Die Enzymdiagnostik dient der Lokalisation und Verlaufskontrolle von Erkrankungen und macht ca. 50% der Untersuchungen in der klinischen Chemie aus.

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1 Die Enzymdiagnostik dient der Lokalisation und Verlaufskontrolle von Erkrankungen und macht ca. 50% der Untersuchungen in der klinischen Chemie aus. Abb. 1: Enzyme pattern caused by acute virus hepatitis. Kenntnisse & Wissen Phase 1b: Sie können Enzyme unterteilen in plasmaspezifische -, Exkretions- und Zellenzyme. Sie kennen die Grundlagen der Enzyme (Verknüpfung & Vorwissen aus Chemie und Biochemie). Sie wissen über die Enzymkinetik Bescheid, kennen und verstehen die Methoden zur Messung der Enzymaktivität. Sie können Enzymresultate interpretieren. Bei optisch-enzymatischen UV-Tests wissen Sie, ob es sich um eine Extinktionszu- oder Extinktionsabnahme handelt. 1

2 Inhaltsverzeichnis: 1. Wirkungsweise von Enzymen Energiediagramm einer biochemischen Reaktion Mechanismus der Enzymkatalyse Aktives Zentrum Spezifität Nomeklatur von Enzymen (Klassifikation) Messung eines Enzyms Direkte Bestimmung der Enzymkonzentration Bestimmung der Enzymaktivität im Serum Bestimmung der Enzymaktivität Reaktionsbedingungen für die Enzymmessung Temperaturabhängigkeit ph-wert Konzentration und Art des Substrates Coenzyme Art und Konzentration des Puffers Effektoren Optimierte Standardmethoden Enzymaktivitätsmessung im Farbtest (kinetische Messung) Enzymaktivitätsmessung im optisch-enzymatischen UV-Test Enzymaktivitätsmessung im gekoppelten optisch-enzymatischen UV-Test Enzymatische Substratbestimmung (Enzymatischer Test) Endpunkt-Methode Kinetische Methode Isoenzyme ALAT ASAT AP GGT CHE GLDH LDH Lipase α-amylase CK

3 Einleitung: Enzyme (früher Fermente genannt) sind Biokatalysatoren, die chemische Reaktionen im Körper überhaupt erst ermöglichen und diese dann auch beschleunigen. Die Gesamtheit der chemischen Umsetzungen im Organismus ist nur möglich durch die Wirkung einer Vielzahl von Enzymen. Der Zellstoffwechsel ist strikte auf Enzyme angewiesen! Chemisch gesehen sind Enzyme Proteine oder Proteide (setzen sich aus einem Protein- und einem Nicht-Protein-Anteil zusammen). Die im Blut bestimmbaren und für medizinische Fragestellungen relevanten Enzyme können unterteilt werden in: Plasmaspezifische Enzyme: Sie haben ihren physiologischen Wirkungsort im Plasma, z.b. Cholinesterase. Sezernierte Enzyme (Exkretionsenzyme): Sie sind exokriner Herkunft, d.h. sie werden von exokrinen Drüsen normalerweise nur in geringen Mengen in das Blut abgegeben. Bei einer Schädigung der Herkunftsorgane bzw. bei Obstruktion der Ausführungsgänge erfolgt ein vermehrter Übertritt ins Blut, z.b. α-amylase (P-Amylase und S-Amylase) und Lipase. Zellenzyme: Sie sind intrazellulärer Herkunft und gelangen bei mehr oder weniger schweren Organschäden (also Zellschädigung) in das Blut, z.b. Transaminasen (ALAT, ASAT) und LDH. Jede Zelle synthetisiert in ihrem RER die zelleigenen Proteine, darunter auch die Enzyme, die sie für ihre Funktionen braucht. Jede ausdifferenzierte Zelle hat ein ganz spezifisches "Paket" unterschiedlicher Enzyme, das auf ihre Funktionen angepasst ist. Damit hat auch jedes Organ eine ganz bestimmte Palette verschiedener Enzyme, also ein spezifisches, einzigartiges Enzymmuster. Diese Organspezifität der Enzyme wird in der Medizin zu diagnostischen Zwecken ausgenutzt: Werden Zellen eines Organs zerstört, so gelangen ihre Enzyme vermehrt (selten auch vermindert, z.b. CHE) ins Blut durch ihre Erfassung (Art, Konzentration und Mengenverhältnis der gemessenen Enzyme) kann auf das geschädigte Organ geschlossen werden: (siehe auch Titelbild). Enzym (Abkürzung) Alanin-Aminotransferase (ALT, ALAT) [früher Glutamat-Pyruvat-Transaminase (GPT)] Aspartat-Aminotransferase (AST, ASAT) [früher Glutamat-Oxalacetat- Transaminase (GOT)] Gamma-Glutamyl-Transferase (GGT) Alkalische Phosphatase (AP, ALP) Lipase Kreatinphosphokinase (CK) Kreatinphosphokinase MB-Typ (CK-MB) Mögliche Ursache einer Vermehrung des Enzyms im Blut Schädigungen der Leber Schädigungen der Leber und des Muskels Krankheiten der Leber und der Gallenwege Krankheiten der Leber, der Gallenwege und des Knochens Schädigungen der Bauchspeicheldrüse (z.b. Pankreatitis) Muskelschäden, (Herzmuskelschäden) Herzmuskelschäden (z.b. Infarkt) 3

