verschließen. 9. Die A- und B-Gefäße bei x g für 10 Sekunden zentrifugieren. 10.Alle Gefäße fest im Block des Thermocyclers platzieren. Die 94 C-Vorstufe, gefolgt vom zyklischen Amplifikationsprogramm, starten. 11.Unbenutzte AmpliTaq Gold Verdünnung sowie die zubereiteten A- und B- Reaktionsgemische verwerfen. 12.Nach Beendigung des zyklischen Amplifikationsprogramms können die Proben entweder bei Raumtemperatur über Nacht oder bis zu 7 Tage lang bei 2-8 C aufbewahrt werden, bevor die Gelelektrophorese durchgeführt wird. * Zur Amplifikation in 0,5-ml-PCR-Gefäßen oder Thermocyclern ohne beheizte Deckel. Gelelektrophorese Dem Anwender wird empfohlen, sicherzustellen, dass die gewählte Ausrüstung gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet wird und mit diesem Test kompatibel ist. In diesem Zusammenhang sind insbesondere die Gelmatrix und die Abmessungen des Kamms zu überprüfen. Die Ergebnisse wurden unter folgenden Elektrophorese-Bedingungen erzielt: 1. Die Elektrophorese des PCR-Produkts erfolgte in einem 3%igen NuSieve 3:1 Agarosegel unter Verwendung von Trisborat und Ethidiumbromid (TBE/EtBr) als Laufpuffer. TBE/EtBr wurde als 134 mm (16,2 g/l) Tris-Base, 74,9 mm (4,63 g/l) Borsäure, 2,55 mm (0,95 g/l) EDTA-Puffer mit 0,1 µg/ml Ethidiumbromid hergestellt g NuSieve 3:1 wurden in 100 ml TBE/EtBr gelöst und in einen 15 x 12 cm horizontalen Geltrog mit 1,5 mm x 5 mm Zahnkamm (1 mm über dem Boden) gegossen. 3. Es sollten jeweils 15 µl PCR-Produkt aus jedem PCR-Gefäß in benachbarte Positionen in dem vorbereiteten Agarosegel geladen werden. 4. Neben den Proben wurde eine 50 Base-Pair Ladder als Molekulargewichtsmarker verwendet. 5. Die Elektrophorese wurde bei 5 bis 6 V/cm zwischen den Elektroden durchgeführt, bis die Farbstofffront 4 cm von den Probenvertiefungen in Richtung Anode gewandert war (1 bis 1,5 Stunden). 6. Nach der Elektrophorese wurden die Gele auf einen UV-Transilluminator (bei 260 nm) gelegt und anschließend betrachtet und fotografiert. TH003BYDE 001 Jul-2014 Seite 9 von 12

10 Interpretation der Ergebnisse 1. Die Negativkontrolle darf in dem von der unteren und der oberen Kontrollbande definierten Bereich keine Banden aufweisen (siehe Abbildung 1). 2. In allen Proben muss die untere und die obere Kontrollbande deutlich sichtbar sein (siehe Abbildung 1). 3. Die Position der oberen und der unteren Kontrollbande muss jeweils das korrekte Molekulargewicht angeben (siehe Abbildung 1). Sind die obigen Kriterien nicht erfüllt, dürfen die Ergebnisse nicht verwendet werden, und der Test muss wiederholt werden. Abbildung 1 zeigt ein Diagramm der Größe (in Basenpaaren) und der relativen Position der PCR-Produkte im Gel, wie sie bei einem heterozygoten Thrombose-Genotyp (Träger von Faktor V-, Faktor II- oder MTHFR-Mutationen) unter Verwendung des Thromboserisiko- Testreagenz zu erwarten sind. Abbildung bp 500 bp LADDER PCR GRÖSSE MUTATION Normal Mutant 526 bp Obere Kontrolle 400 bp 350 bp 423 bp Obere Kontrolle 300 bp 250 bp 260 bp Faktor II 200 bp 200 bp Faktor V 150 bp 100 bp 140 bp 97 bp MTHFR Untere Kontrolle 50 bp Leistungsmerkmale Dreißig Proben, bei denen zuvor anhand einer Analyse durch Restriktionsenzymverdau eine Genotypbestimmung durchgeführt worden war, wurden im Rahmen einer internen Studie und unter Befolgung des empfohlenen Kitprotokolls mit dem Elucigene TRP-Kit (TH003B2) getestet. Es wurden neunundzwanzig DNA-Proben erfolgreich mit dem Elucigene TRP- Kitamplifiziert. Eine DNA-Probe konnte nicht amplifiziert werden, lieferte aber bei Wiederholung des Test ein akzeptables Ergebnis. Sechsundzwanzig der Proben testeten positiv auf mit dem Elucigene TRP-Kit nachgewiesene Mutationen, in vier Proben wurden keine Mutationen festgestellt. Von den 30 getesteten Proben waren 7 positiv für die Faktor V (R506Q) -Mutation, 10 waren positiv für die Faktor II (Prothrombin 20210A) -Mutation und 16 waren positiv für die MTHFR (677C>T)-Mutation. Alle mit dem Elucigene TRP-Kit erhaltenen Ergebnisse wurden durch die Ergebnisse der ursprünglichen Genotypbestimmung bestätigt. TH003BYDE 001 Jul-2014 Seite 10 von 12

