Modul 3 Mikrobiologie

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1 Karlsruher Institut für Technologie Institut für für Angewandte Biowissenschaften Abt. Mikrobiologie Prof. Abteilung Dr. R. Mikrobiologie Fischer Prof. Dr. Reinhard Fischer Modul 3 Mikrobiologie WS 2013/2014 Termine: Dienstags oder Mittwochs 13:30-18:00 Uhr Ort: Praktikumsraum Geb.30.44, UG K 51 Betreuung: Prof. Dr. Reinhard Fischer, Prof. Dr. Johannes Gescher, Dr. Jörg Overhage Dr. Elisabeth Poth

2 Vorläufiger Praktikumsplan Versuch Tag 1 Tag 2 Tag 3 Tag 4 Tag 5 Tag 6 GRAM- Färbung Färbungen Vereinzelung Ausstrich Verdünnungs -reihe Agarplatten GZZ LZZ-Oberfl. MPN Anreicherung Coliforme Bacillus Giessen Agar herstellen Auswerten Zählen Plattieren Ansetzen, Ausstrich Kol.zählen Auswerten Lactoseb. animpfen Kartoffel animpfen Ausstreichen auf Platten Auswerten Exoenzyme Bunte Reihe Medien Beimpfen Auswerten Wachstumskurve Durchführen Auswerten Agardiffusionstest Durchführen Auswerten Hemmhöfe Phagenversuch Durchführen Autoklavieren Spülen Vorkulturen Sterile Utensilien Alle bzw. Nach Absprache Alle bzw. Nach Absprache Alle bzw. Nach Absprache Alle bzw. Nach Absprache Alle bzw. Nach Absprache Alles Aufräumen Putzen Laborplätze kontrollieren

3 Das Praktikum soll folgende Lehrinhalte vermitteln: 1. Erlernen mikrobiologischer Arbeitsmethoden Sicherheit am Arbeitsplatz; Werkzeuge; Hygiene und steriles Arbeiten; Medien und Vorbereitung; Sterilisation; Reinkulturen auf festen und flüssigen Medien; Mikroskopieren; Morphologie von Bakterien 2. Wachstum von Mikroorganismen auf festen und flüssigen Medien Beimpfen von Röhrchen, Platten und Flüssigkulturen; Submers- und Oberflächenkultur Anlegen von Reinkulturen, Gesamtzellzahl, Lebendzellzahl 3. Anreicherung, Charakterisierung und Bestimmung von Bakterien Anreicherung und Isolieren von Mikroorganismen, Physiologische Bestimmung der Bakterien, Bunte Reihe 4. Methoden zur Ermittlung von Wachstumsparametern Bestimmung der optischen Dichte, der Zellzahl, der Verdopplungszeit 5. Einfluss von antibakteriellen Substanzen auf Wachstum Plattendiffussionstest, Wachstumskurve Literatur Lehrbuch "Munck: Mikrobiologie", Thieme Verlag Vorlesung Allgemeine Mikrobiologie Mikrobiologisches Grundpraktikum, Ein Farbatlas, S.K. Alexander und D. Strete, Pearson Studium

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5 Sicherheit im Labor I-1 Bitte bereiten Sie sich auf jeden Kurstag durch das Lesen der betreffenden Versuchsanleitung vor und machen Sie sich auf diese Weise mit den Prinzipien und methodischen Ansätzen vertraut. Wenn Ihnen der Versuchsansatz vor Beginn der Arbeiten bekannt ist, verringern Sie damit die Wahrscheinlichkeit eines Unfalls. Darüber hinaus ermöglicht Ihnen eine solche Vorbereitung, die Zeit im Labor effizienter zu nutzen. Vor Beginn des ersten Kurstages werden die Anordnung der Fluchtwege, Feuerlöscher, Notbrausen und Augenduschen sowie das Verhalten bei einem Unfall besprochen. Im Falle einer Verletzung ist sofort der beaufsichtigende Assistent zu informieren. Im Labor ist Essen, Trinken, Rauchen oder das Auftragen von Kosmetika nicht gestattet. Beim Arbeiten nicht mit den Händen in das Gesicht oder die Haare greifen. Nach jedem Kurs und beim Verlassen des Kursraumes sind die Hände zu waschen. Im Labor muß bei allen Arbeiten ein Kittel getragen werden. Dies stellt sicher, daß kein Kulturmaterial versehentlich auf die Kleidung kommt und so das Labor verläßt, und schützt außerdem Ihre Kleidung vor Verschmutzung durch Chemikalien und Färbelösungen. Auf die Laborarbeitstische darf nur solches Material abgelegt werden, das für die Versuchsdurchführung nötig ist. Das schließt Anleitungen, Protokollhefte und Schreibzeug ein. Dagegen sollen Bücher und Hefte nur auf den Tischen des Seminarraums bzw. Kleidungsstücke und Taschen in den Spinten gelagert werden. Wenn Lebendmaterial versehentlich verschüttet oder verschmiert wurde, muß es sofort mit Desinfektionsmittel und Papierhandtüchern aufgenommen werden. Die betroffenen Arbeitsflächen, Gerätschaften und/oder Hautflächen müssen desinfiziert werden. Alle Gefäße mit Kulturmaterial und Chemikalien müssen entsprechende Beschriftungen erhalten; ebenso müssen alle Kulturgefäße, die über Nacht inkubiert werden sollen, mit Namen bzw. Arbeitsgruppennummer, Inhalt, Versuchsnummer und Datum gekennzeichnet sein, um eine korrekte Behandlung bzw. Entsorgung zu erlauben. Mit dem Bunsenbrenner ist sehr sorgsam umzugehen. Bei Nichtbenutzung ist er abzudrehen oder kurzfristig auf Sparflamme zu stellen. Keine halbe Flamme bei voller Luftzufuhr einstellen: Gefahr des Zurückschlagens der Flamme zur Brennerdüse und Verbrennungen beim Anfassen! Nicht über die Flamme hinweg nach Dingen greifen! Eine weitere Gefahr für Verbrennungen besteht beim Abflammen der Drigalskispatel; die Benutzung ist genau nach der Anleitung des Assistenten vorzunehmen. Alle kontaminierten Gefäße und nicht mehr gebrauchtes Kulturmaterial muß korrekt entsorgt bzw. sterilisiert werden. Pipettenspitzen sind in die dafür vorgesehenen Abfallbehälter abzuwerfen; benutzte Glaspipetten sind mit der Spitze nach oben in die Pipettenbehälter mit Reinigungs-/ Sterilisationsmittel zu stellen.

6 Entsorgung I-2 Alle kontaminierten Gefäße und nicht mehr gebrauchtes Kulturmaterial muß korrekt entsorgt bzw. sterilisiert werden. AUTOKLAVENMÜLL: alles, was mit Bakterien in Berührung gekommen ist und autoklaviert werden muss und nur das!!! Fest: Eppis, Petrischalen, kontaminierte Handschuhe etc., keine Flaschen oder Glaspipetten in Autoklavensack werfen, sondern nur Dinge, die nach dem Autoklavieren weggeworfen werden können Flüssig: Flüssigmüll wird in Flaschen oder Erlenmeyer gesammelt, autoklaviert, anschließend entsorgt, weggeschüttet, danach gespült Kontaminierte Glaspipetten: in Plastikzylinder mit desinfizierender Lösung gesammelt, inkubiert, anschließend gespült Normaler Müll: alles was nicht mit Bakterien in Berührung gekommen ist Glasmüll: Objektträger werden im Becherglas gesammelt, autoklaviert und dann als Glasmüll entsorgt Organischer Müll: Behälter mit Färbelösungen etc. unter dem Abzug

7 I-3 Tag 1. Gramfärbung, Vereinzelung von Bakterien, Herstellen von Klonen, Agarplatten gießen Gramfärbung Munk Kapitel Die Färbemethode nach GRAM (dänischer Mediziner) dient neben der Sichtbarmachung der Zellen zugleich diagnostischen Zwecken in taxonomischen und cytologischen Fragestellungen. Die Zellwandbestandteile der grampositiven Bakterien (mehrschichtiges Peptidoglykan, Teichonsäuren) verhindern eine Entfärbung der mit Kristallviolett/Jod behandelten Zellen durch ein Propanol oder Ethanol/Aceton-Gemisch (Zellen erscheinen blau), die gramnegativen (einschichtiges Peptidoglykan, LPS, keine Teichonsäuren) geben die Farbe wieder ab und können anschließend mit Safranin gefärbt werden (Zellen erscheinen rot). Abb.1a: Unterschiedlicher Zellwandaufbau bei grampositiven und gramnegativen Bakterien

8 I-4 Abb.1b: Schematischer Aufbau der gramnegativen und grampositiven Zellwand. Abb.1c: Schematische Darstellung der Gramfärbung Aufgabenstellung Es werden 7 Bakterienkulturen (Agarplatten) ausgegeben. Davon sind 2 bekannt und dienen als Referenzstämme (Gram+/Gram-). Das Gramverhalten der restlichen 5 unbekannten Stämme (A-E) soll bestimmt werden.

