RIDA FLUOR Legionella IgG (3 Pools)

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1 RIDA FLUOR Legionella IgG (3 Pools) Art. Nr.: I8521 I8525 I8521C00 I8521C01 R-Biopharm AG, An der neuen Bergstraße 17, D Darmstadt, Germany Tel.: +49 (0) / Fax: +49 (0)

2 1. Allgemeines Für die in vitro Diagnostik. RIDA FLUOR Legionella IgG ist ein indirekter Immunfluoreszenztest (IFT) zur Bestimmung von Antikörpern gegen Legionella pneumophila der Serogruppe 1-14 und der non-pneumophilen Spezies von Legionella in humanem Serum. 2. Einleitung Legionella pneumophila ist der Erreger der Legionärskrankheit. Die Krankheit wurde so benannt, weil es im Jahre 1976 in Philadelphia auf einer Versammlung der American Legion zu einem Ausbruch kam. Die Legionärskrankheit äußert sich als akute, fiebrige Erkrankung des Respirationstraktes und zeigt ein breites klinisches Bild von milden Verläufen bis hin zur Pneumonie mit tödlichem Ausgang. Bekannte Risikofaktoren sind Rauchen, Alkoholmissbrauch, Immunsuppression oder zusätzliche Lungenerkrankungen. Kinder und ältere Menschen sind besondere Risikogruppen. Legionellen sind begeißelte, gramnegative Stäbchen. Legionella pneumophila ist der Verursacher von % der dokumentierten Legionella-Infektionen, wobei der Serotyp 1 in mehr als 70 % der Fälle vorkommt. 3. Testprinzip Inaktivierte Legionellen der Spezies pneumophila und non-pneumophila sind in unterschiedlicher Zusammensetzung (Pool I - III) auf Objektträgern mit definierten Feldern fixiert. Auf die Felder werden verdünnte Serumproben aufgetragen. Sind Antikörper gegen Legionellen in den Seren vorhanden, binden diese an die Oberflächenproteine der Legionellen. Nach einem Waschschritt, durch den die nicht gebundenen Antikörper entfernt werden, erfolgt die Zugabe eines FITC-markierten Anti- Human-IgG-Immunglobulins, das die Antigen-Antikörper-Komplexe sichtbar macht. Nach einem weiteren Waschschritt zur Entfernung überschüssigen Konjugates kann der Test in einem Fluoreszenzmikroskop bei 400facher Vergrößerung ausgewertet werden. RIDA FLUOR Legionella IgG (3 Pools)

3 4. Packungsinhalt Tab. 1: Packungsinhalt Slide 10 Stck. Objektträger mit je 30 Feldern; einzeln eingeschweißt; Beschichtung s. Tab. 2 Die Bakterien sind in 0,5% Dottersack suspendiert Buffer 1 Ampulle Wasch-/Verdünnungspuffer (PBS Salz, ph 7,2); für Verdünnung in 1 L Aqua dest. Control IgG + 0,2 ml Positivkontrolle IgG; positives Testserum, gebrauchsfertig; enthält NaN 3 Control IgG 0,2 ml Negativkontrolle IgG; negatives Testserum, gebrauchsfertig; enthält NaN 3 Conjugate IgG 2 x 1,1 ml 2 Ampullen anti-human-igg-fitc-konjugat; FITC-markierter Antikörper; gebrauchsfertig, mit Evans Blau zur Gegenfärbung; enthält Phosphatpuffer mit Proteinstabilisator und NaN 3 MF 3,0 ml Eindeckmedium; gepuffertes Glyzerol, gebrauchsfertig, enthält NaN 3 Zusätzlich zu dem Testkit RIDA FLUOR Legionella IgG (3 Pools) (Art.-Nr. I8521) ist auch der Zubehörkit RIDA FLUOR Legionella IgG Slides (3 Pools) (Art-Nr.I8525) erhältlich. Dieser beinhaltet ausschließlich 10 Objektträger mit der Beschichtung wie in Tabelle 2 dargestellt. Die Negativkontrolle (Art.-Nr. I8521C00) und die Positivkontrolle (Art.-Nr. I8521C01) sind ebenfalls separat erhältlich. Tab. 2: Beschichtung der Objektträger Beschichtung I8521/I8525 (3 Pools) obere Reihe: L. p. Serogruppe 1-6 (Pool I) mittlere Reihe: L. p. Serogruppe 7-14 (Pool II) untere Reihe: L. boz (SG1+2)-dum-gor-jord-longb (SG1+2)-mic (Pool III) 5. Reagenzien und ihre Lagerung Das Testkit ist bei einer Lagerung von 2 8 C bis zu dem auf dem Etikett aufgedruckten Verfallsdatum verwendbar. Der rekonstituierte Waschpuffer ist bei einer Lagerung von 2 8 C vier Monate haltbar. Nach Erreichen des Verfallsdatums kann keine Qualitätsgarantie mehr übernommen werden. Eine Kontamination der Reagenzien ist zu vermeiden. RIDA FLUOR Legionella IgG (3 Pools)