4 In den Zellen sind die einzelnen Zellenzyme unterschiedlich lokalisiert (Zellmembran, Zytoplasma, Mitochondrien) damit kann auf die Schwere und das Ausmass der Organ-/Zellschädigung gedeutet werden: Sind nur die Zellmembranenzyme vom Referenzbereich abweichend, so ist die Organ-/Zellschädigung noch nicht stark ausgeprägt; sind jedoch noch Enzyme aus Zellkompartimenten (z.b. aus den Mitochondrien) in ihrem Wert auffällig, so ist die Schädigung schon gravierender. Enzymbestimmungen im Blut sind daher häufig Teil einer Laboruntersuchung. Selten bestimmt man Enzyme in anderen Proben (Harn: Amylase, Stuhl: Chymotrypsin oder Elastase). Enzyme werden in der Labormedizin jedoch auch als Hilfsmittel bei der Bestimmung anderer Parameter (z.b. Glucose, Harnsäure) in sogenannten enzymatischen Tests eingesetzt (siehe später). Auch Antigen-Antikörper Reaktionen kann man durch Kopplung mit einer enzymatischen Farbreaktion sichtbar machen (z.b. ELISA). 4

5 A. GRUNDLAGEN ENZYME Siehe auch Chemie & Biochemie 1. Wirkungsweise von Enzymen: Die Stoffe, die von einem Enzym umgesetzt werden, bezeichnet man als Substrate. Diese Substrate gehen mit Hilfe von Enzymen in ein Produkt über; ohne Enzyme würden diese biochemischen Reaktionen im Organismus nicht oder nur mit einer nicht messbar kleinen Geschwindigkeit ablaufen. Hier kommen die Enzyme zum Einsatz: die Reaktionen werden mit Hilfe der Enzyme ermöglicht und laufen viel schneller ab. Einfach dargestellt: Substrat (S) Enzym (E) Produkt (P) Abb. 2: Jedes Enzym, das die Reaktion S P katalysiert, katalysiert auch die Reaktion P S Energiediagramm einer biochemischen Reaktion: In untenstehender Abbildung wird das Substrat A in das Produkt B umgewandelt. Um diese Reaktion zu ermöglichen muss Energie aufgebracht werden, um einen angeregten, energiereichen Übergangszustand zu erreichen: die Aktivierungsenergie. Mit Hilfe eines Enzyms wird diese Aktivierungsenergie herabgesetzt (Chemie-Skript S. 71), in dem sich das Enzym an das Substrat bindet es wird weniger Energie für die Reaktion benötigt und die Reaktion läuft viel schneller ab. Enzyme werden als Katalysatoren nur in kleinen Mengen benötigt und verlassen die Reaktion unverändert; sie können in weiteren Reaktionen agieren. Abb. 3: Energiediagramm einer biochemischen Reaktion 5

6 1.2. Mechanismus der Enzymkatalyse: Betrachten wir den Ablauf der Enzymkatalyse etwas detaillierter, dann ergibt sich folgender Reaktionsablauf: Abb. 4: Das freie Enzym E (1.) bindet nacheinander die Substrate A und B (2., 3.) Enzyme können ein Substrat oder mehrere Substrate katalysieren zu einem Zwischenprodukt, dem Enzym-Substrat-Komplex (3. E-A-B-Komplex). Über kurzlebige Übergangskomplexe (4., 5.), dem sogenannten Enzym-Produkt-Komplex (E-C-D-Komplex), findet die Umwandlung der Substrate in die Produkte statt: Das aktive Zentrum des Enzyms macht, dass nur die Substrate A und B ins Enzym passen und dass diese Substrate in die Produkte C und D (6.) zerfallen. Das Enzym geht unverändert aus der Reaktion heraus und kann weitere Reaktionen katalysieren. Bei Reaktionen von zwei Substraten sorgt das Enzym auch für die richtige räumliche Anordnung der Reaktionspartner und erhöht dadurch die Trefferquote. Durch solche Mechanismen wird die Reaktion so erleichtert, dass die Reaktionsgeschwindigkeit um mehr als das fache gesteigert werden kann. 2. Aktives Zentrum: Jedes Enzym besitzt ein aktives Zentrum, welches ein kleines Areal auf dem Enzym ist. Es ist der Ort im Enzym, an welchem die Substratbindung und die Umsetzung vom Substrat ins Produkt mit Herabsetzen der Aktivierungsenergie stattfindet. Abb. 5: Man bezeichnet die Stelle, in die das Substrat (blau) wie ein Schlüssel ins Schloss passt, als aktives Zentrum des Enzyms (rot). Hier findet die enzymkatalysierte Reaktion statt. 6

