Standardisierung der serologischen Immundiagnostik. Möglichkeiten, Grenzen, Perspektiven

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1 Standardisierung der serologischen Immundiagnostik Möglichkeiten, Grenzen, Perspektiven

2 Grundproblem Vielfalt der Antikörper Vielfalt der Antigene Problem: Messung von Antigenspezifischen Antikörpern

3 Antikörper

4 IgG Fab Bindungsstelle Leichte Kette Fc Schwere Kette

5 IgG-Fab / Lysozym-Komplex

6 Polyklonalität von Antikörpern

7 Polyklonalität von Antikörpern

8 Individuelle Immunantwort Isoelektrische IEF + Fokussierung HSV-specific von Immunoblotting individuellen Patientenseren und HSV-spezifisches Immunoblotting Amount of anti-hsv antibodies (index) Menge an HSV-Antikörpern Index ph4 ph9

9 Antigene

10 Antigene

11 Antigen Definition Probleme für die Antikörperdetektion

12 Antigen: molekulare Definition

13 Antigen: Synthese

14 Epitope

15 Proteinstrukturen

16 Epitop: Primär-Struktur light chain heavy chain binding site Sarafianos SG et al. Proc.Nat.Acad.Sci.USA 96 pp (1999)

17 Epitop: Sekundär-Struktur alpha helix Momany C et al. Crystal structure of dimeric HIV-1 capsid protein. Nat Struct Biol 3 pp. 763 (1996)

18 Epitop: Tertiär-Struktur Derrick JP et al. Meningococcal Serosubtype Antigen and a Protein G Domain J.Mol.Biol. 293 pp. 81 (1999)

19 Epitop: Quaternär-Struktur Smith TJ et al. Neutralizing antibody to human rhinovirus 14 Nature 383 pp. 350 (1996)

20 Messung von Antigen spezifischen Antikörpern Antigen Antikörper

21 Parvovirus IgG: verschiedene Patienten U/ml U/ml (anti-vp1) (anti-vp1) Patient B B Patient A A Patient Patient C C Dez Jan Jan Feb Feb Mrz Mrz Apr Apr Mai Mai Jun Jun Index (anti-vp2 ) Test 1 (anti-vp1) Test 1 (anti-vp1) Test 21 (anti-vp2) (anti-vp1) Test 3 (anti-vp2) Test 3 (anti-vp2)

22 Antigen-Denaturierung und zeitlicher Verlauf IgG gegen Parvovirus B19 VP2 Söderlund M et al. J Infect Dis 172: 1431 (1995)

23 Biologische Aktivität von Antikörpern protektiv: pathogen: regulatorisch: Ig-Klasse: Ig-Subklasse: IgG4 Avidität, Affinität Neutralisation Blockierung, Stimulation Mimickry IgM, IgG, IgA, IgE IgG1, IgG2, IgG3,

24 Andere Probleme Mutationen Kreuzreaktionen: - real - Kontaminanten Nonlinearität: Rheumafaktoren Immunkomplexe - Prozone/Hook-Effekt Polyklonale Stimulation (EBV)

25 Hierarchie von Standardmaterial WHO-Standard Internationale Einheiten Hersteller A In-house Standard A Hersteller B In-house Standard B Methode M Kalibrator M Methode N Kalibrator N Labor L Labor K Patent P Patient Q Serumprobe S Serumprobe T

26 Standardisierung? Klinisch definierter Goldstandard für positive Resultate für negative Resultate (Kontrolle) Vergleichssystem: Likelihood Ratio (LR) ROC: Area under the Curve (AUC)

27 Testvergleich Sensitivität / Spezifität y = Richtig-positiv Rate (Sensitivität) Test besser als R LR(+) besser als R R LR(-) besser als R Test schlechter als R Likelihood Ratio LR(+) = y/x LR(-) = x/y Bayes' Theorem LR * Vortest-Odds = Nachtest-Odds x = Falsch-positiv Rate (1-Spezifität) Biggerstaff BJ; Comparing diagnostic tests: a simple graphic using likelihood ratios; Statist. Med. 19: , 2000

28 ROC-Analyse 100% Receiver Operating Characteristics (ROC) 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% 1-Spezifität (Falsch-Positiv-Rate)

29 Testvergleich Vierfeldertafel Cutoff B > A % 90% Sp Se - + A Klinik % 80% Sp Se - + B Klinik A B B A

30 ROC-Analyse für EIA-ANA und IF-ANA Cut-Off: 1:160 1:40 Hayashi, N. et al. Clin Chem 2001;47:

31 ROC-Analyse für EIA-ANA und IF-ANA Cut-Off: 1:160 1:40 Hayashi, N. et al. Clin Chem 2001;47:

32 ROC-Analyse für EIA-ANA und IF-ANA Cut-Off: 1:160 1:40 Hayashi, N. et al. Clin Chem 2001;47:

33 ROC-Analyse für EIA-ANA und IF-ANA Cut-Off: 1:160 1:40 Hayashi, N. et al. Clin Chem 2001;47:

34 ROC analyses for EIA-ANA and IF-ANA Cut-Off: 1:160 1:40 Hayashi, N. et al. Clin Chem 2001;47:

35 ROC analyses for EIA-ANA and IF-ANA Cut-Off: 1:160 1:40 Hayashi, N. et al. Clin Chem 2001;47:

36 Testvergleich in verschiedenen Populationen SLE (ANA IFA = 97% positive) CTD (ANA IFA = 96% positive) Healthy donors (ANA IFA 99% negative) RA (ANA IFA 99% negative) SS Copple, et al. Ann N Y Acad Sci, Aug 2007; 1109: 464

37 Zusammenfassung Individuelle Immunantworten sind polyklonal und gegen verschieden Epitope eines Antigens gerichtet. Im zeitlichen Verlauf können verschieden Epitope erkannt werden. Je genauer das kritische Epitop definiert ist, umso besser lässt sich ein serologischer Test standardisieren. Verschiedene klinische Diagnosen ergeben verschiedene Sensitivitäten und Spezifitäten für denselben Test. Je genauer der klinische Goldstandard und die Kontrolle definiert sind, umso besser lässt sich ein serologischer Test standardisieren. Zum Testvergleich wird die ROC-Analyse benötigt. Es fehlt die quantitative Aviditätsbestimmung

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