4 6. Zusätzlich benötige Reagenzien erforderliches Zubehör 6.1. Reagenzien - Destilliertes Wasser 6.2. Zubehör - Probenröhrchen - Mikropipetten für µl und µl Volumina - Feuchte Kammer - Waschwanne für Objektträger - Deckgläschen (24 x 60 mm) - Fluoreszenzmikroskop 7. Vorsichtsmaßnahmen Nur für die in vitro Diagnostik. Dieser Test ist nur von geschultem Laborpersonal durchzuführen. Die Richtlinien zur Arbeit in medizinischen Laboratorien sind zu beachten. Die Gebrauchsanweisung zur Durchführung des Tests ist strikt einzuhalten. Proben oder Reagenzien nicht mit dem Mund pipettieren, Kontakt mit verletzter Haut oder Schleimhäuten vermeiden. Während des Umgangs mit Proben Einmal- Handschuhe tragen und nach Abschluss des Tests die Hände waschen. In den Bereichen, in denen mit den Proben oder den Test-Reagenzien gearbeitet wird, nicht rauchen, essen oder trinken. Die im Kit befindlichen Kontrollseren (Positivkontrolle und Negativkontrolle) wurden auf HIV- und HCV-Ak sowie HbsAg untersucht und für negativ befunden. Dennoch sollten sie, ebenso wie die Patientenproben und alle Materialien, die mit ihnen in Berührung kommen, als potentiell infektiös behandelt und entsprechend den jeweiligen nationalen Sicherheitsbestimmungen gehandhabt werden. Sämtliche Reagenzien und Materialien, die mit potentiell infektiösen Proben zusammenkommen, müssen mit geeigneten Desinfektionsmitteln behandelt oder mindestens eine Stunde bei 121 C autoklaviert werden. Objektträger und Reagenzien dürfen nicht verwendet werden, wenn ihre Verpackung beschädigt ist oder die Gefäße undicht sind. RIDA FLUOR Legionella IgG (3 Pools)

5 Reagenzien aus Kits unterschiedlicher Chargennummer oder von anderen Herstellern dürfen nicht verwendet werden. Aufgrund des Natriumazidgehaltes (Konz <0,1%) ist der Kontakt von Konjugat, Eindeckmedium und Kontrollen mit Säuren und Schwermetallen zu vermeiden. Aufgrund des Glyzerolgehaltes ist der Kontakt des Eindeckmediums mit Säuren zu vermeiden. Keinen hohen Temperaturen aussetzen. Evans Blau (Konz <0,1%) ist krebserregend. Haut- und Augenkontakt vermeiden. Betroffene Flächen bei Kontakt mit Wasser abwaschen und einen Arzt konsultieren. Das Kit enthält Glaselemente, die bei Bruch zu Körperverletzungen führen können. 8. Sammlung und Lagerung der Proben Die RIDA FLUOR Legionella Tests sind für die Untersuchung humaner Serumproben entwickelt worden. Nach der Blutentnahme sollte zur Vermeidung einer Hämolyse das Serum möglichst schnell vom Blutkuchen getrennt werden. Die Proben sind bis zur Testung kühl oder gefroren zu lagern. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen von Proben ist unbedingt zu vermeiden, ebenso mikrobielle Kontamination. Die Verwendung von Hitze inaktivierten, lipämischen, hämolytischen, ikterischen oder trüben Proben kann zu verfälschten Ergebnissen führen. Tab. 3: Probenlagerung unverdünntes Serum verdünntes Serum 2 8 C 20 C 2 8 C 1 Woche > 1 Woche 7 Stunden 9. Testdurchführung 9.1. Allgemeines Vor Verwendung sind alle Reagenzien und die Objektträger auf Raumtemperatur (20 25 C) zu bringen. Die Objektträger sind erst nach Erreichen der Raumtemperatur der Schutzfolie zu entnehmen und auf dem Mattfeld zu beschriften. Die Reagenzien sind unmittelbar vor der Verwendung gut zu mischen. Nach dem Gebrauch ist das Kit sofort wieder bei 2 8 C zu lagern. Es sollte nur soviel Reagenz entnommen werden, wie für die Durchführung des Tests benötigt wird. Überschüssiges Reagenz darf nicht in die Gefäße zurückgegeben RIDA FLUOR Legionella IgG (3 Pools)