7 3. Spezifität: Enzyme wirken ausserordentlich spezifisch. Sie besitzen meist eine sehr ausgeprägte Substratspezifität (ein Enzym reagiert meist nur mit einem bestimmten Substrat, z.b. das Enzym Urease spaltet nur Harnstoff). In der Regel werden selbst dem eigentlichen Substrat sehr ähnliche Substanzen nicht umgesetzt. Jedoch: Manche Enzyme reagieren zwar mit verschiedenen Stoffen, aber dann meist mit einer ganz bestimmten chemischen Gruppe oder Verbindungsart, die in diesen verschiedenen Stoffen in gleicher Weise vorkommt (z.b. Abbau von exogenen Substanzen wie Medikamente). Doch noch grösser ist ihre Wirkungsspezifität/Reaktionsspezifität: Von den vielen möglichen Reaktionen, die ein Stoffwechselzwischenprodukt eingehen kann, wird nur eine bestimmte Reaktion katalysiert. 4. Nomeklatur von Enzymen (Klassifikation): Viele Enzyme werden durch Anfügen der Nachsilbe "-ase" an den Namen ihrer Substrate oder an die Bezeichnung, die ihre Aktivität beschreibt, benannt. Dieser systematische Name eines Enzyms besteht aus: Name des umgesetzten Substrates Art der katalysierten Reaktion (den 6 Hauptklassen zu entnehmen) Beispiel: Das Enzym Creatinkinase kommt vor allem in den Muskelzellen vor und ist für die Energiebereitstellung der Zellen wichtig. Wie das Enzym zu seinem Namen kommt: Das umgesetzte Substrat ist das Creatin. Das Enzym überträgt das Phosphat von ATP auf das Substrat (Creatin) und daraus ergibt sich ein Produkt (Creatinphosphat) dieses Vorgehen wird von den Kinasen durchgeführt Creatinkinase. Creatin + ATP Creatinkinase Creatinphosphat + ADP Andere Enzyme, wie Pepsin oder Trypsin (Verdauungsenzyme) tragen Namen, die nichts mit ihren Substraten oder Reaktionen zu tun haben. Manchmal hat ein und dasselbe Enzym 2 oder mehr Namen, oder 2 verschiedene Enzyme werden identisch benannt. Wegen diesen Mehrdeutigkeiten und der ständig wachsenden Zahl neu entdeckter Enzyme wurden internationale Richtlinien zur Benennung und Klassifizierung von Enzymen eingeführt: Jedem Enzym werden eine 4-stellige Klassifizierungsnummer/Code-Nr. (EC-Nr., Bildung siehe unten) und ein systematischer Name (Bildung siehe oben) zugewiesen, wodurch die katalysierte Reaktion identifiziert werden kann, d.h. nicht das Enzym selbst, sondern die Reaktion, die es katalysiert, wird kategorisiert. Die Code-Nr. (EC-Nr.: Enzyme- Commission-Number) wird gebildet aus: 7

8 Nr. Klinische Chemie 1. Zahl: Sie gibt eine der 6 Hauptklassen an und bezieht sich auf die katalysierte Reaktion (Anmerkung: Die untenstehende Tabelle müssen Sie nur verstehen): Klasse: 2 Transferasen 3 Hydrolasen 4 Lyasen 5 Isomerasen 6 Ligasen Katalysierte Reaktion: Elektronentransfer Ionen oder H-Atome) 1 Oxidoreduktasen (Hydrid- Gruppentransfer-Reaktion: übertragen funktionelle Gruppe auf Substrat Hydrolyse-Reaktionen: Übertragung funktioneller Gruppen auf Wasser Addition von Gruppen (H 2 O, NH 3, CO 2 ) an Doppelbindungen oder Bildung von Doppelbindungen durch Entfernung von Gruppen Transfer von Gruppen innerhalb eines Moleküls Katalysieren die Bindung zwischen zwei Substraten mit gleichzeitiger Spaltung energiereicher Verbindungen (Aufbau von Bindungen unter Verbrauch energiereicher Phosphate, z.b. ATP) Beispiel: Oxidasen Reduktasen Peroxidasen Dehydrogenasen (Dehydrogenasen verwenden Cosubstrate wie NAD + oder NADP + als Wasserstoffakzeptor) Aminotransferasen (ALAT) Kinasen (Übertragung von Phosphat von ATP auf andere Stoffe, z.b. CK) Esterasen (Cholinesterase) Lipasen Glykosidasen Peptidasen Phosphatasen (ALP) Decarboxylasen Aldolasen (Fruktose-1,6-biphosphat-Aldolase) Racemasen Epimerasen Mutasen T4-DAN-Ligase 2. Zahl: Weitere Unterteilung der Hauptklassen in Unterklassen, je nach chemischer Bindung. 3. Zahl: Unter-Unterklassen 4. Zahl: Seriennummer in der Unter-Unterklasse Als Beispiel soll die Benennung des Enzyms Creatinkinase (CK) erläutert werden, das die folgende Reaktion katalysiert: Creatin (Substrat) + ATP CK (Enzym) Creatinphosphat (Produkt) + ADP Edukte CK hat die System-Nr. (EC): Dies bedeutet: 1. Zahl: Hauptklasse 2 = Transferase 2. Zahl: Unterklasse 7 = Phosphotransferase 3. Zahl: Unter-Unterklasse 3 = H 2 N als Akzeptor 4. Zahl: Seriennummer in der Unter-Unterklasse 2. 8 Produkte

