SOP-Doku PVP-ASA- 15/2-HYD. Probenvorbereitungen. Hydrolyse von Proteinen. Version 1.3 /

Transkript

1 SOP-Doku PVP-ASA- 15/2-HYD Probenvorbereitungen Version 1.3 / SYKAM Chromatographie Vertriebs GmbH Carl-von-Linde-Straße 2 D Fürstenfeldbruck

2 1 of Inhaltsverzeichnis 1 Zusammenfassung: Methodenübersicht Freie Aminosäuren Gesamtaminosäuren Eiweißgebundene Aminosäuren Chemikalien: Sulfosalicylsäure DL Norleucin (IS) ,1 N Salzsäure Salzsäure Wasserstoffperoxid Thiodiglycol Ameisensäure Natriumdisulfit Natriumhydroxid Natriumchlorid Petrolether Phenol Amino Acid Calibration Solution H Amino Acid Calibration Solution H-Ox Stickstoffgas (< 10 ppm Sauerstoff) Probenverdünnungspuffer (Li) Probenverdünnungspuffer (Na) Elutionspuffer A-1 (Na) Elutionspuffer B-1 (Na) Regenerationslösung (Na) Ninhydrin Demineralisiertes Wasser Gerätschaften Zentrifuge für Eppendorf Reaktionsgefäße Eppendorf Reaktionsgefäße 2 ml Reaktionsgefäße Duran 20 ml mit Schraubdeckel Temperaturstabile Gestelle für Reaktionsgefäße Kühlschrank (7 C) Gefrierschrank (- 15 C) Trockenschrank Vakuum-Excikator Variable Pipetten Messkolben Analysenwaage (0,1 mg) Vortexer Laborschüttler Schraubdeckelflaschen Glas 1,5 ml... 13

3 2 of 5 Angesetzte Reagenzien mmol/l Norleucin Stammlösung Fällungsreagenz A 30 % SSA Fällungsreagenz B 10 % SSA Natriumhydroxidlösung, c = 7,5 mol/l Natriumhydroxidlösung, c = 1 mol/l Phenolhaltige Ameisensäurelösung Extraktionslösung, c = 0,1 mol HCl/l, Oxidationsmischung (Perameisensäure-Phenol) Fällungsreagenz A 30 % SSA mit IS (1,8 µmol/ml NorLeu) Fällungsreagenz B 10 % SSA mit IS (0,5 µmol/ml NorLeu) AS Kalibrierlösung mit IS Norleucin Konfektioniertes Mikroreaktionsgefäss mit Fällungsreagenz A Konfektioniertes Mikroreaktionsgefäss mit Fällungsreagenz B Probenvorbereitung Bestimmung des Gehaltes an freien Aminosäuren (amtliche Methode) Bestimmung des Gehaltes an freien Aminosäuren (Haus Methode) Oxidation im Protein (amtliche Methode) Oxidation im Protein (Haus Methode) Hydrolyse des nicht oxidierten Proteins (amtliche Methode) Hydrolyse des nicht oxidierten Proteins (Haus Methode) Hydrolyse des oxidierten Proteins (amtliche Methode) Hydrolyse des oxidierten Proteins (Haus Methode) Basische Hydrolyse des nicht oxydierten Proteins (Haus Methode) Analysenbedingungen: Tabelle 1: Reagenzien Tabelle 2: Analysenprogramm für die Bestimmung von Aminosäuren in hydrolysiertem Probenmaterial Tabelle 3: Aminosäuren Kalibrierstandard H für Protein Hydrolysat Mitgeltende Unterlagen Historie Genehmigungsprotokoll Erstellt/bearbeitet: K.-H. Jansen/GF Formale Überprüfung: M.Jansen/IL Fachliche Überprüfung: M.Hornung/TS QS-Überprüfung + : Dr. M. Lappé/LQS Doku-: M.Jansen/IL Prüfung auf Aktualität: K.-H. Jansen/GF Anhang...

4 3 of 1 Zusammenfassung: Die vorliegende Zusammenstellung von Hydrolysemethoden dokumentiert sowohl die klassischen Verfahren (VDLUFA-Verbandsmethode Aminosäuren / AOAC Official Method Amino Acids in FEED und die im Amtsblatt der Europäischen Union veröffentlichte Verordnung (EG) Nr.152/2009) wie auch angepasste Mikromethoden, die einen geringeren Aufwand erfordern. Die hier aufgeführten Methoden werden in unserem Labor angewendet und permanent einer internen und vergleichenden Qualitätskontrolle mit standardisierten Futtermitteln bekannter Zusammensetzung und Konzentration überprüft. Trotz allem stellen sie nur Anregungen für den täglichen Analysenbetrieb dar. Es kann keine Garantie übernommen werden, dass sich bei allen Probenmaterialien die gleichen Analysenergebnisse im Vergleich der klassischen Verfahren zu den Mikromethoden ergeben. Jedes Analysenlabor muss Abweichungen zu den amtlichen Verfahren eigenständig validieren und begründen. Bei der klassischen Methode wird primär aus der Verordnung Nr. 152/2009 zur Festlegung der Probenahmeverfahren und Analysenmethoden für die amtliche Untersuchung von Futtermitteln unter dem Synonym amtliche Methode zitiert. Der SYKAM Aminosäureanalysator mit den definierten Analysenmethoden unterscheidet sich in seiner Bedienung und Arbeitsweise nicht von den eingesetzten Probenvorbereitungen, so dass bei zusätzlicher alternativer Probenvorbereitung vorbereitend ausreichende statistische Ergebnisse für eine geänderte Prozedur ermittelt werden können. Das Analysenverfahren dient der Bestimmung von Aminosäuren in proteinhaltigen Probematerialien wie Futtermittel, getrockneten Lebensmittel, Pflanzenteile und ähnlichen physiologischen Materialien. Die eiweißgebundenen Aminosäuren werden mit den supplementierten oder natürlich frei vorkommenden zusammen erfasst. Sollten ausschließlich die eiweißgebundenen Aminosäuren analysiert werden, so muss das Probenmaterial vor der Hydrolyse mit geeigneten Extraktions-Verfahren von freien Aminosäuren gereinigt werden.