9 I-5 Bakterienstämme Referenzstämme Escherichia coli (gramnegativ) Bacillus subtilis (grampositiv) Abb.2: Beispiele einer Gram-Färbung: Links: Escherichia coli (gramnegativ). Rechts: Bacillus subtilis (grampositiv) Zu charakterisierende Bakterienstämme (A-E) Enterobacter cloacae Proteus mirabilis Serratia marcescens Micrococcus luteus Pseudomonas stutzeri Material 5 Objektträger, je ca. 50 ml der Färbelösungen in Falcon Tubes, Papierhandtücher oder Windel 1 Glasbecherglas oder Schale Pasteurpipetten 7 Bakterienkulturen (24-48h alt)

10 I-6 Färbelösungen Kristallviolettlösung 2 g Kristallviolett wird in 100 ml A. dest gelöst und durch einen Faltenfilter filtriert. Vorsicht beim Abwiegen und Ansetzen der Lösung!!!! (Sauerei!) Lugolsche Lösung 1 g Iod und 2 g Kaliumiodid werden vollständig in ca. 5 ml A. dest gelöst und anschließend mit A. dest auf 300 ml aufgefüllt. Differenzierlösung Aceton : Ethanol (96 %ig) = 1:3 Safraninlösung: 2 g Safranin werden in 100 ml A. dest gelöst. Die Lösungen aufbewahren! Durchführung - Herstellen eines Präparates Es ist zweckmäßig, auf demselben Objektträger in der Mitte das zu untersuchende Material aufzubringen und an beiden Seiten je ein bekanntes grampositives und gramnegatives Bakterium als Referenz. Mit einem Diamantstift bzw. Fettstift wird der Objektträger entsprechend beschriftet. (Kein normaler Filzstift verwenden!) Beispiel für ein Präparat:? Gram? Gram + - Bakterien aus einer Flüssigkultur Ein Tropfen Bakteriensuspension wird auf einem sauberen Objektträger durch "Breitschaukeln" oder mit der Pipettenspitze ausgebreitet. Der Ausstrich wird an der Luft getrocknet.

11 - Bakterien aus einer Agarkolonie Auf einen sauberen Objektträger wird ein Tropfen A. dest gebracht. Mit einer sterilen Impföse entnimmt man von einer Kolonie eine winzige Menge Bakterien und verreibt sie sorgfältig in dem Tropfen Wasser oder steriler Saline, so dass eine dünne, gleichmäßige, leicht trübe Bakteriensuspension entsteht. An der Luft trocknen lassen. Die zu untersuchenden Kulturen sollten ca. 24 h, keinesfalls jedoch älter als 48 h sein, da mit zunehmendem Alter das Gram-Verhalten variieren kann. - Hitzefixierung Der Objektträger wird mit den Bakterien nach oben 3 mal durch die Flamme eines Bunsenbrenners gezogen. Die Bunsenbrennerflamme sollte zum Fixieren gerade entleuchtet, keinesfalls jedoch prasselnd sein. Vor dem Färben lässt man ihn abkühlen. - Färbung: (Zeiten einhalten!) Arbeitsplatz mit saugfähigem Papier oder Windel auslegen!!! Und vorsichtig mit den Färbelösungen hantieren, damit es keine Sauerei gibt! 1. Objektträger mit den fixierten Bakterien wird in die Kristallviolettlösung eingetaucht. Farbstoff 1 min. einwirken lassen, dann in kaltes A. dest. tauchen und mit dest. Wasser aus einer Spritzflasche abspülen (in Glasbecherglas oder Glasschale). 2. Objektträger abtropfen lassen (auf Papierhandtücher), dann 1 min in Lugolsche Lösung eintauchen, danach kurz in A. dest. eintauchen, auf Papierhandtücher abtropfen lassen. 3. Objektträger mehrmals mit der Differenzierlösung (Aceton:Ethanol=1:3) abspülen (Pasteurpipette) Nicht eintauchen!!!!, bis keine Farbwolken mehr vom Präparat abgehen. Danach wird mit A. dest. abgespült (mit Pipette oder Spritzflasche). 4. Objektträger in Safraninlösung eintauchen und 1 min einwirken lassen. Danach wird der Objektträger wiederum mit A. dest. gewaschen. Die restliche Flüssigkeit ablaufen lassen und an der Luft trocknen. Das Präparat kann nun mikroskopiert werden (ohne Deckglas, ohne Wasser!). Entsorgung Benutzte Objektträger im Becherglas sammeln, mit Ethanol desinfizieren oder Autoklavieren und als Glasmüll entsorgen. Färbelösungen als organischer Müll (+ Halogen) sammeln (Gefäß unter dem Abzug)! Auswertung 1. Charakterisieren Sie die Bakterienstämme bezüglich Ihres Gram-Verhaltens und ihrer Form. I-7

12 I-8 Tag 1. Vereinzelung von Mikroorganismen auf Agaroberflächen, Herstellung von Klonen und Agarplatten Munk Kapitel Mikroorganismen leben in der Natur in enger Gemeinschaft miteinander und mit höher organisierten Lebewesen. Will man mit einem bestimmten Mikroorganismus arbeiten, erfordert seine Isolierung von den Begleitorganismen (die Erstellung einer Reinkultur) auf Grund seiner Kleinheit besondere Techniken. Weiterhin sind spezielle Methoden nötig, um eine reine Population des betreffenden Organismus während der Untersuchung von der Umgebung getrennt zu halten, wie auch Mikroorganismen aus der Umgebung von der Reinkultur fernzuhalten (Steriltechnik). Bei der Arbeit mit pathogenen Formen dient die Steriltechnik zusätzlich der Laborsicherheit. Mikroorganismen, die im Labor isoliert von den natürlichen Substraten ihres ökologischen Raumes wachsen sollen, müssen mit einem Nährmedium versorgt werden, das die chemischen, physikalischen und physiologischen Bedingungen ihres natürlichen Wuchsortes (oder Wirtes) dupliziert. Da die Mehrheit der Mikroorganismen auf enge Bereiche dieser Bedingungen spezialisiert ist, gelingt es durch eine geschickte Wahl der Kulturbedingungen (z.b. in Bezug auf die Art der Kohlenstoff- oder Stickstoffquelle, Temperatur, Versorgung mit Sauerstoff, phwert und Pufferung, Mineralstoffe, Wuchsstoffe usw.) spezifische Gruppen oder sogar einzelne Formen in einer Mischkultur anzureichern. Mit einer nachfolgenden mechanischen Absonderung einzelner Zellen und daraus entstehender Kolonien kann man schließlich Reinkulturen eines Stammes isolieren. Eine gebräuchliche Methode dieser Art ist das Ausstreichen von Bakteriensuspensionen einer Anreicherungskultur mit einer Impföse bis zu einem Verdünnungsgrad, bei dem einige Bakterienzellen vereinzelt liegen. Bakterienstämme - 2 frische Bakterienkulturen, z.b. Serratia marcescens und M.luteus - ca. 2 ml einer Bakterienmischkultur (Übernachtkultur von Serratia marcescens/m.luteus) Material 2 LB Agarplatten für Ausstrich der Bakterienstämme 1 LB Agarplatte für Ausstrich der Bakterienmischkultur 3 LB Agarplatten fürs Plattieren der letzten 3 höchsten Verdünnungsstufen (Mischkultur) Sterile 2 ml Eppendorfgefäße / Sterile Kulturröhrchen, Glaspipetten, Sterile 50 ml Saline (0,9 % NaCl)

