Biotechnologie. Auf Gentechnologie basierende Aspekte. Nicht-genetisch basierende Techniken. Transgenische & knockout Lebewesen.

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3 1. Biotechnologie Auf Gentechnologie basierende Aspekte Nicht-genetisch basierende Techniken Transgenische & knockout Lebewesen Rekombinante Proteine Neue Stammzellen - Techniken Industrielle Fermentation Klonierung von Lebewesen Lebende Vakzinen Mikrochips Lebende Vakzinen Gentherapie, Immuntherapie Monoklonale Antikörper Traditionelle Stammzellentechnologien Usw.

4 1. Wir mischen uns ein Wir untersuchen Rekombinante Gentechnologie Genomik

5 Gentechnologie 2. Weltbedrohung Nr. 1

6 Moratorium über genetische Manipulation - Asilomar: die Entlösung 3. Freiwilliges Moratorium Direkter Grund: Die Klonierung des totalen SV40 Virus E. coli-ban: infizierender Tumor? Sorge: um die Gesundheit der Menschen und das Ökosystem der Erde Asilomarer Konferenz (1975): Etwas ist gefährlich, wenn es sich als das erweist Paul Berg James Watson Sidney Brenner

7 4. Gegenwärtige Besorgnisse 1. Freisetzung von uns erschaffenen ansteckenden Krankheiten auf die Menschheit - AIDS: aus poliomyelitis (epidemische Kinderlähmung) Vakzinen? 2. Wir verändern die menschliche Evolution 3. Wir mischen uns in die Gelegenheiten des Erschöpfers ein 4. Die genetisch modifizierten Futterpflanzen und Tiere sind ungesund 5. Wir verändern das Ökosystem

8 5.

9 Illegitime Rekombination - zufälliger DNA-Einbau 6. Plasmid Vektor Transgen Chromosom Transgen Transgen Transgen

10 Homologe Rekombination - gezielter DNA-Einbau Transfer Vektor Knock-in Knock-out 7. Markierungs Abschnitt fremde DNA Markierungs Abschnitt Chromosom Zielsequenz Chromosom fremde DNA Genetisch modifizierte Sequenz

11 8. Gezüchtete Zelltypen 1. Primäre Zellzucht 2. Tumoröse Zellzucht 3. Unsterbliche Zell-Linien

12 Geneinfügung in gezüchtete Zellen 9. Transfektion 1. Liposom 2. Ca-PO 4 3. Elektroporation 4. Genkanone Virus Vektor 1. Retrovirus 2. Adenovirus 3. Adeno-assoziiertes Virus Schutzschicht LIPOSOM DNA Homing Peptide Kristallisierte Wasserlösliche Droge Lipid Droge Doppelschicht

13 Geneinfügungs Techniken 9. Liposom Elektroporation Retrovirus Lipidlösung DNA in der Liposom Vermischung DNA Zellkultur Fremdes Gen Selektionsmarker Expressionsvektore Zu den Verpackungs- Zell-Linien Entfernung nicht Essenzieller Gene Liposom bindet an die Zelle Vermischung Transformante Zell-Linien Klonieren vom fremden Gen in den Vektor Zu den Zellen hingefügt Elektrischer Impuls Verpackung Liposom fusionoert mit der Zellmembran Zelle nimmt die DNA auf Vektor RNA Virus Isolation RNA Infektion der Zielzellen ds-dna DNA im Zellkern Selektion + - DNA im Zellkern idegen gén expressziója Integration in das Genom Fremdes Gen wird expressiert stabil Expression transient Expression des fremden Gens

14 Einfügung fremdes Gens in die Zielzellen (Transgen) 10. Promoter Transgen T Transfektion

15 11. Fremdes Gen vorübergehende Expression

16 11. Fremdes Gen vorübergehende Expression

17 Fremdes Gen- stabile Expression 12.

18 Fremdes Gen- stabile Expression 12.

19 Fremdes Gen Einfügung - Adeno assoziiertes Virus Vektor Transfektion

20 14. Genetisch Modifizierte Organismen(GMO-s) Definition: Hinzufügung neues genetischen Materials zu dem Genom eines Organismus VERWENDUNG 1. Grundforschung 2. Wirtschaftlicher Profit TAXONOMIE 1. Mikroorganismen 2. Pflanzen 3. Tiere 4. Mensch GMO: Genetically Modified Organism