9 B. ENZYMKINETIK 5. Messung eines Enzyms: Es gibt zwei prinzipiell unterschiedliche Methoden, um Enzyme im Blut nachzuweisen: 5.1. Direkte Bestimmung der Enzymkonzentration: Man kann ein Enzym im Serum mit Spezialmethoden direkt nachweisen und seine Konzentration bestimmen im Laboralltag sagt man: Man misst die Masse des Enzyms. Das funktioniert, indem man spezielle Antikörper gegen das Enzym herstellt. Eine solche Bestimmungsmethode wird in den meisten Labors zur Bestimmung des Herz-Enzyms CK-MB (da misst man also die CK-MB-Masse) eingesetzt. Im Allgemeinen ist der direkte Enzymnachweis aber zu aufwändig, auch weil Enzyme im Serum nur in sehr geringer Konzentration vorhanden sind und die Reagenzien teuer sind. Es kommen jedoch immer mehr Reagenzien auf den Markt, mit welchen die direkte Bestimmung der Enzymkonzentration bestimmt werden kann. Auf diese Bestimmungsmethode wird hier nicht näher eingegangen, da es sich um immunologische Bestimmungen handelt, welche turbidimetrisch gemessen werden und Sie schon in anderen Zusammenhängen kennen gelernt haben bzw. werden (siehe Labortechnik, Turbitimer). Abb. 6: Die Darstellung symbolisiert ein Enzymmolekül im Blut. Die Enzyme liegen im Blut nur in sehr geringer Konzentration vor. Eine direkte Bestimmung, also eine Bestimmung des Enzyms selbst, ist möglich aber oft schwierig. 9

10 5.2. Bestimmung der Enzymaktivität im Serum: Ein einziges Enzym-Molekül ist in der Lage, in einer Minute Zig-Tausende Substrat- Moleküle umzuwandeln. Das macht man sich zunutze, um Enzyme nachzuweisen: Man bietet dem Enzym im Reagenz ein geeignetes Substrat an, lässt das Enzym eine Zeit lang arbeiten und misst dann die Zig-Tausend entstandenen Produkt- Moleküle. Das ist meist leichter als das Enzym direkt nachzuweisen. Statt zu messen, wie viel Produkt entstanden ist, kann man natürlich auch messen, wie viel Substrat verschwunden ist (siehe unten). Bei dieser Bestimmungsmethode muss man sich zwar bewusst sein, dass man so nicht die Menge des Enzyms, sondern seine Aktivität im Blut bestimmt das ist aber kein grosses Problem. Unter geeigneten Bedingungen (siehe später) ist die Enzymaktivität zur Enzymmenge proportional. Abb. 7: 1. Schritt: Man setzt dem Serum Substrat zu (weisse Kugeln). Unter geeigneten Bedingungen (optimaler ph-wert, richtige Temperatur usw.) wird das Enzym damit beginnen, das Substrat umzusetzen - und zwar sehr grosse Mengen. Abb. 8: 2. Schritt: Nach genau definierten Zeitabständen (siehe nächster Abschnitt) misst man fotometrisch bei der spezifischen Absorptionswellenlänge wie viele Substratmoleküle umgesetzt sind, also wie viele orange Kugeln (=Produkt) entstanden sind. Alternativ kann man auch die Abnahme des Substrates (der weissen Kugeln) messen. Das Ergebnis ist die Anzahl der durch die Enzyme umgewandelten Moleküle pro Zeiteinheit, also anders ausgedrückt: die Reaktionsgeschwindigkeit oder die Enzymaktivität. Auch in der Enzymkinetik gilt das Lambert-Beer'sche Gesetz. Abb. 9: Je mehr Enzym im Serum, desto mehr Substrat wird umgesetzt. Waren zwei Enzyme im Serum, ist die Reaktionsgeschwindigkeit doppelt so hoch und es werden doppelt so viele orange Kugeln produziert. Die Reaktionsgeschwindigkeit ist also proportional zur Enzymkonzentration. 10