6 werden, da dies zu einer Kontamination führen kann. Jeder Objektträger ist nur einmal zu benutzen. Er darf weder geteilt noch dürfen unbenutzte Felder wieder verwendet werden Herstellung des Wasch-/Verdünnungspuffers Den Inhalt der Ampulle Buffer auf 1 Liter destilliertes Wasser geben und bis zur vollständigen Auflösung rühren. Der verdünnte Waschpuffer ist bei einer Lagerung von 2 8 C vier Wochen, bei einer Lagerung bei Raumtemperatur (20 25 C) fünf Tage haltbar Vorbereitung der Proben Die zu untersuchenden Serumproben werden vor Testbeginn 1:64 und 1:128 mit dem Wasch-/ Verdünnungspuffer verdünnt z. B. 10 µl Serum µl Puffer für die 1:64 Verdünnung. Gegebenenfalls sollten hoch positive Seren mit dem Verdünnungspuffer weiter titriert werden. Achtung! Positiv- und Negativkontrollen sind gebrauchsfertig und werden ohne Verdünnung im Test eingesetzt Erste Inkubation Die Objektträger Slide sind in einzelne Felder unterteilt. Jede Reihe bestehend aus zehn Feldern ist mit einem anderen Pool (I - III) beschichtet (Beschichtung siehe Tabelle 2). Für die Durchführung des Tests werden jeweils 5 µl verdünntes Patientenserum der 1:64 und 1:128-Verdünnung auf jeweils ein Feld je Pool aufgetragen (siehe Abb. 1). Die hydrophobe Beschichtung zwischen den Feldern verhindert eine Vermischung der Proben. Von der Positivkontrolle Control IgG + und der Negativkontrolle Control IgG - werden ebenfalls 5 µl auf jeweils ein Feld je Pool aufgetragen (siehe Abb. 1). Anschließend werden die Objektträger für 30 Minuten bei 37 C in einer feuchten Kammer inkubiert. RIDA FLUOR Legionella IgG (3 Pools)

7 Abb. 1: Beschichtung der Objektträger und empfohlene Belegung mit Kontrollen und Patientenproben Kontrolle Kontrolle Probe 1 Probe 2 Probe 3 Probe 4 Negativ Positiv 1:64 1:128 1:64 1:128 1:64 1:128 1:64 1:128 I neg. pos. II neg. pos. III neg. pos. Pool I: Serogruppe 1-6 Pool II: Serogruppe 7-14 Pool III: L.b-d-g-j-l-m 9.5 Waschen Die Objektträger werden kurz mit Waschpuffer abgespült und danach 10 Minuten in frischem Waschpuffer stehen gelassen. Nochmals leicht mit destilliertem Wasser abspülen und die Flüssigkeit gut abschlagen. Die Felder müssen für die nachfolgenden Schritte trocken sein. 9.6 Zweite Inkubation Jeweils 5 µl Anti-human-IgG-FITC-Konjugat Conjugate IgG auf die Felder auftragen. Anschließend werden die Objektträger für 30 Minuten bei 37 C in einer feuchten Kammer inkubiert Waschen Waschen gemäß Pkt Mikroskopie Für die Auswertung wird auf jedes Feld ein kleiner Tropfen Eindeckmittel MF gegeben und das Deckgläschen luftblasenfrei auf den Objektträger aufgelegt. Überschüssiges Eindeckmittel wird vorsichtig herausgedrückt. Die Auswertung erfolgt am Fluoreszenzmikroskop bei 400facher Vergrößerung. Im Fall von positiven Befunden bei beiden Screening-Verdünnungen werden weitere Serumverdünnungen bis 1:2048 empfohlen um so den Endtiter zu bestimmen. RIDA FLUOR Legionella IgG (3 Pools)