21 15. Transgenische Lebewesen Was sind diese? - Solche Tiere oder Pflanzen, in wessen DNA wir ein oder mehrere Gene eingefügt haben Wozu sind sie gut? - (1) Untersuchung der Genfunktion; (2) wirtschaftlich bedeutende GMO-s; (3) in der Zukunft: Gentherapie

22 Geneinfügung in lebenden Organismen Keimlinien Geneinfügung fremdes Gen in jeder Zelle anwesend 1. DNA Mikroinjektion Zygote 2. Geneinfügung in embrionale Stammzellen 3. Virus Vektore(Retroviren) Zygote 16. Somatische Geneinfügung fremdes Gen nicht in jeder Zelle anwesend 1. physisch/chemisch 2. Virus Vektore 3. in Stammzelen Direkt: in vivo Durch Zelle mediiert: ex vivo

23 17. Einfügung fremdes Gens In die Zygote durch pronukleare Injektion Pronukleare Mikroinjektion Promoter fremdes Gen Plasmid Fremdes Gen mit Promoter + pronukleare Injektion Transgenischer Gründer Implantation der injizierten Embrione in scheinschwangere Weibchen Transgenischer Nachfolger

24 Einfügung fremdes Gens In die Zygote durch pronukleare Injektion 17. Pro-nuclei + Injektion des fremden Gens in den männlichen pro-nucleus Implantierung der injizierten Zygoten in Erziehmütter Ca % der Nachfolger enthält fremde DNA Zucht der Mäuse die die fremde DNA expressieren

25 Einfügung fremdes Gens Durch Retrovirus Vektor 18.

26 19. Einfügung fremdes Gens - In embrionale Stammzellen Innere Zellmasse Blastula (Blasenkeim)

27 Kloniertes Gen Geneinfügung in ES Zellen

28 Dornröschen und der Froschprinz Sleeping Beauty & Frog Prince Korrigierter Fisch bzw. Frosch DNA Transposon Binares System 19. IR Transgen IR Promoter Transposase Izsvák Zsuzsanna Ivics Zoltán

29 21. Regelung der Genexpression A. Transgen Expression (gain of function) 1. Konstitutive (ständige) a. überall Expression b. fast überall Expression c. Zell-spezifische Expression UP PNP TSP Transgen Transgen Transgen 2. Induzierbare IP Transgen B. Gen Inaktivation (loss of function) 1. Knock-out Technologie 2. RNS Interferenz (knock-down)

30 22. Zell-spezifische Genexpression BAC - Technologie BAC Genomiale DNA 100, ,000 bp RE Verdauung Regelungselemente Fremdes Gen Originalgen (Exon + Intron) Ligation rekombinantes BAC Mikroinjektion Transformation Transgenische Maus

31 23. Knock-out Tiere 2007 M. Evans: Entwicklung der Stammzellentechnologie (bei den folgenden Techniken werden Stammzellen verwendet) M. Capecchi & O. Smithies: homologe Rekombination: - knock-out Technologie - Austausch defekter Gene auf funktionsfähige: medizinische Bedeutung

32 Herstellung von Knock-out Tieren 24. Genomiale DNA Zygote Blasenkeim neo Targeting Plasmidkonstruktion Markierungs Abschnitt Markierungs A. tk Innere Zellmasse ES Zellen Genomiale DNA neo Genomiale DNA Homologe Rekombination Genomiale DNA neo Genomiale DNA Illegitime Rekombination tk

33 Donor Eltern-1 Donor Eltern x neo tk x 1. ICM Targeting Sequenz Mikroinjektion Blasenkeim Rezipient Elternteil ES Zellzucht Vermischung von ES Zelle und Selektion der Transgen Fremdes Gen enthaltenden Zellen 6. Transgenische ES Zelle wird ins Embryo eingebaut 9. x 8. Chimera Mäuse Gen knock-out in ES Zellen Normaler Homozygot Heterozygot Chimera Normal 10. x Heterozygoten Mäuse Homozygot knock-out