11 6. Bestimmung der Enzymaktivität: Bei den meisten Enzymbestimmungen wird also nicht die Enzymkonzentration (oder Masse) gemessen, sondern die Enzymaktivität. Die Enzymaktivität entspricht der Geschwindigkeit, mit der die katalysierte Reaktion abläuft. Das bedeutet, dass wir bei der Messung anders vorgehen müssen als bei der üblichen Konzentrationsmessung. Wie oben erwähnt, kann entweder das Substrat oder das Produkt gemessen werden: die Enzymaktivität kann gleichermassen über die Geschwindigkeit des Verschwinden des Substrates oder über die Geschwindigkeit des Entstehen des Produktes pro Zeiteinheit bestimmt werden: Substrat nimmt ab Produkt nimmt zu 18 Substrat Produkt Zeit Zeit 4 Abb. 10 & 11: Auf die Enzymaktivität kann aus der Substratabnahme pro Zeiteinheit oder aus der Produktzunahme pro Zeiteinheit geschlossen werden. Fotometrisch wird die Extinktion der Substratabnahme oder die Extinktion der Produktzunahme nach mehreren Zeitabschnitten gemessen und zwar nicht nur 1x am Schluss, sondern in genau definierten Zeitabschnitten: Z.B wird bei der CK- Bestimmung (Handmethode von Axonlab!) die Extinktion der Produktzunahme nach 2 Min., dann wieder 1, 2, 3, 4, und 5 Min. später gemessen. Anschliessend wird die Differenz der einzelnen Extinktionsmessungen ausgerechnet: Während den einzelnen Minuten muss das Enzym immer gleich viel Substrat katalysiert haben, d.h. das Enzym muss gleichmässig gearbeitet haben. Die Differenz von einem Extinktionspunkt zum nächsten muss also immer gleich sein, d.h. die Zunahme bzw. Abnahme muss gleichmässig ablaufen. Diese Differenz nennt man E/Min. (Delta Extinktion pro Minute). Aus den mehreren ausgerechneten E/Min. Resultaten wird der Mittelwert ermittelt, welcher mit einem entsprechenden Faktor (wird durch die Kalibration ermittelt) multipliziert wird. Jetzt erhalten wir die Enzymaktivität in U/l für das entsprechende Enzym: Die Enzymeinheit (U) ist diejenige Enzymmenge, die 1 µmol Substrat pro Minute unter definierten Standardbedingungen umsetzt - und genau das wird bei diesem Vorgehen gemessen. Sind die einzelnen E/Min. nicht gleich gross, ergibt sich beim Aufzeichnen und Verbinden der Messpunkte (Extinktion gegen Zeit) keine Gerade d.h. die Messung lief nicht linear ab, die Reaktionsbedingungen waren nicht optimal bzw. haben sich während der Messung verändert die Messung muss wiederholt werden. 11

12 Falls sich die Gerade gegen Ende krümmt, lief die Reaktion ebenfalls nicht linear ab, denn auch hier gilt das Lambert-Beer sche Gesetz. Die Probe muss verdünnt werden, da das zugefügte Substrat im Reagenz aufgrund einer grossen Enzymkonzentration zu schnell verbraucht wurde. Abb. 12: E/Min. entspricht der Differenz zwischen zwei Messpunkten und muss möglichst gleich sein: Im Beispiel ist E/Min. 0,08 (Produktzunahme wird gemessen). Wir messen also die Aktivität und nicht die Menge des Enzyms. Enzymeinheit: Die Enzymaktivität (also das Resultat) wird in internationalen Einheiten (Unit=U) angegeben: 1 U bezeichnet diejenige Enzymaktivität, die den Umsatz von 1 µmol Substrat pro Minute unter Standardbedingungen (ph, Temperatur usw.) katalysiert. Aus dem Substratumsatz pro Zeitintervall ergibt sich also die Reaktionsgeschwindigkeit. 12