11 Dreißig Paare aus Vollblut- und Trockenblutproben von dreißig Personen wurden mit dem Elucigene TRP-Kit (TH003B2) im Rahmen einer internen Studie und unter Befolgung des empfohlenen Kitprotokolls getestet. Achtzehn der Probenpaare testen positiv auf Mutationen, die vom Elucigene TRP-Kit nachgewiesen werden. Das von jeder Vollblutprobe erhaltene Ergebnis war mit dem der Trockenblutprobe derselben Person konkordant. Grenzen des Verfahrens 1. Die Ergebnisse dieses und anderer diagnostischer Assays sollte in Verbindung mit anderen, dem Arzt vorliegenden Laborwerten und klinischen Daten ausgewertet werden. 2. Das Nichtvorhandensein der mit diesem Kit nachgewiesenen Mutationen schließt nicht aus, dass andere Mutationen im Faktor V Leiden-, Faktor II- und MTHFR-Gen vorhanden sind. Andere Mutationen, die dieses Kit nicht nachweisen kann, sind möglich. 3. Wie bei jedem Gentest können durch Blutproben, die im Anschluss an eine kürzliche Bluttransfusion entnommen wurden, fehlerhafte Ergebnisse entstehen. Der Anwender dieser Tests sollte diese Hinweise in seinem Bericht an die verantwortlichen Arzt oder Genetiker besonders hervorheben. TH003BYDE 001 Jul-2014 Seite 11 von 12

12 Literaturangaben 1. Heit JA, Silverstein MD, Mohr DN, Petterson TM, Lohse CM, O'Fallon WM, Melton LJ 3rd. The epidemiology of venous thromboembolism in the community. Thromb Haemost 2001;86: Rosendaal FR. Risk factors for venous thrombotic disease. Thromb Haemost 1999;82: Bertina RM, Rosendaal FR. Venous thrombosis the interaction of genes and environment. N Engl J Med 1998;338: Poort SR, Rosendaal FR, Reitsma PH, Bertina RM. A common genetic variation in the 3'- untranslated region of the prothrombin gene is associated with elevated plasma prothrombin levels and an increase in venous thrombosis. Blood 1996 Nov 15;88: Press RD, Bauer KA, Kujovich JL, Heit JA. Clinical utility of factor V Leiden (R506Q) testing for the diagnosis and management of thromboembolic disorders. Arch Pathol Lab Med 2002;126: Zöller B. Hillarp A, Berntorp E, Dählback B. Activated protein C resistance due to a common factor V gene mutation is a major risk factor for venous thrombosis. Ann Rev Med 1997;48: Makris M, Preston FE, Beauchamp NJ, Cooper PC, Daly ME, Hampton KK, Bayliss P, Peake IR, Miller GJ. Co-inheritance of the 20210A allele of the prothrombin gene increases the risk of thrombosis in subjects with familial thrombophilia. Thromb Haemost 1997;78: Endler G, Mannhalter C. Polymorphisms in coagulation factor genes and their impact on arterial and venous thrombosis. Clin Chim Acta 2003;330: Hirsch DR, Mikkola KM, Marks PW, Fox EA, Dorfman DM, Ewenstein BM, Goldhaber SZ. Pulmonary embolism and deep venous thrombosis during pregnancy or oral contraceptive use: prevalence of factor V Leiden. Am Heart J 1996;131: Bokarewa MI, Bremme K, Blomback M. Arg506-Gln mutation in factor V and risk of thrombosis during pregnancy. Br J Haematol 1996;92: Spector EB, Grody WW, Matteson CJ, Palomaki GE, Bellissimo DB, Wolff DJ, et al. Technical standards and guidelines: venous thromboembolism (factor V Leiden and prothrombin 20210G>A testing): a disease-specific supplement to the standards and guidelines for clinical genetics laboratories. Genet Med Jul-Aug;7(6): Newton CR et al. Analysis of any point mutation in DNA. The Amplification Refractory Mutation System (ARMS). Nucleic Acid Res 17: (1989). 13. Satsangi J et al. Effect of heparin on polymerase chain reaction. Lancet 343: (1994). ELUCIGENE is a trademark of Delta Diagnostics (UK) Ltd. ARMS is a trademark of AstraZeneca UK Ltd. QIA AMP is a trademark of the Qiagen Group. NUSIEVE is a trademark of Lonza. AMPLITAQ GOLD is a trademark of Roche Molecular Systems Inc. Copyright 2014 Delta Diagnostics (UK) Ltd. TH003BYDE 001 Jul-2014 Seite 12 von 12