5 4 of Es können folgende Aminosäuren erfasst werden: Aminosäure Amino acid Dreibuchstabencode Einbuchstabencode 1 Asparaginsäure aspartic acid ASP D 2 Threonin threonine THR T 3 Serin serine SER S 4 Glutaminsäure glutamic acid GLU E 5 Prolin proline PRO P 6 Glycin glycine GLY G 7 Alanin alanine ALA A 8 Cystin cystine CYS C 9 Valin valine VAL V 10 Methionin methionine MET M 11 Isoleucin isoleucine ILE I 12 Leucin leucine LEU L 13 Tyrosin tyrosine TYR Y 14 Phenylalanin phenylalanine PHE F 15 Histidin histidine HIS H 16 Lysin lysine LYS K 17 Arginin arginine ARG R Tabelle 1: nachweisbare Aminosäuren im Hydrolysatprogramm (Essentielle sind gelb, semi-essentiell blau markiert) Die Analysenmethode ist nicht für Tryptophan oder Methionin Hydroxyanalog anwendbar.

6 5 of 2 Methodenübersicht Das Resultat der Aminosäurenbestimmung richtet sich nach der Art der Probenvorbehandlung. Man unterscheidet hierbei drei prinzipielle Klassifizierungen, die im Folgenden kurz beschrieben werden. 2.1 Freie Aminosäuren Die freien Aminosäuren werden mit verdünnter Salzsäure extrahiert. Mitextrahierte stickstoffhaltige Makromoleküle werden mit Sulfosalicylsäure ausgefällt und durch Filtrieren entfernt. Die filtrierte Lösung wird auf einen ph-wert von 2,20 eingestellt (amtliche Methode). Alternativ kann das Probenmaterial auch direkt mit dem Probenvorbereitungspuffer (PVP) für die jeweilige Aminosäuren Bestimmung (Li oder Na) extrahiert und nach Ultrafiltration oder Proteinfällung (siehe SOP PVP-ASA_15-1-SSA) direkt injiziert werden. Die Aminosäuren werden durch Ionenaustauschchromatografie getrennt und nach Reaktion mit Ninhydrin durch fotometrischen Nachweis bei 570 nm bestimmt. Für den Nachweis von extrahierten Aminosäuren empfiehlt sich ein erweitertes Hydrolysatprogramm (+ Tau, Trp, Orn) oder gleich ein physiologisches Kurzprogramm. 2.2 Gesamtaminosäuren Die gewählte Methode hängt von den zu untersuchenden Aminosäuren ab. Cyst(e)in und Methionin müssen vor der Hydrolyse zu Cysteinsäure bzw. Methioninsulfon oxidiert werden. Tyrosin muss im Hydrolysat der nicht oxidierten Probe bestimmt werden. Alle übrigen unter Tabelle: 1 genannten Aminosäuren können aus dem Hydrolysat der oxidierten oder der nicht oxidierten Probe bestimmt werden. Die Oxidation wird bei 0 C mit einer Perameisensäure-Phenol-Mischung durchgeführt. Überschüssiges Oxidationsreagenz wird mit Natriumdisulfit zerstört. Die oxidierte bzw. die nicht oxidierte Probe wird mit Salzsäure (3.20) 23 h lang hydrolysiert. Das Hydrolysat wird auf einen ph-wert von 2,20 eingestellt (amtliche Methode).

7 6 of Alternativ kann nach der Hydrolyse die HCl abgedampft oder abrotiert werden und der Rückstand in PVP aufgenommen werden. Die Aminosäuren werden durch Ionenaustauschchromatografie getrennt und nach Reaktion mit Ninhydrin fotometrisch bei 570 nm (bei Prolin 440 nm) bestimmt. 2.3 Eiweißgebundene Aminosäuren Soweit es sich nicht um eine aufgearbeitete Proteinprobe handelt, muss das Probenmaterial von supplementierten Aminosäuren extrahiert werden. Hierzu wird das Probenmaterial, wie schon unter 2.1 erwähnt mit Salzsäure extrahiert, filtriert und das Filtrat vor der sauren Hydrolyse (2.2) mit dem abzentrifugierten SSA Rückstand (mitextrahierte stickstoffhaltige Makromoleküle ) vereinigt. Die Aminosäuren werden durch Ionenaustauschchromatografie getrennt und nach Reaktion mit Ninhydrin fotometrisch bei 570 nm (bei Prolin 440 nm) bestimmt.