13 Durchführung I-9 Einzelkolonien (Klone) lassen sich einerseits auf Agarplatten durch einen Verdünnungsausstrich erhalten bzw. nach Plattieren einer definierten Menge, meist 100 µl, aus einer geeigneten Verdünnung. 1. Fraktionierter Ausstrich: Neunstrichtechnik bzw. 3-Ösenausstrich Einen Tropfen bzw. eine Impföse (ca 30 µl) einer Bakterienkultur bzw. einer Mischkultur werden auf LB- Agarplatten (siehe Abbildung) ausgestrichen und vereinzelt. Dazu den Tropfen auf die Agarplatte setzen und den ersten Ausstrich durch den Tropfen machen. Es kann nur ein Verdünnungseffekt stattfinden, wenn die Impfnadel zwischendurch, nach Schritt 3, 6 und 9 ausgeglüht wird! (deshalb auch Verdünnungsausstrich genannt!) Petrischalen auf der Rückseite mit Gruppennummer und Datum beschriften! Abb. 3a: Neunstrichtechnik Abb. 3b : Dreiösenausstrich

14 I Ausplattieren einer Bakteriensuspension - Von der Mischkultur wird eine Verdünnungsreihe in Saline (0,9 % NaCL) in 2 ml Eppis bis 10-7 hergestellt (genau pipettieren!). - Von jeder Verdünnungsstufe werden jeweils 100 µl mit einem Drigalskispatel auf eine LB-Platte plattiert. - Die Agarplatten werden bei 30 C über Nacht inkubiert. - Am nächsten Praktikumstag können die Einzelkolonien gezählt bzw. abgenommen werden. Abb. 3c: Plattiermethode mit Drigalskispatel.

15 I-11 Herstellung von Flüssigmedien und Agarplatten Munk Kapitel 7.1 Die Medien enthalten die nötigen Nährstoffe, die eine bestimmte Bakteriengruppe zum Wachstum benötigt. Diese werden i.d.r. im Autoklaven bei 121 C, min sterilisiert (oder spezielle Herstellerangaben beachten!). Für Agarplatten wird den Medien Agar als Verfestigungsmittel (12-15 g/l) zugegeben. Material Pro Gruppe: 0,4 L LB-Agar giessen (vorbereitet!) Pro Gruppe: 0,4 L LB-Agar herstellen (in 500 ml Flasche) 100 ml LB-Bouillon in 100 ml Flasche (d.h. pro Gruppe 0,5 L LB-Bouillon ansetzen, dann aufteilen, 100 ml in 100 ml Flasche und 400 ml in 500 ml Flasche, hier noch 6 g Agar zusetzen) LB-Agar /L (Fertigmedium) oder 10 g Pepton aus Fleisch oder Trypton 5 g Fleischextrakt oder Hefeextrakt 10 g NaCl 15 g Agar Duchführung -ca. 0,4 L LB-Agarplatten pro Gruppe giessen (Die-Gruppe: 0,4 L vorbereiteten, bei ca. 55 C warmgehaltenen Agar gießen und für die Mi-Gruppe 0,4 L LB-Agar herstellen und autoklavieren) 100 ml LB-Bouillon herstellen (siehe oben!) -Die Substanzen werden einzeln in dest. Wasser gelöst. Die Rezeptangaben beziehen sich generell auf 1L. Bei Fertigmedien Herstellerangaben beachten. -Falls der ph eingestellt werden muss, muss dies geschehen bevor Agar zugesetzt wird (Elektrode wird sonst geschädigt!) -Es ist darauf zu achten, dass der Kolben bzw. Flasche groß genug ist! Um ein Überkochen zu vermeiden, sollten die Gefäße nur zu ca. 4/5 gefüllt werden, besonders bei Agarmedien. -Nach Abkühlen der Agarmedien auf ca C können Agarplatten gegossen werden. Dazu ca ml in eine leere Petrischale giessen. Steril! -Um Kondenswasserbildung zu vermeiden, Agarplatten stapeln und nicht zu heiß giessen -Darauf achten, dass der Agar gut gelöst und verteilt ist Für den nächsten Versuchstag mitbringen (pro Gruppe) - 1 Kartoffel zur Anreicherung von Bacillus 1 Erdprobe zur Anreicherung von Bacillus 1 Wasserprobe zur Anreicherung von Coliformen Keimen

16 I-12 Tag 2. Gesamt- und Lebendzellzahl, Anreicherung von Bakterien Munk Kapitel und Bestimmung der Gesamtzellzahl (GZZ) mit der Thoma-Zählkammer Die Bestimmung der Gesamtkeimzahl (lebende oder schon abgestorbene Zellen sind nicht zu unterscheiden!) erfolgt durch direktes Auszählen der Bakterienzellen in einer mit 5% Formol konservierten Probe. Eine Bakteriensuspension wird in einer Zählkammer unter dem Mikroskop bei facher Vergrößerung mit Phasenkontrast ausgezählt. Die Zählkammer nach THOMA ist ein Glasobjektträger mit einem in einer eingeschliffenen Vertiefung markierten Liniennetz. Das Netz enthält 400 Kleinquadrate mit je 50 µm Kantenlänge und mit einer darüberliegenden Wassersäule von 100 µm, wenn die Kammer nach oben durch ein aufgelegtes Deckglas begrenzt wird. Zur besseren Orientierung sind jeweils 16 Kleinquadrate durch vergrößerte Abstände zu einem Großquadrat zusammengefaßt. Das Volumen über einem Großquadrat ist demnach µl. Kleinquadrat: Länge 0,05 mm Tiefe: 0,1 mm Volumen: 0,00025 mm3 Großquadrat = 16 Kleinquadrate à 0,004 mm3 Um eine ausreichende Genauigkeit zu erhalten, sollten mindestens zwei Proben ausgezählt und diese soweit verdünnt werden, daß die Bakterien nicht dichter als 100 pro Großquadrat liegen. Pro Probe sollten nicht weniger als 200 Bakterienzellen und nicht weniger als 4 Großquadrate gezählt werden. Aus den Ergebnissen wird ein Mittelwert als Gesamtkeimzahl pro ml berechnet. Abb.4a: Thoma-bzw. Neubauer-Zählkammer.

17 I-13 Abb.4b.: Ein Großquadrat (bzw.16 Kleinquadrate ) im Gitternetz der Thomakammer Material Sterile Saline (0,9 % NaCl), Reagenzgläser oder Eppis zum Verdünnen Thomakammer Bakterienmaterial - frische 5 ml Bakterienkultur von Escherichia coli in LB Medium (Übernachtkultur) Durchführung - Kultur unverdünnt in der Zählkammer begutachten (steril entnehmen). Wenn die Suspension zu dicht ist, adäquat verdünnen (z.b. 1:2, 1:5, 1: 10 etc.) - In jeder Verdünnung müssen so viele Großquadrate ausgezählt werden, bis eine Zellzahl von >100 Zellen erreicht ist. Eine Bestimmung der GZZ ist nur dann möglich, wenn pro KQ nicht mehr und nicht weniger als 5-10 Zellen zu finden sind. Die Verdünnung muss entsprechend angepasst werden - GZZ berechnen: GZZ = Kammerfaktor (z.b. Großquadrat) Zellzahl/Großquadrat X Verdünnung X gemittelte

18 I-14 Beachte: Der Kammerfaktor bezieht sich entweder auf ein Groß- oder Kleinquadrat! - Welcher Kammerfaktor für das Groß-bzw.Kleinquadrat lässt sich für die Zählkammer berechnen? Fläche über einem Kleinquadrat: 0,0025 mm 2, Höhe: 0,1 mm. 16 KQ ergeben ein GQ. - Richtwert: eine gut gewachsene Bakterienkultur enthält ca. 5 X 10 9 Zellen/ml (= ca Zellen/ml bei OD 578 = 1). Bei einer Kultur mit unbekannter OD, muß die zu zählende Probe so weit mit Saline verdünnt werden, dass ca. 5 bis 10 Zellen/Kleinquadrat gezählt werden.