13 7. Reaktionsbedingungen für die Enzymmessung: Die Messung der katalytischen Enzymkonzentration/der Enzymaktivität hängt im Gegensatz zu einfachen Konzentrationsbestimmungen von Stoffen wie etwa Albumin stark von den Messbedingungen ab, insbesondere von der Temperatur, dem ph- Wert, der Konzentration und der Art des Substrates, von Cofaktoren, der Art und Konzentration des Puffers und dem Einfluss von Effektoren. Daher müssen die Reaktionsbedingungen für die Messung von Enzymaktivitäten verbindlich festgelegt werden, um vergleichbare Bedingungen zu schaffen nur so können reproduzierbare Ergebnisse erzielt werden. Anmerkung: Das Einhalten der Reaktionsbedingungen muss vor allem strikte bei Handmethoden eingehalten werden dies wird heute jedoch nur noch vereinzelt gemacht. Die heutigen Vollautomaten sowie Reagenzien gewähren, dass die Reaktionsbedingungen konstant gehalten werden Temperaturabhängigkeit: Sie ist von Enzym zu Enzym unterschiedlich. Eine Temperaturerhöhung um 10 C ergibt in etwa eine Verdoppelung der Reaktionsgeschwindigkeit (RGT-Regel = Reaktionsgeschwindigkeit-Temperatur-Regel). Heute ist die Messtemperatur moderner Analysengeräte und die Temperatur für die Befundmitteilung von Enzymaktivitäten einheitlich 37 C. Übrigens dürfen wir die Temperatur zur Reaktionsbeschleunigung bei einer enzymkatalysierten Reaktion nicht beliebig erhöhen (oft schon nicht über 40 C), da durch das Erhitzen die Raumstruktur der Enzyme zerstört wird. Obwohl bei der Denaturierung der chemische Aufbau in Form der Aminosäuresequenz erhalten bleibt, geht die katalytische Aktivität durch Strukturänderung des aktiven Zentrums verloren die Reaktionsgeschwindigkeit sinkt ph-wert: Jedes Enzym besitzt einen optimalen ph-bereich, in welchem die enzymkatalysierte Reaktion am optimalsten abläuft. Dieser Bereich ist meistens relativ eng, wobei das eigentliche Maximum aber oft doch so breit ist, dass kleine ph-abweichungen unter 0,2 ph-einheiten kaum Einfluss auf die Reaktionsgeschwindigkeit haben. Durch extreme ph-werte jedoch kann es zur irreversiblen Denaturierung von Proteinen kommen Konzentration und Art des Substrates: Bei Bestimmungen von Enzymaktivitäten muss stets in Gegenwart eines Substratüberschusses (d.h. bei Substratsättigung) bzw. beim Substratoptimum gearbeitet werden. Nur so ist Gewähr geboten, dass der gemessene Umsatz durch die zu bestimmende Enzymkonzentration und nicht durch das Substratangebot limitiert wird. Denn während der gesamten Reaktionszeit muss jedes Enzymmolekül ein Substratmolekül binden und umsetzen können nur so kann die ganze Enzymaktivität erfasst werden. 13

14 Vorsicht: Bei zu hoher Substratkonzentration kann das Enzym gehemmt werden: Substrathemmung. Als Erklärung dient die Vorstellung, dass sich die Substratmoleküle in diesem Fall gegenseitig bei der Bindung an das aktive Zentrum des Enzyms behindern: Zu viele Substratmoleküle sind vorhanden und versperren so den Eingang zum aktiven Zentrum. Abb. 13: Substrathemmung der Enzymkatalyse Auch die Art des Substrates hat einen Einfluss: Je besser das zugefügte Substrat zum aktiven Zentrum des Enzyms in der Probe passt (je höher also die Affinität ist), desto schneller liegen Enzym-Substrat-Komplexe vor. Also werden Substrate mit hoher Affinität daher schon bei relativ niedriger Substratkonzentration rasch umgesetzt. Wenn das Enzym grosse Affinität zum Substrat besitzt, so ist eine kleinere Substratkonzentration nötig, da die Enzym-Substrat-Komplexe schnell vorliegen. Wenn das Enzym eine geringe Affinität zum Substrat besitzt, so ist eine grössere Substratkonzentration nötig, da es länger dauert bis die Enzym- Substrat-Komplexe vorliegen Coenzyme: Coenzyme (auch Cosubstrate genannt) werden bei katalytischen Reaktionen für die Aktivität von Enzymen oft gebraucht: Das Enzym bindet sich an das Coenzym, um dann aktiv zu werden. Coenzyme (z.b. NAD + ) binden reversibel und nicht kovalent an das Apoenzym (Enzym-Molekül) und bildet zusammen mit ihm das Holoenzym (Apoenzym + Coenzym = Holoenzym). Das Coenzym wird dabei verändert, das Apoenzym geht unverändert aus der katalysierten Reaktion hervor. Coenzyme leiten sich von Vitaminvorstufen ab: z.b. hat das Coenzym Pyridoxalphosphat das Vitamin B6 (Pyridoxin) als Baustein. Liegt ein Vitamin B6- Mangel vor, so liegt auch ein Mangel des Coenzyms Pyridoxalphosphat vor die Enzyme, welche das Pyridoxalphosphat als Coenzym benötigen, können die Reaktion nicht katalysieren. Ein Vitaminmangel kann also verschiedene Stoffwechselvorgänge beeinträchtigen und unspezifische Symptome bewirken. (Vitamine sind lebensotwendige hochwirksame Stoffe, die der Mensch in geringen Mengen mit der Nahrung aufnehmen muss, da sie nicht im Körper hergestellt werden können. Sie gehören sehr unterschiedlichen chemischen Stoffklassen an.) Coenzyme & ihre Vitaminbausteine: NAD + (Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid) Vitamin B3 NADP + (Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat) Vitamin B3 Pyridoxalphosphat Vitamin B6 14