8 7 of 3 Chemikalien: Die aufgeführten Chemikalien sind ausführlich mit Lieferant, Katalog Nr. und Packungsgröße definiert. Es besteht jedoch in dieser SOP keine Bindung an die aufgeführten Lieferanten; vergleichbare Qualitäten sind ohne gesonderten Verweis einsetzbar. 3.1 Sulfosalicylsäure 5-Sulfosalicylic acid dihydrate, Lieferant: SIGMA-ALDRICH Katalog Nr.: M 254, DL Norleucin (IS) DL Norleucine Lieferant: Katalog Nr.: M 131,17 SIGMA-ALDRICH N 1398 Sigma 3.3 0,1 N Salzsäure Salzsäure 0,1 mol/l (0,1 N), gebrauchsfertig Lieferant: Merck Millipore Formel: HCl MW: 36,46 g/mol Dichte: 1,004 g/cm³ (25 C) Katalog Nr.:

9 8 of 3.4 Salzsäure Salzsäure 37% EMSURE ACS, ISO, Reag. Ph. Eur. zur Analyse Artikel-Nr: VE: 1 * 2,5 l Lieferant: Merck Millipore Formel: HCl MW: 36,46 g/mol Siedepunkt: 110 C (1013 hpa) Melting Pt: -30 C Dichte: 1,18 g/cm³ (20 C) 3.5 Wasserstoffperoxid Wasserstoffperoxid 50% GPR RECTAPUR Lieferant: VWR Chemicals Formel: H₂O₂ MW: 34,01 g/mol Siedepunkt: 126 C (1013 hpa) Melting Pt: -40 C Dichte: 1,19 g/cm³ (20 C) Katalog Nr.: Thiodiglycol Artikel-Nr: SAFA G VE: 1 * 500 g Lieferant: Sigma-Aldrich Formel: S(CH₂CH₂OH)₂ MW: 122,19 g/mol Siedepunkt: 282 C (1013 hpa) Melting Pt: -10 C Dichte: 1,18 g/cm³ (20 C) Flash-Pt: 113 C (geschlossener Becher)

10 9 of 3.7 Ameisensäure Ameisensäure % EMSURE ACS, Reag. Ph. Eur. zur Analyse Artikel-Nr: Lieferant: Merck Millipore 3.8 Natriumdisulfit Natriummetabisulfit EMSURE ACS, Reag. Ph. Eur. zur Analyse Formel: Na₂S₂O₅ MW: 190,11 g/mol Melting Pt: 150 C Dichte: 1,48 g/cm³ (20 C) Artikel-Nr: VE: 1 * 100 g Lieferant: Merck Millipore 3.9 Natriumhydroxid Natriumhydroxid, Plätzchen EMSURE zur Analyse Artikel-Nr: VE: 1 * 1 kg Lieferant: Merck Millipore Formel: NaOH MW: 40 g/mol Siedepunkt: 1390 C (1013 hpa) Melting Pt: 323 C Dichte: 2,13 g/cm³ (20 C)

11 10 of 3.10 Natriumchlorid Natriumchlorid EMSURE ACS, ISO, Reag. Ph. Eur. zur Analyse Artikel-Nr: VE: 1 * 1 kg Lieferant: Merck Millipore Formel: NaCl MW: 58,44 g/mol Siedepunkt: 1413 C (1013 hpa) Melting Pt: 801 C Dichte: 2,16 g/cm³ (20 C) 3.11 Petrolether Petroleumbenzin C EMSURE ACS, ISO zur Analyse Artikel-Nr: VE: 1 * 10 l Lieferant: Merck Millipore Siedepunkt: 40 bis 60 C (1013 hpa) Dichte: 0,65 g/cm³ (20 C) Flash-Pt: -40 C 3.12 Phenol Phenol, einzelne Kristalle AnalaR NORMAPUR ACS, Reag. Ph. Eur. zur Analyse Artikel-Nr: VE: 1 * 250 g Lieferant: VWR Chemicals Formel: C₆H₅OH Siedepunkt: 181,8 C (1013 hpa) Melting Pt: 40,8 C Dichte: 1,06 g/cm³ (20 C)

12 11 of 3.13 Amino Acid Calibration Solution H 17 Aminosäuren und Ammoniak zwischen 1,25 µmol/ml und 2,5 µmol/ml in 5 ml 0,1 N HCl/0,1 % Phenol für die Hydrolisatbestimmung Lieferant: SYKAM Chr.Vertr. GmbH Katalog Nr.: Amino Acid Calibration Solution H-Ox 19 Aminosäuren und Ammoniak mit 1,00 µmol/ml in 5 ml 0,1 N HCl/0,1 % Phenol für die Hydrolisatbestimmung nach Oxidation Lieferant: SYKAM Chr.Vertr. GmbH Katalog Nr.: Stickstoffgas (< 10 ppm Sauerstoff) Probenverdünnungspuffer (Li) Probenverdünnungspuffer/Li, 0,12 N, ph 2,2 Lieferant: SYKAM Chr.Vertr. GmbH Katalog Nr.: Probenverdünnungspuffer (Na) Probenverdünnungspuffer/Na, 0,12 N, ph 2,2 Lieferant: SYKAM Chr.Vertr. GmbH Katalog Nr.:

13 12 of 3.18 Elutionspuffer A-1 (Na) Na-Citrat-puffer/Na, 0,12 N, ph 3.45 Lieferant: SYKAM Chr.Vertr. GmbH Katalog Nr.: Elutionspuffer B-1 (Na) Na-Citrat-puffer/Na, 0,2 N, ph Lieferant: SYKAM Chr.Vertr. GmbH Katalog Nr.: Regenerationslösung (Na) NaOH-Lsg /Na, 0,45 N, Lieferant: SYKAM Chr.Vertr. GmbH Katalog Nr.: Ninhydrin 2-Komponenten Fertigninhydrin-Reagenz, Lieferant: SYKAM Chr.Vertr. GmbH Katalog Nr.: Demineralisiertes Wasser Steril filtriert, Leitfähigkeit > 0,1 µs

14 13 of 4 Gerätschaften 4.1 Zentrifuge für Eppendorf Reaktionsgefäße 4.2 Eppendorf Reaktionsgefäße 2 ml 4.3 Reaktionsgefäße Duran 20 ml mit Schraubdeckel 4.4 Temperaturstabile Gestelle für Reaktionsgefäße 4.5 Kühlschrank (7 C) 4.6 Gefrierschrank (- 15 C) 4.7 Trockenschrank 4.8 Vakuum-Excikator 4.9 Variable Pipetten 4.10 Messkolben 4.11 Analysenwaage (0,1 mg) 4.12 Vortexer Laborschüttler 4.13 Schraubdeckelflaschen Glas 1,5 ml

15 14 of 5 Angesetzte Reagenzien mmol/l Norleucin Stammlösung 262,3 mg Norleucin (2.2) werden mit ca. 50 ml 0,1 N HCl (2.3) in ein 100 ml Becherglas überführt und bis zur vollständigen Löslichkeit auf einem Magnetrührer mit einem Magnetfisch gerührt. Die Lösung wird vollständig in einen 100 ml Messkolben überführt und mit 0,1 N HCl bis zur Marke aufgefüllt. Diese Lösung entspricht 20 mmol (2,62 g/l) DL Norleucin. Überführt in eine Braunglasflasche ist diese Lösung bei 7 C 1 Jahr stabil. 5.2 Fällungsreagenz A 30 % SSA 30 g Sulfosalicylsäure werden in einem Becherglas auf ca. 80 ml mit demineralisiertem Wasser aufgefüllt und auf einem Magnetrührer bis zur vollständigen Löslichkeit mit einem Magnetfisch gerührt. Die Lösung wird in einen 100 ml Messkolben überführt und bis zur Marke mit demineralisiertem Wasser aufgefüllt. Überführt in eine Kunststoffflasche ist diese Lösung bei 7 C 1 Jahr stabil. 5.3 Fällungsreagenz B 10 % SSA 10 g Sulfosalicylsäure werden in einem Becherglas auf ca. 80 ml mit demineralisiertem Wasser aufgefüllt und auf einem Magnetrührer bis zur vollständigen Löslichkeit mit einem Magnetfisch gerührt. Die Lösung wird in einen 100 ml Messkolben überführt und bis zur Marke mit demineralisiertem Wasser aufgefüllt. Überführt in eine Kunststoffflasche ist diese Lösung bei 7 C 1 Jahr stabil.

16 15 of 5.4 Natriumhydroxidlösung, c = 7,5 mol/l 300 g NaOH (3.9) in Wasser lösen und auf 1 l auffüllen 5.5 Natriumhydroxidlösung, c = 1 mol/l 40 g NaOH (3.9) in Wasser lösen und auf 1 l auffüllen 5.6 Phenolhaltige Ameisensäurelösung 889 g Ameisensäure (3.7) werden mit 111 g Wasser gemischt; anschließend werden 4,73 g Phenol (3.12) hinzugefügt 5.7 Extraktionslösung, c = 0,1 mol HCl/l, 8,2 ml HCl (3.4) werden in ca. 900 ml Wasser gegeben, 20 ml Thiodiglycol (3.6) hinzugefügt, mit Wasser auf 1 l aufgefüllt (3.4 und 3.6 dürfen nicht unmittelbar gemischt werden). 5.8 Oxidationsmischung (Perameisensäure-Phenol) 0,5 ml Wasserstoffperoxid (3.5) werden mit 4,5 ml phenolhaltiger Ameisensäurelösung (5.6) in einem kleinen Becherglas gemischt. Es wird bei 20 bis 30 C 1 h stehen gelassen, um die Bildung von Perameisensäure zu bewirken. Anschließend wird die Lösung 15 min in ein Eisbad gestellt, bevor sie der Probe zugegeben wird. Vorsicht: Hautkontakt vermeiden und Schutzkleidung tragen.

17 16 of 5.9 Fällungsreagenz A 30 % SSA mit IS (1,8 µmol/ml NorLeu) 9 ml Norleucin Stammlösung (5.1) werden in einem 100 ml Messkolben mit Fällungsreagenz A (5.2) bis zur Marke aufgefüllt. Diese Lösung entspricht 1,8 mmol DL Norleucin. Überführt in eine Braunglasflasche ist diese Lösung bei 7 C 1 Jahr stabil Fällungsreagenz B 10 % SSA mit IS (0,5 µmol/ml NorLeu) 2,5 ml Norleucin Stammlösung (5.1) werden in einem 100 ml Messkolben mit Fällungsreagenz B (5.3) bis zur Marke aufgefüllt. Diese Lösung entspricht 0,5 mmol DL Norleucin. Überführt in eine Braunglasflasche ist diese Lösung bei 7 C 1 Jahr stabil AS Kalibrierlösung mit IS Norleucin 0,4 ml AS Standardlösung H (3.19) werden in einen 10 ml Messkolben überführt. 500 µl Norleucin Stammlösung (5.1) werden zudosiert. Mit PVP-Lösung (3.17) wird bis zur Marke aufgefüllt. Die Lösung enthält Aminosäuren im Konzentrationsbereich zwischen 50 bis 100 nmol/ml (Harnstoff 1 µmol/ml) und eine interne Standardkonzentration von 100 nmol/ml Norleucin. Diese Lösung ist direkt zur Analyse/Kalibrierung einsetzbar und 8 Wochen gekühlt (7 C) haltbar.