19 I-15 Tag 2. Bestimmung der Lebendzellzahl (LZZ) durch Ausplattieren und MPN-Methode Oberflächenverfahren zur Bestimmung der Lebendzellzahl Für eine Lebendkeimzahlbestimmung (nur lebende Kolonie bildende Zellen) wird die Bakteriensuspension über mehrere Stufen soweit verdünnt, daß 0,1 ml der Probe, auf einer Agarplatte gleichmäßig ausgespatelt eine Dichte von ca. zwischen 20 und 200 einzeln liegenden Zellen ergibt. Diese Zellen produzieren beim nachfolgenden Inkubieren Einzelkolonien,die ohne optische Hilfsmittelgezählt werden können und so auf einfache Weise die Berechnung der ursprünglichen Keimzahl ermöglichen. Abb.5: Verdünnungsreihe zur Bestimmung der Keimzahl nach der Oberflächenmethode. Material: pro Gruppe 6 LB-Agarplatten, ca 50 ml sterile Saline, Pipetten (steril) + Röhrchen (steril) oder Eppis (steril) Escherichia coli Bakteriensuspensionen: siehe wie bei GZZ

20 Durchführung I Die Bakterienkultur wird so in Saline verdünnt, dass 3 Endverdünnungen mit jeweils ca. 200 Zellen/ml, 2000 Zellen/ml und Zellen/ml darin enthalten sind (als Richtwert zur Berechnung dient die ermittelte GZZ). 2. Verdünnungsreihe in 10 er Schritten in Glasröhrchen mit jeweils 4,5 ml Saline + 0,5 ml Probe ansetzen. Sterile Glaspipetten verwenden! 3. Je 100 µl der 3 Endverdünnungen werden auf vorgetrocknete LB-Platten ausplattiert (20 Zellen/Platte, 200 Zellen/Platte und 2000 Zellen/Platte). Doppelter Ansatz! Also pro Verdünnung 2 LB-Platten bespateln. 4. Über Nacht bei 37 C inkubieren und LZZ ausrechnen. 5. Keimzahl: Anzahl der Kolonien pro Platte x 10 x Verdünnungstufe (Warum?) MPN -Methode zur Bestimmung der Lebendzellzahl von Hautkeimen Menschliche Hautoberflächen sind im Allgemeinen von zahlreichen Bakterien besiedelt, die dort entweder resident oder transient sind. Residente Mikroorganismen teilen sich auf der Haut und sind Teil der normalen Hautflora. Zusätzlich wird die Haut ständig von transienten Mikroorganismen inokuliert, die sich aber nur selten weiterteilen und meist absterben. Die normale Bakterienflora besteht hauptsächlich aus Stämmen der Gattungen Staphylococcus und Corynebacterium, gramnegative Formen sind im Allgemeinen von untergeordneter Bedeutung. Es sollen von einer definierten Hautfläche Keime quantifiziert werden. Die Keimzahlbestimmung wird mittels der MPN-Technik ( most probable number bedeutet wahrscheinliche Keimzahl ) durchgeführt. Hierbei handelt es sich um eine statistische Methode und wird vor allem dort eingesetzt, wo geringe Keimzahlen zu erwarten sind. Die Methode beruht darauf, dass mindestens ein lebensfähiger Keim in einer Nährlösung vorhanden sein muss, um die Trübung des Röhrchens hervorzurufen. Die Keimzahl wird mit Hilfe von MPN-Tabellen bestimmt. Materialien Sterile Wattetupfer (vor Gebrauch mit ca 100 ul steriler Saline befeuchten) Alufolie

21 Vorbereitung I Röhrchen mit je 4,5 ml LB-Medium (pro Testperson/Gruppe) (ca. 100 ml LB-Medium) Abb.5b: Schema zur Durchführung der Keimzahlbestimmung mittels der MPN- Methode Durchführung Anreicherung und Keimzahlbestimmung - eine Schablone aus Alufolie mit einem 3 * 3 cm großem Fenster anfertigen oder einfach nur das Areal mit Kuli markieren -Schablone auf die Hautfläche legen und mit einem sterilen, in Saline getränkten Wattetupfer die Fensterfläche oder markierte Fläche abstreichen. Dabei den Wattetupfer mehrmals drehen. - Tupfer in ein Reagenzglas mit 4,5 ml LB-Bouillon geben, gut vortexen und auf Eis stellen, wenn nicht sofort damit weitergearbeitet wird (Warum?) MPN-Teachnik - Ausgehend von diesem Röhrchen werden die Verdünnungsstufen 10-1 bis 10-5 in LB Bouillon hergestellt (3 Parallelansätze) - die drei Röhrchen jeder Verdünnungsstufe und das Ausgangsröhrchen 24 h bei 37 C inkubieren - alle Verdünnungsstufen werden auf Wachstum kontrolliert und das Ergebnis tabelliert - die MPN Zahl wird aus der Anzahl der bewachsenen Röhrchen ermittelt, wobei der Übergang von Wachstum/kein Wachstum bestimmt wird

22 I-18 - die Keimzahl wird nach der MPN-Tabelle (de Man, McCrady) bestimmt - daraus ergibt sich die Anzahl der Keime / cm 2 Hautfläche Tab 3.Ermittlung der MPN aus der Stichzahl nach McCrady (gekürzt) mit 3 Parallelen Stichzahl MPN 001 0, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , >110

23 I-19 Einige Richtwerte Kopfhaut: ca. 1,5x 10 6 / cm 2 Unbedeckte Haut (Stirn): ca. 0,2 x 10 6 /cm 2 Bedeckte Haut (Rücken): ca.3 x 10 3 / cm 2 Hand : ca 6 x 10 3 /cm 2 Fingerkuppe: ca /cm 2 Quelle: http: // Auswertung 1. Welche Hautpartie wurde getestet? 2. Wieviel Keime/cm 2 wurden ermittelt? Sind diese Werte realistisch? (Vergleich mit Werten aus der Literatur?) 3. Konnten Sie irgendwelche Hautkeime identifizieren? Literatur De Man, J.C. (1975) The probability of most probable numbers Eur.J.Appl.Microbiol.1,67-68

24 I-20 Tag 3. Anreicherung und Isolierung von Bakterien der Gattung Bacillus aus einer Erdprobe. Nachweis von Exoenzymen Munk Kapitel 2.4.2, Bakterien der Gattung Bacillus sind typische Bodenbewohner und können leicht aus Erde angereichert und isoliert werden. Typische Vertreter sind Bacillus subtilis und Bacillus cereus. Diese sind auch als Exoenzym-Produzenten bekannt. Proteasen und Amylasen werden biotechnolgisch aus Bacillus gewonnen. Proteasen werden den Waschmitteln zugesetzt. Amylasen finden u.a. in der Lebensmittelindustrie Verwendung. Exoenzyme lassen sich auf geeigneten Agarplatten (mit Stärke bzw. Milchprotein) durch Verschwinden des Substrates leicht nachweisen. Der mikrobielle Abbau von Stärke als dem hauptsächlichen Reserveprodukt der Pflanzen geschieht meist aerob durch hydrolytische Spaltung mit Hilfe des Enzyms ß-Amylase oder, in seltenen Fällen, durch Transglycosylasen. Von den saccharolytischen Clostridien kann Stärke auch unter anaeroben Bedingungen abgebaut werden. Mit Hilfe der extrazellulären Proteasen vermögen Mikroorganismen die hoch molekularen Proteine zu Polypeptiden, Oligopeptiden und Aminosäuren abzubauen, die dann die Zellwand passieren können und intrazellulär durch andere Proteasen weiter in die Aminosäurebausteine gespalten werden. Abb.6: Amylaseproduktion von B.subtilis