8 10. Qualitätskontrolle - Anzeichen für Reagenzienverfall Für die Qualitätskontrolle sind bei jeder Testdurchführung Positivkontrolle und Negativkontrolle mitzuführen. Der Test ist korrekt verlaufen, wenn die Positivkontrolle eine spezifische Fluoreszenz aufweist und die Negativkontrolle keine Fluoreszenz zeigt. Die spezifische Fluoreszenz ist eine leuchtend, apfelgrüne Färbung, die in gleichmäßiger Verteilung im gesamten Antigenfeld an der Zelloberfläche der stäbchenförmigen Legionellen sichtbar ist. Zeigt die Positivkontrolle keine Reaktion mehr, d.h. die Zelloberflächen fluoreszieren nur noch schwach und eine homogene Verteilung der Fluoreszenz innerhalb des Antigenfeldes ist nicht erkennbar, kann dies ein Hinweis auf Reagenzienverfall sein. Sollten die Bedingungen nicht erfüllt sein, ist vor einer Testwiederholung folgendes zu überprüfen: - Haltbarkeit der verwendeten Reagenzien - Funktionsfähigkeit der eingesetzten Geräte (Pipetten, Mikroskop) - Korrekte Testdurchführung - Visuelle Kontrolle der Kitkomponenten auf Kontamination oder Undichtigkeit Sind nach Testwiederholung die Bedingungen wiederum nicht erfüllt, wenden Sie sich bitte an den Hersteller oder Ihren lokalen R-Biopharm Distributor. 11. Auswertung und Interpretation Für die positive Bewertung eines Serums ist eine spezifische Fluoreszenz ausschlaggebend. Die spezifische Fluoreszenz ist eine leuchtend, apfelgrüne Färbung, die in gleichmäßiger Verteilung im gesamten Antigenfeld an der Zelloberfläche der stäbchenförmigen Legionellen sichtbar ist. Es können sowohl einzelne als auch mehrere Serogruppen fluoreszieren. Die Intensität der Fluoreszenz kann unterschiedlich sein, von kaum sichtbar bis hell leuchtend. Ist keine spezifische Fluoreszenz sichtbar, ist das Ergebnis negativ zu bewerten. RIDA FLUOR Legionella IgG (3 Pools)

9 12. Grenzen der Methoden Die RIDA FLUOR Legionella-Tests weisen spezifisch Antikörper gegen Legionellen nach. Sie sollten bei begründetem Verdacht auf eine Infektion mit Legionellen durchgeführt werden. Ein Zusammenhang zwischen der Intensität der erzielten Fluoreszenz und dem Auftreten oder der Schwere klinischer Symptome kann nicht abgeleitet werden. Die erzielten Ergebnisse sind immer in Verbindung mit dem klinischen Bild und anderen diagnostischen Ergebnissen zu interpretieren. Dieser Test zeigt nicht den Infektionsort. Er kann eine Erregerisolierung nicht ersetzen. Sehr früh im Verlauf einer Infektion genommene Proben können eventuell keine erkennbaren IgG-Anteile enthalten. In diesen Fällen wird die Durchführung einer IgM- Bestimmung oder eine zweite Probenentnahme nach Ablauf von 14 bis 21 Tagen empfohlen, die dann zur Bestimmung einer Serokonversion parallel zur Originalprobe zu testen ist. Der Nachweis von IgG gegen Legionellen bei Neugeborenen ist mit Vorsicht zu interpretieren, da Mutter-IgG vor der Geburt passiv von der Mutter auf den Fetus übertragen wird. Bei Kindern unter 6 Monaten ist die IgM-Bestimmung der bessere Infektionsindikator. Manche Sera können Antikörper aufweisen, die mit Ei-Antigenen reagieren. Die Antigene werden in 0,5% Dottersack suspendiert um die Haftung des Antigens zu verbessern und die Bakterienaggregation zu verhindern. Dadurch kann eine Bodenfluoreszenz entstehen. In diesen Fällen können diese Seren nicht mit der Immunfluoreszenztechnik analysiert werden. Patientenseren mit einem Titer von 1:<128 gelten als negativ. Ein negatives Ergebnis schließt eine Infektion nicht aus, da die Serumentnahme zu einem so frühen Zeitpunkt erfolgt sein kann, dass Antikörper noch nicht nachweisbar sind. Bei begründetem Verdacht auf eine Infektion mit Legionellen und negativem serologischen Befund sollte deshalb nach zwei Wochen eine weitere Probenentnahme und Testung erfolgen. Ein Titer von 1:128 wird als grenzwertig eingestuft. Es kann ein Resttiter einer früheren Infektion oder ein Anzeichen der beginnenden Antikörperbildung im Laufe einer neuen Infektion sein. Deshalb sollte nach zwei Wochen eine zweite Serumprobe untersucht werden. RIDA FLUOR Legionella IgG (3 Pools)