18 17 of 5.12 Konfektioniertes Mikroreaktionsgefäss mit Fällungsreagenz A In ein 1,5 ml Polypropylen Mikroreaktionsgefäss (Eppi-Cap) mit Dichtkonus werden 100 µl Fällungsreagenz A (4.4) 30 % SSA mit IS (1,8 µmol/ml NorLeu) pipettiert und verschlossen. Die Reaktionsgefässe werden aufrecht bei -15 C gelagert und können 3 Monate zur Probenvorbereitung verwendet werden Konfektioniertes Mikroreaktionsgefäss mit Fällungsreagenz B In ein 1,5 ml Polypropylen Mikroreaktionsgefäss (Eppi-Cap) mit Dichtkonus werden 500 µl Fällungsreagenz B (4.5) 10 % SSA mit IS (0,5 µmol/ml NorLeu) pipettiert und verschlossen. Die Reaktionsgefässe werden aufrecht bei -15 C gelagert und können 3 Monate zur Probenvorbereitung verwendet werden.

19 18 of 6 Probenvorbereitung Das Probenmaterial muss vollständig homogen, trocken und fettfrei vorliegen. Es muss so fein vermahlen sein, dass es ein Sieb mit 0,5 mm Maschenweite passieren kann. Feuchtes Probenmaterial muss vor der Homogenisierung gefriergetrocknet oder bei 50 C (24 h) luftgetrocknet werden. Probenmaterial mit klar erkennbarem Fettgehalt wird vor dem Vermahlen mit Petrolether extrahiert. 6.1 Bestimmung des Gehaltes an freien Aminosäuren (amtliche Methode). A ca. 1 bis 5 g des vorbereiteten (wie oben beschrieben) Probenmaterials werden genau eingewogen. B in einem 250 ml Becherglas (Hochform) wird das eingewogene Probematerial mit 100 ml Extraktionslösung () versetzt. C mit einem Flügelmagnetfisch wird die Slurry bei mittlerer Geschwindigkeit (Magnetrührer) 60 Minuten gerührt. D Nach dem Absetzen (ca. 20 Minuten) werden mit einer Pipette 10 ml der überstehenden Lösung in ein 100 ml Becherglas gegeben. E Nach Zusatz von 5 ml Fällungsreagenz B wird die Lösung 5 Minuten gerührt. F Die Lösung wird filtriert und davon 10 ml in ein 100 ml Becherglas gegeben. G Unter Verwendung der Natriumhydroxid-Lösung wird der ph-wert auf 2,2 eingestellt. H Die Lösung wird mit Citratpufferlösung in einen 50 ml Meßkolben überführt und bis zur Marke aufgefüllt. Hinweis: Bei Verwendung eines internen Standards werden vor dem Auffüllen 0,5 ml der internen Standard Stammlösung zugesetzt. Das Extrakt ist bei < 5 C 3 Tage lagerfähig.

20 19 of 6.2 Bestimmung des Gehaltes an freien Aminosäuren (Haus Methode). A ca. 1 bis 5 g des vorbereiteten (wie oben beschrieben) Probenmaterials werden genau eingewogen. B in einem 250 ml Becherglas (Hochform) wird das eingewogene Probematerial mit 100 ml Extraktionslösung () versetzt. C mit einem Flügelmagnetfisch wird die Slurry bei mittlerer Geschwindigkeit (Magnetrührer) 60 Minuten gerührt. D Nach dem Absetzen werden 0,9 ml des Überstandes in ein mit SSA konfektioniertes Mikroreaktionsgefäß () überführt. E Das Reaktionsgefäß lagert nach Vortexen 30 Minuten im Kühlschrank bei 7 C. F Nach 10 Minuten Zentrifugation (10000 bis U/min) werden 500 µl in ein 1,5 ml Probenaufgabe Schraubdeckelglas überführt und mit 100 µl Natriumhydroxid Lösung (1 N) und 400 µl PVP versetzt. Hinweis: Die Injektionslösung enthält 90 nmol/ml I.S. (NorLeu); die bestimmte Aminosäuren Konzentration entspricht 0,45 % der Einwaage. Das Extrakt ist bei < 5 C 3 Tage lagerfähig. 6.3 Oxidation im Protein (amtliche Methode). A ca. 0,1 bis 1 g (ca. 10 mg Stickstoff) des vorbereiteten (wie oben beschrieben) Probenmaterials werden genau eingewogen. B in einer 100 ml Flasche mit Schraubverschluss wird das eingewogene Probematerial auf 0 C abgekühlt und dann mit 5 ml Oxidationslösung versetzt. C die Lösung wird mit Glassiedeperlen (3 Stck) versetzt, mehrmals kreisend bewegt dann mit einer Laborfolie luftdicht verschlossen und 16 h in einem Kühlschrank bei ca. 0 C gelagert. D Nach der Lagerung wird das überschüssige Oxidationsreagenz mit 0,84 g Natriumdisulfid zerstört.. Hinweis: Die Probe wird anschließend hydrolysiert (6.5).