25 Material: Jeweils ca. 1 g einer Bodenprobe Je 3 LB-, Stärke- und Milchagar-Platten sterile Reagenzgläser und Pipetten I-21 Casein oder Milchagar: LB-Grundagar mit Zusatz von 1,0 % Milcheiweiss (Casein) 10 % ige Magermilchpulver-Lösung extra autoklavieren und dem Grundmedium steril zusetzen (d.h. Grundmedium z.b. für 500 ml berechnen, dann aber nur in 450 ml lösen und nach dem Autoklavieren noch 50 ml 10 %ige Caseinlösung zugeben (1 % Casein im Medium) Stärkeagar: LB-Grundagar mit Zusatz von 0,5 % löslicher Stärke (kann mitautoklaviert werden) Durchführung Ca. 1 g der Bodenprobe in 8 ml dest. Wasser geben, gut mischen. Erde absetzen lassen. Überstand abnehmen, in 2 Röhrchen aufteilen. Die eine Probe bleibt unbehandelt, die andere wird 10 min vorsichtig gekocht (Vorsicht, dass es kein Siedeverzug gibt). Für jede Bodenprobe zwei Scheiben einer frisch geschnittenen Kartoffel in eine leere Petrischale legen und die eine mit der ungekochten Probe beträufeln und eintrocknen lassen und die andere mit der gekochten Probe beschmieren. Die Ansätze werden bei 30 C inkubiert. Am nächsten Praktikumstag wird mit der Impföse von einigen Kolonien auf der Kartoffeloberfläche etwas abgekratzt und ein Vereinzelungsausstrich auf eine LB-Platte, einer Stärke- und eine Milchagarplatte gemacht. Als Referenzstamm wird B.subtilis ebenfalls auf eine LB-Platte, eine Stärke und eine Milchagarplatte als Verdünnungsausstrich aufgetragen (reicht 1 x pro bench).

26 I-22 Am nächsten Praktikumstag Exoenzymplatten auswerten: Caseinplatte: Test auf Proteinasen - keine Proteinasen : Caseinplatte durch Milcheiweiss gleichmäßig trüb - Proteinasen vorhanden: Heller Fresshof um Kolonie/Bakterienausstrich Stärkeplatte: Test auf Amylasen Überschichten mit Lugolscher Lösung. Die vorhandene Stärke wird sofort blau gefärbt. Überschüssige Lugolsche Lösung kann abgekippt und weiter verwendet werden. - keine Amylasen: Stärkeplatte gleichmäßig blau gefärbt - Amylasen vorhanden: Heller Fresshof um Kolonie/Bakterienausstrich - Bakterien im Phasenkontrast mikroskopieren und auf Sporen prüfen Auswertung 1. Wo taucht Sporenbildung auf? 2. Konnten Exoenzym-produzierende Bakterien aus der Erdprobe isoliert und identifiziert werden?

27 I-23 Tag 3. Anreicherung und Isolierung von Coliformen Keimen (Escherichia coli) aus einer Wasserprobe Munk Kapitel , Enterobakterien, insbesondere Vertreter der Coliformen Keime wie Escherichia coli und Enterobacter aerogenes spielen u.a. in der Trinkwasseranalyse als Indikatorbakterien für fäkale Verunreinigungen eine wichtige Rolle, da sie sehr schnell wachsen und durch wenige biochemische Reaktionen schnell identifiziert werden können. E.coli ist ein harmloser Dambewohner. Seine Anwesenheit in Wasser deutet allerdings darauf hin, dass es mit Fäkalien in Kontakt gekommen ist und dass auch andere Krankheitserreger vorhanden sein könnten, die z.t. schwere Krankheiten (Cholera, Ruhr, Typhus) hervorrufen können. Alle Enterobakterien sind Gram negativ, Katalase positiv, wachsen bei 37 C aerob oder fakultativ anaerob und vergären Glucose zu Gas und Säure. Zusätzlich besitzen die Coliformen ein Enzym, die ß-Galaktosidase, wodurch sie auch Lactose zu Gas und Säure umsetzen können. Auf EMB-Agar (Selektivagar mit Eosin, Methylenblau und Lactose) besitzen E.coli Kolonien einen typischen grünlich metallischen Glanz. Material Jeweils 50 ml der verschiedenen Wasserproben Sterile 100 ml Schraubdeckelflasche (alternativ: 100 ml Erlenmeyer) LB-, EMB-Platten Sterile Reagenzgläser und Pipetten für Verdünnungsreihe 50 ml 2x konz. Lactose-Bouillon Lactose-Bouillon (2fach konzentriert): 20 g/l Pepton aus Fleisch 10 g/l NaCl 6 g/l Fleischextrakt 20 g/l Lactose 0,04 g/l Bromkresolpurpur oder Bromkresolgrün Durchführung 1. Praktikumstag: Zu der 50 ml Lactose-Nährlösung jeweils 50 ml der Wasserprobe geben (ergibt einfach konzentriertes Medium). Flasche füllen und mit Schraubdeckel verschliessen. Die Ansätze werden stehend bei 37 C inkubiert (Warum?). Als Negativ-Kontrolle beimpft eine Gruppe/Bankreihe zusätzlich 50 ml Lactoseboullion mit 50 ml steriler Saline.

28 I-24 Als Positiv-Kontrolle beimpft eine Gruppe/Bankreihe zusätzlich 50 ml Lactosebouillon mit 50 ml einer sehr verdünnten E.coli Suspension (z.b. 100 ul E.coli Suspension + 50 ml sterile Saline) Am nächsten Praktikumstag die Flaschen auf Trübung und Farbumschlag nach gelb (Säureproduktion!) prüfen. Von der Lactose-Anreicherung jeweils einen Vereinzelungsausstrich auf eine LBund EMB-Platte machen. Am nächsten Praktikumstag die EMB- Platten auf grün-metallisch glänzende Kolonien prüfen. Nur E.coli erscheint auf den EMB Platten mit grün metallischem Glanz, andere coliforme Keime nicht! AUSWERTUNG 1. Konnten in den Wasserproben coliforme Keime oder sogar E.coli nachgewiesen werden? 2. Warum ist dieser Test von Bedeutung?

29 I-25 Tag 3 und 4. Charakterisierung und Identifizierung von Enterobakterien ( Bunte Reihe ) Munk Kapitel 7.5 Ziel: Durch verschiedene physiologische Tests sollen die 4 ausgegebenen Stämme aus der Gruppe der Enterobakterien näher charakterisiert (und wenn möglich auf die Art bestimmt) werden (siehe dazu auch Tabelle). Abb.8: Identifizierung von Enterobakterien mit Hilfe der Bunten Reihe