10 Titer von 1: 256 gelten als positiv. Zum Nachweis einer akuten Infektion sollte der Titerverlauf bei zwei sukzessive gewonnenen Serumproben bestimmt werden. Ein vierfacher Titeranstieg gilt als beweisend für eine frische Infektion. Generell sollten bei serologischen Untersuchungen zur Verbesserung der diagnostischen Aussage immer zwei sukzessiv entnommene Seren eines Patienten untersucht werden. Ein positives Ergebnis schließt die Anwesenheit anderer infektiöser Erreger als Ursache für eine Erkrankung nicht aus. 13. Leistungsmerkmale Inter-Assay-Varianz (n = 3) Es wurden 3 Seren (2 positiv, 1 negativ) titriert und einzeln unter 5 verschiedenen Bedingungen pipettiert. Unterschiede hierbei waren die Personen, die den Test durchführten oder der Durchführungstag. In keinem Fall waren Schwankungen über eine Titerstufe fest zu stellen. Intra-Assay-Varianz (n = 3) Es wurden 3 Seren (2 positiv und 1 negativ) titriert und einzeln unter identischen Arbeitsbedingungen von derselben Person in einem Versuch abgearbeitet. Sensitivität und Spezifität im Vergleich zu einem anderen kommerziellen IFA-Test n = 41 Sensitivität Spezifität IgG 87,5% 93,9% Die Seren, die keine spezifische Reaktion aufwiesen, wurden aus den Endberechnungen ausgeschlossen. Kreuzreaktivität und Interferenzen Zur Überprüfung von Kreuzreaktivitäten oder Interferenzen wurden 12 für Mycoplasma pneumoniae, Chlamydophila pneumoniae und Coxiella burnettii sowie für antinukleäre Antikörper bekannte positive Proben getestet. Die getesteten Proben ergaben negative Ergebnisse wodurch eine Kreuzreaktivität zu diesen Erregern ausgeschlossen wurde. RIDA FLUOR Legionella IgG (3 Pools)

11 Literatur 1. Bangsborg.J.M., Shand G., Pearlman E., and Hoiby, 1991, Cross-reactive Legionella antigens and the antibody response during infection, APMIS 99: Bettelheim, K.A., Metcalfe R.V., and Sillars H., 1982, Levels of antibody against Legionella pneumophila serotype I in healthy populations in five areas in New Zealand, J.Clin.Microbiol 16: Bornstein N., Fleurette J., 1983, Comparison of microagglutination with the indirect immunofluorescence assay for the diagnosis of infection with Legionella pneumophila serogroup I, Eur J Clin Microbiol 2: De Ory, F., Echevarria, J.M., Pelaz C., Tellez A., Mateo M.A., and Lopez J, 2000, Detection of specific IgM antibody in the investigation of an outbreak of pneumonia due to Legionella pneumophila serogroup I, Clin Microbiol Infect 6: Edelstein P.H., 1992, Detection of antibodies to Legionella, p 459 RIDA FLUOR Legionella IgG (3 Pools)