15 7.5. Art und Konzentration des Puffers: Nicht nur der ph-wert des Puffers, sondern auch seine chemische Natur beeinflusst die katalytische Aktivität. Z.B. ist die Aktivität der Alkalischen Phosphatase bei gleichem ph und Substrat in Diethanolamin-Puffer 2- bis 4-mal höher als in 2-Amino- 2-methylpropanol-Puffer Effektoren: Effektoren (Ionen, kleine Moleküle, Proteine) sind Aktivatoren (positive Effektoren) oder Inhibitoren (Hemmstoffe, negative Effektoren). Aktivatoren erhöhen und Inhibitoren vermindern die katalytische Aktivität von Enzymen. Effektoren kommen z.b. auch in Antikoagulantien und Reagenzien vor: ATP und NADH sind Inhibitoren gewisser Enzyme des Glucoseabbaus (siehe Biochemie). ADP und AMP sind Aktivatoren gewisser Enzyme des Glucoseabbaus (siehe Biochemie). Fluorid (Antikoagulant in Fluoridröhrchen) hemmt die glykolytischen Enzyme. Tartrat (Reagenzienzusatz) hemmt die saure Prostata-Phosphatase der Prostata, Thrombozyten, Monozyten. Kalziumionen (aus dem Probenmaterial) hemmen die Creatinkinase. N-Acetylcystein (NAC) reaktiviert die Creatinkinase, die infolge Oxidation ihrer beiden Sulfhydrylgruppen inaktiviert wurde. 8. Optimierte Standardmethoden: Aus den zuvor genannten Gründen erscheint es verständlich, dass die Vergleichbarkeit von Enzymaktivitätsbestimmungen oft eingeschränkt ist und erst erreicht werden kann, wenn in sog. optimierten Methoden all diese Einflussgrössen (ph-wert, Substratkonzentration, Effektoren usw.) durch genaue Festlegung der Durchführungsbedingungen weitgehend ausgeschaltet werden. International sind die Bedingungen für die Messung von Enzymreaktionen nicht einheitlich, so dass eine Vielzahl sog. optimierter Testverfahren von der IFCC (Internationale Fachstelle für klinische Chemie) eingeführt wurde: Optimierte Tests sind Tests, welche standardisierte Bedingungen (ph-wert, Substratkonzentration, Effektoren usw.) erfüllen. Durch optimierte Standardmethoden werden vergleichbare Resultate erzielt (z.b. können so im Labor die gleichen Referenzwerte wie in der Reagenzpackung erreicht werden). In den Packungsbeilegern werden optimierte Tests folgendermassen bezeichnet: " nach den Empfehlungen der International Federation of Clinical Chemistry (IFCC) modifiziert." In einem Labor sollten optimierte Standardmethoden den anderen Methoden vorgezogen werden (gilt nicht nur bei der Bestimmung der Enzymaktivität sondern für alle Tests). 15

16 C. METHODEN ZUR MESSUNG DER ENZYMAKTIVITÄTEN Die Messung von Enzymaktivitäten wird mit sog. Enzymtests erfasst: In einem Enzymtest wird die Aktivität eines Enzyms gemessen. Die Messung erfolgt hier immer kinetisch, d.h. die Extinktionszu- oder Extinktionsabnahme wird kontinuierlich oder in genau definierten Zeitabständen über eine bestimmte Zeit gemessen. Oft reicht es nicht, nur ein Substrat zuzuführen man muss zwei oder mehrere Stoffe hinzugeben. Die Enzymaktivität kann in zwei verschiedenen Verfahren erfolgen: mit einem Farbtest (kinetische Messung) oder mit dem sogenannten optisch-enzymatischen (kinetischen) UV-Test (einfach oder gekoppelt). 9. Enzymaktivitätsmessung im Farbtest (kinetische Messung): Wie auf den vorherigen Seiten schon erwähnt, ist es zur Ermittlung der Enzymaktivität entscheidend zu wissen, wie viel Substrat pro Zeiteinheit umgesetzt wurde - man kann die Produktzunahme oder aber auch die Substratabnahme im Fotometer messen. Bei der Bestimmung der Gamma-Glutamyl-Transferase (GGT) wird die Produktzunahme gemessen: Bietet man diesem Enzym zwei bestimmte Substrate an, dann entsteht als Produkt ein Farbstoff, den man im Fotometer messen kann. Glycylglycin Abb. 14: Kinetischer Farbtest (am Beispiel der Aktivitätsmessung der GGT): Die zwei Substrate sind im Testansatz (im Reagenz) im Überschuss enthalten. Unter Wirkung der GGT aus dem Serum entstehen die zwei untenstehenden Produkte. Die Farbänderung auf Zeit des 5-Amino-2- nitrobenzoat kann man im Fotometer bei 405 nm messen und ist proportional zur Enzymaktivität. Man beobachtet bei der Enzymaktivitätsmessung im Farbtest also den Verlauf der Zu- oder Abnahme der Farbintensität auf Zeit, welche der Enzymaktivität proportional ist. 16