30 I-26 Herstellung von Medien, Lösungen und Beimpfen der Testmedien Material zur Kultivierung (pro Gruppe) 4 EMB-Agarplatten (Fertigmedium, Selektivmedium für Coliforme Keime) 5 LB-Agarplatten (Fertigmedium) (eine LB-Platte für Pseudomonas ) 4 Citrat-Agarplatten (Fertigmedium nach Simmons) Steriles A. dest. oder Sterile NaCl 0,9 % 4 Harnstoff-Agarplatten oder Schrägagarröhrchen (siehe Rezept) 8 MRVP Medium (siehe Rezept) 4 SIM Halbfest-Medium (Fertigmedium, bzw. siehe Rezept, aufkochen, portionieren, autoklavieren) 4 Glucose-Bouillon-Röhrchen (mit Durham-Röhrchen autoklavieren) Durchführung Von jedem Bakterienstamm wird zunächt eine Stammlösung hergestellt. Dazu etwas Bakterienmaterial von einer Einzelkolonie in ca. 500 ul Saline suspendieren und damit folgende Medien mit ca 30 μl (mit Impföse oder Pipette) beimpfen. Pro Bakterienstamm - Verdünnungsausstrich auf EMB -Agarplatte - Glucose Bouillon-R. (mit Durham-Röhrchen) nicht Schütteln! - 2 MRVP Röhrchen - SIM-Agar (das halbfeste SIM-Medium als Stich mit Impföse ganz bis zum Boden beimpfen) - SIMMONS-Citrat-Agar, Austrich - Harnstoff-Agar Ausstrich - LB-Platte (für Oxidase und Katalasetest!,) Einen Pseudomonas-Stamm zusätzlich als positive Kontrolle auf einer LB- Platte für den Oxidasetest frisch ausstreichen) - 36 h bei 37 C stehend inkubieren; Bakterienstämme Escherichia coli Enterobacter cloacae Serratia marcescens Proteus mirabilis

31 I-27 Medien Glucose-Bouillon-Gärröhrchen Trypton 10.0 g Glucose 5.0 g NaCl 5.0 g Bromthymolblau 0,17 g A. dest ml ph 7.3 Medium in Röhrchen (ca 4-5 ml) portionieren, Durhamröhrchen mit Öffnung nach unten dazugeben, dann erst autoklavieren) SIMMONS-Citrat-Agar (bzw. Fertigagar) K2HPO4 1.0 g (NH4)H2PO4 1.0 g NaCl 5.0 g Na-citrat 2.0 g MgSO4 0.2 g Bromthymolblau 0.08g Agar 15.0 g A.dest ml ph 6.9 Medium sollte grün sein, sonst stimmt der ph-wert nicht! MRVP-Medium Pepton 7.0 g Glucose 5.0 g K2HPO4 5.0 g A.dest ml ph 6.9 SIM Medium (bzw. Fertigmedium) Pepton (Casein) 20.0 g Pepton (Fleisch) 6.6 g (NH4)Fe-citrat 0.2 g Na-thiosulfat 0.2 g Agar 3.0 A.dest ml ph 7.3 In Mikrowelle aufkochen, damit sich der Agar löst, auf Röhrchen mit je ca 4 ml aufteilen, dann erst autoklavieren und stehend erkalten lassen.

32 I-28 Harnstoff-Agar Pepton 1.0 g Glucose 1.0 g NaCl 5.0 g KH2PO4 2.0 g Harnstoff 20.0 g Phenolrot 0.012g Agar 15.0 g A.dest ml ph 6.8 Medium sollte orange sein, sonst stimmt der ph nicht, evtl. ph nach dem Autoklavieren erneut einstellen.

33 I-29 Tag 5. Auswertung der Bunten Reihe Durchführung der Tests/Auswertung Reagenzien für die Bunte Reihe Kovacs Indolreagenz: 10 ml/gruppe 0,5 g Dimethylaminobenzaldehyd 7,5 ml Amylalkohol 2,5 ml HCl (konz.) Cytochromoxidasereagenz (Wursters Reagenz): 50 ml/kurs 1%ige (w/v) Lösung N,N,N',N'-Tetramethyl-1,4-phenylendiammoniumdichlorid muß vor Versuchsbeginn frisch angesetzt werden. Löslich in Wasser! Voges-Proskauer Reagenzien: Lösung A: 5% (w/v) 1-Naphtol in 96%igem Ethanol : 20 ml/gruppe Lösung B: 0,3% (w/v) Kreatinin in 40%iger KOH: 10 ml/gruppe 3% H 2 O 2 (aus 10 % durch Verdünnen mit Wasser): ca 50 ml/kurs frisch ansetzen! Methylrotlösung: 20 mg Methylrot in 30 ml 96 %igem Ethanol: 50 ml/kurs Tests Test auf Gasbildung und Wachstum Die Röhrchen werden auf Wachstum (Trübung) und Gasbildung (in den Durham- Röhrchen) getestet Test auf Indolbildung bei Wachstum auf Tryptophan Die SIM-Agar-Röhrchen werden mit 0,5 ml Kovacs-Reagenz überschichtet und kurz angestoßen. Sind die Organismen in der Lage, Tryptophan zu Indol umzuwandeln, färbt sich die organische (obere) Phase rot. (Nach Beendigung des Tests wird der Inhalt des RG als organischer Abfall gesammelt.) Test auf Sulfidbildung und Motilität Die SIM-Agar-Röhrchen werden auf das Vorhandensein eines schwarzen Niederschlages (Sulfid) und die Form des Bewuchses hin untersucht.

34 Test auf Citratverwertung bzw. Alkalisierung des Mediums bei Wachstum auf Citrat Auf dem Citratagar nach Simmons läßt sich feststellen, ob die Keime in der Lage sind, Citrat aufzunehmen und Citrat als alleinige C-Quelle zu verwerten (Medium wird alkalisiert, Indikator schlägt von grün nach blau um). (Wichtig: Ist überhaupt Wachstum erfolgt?) 2 Tage inkubieren! Test auf Cytochrom-c-Oxidase Es wird ein Filterpapier mit Wursters Reagenz getränkt. Auf diesem Filter wird eine Einzelkolonie von den NB-Platten verrieben. Tritt innerhalb von 5-10 Sekunden eine Blaufärbung auf, ist der Keim als Cytochrom-c-Oxidase positiv zu betrachten (dieser Test ist nicht immer eindeutig). Alternativ kann ein Tropfen des Reagenzes auf eine Kolonie (Ausstrich) auf der Agarplatte gegeben werden. Test auf Katalase Einige Tropfen 3 %ige H 2 O 2 werden direkt auf eine Bakterienkultur gegeben. Bei Anwesenheit von Katalase entstehen Bläschen. Test auf Acetoinbildung (Voges-Proskauer-Reaktion) Eines der MRVP Röhrchen mit 1,5 ml Lösung A und 0,5 ml Lösung B versetzen (Reihenfolge beachten!) und 30 sek. schütteln. Bei Anwesenheit von Acetoin tritt eine rosa bis rote Färbung auf (dauert ca 20 min oder bis zum nächsten Tag stehen lassen) Methylrot-Probe (MR) (viel Säure aus Glucose) Zugabe von ca 1 ml Methylrotlösung (20 mg Methylrot in 30 ml 96% igem Ethanol) zu ca 3 ml Kultur. Bei Anwesenheit von viel Säure (ph<4,4) färbt sich das Röhrchen tiefrot (positive Reaktion). Bei wenig Säure färbt sich das Röhrchen gelb (negative Reaktion). Test auf Urease Auf den Harnstoff-Agarplatten lässt sich feststellen, ob ein Organismus das Enzym Urease produzieren kann. Urease spaltet den Harnstoff, es entsteht Ammoniak, welches den Agar alkalisiert und deshalb den ph-indikator Phenolrot von orangerot nach pink-rot umschlagen lässt. Urease positiv ist die Gattung Proteus. Entsorgung: SIM-Agar und VP-Röhrchen werden gesondert entsorgt! Nicht Autoklavieren! Schädliche Dämpfe von a-naphthol und Dimethylaminobenzaldehyd (Nach Beendigung des Tests wird der Inhalt des RG als organischer Abfall gesammelt. Halbfest-agar mit Spatel auskratzen, dann Röhrchen mit 70 %igem Ethanol desinfizieren und entsorgen in organischen Müll) I-30

35 I-31 Tab.1: Identifizierung von Enterobakterien Gas Bewegl. Glucose Laktose Indol Voges-P. Urease H 2 S Citrat Escherichia Enterobacter Salmonella Klebsiella / Proteus /- Serratia /- +/- +/- +

36 Tab. 2: Identifizierung der Enterobakterien mit Hilfe der Bunten Reihe. I-32 Stamm 1 Stamm 2 Stamm 3 Stamm 4 Glucose-B-R. - Wachstum - Gasbildung Alkalisierung Citrat (blau) auf SIM-Agar - Sulfidbildung - Indolbildung - Motilität Oxidase (blau nach 5-10 sec.) Katalase (Gasbläschen) MR-Test (viel Säure) rot VP-Test (Acetoin) rot Gram-Färbung Morphologie (Aussehen) - EMB - LB Harnstoff- Spaltung (Urease) pink Organismus? Stamm identifiziert als? Auswertung 1. Als welchen Stamm haben Sie die Bakteriensuspensionen 1-4 identifiziert? 2. Wie sind die folgenden Medien (EMB, SIM, Citrat-Agar, Harnstoff-Agar) zusammengesetzt und was lässt sich mit ihnen nachweisen?