34 In vivo RNA Interferenz 26. Wozu ist RNSi gut? Lentivírus Adenovirus shrna kodierendedna dsrna 3b. sirna 1. 3a Zellmembran Kernmembran (1)Untersuchung der Genfunktion Integration DICER shrna sirna (2) Therapischer Ziel: (a) Blockierung der Funktion des defekten Gens shrna Episom RISC RISC Stabile Expression Transiente Expression (b)minderung der überwirkenden Protoonkogene in Tumoren DICER sirna aktivierterrisc mrna Was fügen wir ein? (1) lange dsrna ----(bei Säugetieren nicht anwendbar, weil sie Apoptose auslöst) (2) sirna (systemisch oder lokal) (3) shrna kodierende DNA -(systemisch oder lokal) (3a) Plasmid DNA Wohin? Intravasculare Perfusion, Hipodermale Injektion (3b) durch Virus Vektor(Lentivirus, Adenovirus, Adeno-Assoziierter Virus) LOKAL - SYSTEMISCH Intraperitoneal Intracerebral

35 (2) In vitro Transkription lange dsrns Dicer sirna Arten (1) chemische Synthese (3a) Plasmid Vektor extrazellularer Raum (3b) Virus Vektor 26. Dicer Cytoplasma Zellkern shrna kodierende DNA Dicer shrna

36 26. RNA Interferenz DICER shrns Zellkern exportin Cytoplasma degradierte mrna P Körper Ziel mrna DICER einsträngige sirna Aktiver RISC shrns: kleine Haarnadel (small hairpin) RNA

37 Rekombinante Proteine 27. Rekombinante Proteine Insulin Blutgerinnungsfaktore Wachstumshormone: Gegen welche Krankheit? Diabetes Hämophilie Zwergwuchs Vorteil: kann keine Krankheiten verursachen (im Gegensatz zu den ehemaligen, aus Kadavern gewonnene Faktoren) Nachteil: in Bakterien reifen die Proteine anders (z.b. gibt es keine Glykosylation)

38 Bakteriale DNA 28. Nicht-integrierende Plasmide Integrierendes Plasmid Klonierung (falls wir fremde DNA einbauen) Genomiale DNA Genomiale DNA

39 Wirkungen von Insulin 29. Insulin Glucosetransporter Insulinrezeptor Glycogensynthese Glycolyse Fettsäuresynthese

40 Rekombinantes Insulin 30. Humanzelle Bakteriumzelle DNA Plasmid RE Verdauung RE Verdauung Menschliches Insulin-Gen

41 Protein Engineering 31. (1) Geleitete Evolution: Mutagenese Selektion neue Mutagenese Selektion (2) Rationaler Proteinentwurf : geleitete Mutagenese nach 3D Modelle

42 Antikörper Techniken 32.

43 33. Poliklonale Antikörper Antigeninjektion in das Tier Memorie B Zellen Poliklonale Antikörper enthaltendes Serum aus dem Blut des Tieres B Zelle Antigen B Zelle Plasmazellen Poliklonale Antikörper

44 Monoklonale Antikörper 34. Isolierung von B-Zellen aus der Milz Züchten von Myelom Zellen Immunisierung einer Maus 1984 Fusion der Myelom und der B-Zelle Wanderung der Antikörper bildenden Zellen: Knochenmark Milz Blut Separation der Zellklone Sortierung entsprechender Zell-Linien in vitro und in vivo Vermehrung Rausgewinnen

45 Monoklonale Antikörper 35. Maus Milz-Zellen (Plasmazellen; sie teilen sich nicht) Einige Zellen enthalten gegen Antigen X produzierte Antikörper Die Maus-Myelomzellen die im TK Gen eine Mutation tragen können in der HAT Nährflüssigkeit nicht wachsen Impfung der Maus Mit Antigen X Fusion Transfer in HAT Nährflüssigkeit Nichtfusionierte Zellen( Fusionierte Zellen( ) sterben ) vermehren sich Separierte Züchtung der Zellen einer Art Selektion der Klone für das Binden mit Antigen X

46 Herstellung von Hybridomzellen 36. Zellfusion Selektive Nährflüssigkeit: Nur die Hybridzellen teilen sich Plasmazelle Tumorzelle (Myelom) Heterokaryon Hybridomzelle

47 Rekombinante Antitkörper 36. Schwere Kette Variable Region Leichte Kette Konstante Region Papain Enzym Antikörper Gen giii Gen Bakteriophag Fab Fragment (Antigenbindung) giii Proteine Fc Fragment (physiologische Wirkungen) Disulfidbund Antikörper Fab Fragment

48 Antibiotiken 38. Bakterium Pilz Alexander Fleming Penizillin verhindert das Wachsen von Bakterien

49 Antibiotiken 38. Wirkung der Antibiotika Wie währt sich das Bakterium? Antibiotikum DNA Struktur und Funktion (Nitrimidazol)