Untersuchungen zur Chemotherapie-Resistenz des malignen testikulären Keimzelltumors

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1 Untersuchungen zur Chemotherapie-Resistenz des malignen testikulären Keimzelltumors Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät (mathematisch-naturwissenschaftlicher Bereich) der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg von Herrn Diplom-Biochemiker Thomas Müller geb. am: in Halle Gutachterin/ Gutachter: 1. Prof. E. Wahle 2. Prof. P. Albers Halle (Saale), den urn:nbn:de:gbv: [

2 Inhaltsverzeichnis I INHALTSVERZEICHNIS Abkürzungsverzeichnis...III 1 Einleitung Der maligne testikuläre Keimzelltumor (TKZT) Keimzelltumoren und Embryogenese die Expression des embryonalen Transkriptionsfaktors Oct-3/ Die Cisplatin-haltige Chemotherapie von metastasierten TKZT das Problem der Chemotherapie-Resistenz Die Wirkungsweise von Cisplatin Determinanten der Sensitivität und Resistenz gegenüber Cisplatin Der programmierte Zelltod Apoptose und die Aktivierung von Caspasen Aufgabenstellung und Zielsetzung Material Zelllinien Medien, Chemikalien, Puffer und Lösungen Antikörper Geräte und Verbrauchsmittel Methoden Zellkultivierung SRB-Zytotoxizitäts-Assay und Bestimmung des IC90-Wertes von Cisplatin SRB-Zytotoxizitäts-Assay Bestimmung des Zelllinien-spezifischen IC90-Wertes von Cisplatin Ermittlung der Zelllinien-spezifischen Wachstumskinetik Behandlung mit Cisplatin Apoptoseanalyse Aktivierung der Caspase DNA-Leiter-Assay Trypanblau-Ausschluss-Test Messung der DNA-Platinierung mittels ELISA Zellzyklusanalyse Messung der Proteinkonzentration Analyse der Proteinexpression mittels Western-Blotting Analyse der Proteinexpression mittels Immunzytochemie... 41

3 Inhaltsverzeichnis II 3.10 Herstellung zytosolischer Fraktionen Analyse von Protein-Protein Interaktionen mittels Immunpräzipitation Etablierung von Tumor-Xenograften in Nacktmäusen und Behandlung mit Cisplatin Gewinnung von Tumor-Xenograften aus Nacktmäusen und immunhistochemische Analyse Caspase-Assay und Inhibierung von Caspasen Transfektion von sirna und Expressionsvektoren Zell-Klonierung Ergebnisse Zelllinien-spezifische Wachstumskinetiken und Zellzahlen Charakterisierung der TKZT-Zelllinien hinsichtlich der Cisplatin-Sensitivität Analyse des Cisplatin-induzierten Zelltodes Analyse der Cisplatin-Wirkung in vivo Zellzyklusanalyse und Untersuchungen zur DNA-Platinierung Expression von p53, Proteinen des MMR und der Bcl2-Familie Analyse zur Funktion von p Spaltung und Aktivierung von Caspasen nach Cisplatin-Behandlung Untersuchungen zur Aktivierung und Funktion von Caspase Expression des embryonalen Transkriptionsfaktors Oct-3/ Untersuchung zur Funktion von Oct-3/ Assoziation zwischen Oct-3/4-Status, p53-expression und Caspasen-Aktivierung Diskussion Die Cisplatin-induzierte Apoptose in TKZT-Zellen und mögliche Mechanismen der zellulären Cisplatin-Resistenz Charakterisierung des Cisplatin-resistenten TKZT-Zelltyps die Bedeutung der Oct-3/4-Expression Die Tumorstammzell-Hypothese und mögliche Mechanismen der Cisplatin-Resistenz beim metastasierten TKZT Zusammenfassung und Ausblick Literaturverzeichnis Anhang

4 Abkürzungsverzeichnis III ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS Abb. AFP AK bidest. bp BSA bzw. CC CDDP CIS cm 3 C-terminal dest. d.h. DMF DMSO DNA DTT EC EDTA ELISA ES FKS h HCG H 2 O 2 HSP IAP ICM kda kg Abbildung Alpha-Fetoprotein Antikörper bidestilliert Basenpaare Kälberserum-Albumin beziehungsweise Chorionkarzinom cis-diamin(dichloro)platin (II), Cisplatin carcinoma in situ Kubikzentimeter Carboxylterminus eines Proteins destilliert das heißt Dimethylformamid Dimethylsulfoxid Desoxyribonukleinsäure Dithiothreitol Embryonales Karzinom Ethylendiamintetraazetat enzyme-linked immuno sorbent assay Embryonale Stammzellen fetales Kälberserum Stunde humanes Choriongonadotropin Wasserstoffperoxid Hitzeschockprotein Inhibitoren der Apoptose innere Zellmasse der Blastozyste Kilo-Dalton Kilogramm

5 Abkürzungsverzeichnis IV mg Milligramm min Minute Mio Millionen ml Milliliter mm Millimolar MMR Mismatch repair MSI Mikrosatelliten-DNA-Instabilitäten MW Mittelwert µl Mikroliter µm Mikromolar µm Mikrometer NaCl Natriumchlorid NER Nucleotide excision repair nm Nanometer N-terminal Aminoterminus eines Proteins OD optische Dichte PAGE Polyacrylamidgelelektrophorese PBS phosphatgepufferte Saline PBST phosphatgepufferte Saline + Tween20 PCD Programmierter Zelltod PGC primordiale Keimzellen RNase Ribonuklease RT Raumtemperatur SDS Sodiumdodecylsulfat sec Sekunde SRB Sulforhodamin B STABW Standardabweichung Tab. Tabelle TCA Trichloressigsäure TE Teratom TIN testikuläre intratubuläre Neoplasie TKZT Testikulärer Keimzelltumor Tris Tris-(hydroxymethyl-) aminomethan

6 Abkürzungsverzeichnis V U/ min Umdrehungen pro Minute ÜN über Nacht UV Ultraviolett V Volt YST Dottersacktumor z.b. zum Beispiel

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