37 I-33 Tag 5. Agardiffusionstest Munk Kapitel Die Wirkung von Antibiotika oder anderen antibakteriellen Substanzen soll im Agardiffusionstest getestet werden. Antibiotika spielen in der Medizin eine große Rolle zur Bekämpfung von Infektionskrankheiten. Bevor ein Antibiotikum zum Einsatz kommt wird oft ein Antibiogramm erstellt, d.h. es wird zuerst festgestellt, welches Antibiotikum bei welchem Keim wirksam ist. Immer mehr Keime werden u.a. durch unsachgemäßem Gebrauch resistent (Beispiele: Methicillin resistente Staphylococcen und neuerdings das NDM-1 Gen, welches gramnegative Organismen gegen ß-Lactamantibiotika resistent macht). Man ist permanent auf der Suche nach neuen antibakteriellen Wirkstoffen, um auch in Zukunft noch gegen pathogene Keime gerüstet zu sein. Abb.10: Wirkung verschiedener antibakterieller Substanzen auf verschiedene Testkeime. Material Sterile Filterplättchen Sterile Pasteurpipetten zum Ausstanzen der Löcher 4 Eppies mit verschiedenen Antibiotika 4 Eppies mit antibakteriellen Substanzen (Von Studenten mitzubringen, Proben aus dem Putz-, Kosmetik- oder Arzneimittelschrank) frische 5 ml-suspensionen der Indikatorkeime (E.coli und B.subtilis in LB) 4 LB-Platten

38 I-34 Durchführung - 0,1 ml einer Übernachtkultur von E.coli bzw. B.subtilis werden auf LB-Agar plattiert. Die Agarplatte wird mit dem Filzstift auf der Rückseite in 4 Sektoren geteilt. In den Sektoren der Agarplatte werden mit der Rückseite einer sterilen (mit EtOH abgeflammten) Pasteurpipette Löcher gestanzt, und in die Löcher werden die zu testenden Substanzen gefüllt. Alternativ können sterile Filterblättchen auf einen Sektor der Agarplatte gelegt und ca 10 μl der zu testenden antibakteriellen Substanzen aufpipettiert werden. - Die Platten werden dann über Nacht bei 37 C inkubiert. Es werden zwei verschiedene Bakterien, E. coli und B. subtilis mit den gleichen Substanzen getestet. - Der Hemmhof kann am nächsten Tag ausgemessen werden. Auswertung 1. Wie wirken die verschiedenen Antibiotika auf die verschiedenen Testorganismen? 2. Wirken die mitgebrachten Substanzen antibakteriell? Und auf welchen Keim?

39 I-35 Tag 5. Wachstum von E.coli und Wirkung von Antibiotika auf das Wachstum Munk Kapitel und Das Wachstum einer Bakterienkultur besteht in einer Zunahme der Masse der Proteine und Nukleinsäuren und ist im typischen Fall von einem Anwachsen der Gesamtzellmasse und einer Vermehrung der Zellen in der Kultur begleitet. Für eine quantitative Messung bestimmt man die Absorption einfallenden, monochromatischen Lichtes in der Kultur ("optische Dichte", O.D., Trübung ) Die Einfachheit und Schnelligkeit der Trübungsmessung erlaubt so das Verfolgen des zeitlichen Verlaufs des Wachstums (Wachstumskurve). Unter optimalen Bedingungen verdoppeln sich einzellige mikrobielle Populationen in regelmäßigen Zeitabständen. Die Zellzahl No in einer Kultur vermehrt sich in einer Zeitspanne t auf die Zellzahl Nt nach einem exponentiellen Funktion: Nt = N 2kt 0 Infolge der raschen Zunahme der Zellzahl in einer nicht-kontinuierlichen ("batch") Kultur in der exponentiellen Wachstumsphase kommt es bald zu Bedingungen, die das weitere Wachstum limitieren (z.b. abnehmende Substratkonzentrationen, Sauerstoffmangel, ph-änderungen, hemmende Stoffwechselprodukte). Die Kultur wechselt von der exponentiellen (logarithmischen) Wachstumsphase in eine Phase retardierten Wachstums Abb.9: Typische Wachstumskurve.

40 Material I-36-3 Stück 300 ml Erlenmeyerkolben (ersatzweise auch 1 x 300 ml und 3 x 100 ml Kolben), einer davon mit 150 ml LB-Medium ml LB-Bouillon, steril (für Verdünnungen) - sterile Pipetten, steriler Meßzylinder oder Falcon - Übernachtkultur: 50 ml E. coli in 300 ml Erlenmeyer-Kolben - Millimeterpapier, Küvetten, Antibiotikalösungen - Schüttler bzw. Schüttelwasserbäder Als Antibiotika (AB) werden eingesetzt (frisch ansetzen): Ampicillin - Stammlösung: 100 mg/ml (in 70 % EtOH) herstellen - Endkonzentration im Kolben soll 0,4 mg/ml sein - Berechnen: Wieviel ul von der Stammlösung werden benötigt, damit im Kolben (50 ml) eine gewisse Endkonzentration eines bestimmten Antibiotikums vorliegt Chloramphenicol: Stammlösung: 6,4 mg/ml (in 96 % EtOH) Endkonzentration: 0,016 mg/ml Kontrolle: ohne Antibiotikum (Zugabe von 70 % EtOH) Durchführung - Photometer anstellen - OD 600 nm der Übernachtkultur bestimmen - Einen 300 ml- Kolben mit 150 ml LB-Medium wird auf OD 600 = 0,1 angeimpft und sofort (t = 0) die OD 600 gemessen. (Zuerst die Übernachtkultur z.b. 1:10 mit LB-Medium verdünnen, die OD 600 bestimmen, dann ausrechnen, wieviel ml benötigt werden, um 150 ml auf eine OD 600 von 0,1 zu bringen!) - Der Kolben wird dann auf dem Schüttler bei 250 rpm und 37 C inkubiert, bis ΔOD 600 = 0,8 erreicht ist. Dann wird der Inhalt des Kolbens auf drei 300 ml Kolben (alternativ100 ml-kolben) zu je 50 ml aufgeteilt und bei einer ΔOD 600 von ca 0,8-1,0 werden die Antibiotika zugegeben, wobei bei der AB- Konzentration die Probeentnahme berücksichtigt werden muss. (Kolben beschriften! Kolben 1 + Amp, Kolben 2 + CAP, Kolben 3 Kontrolle) - Danach werden sofort, bzw. alle 30 Minuten weitere Proben für die ΔOD Messung entnommen. Schüttler dabei immer nur kurz ausstellen und Kolben sofort nach Probenentnahme schüttelnd weiter inkubieren (Warum?).