21 20 of 6.4 Oxidation im Protein (Haus Methode). A ca. 0,02 bis 0,2 g (ca. 2 mg Stickstoff) des vorbereiteten ( wie oben beschrieben) Probenmaterials werden genau eingewogen. B in einem 20 ml Duran Reagenzglas mit Schraubverschluss (PTFE Dichtung) wird das eingewogene Probematerial auf 0 C abgekühlt und dann mit 1 ml Oxidationslösung versetzt. C die Lösung wird mit Glassiedeperlen (3 Stck) versetzt, mehrmals leicht geschüttelt, dann mit einer Laborfolie luftdicht verschlossen und 16 h in einem Eisbad im Kühlschrank bei ca. 7 C gelagert. D Nach der Lagerung wird das überschüssige Oxidationsreagenz mit 0,16 g Natriumdisulfid zerstört. Hinweis: Die Probe wird anschließend hydrolysiert (6.6). 6.5 Hydrolyse des nicht oxidierten Proteins (amtliche Methode). A ca. 0,1 bis 1 g (ca. 10 mg Stickstoff) des vorbereiteten (wie oben beschrieben) Probenmaterials werden genau eingewogen. B in einer 100 ml Flasche mit Schraubverschluss wird das eingewogene Probematerial mit 25 ml Hydrolyse 1 Lösung versetzt. C die Lösung wird mit Glassiedeperlen (3 Stck) versetzt, mehrmals kreisend bewegt, dann verschlossen und im Trockenschrank 23 h bei 110 C erhitzt. Die verwendeten Duran Reaktionsflaschen sind normalerweise ausreichend druckstabil; aus Sicherheitsgründen sollten diese jedoch zusätzlich in einem geeigneten Berstgefäss im Trockenschrank aufbewahrt werden. D Die Reaktionsgefäße werden nach der Hydrolyse im Berstgefäss unter dem Abzug abkühlen gelassen. E Dann wird nach vorsichtiger Zugabe von 17 ml Natriumhydroxid Lösung (max. 40 C) der ph-wert bei Raumtemperatur auf 2,2 eingestellt. F Die ph eingestellte Hydrolysatlösung wird in einen 200 ml Meßkolben überführt, mit 2 ml I.S.- Lösung versetzt und mit Citratpuffer bis zur Marke aufgefüllt. G 1,5 ml Probelösung wird in ein 1,5 ml PP-Mikroreaktionsgefäß pipettiert und 10 Minuten bei U/min zentrifugiert. H 1 ml des Überstandes werden in ein 1,5 ml Probenaufgabe Schraubdeckelglas überführt. Hinweis: Die Injektionslösung enthält 200 nmol/ml I.S. (NorLeu); die bestimmte Aminosäuren Konzentration entspricht 0,5 % der Einwaage. Das Extrakt ist bei < 5 C 3 Tage lagerfähig.

22 21 of 6.6 Hydrolyse des nicht oxidierten Proteins (Haus Methode). A ca. 0,02 bis 0,2 g (ca. 2 mg Stickstoff) (in der Regel 0,1 g) des vorbereiteten ( wie oben beschrieben) Probenmaterials werden genau eingewogen. B in einem 20 ml Duran Reagenzglas mit Schraubverschluss (PTFE Dichtung) wird das eingewogene Probematerial mit 5 ml Hydrolyse Lösung 2 (1,6 mmol/l I.S. Norleu) versetzt. C die Lösung wird mit Glassiedeperlen (3 Stck) versetzt, mehrmals leicht geschüttelt, dann verschlossen und im Trockenschrank 23 h bei 110 C erhitzt. Die verwendeten Duran Reaktionsgläser sind in der Regel ausreichend druckstabil; aus Sicherheitsgründen sollten diese jedoch zusätzlich in einem geeigneten Berstgefäss im Trockenschrank aufbewahrt werden. D Die Reaktionsgefässe werden nach der Hydrolyse im Berstgefäss unter dem Abzug abkühlen gelassen. E 125 µl werden in ein 1,5 ml PP-Mikroreaktionsgefäss pipettiert und im Vakuum bei 90 C bis zur Trockene abgezogen. F In das PP Mikroreaktionsgefäß wird 1 ml PVP pipettiert, mit einem neuen Deckel geschüttelt und in ein 1,5 ml Probenaufgabe Schraubdeckelglas überführt. Hinweis: Die Injektionslösung enthält 100 nmol/ml I.S. (NorLeu); die bestimmte Aminosäuren Konzentration entspricht 2,5 % der Einwaage. Das Extrakt ist bei < 5 C 3 Tage lagerfähig. 6.7 Hydrolyse des oxidierten Proteins (amtliche Methode). A die oxidierte Proteinlösung wird nach der Zerstörung des Oxidationsreagenzes mit 25 ml Hydrolyse Lösung 1 versetzt, mehrmals kreisend bewegt dann verschlossen und im Trockenschrank 23 h bei 110 C erhitzt. Die verwendeten Duran Reaktionsflaschen sind normalerweise ausreichend druckstabil; aus Sicherheitsgründen sollten diese jedoch zusätzlich in einem geeigneten Berstgefäss im Trockenschrank aufbewahrt werden. B Die Reaktionsgefässe werden nach der Hydrolyse im Berstgefäss unter dem Abzug abkühlen gelassen. C Dann wird nach vorsichtiger Zugabe von 17 ml Natriumhydroxidlösung (max. 40 C) der ph-wert bei Raumtemperatur auf 2,2 eingestellt. D Die ph eingestellte Hydrolisatlösung wird in einen 200 ml Meßkolben überführt, mit 2 ml I.S.- Lösung versetzt und mit Citratpuffer bis zur Marke aufgefüllt. E 1,5 ml Probelösung wird in ein 1,5 ml PP-Mikroreaktionsgefäss pipettiert und 10 Minuten bei U/min zentrifugiert. F 1 ml des Überstandes werden in ein 1,5 ml Probenaufgabe Schraubdeckelglas überführt. Hinweis: Die Injektionslösung enthält 200 nmol/ml I.S. (NorLeu); die bestimmte Aminosäuren Konzentration entspricht 0,5 % der Einwaage. Das Extrakt ist bei < 5 C 3 Tage lagerfähig.

