Bestimmung von CEBPA-Mutationen bei Patienten mit akuter myeloischer Leukämie und normalem Karyotyp mit der Fragmentlängen-Analyse
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- Erna Seidel
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1 Aus der Medizinischen Klinik und Poliklinik III - Großhadern der Ludwig-Maximilians-Universität München Direktor: Prof. Dr. med. W. Hiddemann Bestimmung von CEBPA-Mutationen bei Patienten mit akuter myeloischer Leukämie und normalem Karyotyp mit der Fragmentlängen-Analyse Dissertation zum Erwerb des Doktorgrades der Medizin an der Medizinischen Fakultät der Ludwig-Maximilians-Universität zu München vorgelegt von Tobias Benthaus aus München Jahr
2 Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 5 EINLEITUNG 8 Akute myeloische Leukämie mit normalem Karyotyp 8 CCAAT/Enhancer Binding Protein Alpha (CEBPA) 9 CEBPA in der normalen Hämatopoese und bei NK-AML 11 Stellenwert von CEBPA in der Diagnostik der AML 14 Methoden zur Untersuchung von CO/M-Mutationen 15 Zielsetzung der Arbeit MATERIAL UND METHODEN Material Reagenzien und Geräte Chemikalien. Verbrauchsmaterial Geräte Software. Online-Ressourcen Probenmaterial Patientenproben Kontrollproben Zelllinie Gewinnung des Probenmaterials Dichtegradienten-Zentrifugalion (Ficoll-Hypaque-Verfahren) Nukleinsäure-Isolierung Rerverse Transkription von RNA in cdna Qualitätskontrolle der cdna (control of inlegrity) mit ABL Konzentrationsbestimmung und Konzentrationsstandardisierung Lagerung des Probenmaterials Methoden Methodenübersicht Methoden im Überblick Untersuchungsablauf Polymerase Chain Reaction (Polvmerase-Kettenreaktion. PCR) 28
3 Primer Prinzip der Kapillarelektrophorese Aufbau und Funktion des Kapillarelektrophoresegerätes Fragmentlängen-Analvse Prinzip der Fragmentlängen-Analyse Polymerase-Kettenreaktion (PCR) PCR für die Fragmentlängen-Analyse (PCR FLA) Multiplex-PCR Primer für die PCR FLA Reaktionsansatz für die PCR FLA PCR-Bedingungen für die PCR FLA Fluoreszenz-Farbstoff-Markierung (FAM. HEX) Agarose-Gelelektrophorese Inkubation mit Längenstandard (ROX) Fragmentlängen-Analyse: Kapillar-Elektrophorese Datenanalvse Sequenzier-Analyse Prinzip der Sequenzier-Analyse Polymerase-Kettenreaktion (PCR) PCR für die Sequenzier-Analyse (PCR SEQ) Primer für die PCR SEQ Reaktionsansatz für die PCR SEQ PCR-Bedingungen für die PCR SEQ Agarose-Gelelektrophorese Aufreinigung der Produkte der PCR SEO Cycle Sequencing Reaction (CSR) Primer für die CSR Reaktionsansatz für die CSR CSR-Bedingungen Aufreinigung der CSR-Produkte Sequenzier-Analyse: Kapillar-Elektrophorese Datenanalyse
4 3. ERGEBNISSE Ergebnisse im Evaluierungsansatz Messergebnisse von Fragmentlängen- und Sequenzier-Analvse Überprüfung der Ergebnisse der Fragmentlängen- mit der Sequenzier-Analvse Auffälligkeiten. Mutationen und Polymorphismen im Evaluierungsansatz Sequenzvariationen der Patientenproben im Evaluierungsansatz Auffälligkeiten der Kontrollproben Validität der Fragmentlängen-Analyse Sensitivität Spezifität Berücksichtigung der längenwirksamen Duplikation 584_589dup Positiver Prädiktiver Vorhersagewert (PPV) Reproduzierbarkeit Leistungsvermögen der Fragmentlängen-Analvse Auflösung Minimale detektierbare Konzentration mutierter DNA Einzelnukleotidaustausche (SNP) Material- und Zeitbedarf Ergebnisse im Routinescreening und der Gesamtgruppe Messergebnisse im Routinescreening Inzidenz von -Mutationen in der Gesamtgruppe Mutationen: Art, Lokalisation und Auswirkungen auf das Genprodukt Einzelnukleotidaustausche (SNP) Polymorphismen DISKUSSION Eignung der Fragmentlängen-Analvse zum C fi/ >.4-Mutationsscreening Sequenzier-Analvse als Referenzmethode Validität der Fragmentlängen-Analvse Cfß/Vl-Mutationen: Typen. Lokalisation. Auswirkung Längenwirksame Mutationen (Deletionen. Insertionen/Duplikationen) Einzelnukleotidaustausche (SNP) Relevanz der Ergebnisse für die Diagnostik der AML Ausblick 86
5 5. ZUSAMMENFASSUNG LITERATURVERZEICHNIS ANHANG EIGENE PUBLIKATIONEN DANKSAGUNG EIDESSTATTLICHE VERSICHERUNG 108 4
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