41 I-37 Die ΔOD 600 -Messung erfolgt folgendermaßen: 1 ml Probe entnehmen und in kleines Eppi oder direkt in die Küvette füllen. OD 600 des LB-Mediums messen (Blindwert) und Photometer gegen diesen Blindwert abgleichen, OD 600 der Kultur messen. Falls nötig, Kultur verdünnen (mit Medium) und in ausgespülter und trocken geklopfter Küvette erneut OD 600 messen. Achtung: ab einer OD von 0,5 muss die Probe mit Medium verdünnt werden! Übernachtkultur 1:10 verdünnen; wachsende Kultur nach Bedarf 1:2; 1:5; 1:10. Warum? Bei jedem Messpunkt und für jeden Kolben separat notieren (Tabelle). 1. Uhrzeit und Zeit (t =...) 2. OD 600 unverdünnt 3. Verdünnung 4. OD 600 verdünnt 5. OD 600 verdünnt abzüglich BW ( ΔOD 600 ) 6. ΔOD 600 x Verdünnungsfaktor 7. Zeichnen der Wachstumskurve auf halblogarithmisches Papier Schon während des Versuchs sollten die ermittelten ΔOD 600 -Werte gegen die Zeit graphisch auf halblogarithmischem Papier dargestellt werden. Auswertung 1) Auftragung der Wachstumskurve 2) Bestimmung der Verdopplungszeit von Escherichia coli 3) Wie wirken die Antibiotika? Bakteriozid oder bakteriostatisch?

42 I-38 Halblogarithmisches Papier

43 I-39 Anhang Einige Charakteristika der untersuchten Bakterien (Vergl.: Escherichia coli Familie Enterobacteriaceae gramnegative Stäbchen, 0,3-1 x 1-6 µm (1,1-1,5-2-6 µm) peritrich begeißelt fakultativ (anaerobe Atmung und gemischte Säuregärung) Kolonieformen: S- oder R-Formen, leicht konvex, feucht, grau und mit durchscheinender Oberfläche Wachstum bei 37 C Vorkommen: Normales Darmbakterium des Menschen, dient als Indikatorbakterium für fäkale Verunreinigung des Trinkwassers, Krankheitserreger: Harnwegsinfektionen; verschiedene Stämme von E. coli können zur Diarrhöe und Ruhr führen. Serratia marcescens Familie Enterobacteriaceae gramnegative Stäbchen, 0,5-0,8 x 0,9-2,0 µm peritrich begeißelt fakultativ Wachstum bei 37 C Kolonieform: glattranding und rot bei Wachstum < 37 C durch Bildung von Prodigiosin, einem Tripyrrolfarbstoff. Das Bakterium wurde früher auch Hostienpilz genannt. Krankheitserreger: Vorkommen als Hospitalkeime, die gegen die meisten Antibiotika resistent sind, aber nur bedingt pathogen (opportunistisch) Pathogener Verwandter: Yersinia pestis Proteus mirabilis Familie Enterobakteriaceae gramnegativ Peritrich begeißelt, schwärmt auf Agaroberfläche Wachstum in konzentrischen Ringen Vorkommen im Darm, Boden und Wasser Vergärt keine Lactose (also nicht coliformer Keim) Zeigt aber positive H 2 S, Indol- und Ureaseproduktion Fakultativ Wachstum bei 37 C

44 I-40 Enterobacter cloacae ase/crop/type/e_cloac.htm Familie Enterobacteriaceae gramnegative Stäbchen aneinandergelegt, 0,3-0,6 x 0,8-2 µm peritrich begeißelt Wachstum bei 30 C, Säurebildung, Citratverwertung, Nitratreduktion, keine Sulfidbildung, keine Tryptophanverwertung, Kolonieform: glatt, cremig oder weiß, ganzrandig Vorkommen: in Schleimhäuten und Darm von Mensch und Tier. Pathogener Verwandter: Streptococcus pyogenes Scharlach Bacillus subtilis Micrococcus luteus Familie Bacillaceae grampositive Stäbchen, 0,7-0,8 x 2-3 µm fakultativ (Ammonifikation mit Nitrat als terminalem Elektronenakzeptor) Endosporenbildner mit ovalen Endosporen, die zentral sitzen und die nicht dicker als die Mutterzelle sind Stäbchen, meist einzeln peritrich begeißelt Wachstum bei 37 C, wird auch Heubacillus genannt, da er aus Heuaufgüssen angereichert werden kann; Vorkommen im Boden. Pathogener Verwandter: Bacillus anthracis Milzbrand Familie Micrococcaceae grampositive Kokken (0,5-3,5 µm), die traubenförmig oder unregelmäßig zusammengelagert sind, strikt aerob, oxidiert Kohlenhydrate zu CO 2, produziert keine Säuren bei Wachstum auf Glucose, Wachstum bei 37 C, bilden ein gelbes Pigment, Oxidase positiv, wächst auf Simmons Citratagar, Nitrat wird zu Nitrit umgesetzt Vorkommen auf der Haut, setzt Stoffe aus dem Körperschweiss um in übel riechende Substanzen, typischer Luftkeim, beweglich

45 I-41 Pseudomonas stutzeri ogy.net/pseudomonas.etc.html Familie Pseudomonaceae gramnegative Stäbchen 0,5-1 x 1-3 µm polar begeißelt (mehr als eine), dadurch sehr schnell schwimmend nicht zur Fermentation befähigt Wachstum bei 30 C Aromatenabbau; Zucker über Entner-Douderoff-Weg, Katalase und Oxidase positiv, Vorkommen: ubiquitär - Denitrifikation mit NO 3 als terminalem Elektronenakzeptor, Stickstoffbildung?

46 PROTOKOLL Gebundenes Heft mit Seitenzahlen Inhaltsverzeichnis Datum für jeden Kurstag I-42 Überschrift - Thema - Versuchsziel Vorschrift Planung Durchführung + Versuchsaufbau Verwendete Arbeitsmaterialien: Chemikalien Geräte - Beschreibung einzelner Arbeitsschritte - Versuchsbeobachtungen - Sammlung der Messwerte Auswertung: graphische oder tabellarische Darstellung der Versuchsergebnisse Diskussion der Ergebnisse (evtl. Vergleich mit Literaturwerten) Voraussetzung für die Scheinvergabe: - Erfolgreiche Durchführung der Experimente mit Protokoll - Regelmäßige Teilnahme - Bestehen der Abschlussklausur

47 Sicherheitsanweisung für die Benutzung von Autoklaven I-43 Autoklav nur nach Einweisung durch geschultes Personal nutzen! In Autoklaven werden Flüssigkeiten und Geräte sterilisiert durch Erhitzen für 20 min, auf 121 C mit Wasserdampf bei 1 bar (Atmosphäre) Überdruck. Die Sterilisierzeit beträgt 20 min plus die Zeit, die zum Erwärmen auf 121 C benötigt wird. Nach Beendigung des Sterilisiervorganges muss so lange gewartet werden, bis die Temperatur in den Autoklaven auf 70 C abgesunken ist, ehe die Autoklaven geöffnet werden dürfen. Alle im Laboratorium für Mikrobiologie vorhandenen Autoklaven sind mit einem Thermometer und mit einem Barometer versehen. Der Autoklav läuft vorschriftsmäßig, wenn das Thermometer 121 C und der Druckmesser 1 bar Überdruck anzeigen. Ist die Temperatur niedriger als 121 C bei 1 bar, dann deutet dies auf eine Restmenge Luft im Autoklaven hin. Steigt dagegen die Temperatur an, ohne dass sich der Druck entsprechend erhöht, dürfte vergessen worden sein, den Autoklaven mit genügend Wasser zu füllen. Nach Abschalten der Autoklaven kann sich der Autoklaveninnenraum, dessen Temperatur durch das Thermometer angezeigt wird, schneller abkühlen als die darin befindlichen Flüssigkeiten. Bei zu frühem Öffnen der Autoklaven kann es daher zu explosionsartigen Siedeverzügen kommen. Bei geschlossenen Gefäßen kann es zu regelrechten Explosionen kommen. Daher dürfen alle Autoklaven erst geöffnet werden, wenn das Thermometer weniger als 70 C anzeigt. Das Tragen einer Schutzbrille beim Öffnen der Autoklaven ist ein absolutes Muß!! In den Autoklaven mit einem Druck x Volumen Produkt von mehr als 100 l dürfen Flüssigkeiten nur sterilisiert werden, wenn die Autoklaven mit einem Öffnungsschutz versehen sind, der ein zu frühes Öffnen automatisch verhindert.