23 22 of 6.8 Hydrolyse des oxidierten Proteins (Haus Methode). A B C die oxidierte Proteinlösung wird nach der Zerstörung des Oxidationsreagenzes mit 4 ml Hydrolyse Lösung 3 (2 mmol/l I.S. Norleu) versetzt, mehrmals leicht geschüttelt, dann verschlossen und im Trockenschrank 23 h bei 110 C erhitzt. Die verwendeten Duran Reaktionsgläser sind in der Regel ausreichend druckstabil; aus Sicherheitsgründen sollten diese jedoch zusätzlich in einem geeigneten Berstgefäss im Trockenschrank aufbewahrt werden. Die Reaktionsgefäße werden nach der Hydrolyse im Berstgefäss unter dem Abzug abkühlen gelassen. 125 µl werden in ein 1,5 ml PP-Mikroreaktionsgefäß pipettiert und im Vakuum bei 90 C bis zur Trockene abgezogen. In das PP Mikroreaktionsgefäß wird 1 ml PVP pipettiert, mit einem neuen Deckel geschüttelt und D in ein 1,5 ml Probenaufgabe Schraubdeckelglas überführt. Hinweis: Die Injektionslösung enthält 100 nmol/ml I.S. (NorLeu); die bestimmte Aminosäuren Konzentration entspricht 2,5 % der Einwaage. Das Extrakt ist bei < 5 C 3 Tage lagerfähig. 6.9 Basische Hydrolyse des nicht oxydierten Proteins (Haus Methode). A ca. 0,02 bis 0,2 g (ca. 2 mg Stickstoff) (in der Regel 0,1 g) des vorbereiteten ( wie oben beschrieben) Probenmaterials werden genau eingewogen. B in einem 10 ml Polypropylen Reagenzglas mit Schraubverschluss wird das eingewogene Probematerial mit 1,6 g Bariumhydroxid-Octahydrat und 2 ml Wasser versetzt. C die Lösung wird mit Glassiedeperlen (3 Stck) versetzt, mehrmals leicht geschüttelt, dann am Rand haftendes Material mit 1 ml Wasser nach unten gespült, verschlossen und im Trockenschrank 23 h bei 110 C erhitzt. Die verwendeten Duran Reaktionsgläser sind in der Regel ausreichend druckstabil; aus Sicherheitsgründen sollten diese jedoch zusätzlich in einem geeigneten Berstgefäss im Trockenschrank aufbewahrt werden. D Die Reaktionsgefässe werden nach der Hydrolyse im Berstgefäss unter dem Abzug abkühlen gelassen und das Hydrolisat mit 5 ml warmem Wasser verdünnt. E Dann werden zur Neutralisation 2 ml xx molare Schwefelsäure zudosiert und kräftig geschüttelt. F In das PP Mikroreaktionsgefäß wird 1 ml des Überstandes pipettiert, 5 Minuten bei U/min zentrifugiert und vom Überstand 0,5 ml in ein 1,5 ml Probenaufgabe Schraubdeckelglas überführt. Die klare Lösung wird noch mit 0,5 ml PVP versetzt. Hinweis: Die Injektionslösung enthält 200 nmol/ml I.S. (NorLeu); die bestimmte Aminosäuren Konzentration entspricht 2,5 % der Einwaage. Das Extrakt ist bei < 5 C 3 Tage lagerfähig.

24 23 of 7 Analysenbedingungen: Die Analysen wurden mit SYKAM Aminosäureanalysator S 433 durchgeführt, bestehend aus folgenden Baugruppen: Quaternäres Gradientensystem S 2100, analytisch PEEK mit integriertem Vakuumdegaser. Aminomodul S 4300, mit integriertem Hochtemperaturreaktor, 2-Kanal Photometer (440nm/570nm), Mikro-Kolbendosierpumpe PEEK und gradiententauglichem Säulenofen. Probengeber S 5200, PEEK mit variabler Mikrodosierung und integrierter Probenkühlung. Reagenzientableau S 7130, zur Lagerung aller Reagenzien unter N2. GMP/GLP workstation CS 7 Amino (build 7.14). Das System wurde ausgerüstet mit Na-Citrat Puffer (siehe 7.1 Tabelle 1) für hydrolysierte Proben mit folgenden Trennsäulen: Puffervorwaschsäule LCA K04/Na, PEEK 4,6x100 mm, Katalog Nr.: Amino-Trennsäule LCA K06/Na, PEEK 4,6x 150 mm, Katalog Nr.: Der Rückdruck hinter der Messzelle wurde mit einem Rückdruckregler auf 3 bar eingestellt. Die 100 µl Probenschleife wurde mit 30 µl bis 50 µl Probenmaterial befüllt und der Messbereich für die gesamte Analysenserie wurde für beide Kanäle auf 2 E/fs (1000 mv) festgesetzt. Zur Lagerung der Fließmittel wurde N 2 der Qualität 5.0 verwendet. Alle weiteren Analysenbedingungen sind in der Zeittabelle (7.2 Tabelle 2) dokumentiert. Für die Untersuchung wurde der Aminosäuren Kalibrierstandard H für Protein Hydrolysat (7.3 Tabelle 3) verwendet und mit Probenverdünnungspuffer gemäß angesetzt. 7.1 Tabelle 1: Reagenzien Sykam ASA S 433 Eluent A: A1 Na-Citrat 0,12 N ph 3,45 Katalog Nr.: Eluent B: B1 Na-Citrat 0,2 N ph 10,85 Katalog Nr.: Eluent D: Reg. Lsg. NaOH 0,45 N Katalog Nr.: Reagenz: Ninhydrin 0,2 N ph 10,85 Katalog Nr.: Waschlösung: Wasser/Ethanol/Isopropanol 500/250/250 v/v/v Probenverdünnungspuffer: Na-Citrat 0,12 N ph 2,2 Katalog Nr.:

25 24 of 7.2 Tabelle 2: Analysenprogramm für die Bestimmung von Aminosäuren in hydrolysiertem Probenmaterial

26 25 of 7.3 Tabelle 3: Aminosäuren Kalibrierstandard H für Protein Hydrolysat Katalog Nr.: Konzentration der Aminosäuren in 0,1 N HCl/0,1 % Phenol Aminosäure Symbol µmol/ml 1 Asparaginsäure ASP 2,5 2 Threonin THR 2,5 3 Serin SER 2,5 4 Glutaminsäure GLU 2,5 5 Prolin PRO 2,5 6 Glycin GLY 2,5 7 Alanin ALA 2,5 8 Cystin CYS 1,25 9 Valin VAL 2,5 10 Methionin MET 2,5 11 Isoleucin ILEU 2,5 12 Leucin LEU 2,5 13 Tyrosin TYR 2,5 14 Phenylalanin PHE 2,5 15 Histidin HIS 2,5 16 Lysin LYS 2,5 17 Ammoniak NH4 2,5 18 Arginin ARG 2,5

27 26 of 8 Mitgeltende Unterlagen Sicherheitsdatenblätter SYKAM AS-Puffer und Reagenzien VDLUFA-Verbandsmethode Aminosäuren AOAC Official Method Amino Acids in FEED Amtsblatt der Europäischen Union veröffentlichte Verordnung (EG) Nr.152/2009 ERNDIM : EU BIOMED 2-project, BMH RECOMMENDATIONS TO IMPROVE THE QUALITY OF DIAGNOSTIC QUANTITATIVE ANALYSIS OF AMINO ACIDS IN PLASMA AND URINE USING CATION- EXCHANGE LIQUID CHROMATOGRAPHY WITH POST COLUMN NINHYDRIN REACTION AND DETECTION Protein Purification Robert K. Scopes. 3th edition. Springer-Verlag, New York Methods in Enzymology. Vol Guide to protein purification ed: Murray P. Deutscher. Academic Press San Diego EUROPEAN PHARMACOPEIA 8.0, AMINO ACID ANALYSIS 01/2010:20256

28 27 of 9 Historie Revision Datum Änderung Neuerstellung SOP Vorlage Neuerstellung SOP Vorlage Aminosäurenanalytik Ph.Eur Neuerstellung SOP Vorlage Neuerstellung SOP PVP-ASA-15/1-SSA

29 28 of 10 Genehmigungsprotokoll 10.1 Erstellt/bearbeitet: K.-H. Jansen/GF Datum Änderung/Weitergabe Neuerstellung Weitergabe zur formalen Überprüfung 10.2 Formale Überprüfung: M.Jansen/IL Datum Änderung/Weitergabe Formale Überprüfung V Weitergabe zur fachlichen - + QS - Überprüfung 10.3 Fachliche Überprüfung: M.Hornung/TS Datum Änderung/Weitergabe Fachliche Überprüfung V. 1.3 Weitergabe zur QS - Überprüfung 10.4 QS-Überprüfung + : Dr. M. Lappé/LQS Datum Änderung/Weitergabe QS Überprüfung V. 1.3 Weitergabe zur Prüfung auf Aktualität QS- V.1.3 Weitergabe V 1.3 zur Doku 10.5 Doku-: M.Jansen/IL Datum Änderung/Weitergabe Löschung des Draft-Verfahrens, Doku und Veröffentlichung Version Prüfung auf Aktualität: K.-H. Jansen/GF Datum Änderung/Weitergabe Prüfung auf Aktualität V. 1.3 Weitergabe zur QS -

30 of 11 Anhang Anhang Nr. A 1 A 2 Inhalt