17 10. Enzymaktivitätsmessung im optisch-enzymatischen (kinetischen) UV-Test: Im Vergleich zum obgenannten Farbtest wird hier nicht im Farbbereich gemessen, sondern im UV-Bereich. Grund dafür ist, dass wir NADH oder NADPH messen müssen (da die anderen Produkte oder Edukte nicht messbar sind), welche bei der Reaktion entstanden sind und welche ihr Absorptionsmaximum im UV-Bereich haben. NADH + H + NAD + (NADH ist die reduzierte Coenzymform von NAD + ) NADPH + H + NADP + (NADPH ist die reduzierte Coenzymform NADP + ) Wir schauen uns als Beispiel das Bestimmungsverfahren des Enzyms Lactatdehydrogenase (LDH) an: a. Messreaktion: LDH L-Lactat + NAD + Pyruvat + NADH + H + Abb. 15: Die Lactatdehydrogenase katalysiert die Oxidation von L-Lactat (Substrat) zu Pyruvat (Produkt) unter gleichzeitiger Reduktion von NAD + (Coenzym) zu NADH. Die Geschwindigkeit der Bildung von NADH ist direkt proportional zur LDH-Aktivität. Bei einem optisch-enzymatischen UV-Test wird bei einer entsprechenden Testreaktion die Oxidation von reduziertem Nikotinamid-adenin-dinukleotid (NADH), gemessen. Fotometrisch kann immer nur das NADH im UV-Bereich bei 340 nm (auch möglich bei 334 nm, 365 nm) gemessen werden Grund: Würde man im Absorptionsmaximum bei 260 nm messen, so wäre dies ungünstig, weil sowohl NAD + als auch NADH ihr Absorptionsmaximum bei 260 nm haben. Da NADH im Gegensatz zu NAD zwischen 300 und 370 nm stark absorbiert, kann anhand der Extinktionsänderung (Abnahme bei Oxidation von NADH, Zunahme bei Reduktion von NAD) bei einer Wellenlänge von 340 oder 366 nm der Ablauf der Reaktion verfolgt werden. Die Extinktion des NAD + ist bei dieser Wellenlänge fast gleich null. Abb. 16: Absorptionsspektrum von NADH (NADPH) und NAD (NADP). NADH bzw. NADPH haben bei 340 nm ein zusätzliches Absorptionsmaximum. 17

18 Die Extinktionsänderung ist der Enzymaktivität proportional. NADH bzw. NAD kann direkt an der vom Enzym katalysierten Reaktion beteiligt sein. Analoges gilt für Nikotinamid-adenin-dinukleotidphosphat (NAD(P)) bzw. die reduzierte Verbindung NAD(P)H. Läuft die Reaktion von NADH zu NAD + ab, so handelt es sich um eine Extinktionsabnahme. Wenn die Reaktion von NAD + zu NADH abläuft, so handelt es sich immer um eine Extinktionszunahme: a. Messreaktion: LDH L-Lactat + NAD + Pyruvat + NADH + H + Abb. 17: LDH: Läuft die Reaktion von NAD + (Eduktabnahme) nach NADH (Produktzunahme) ab, so handelt es sich um eine Extinktionszunahme. a. Messreaktion: L-Aspartat + 2-Oxoglutarat ASAT Oxalacetat + L-Glutamat b. Indikatorreaktion: MDH Oxalacetat + NADH + H + L-Malat + NAD + Abb. 18: ASAT: Die Reaktion läuft von NADH (Eduktabnahme) nach NAD + (Produktzunahme) ab, so handelt es sich um eine Extinktionsabnahme. 18

19 10.1. Enzymaktivitätsmessung im gekoppelten optisch-enzymatischen (kinetischen) UV-Test: Auch die Aktivität von Enzymen, welche nicht NAD + - oder NADP + -abhängig sind, kann mit Hilfe des optischen Tests bestimmt werden. Es gibt eine Vielzahl von Enzymen, bei denen keines der in der Messreaktion auftretenden Substrate, Cosubstrate und Produkte photometrisch erfasst werden kann; denn diese Enzyme sind nicht NAD + - oder NADP + -abhängig. Bei ihnen muss die eigentliche enzymatisch-katalysierte Reaktion mit einer NAD + - oder NADP + -abhängigen Indikatorreaktion gekoppelt werden. Man spricht dann von einem gekoppelten optisch-enzymatischen Test. Meistens ist die Indikatorreaktion der eigentlichen Messreaktion nachgeschaltet, indem eines der Produkte der Messreaktion in der Indikatorreaktion weiterreagiert: Die Messreaktion wird von dem zu untersuchenden Enzym aus der Probe katalysiert. In der Indikatorreaktion reagiert eines der dabei gebildeten Produkte zu einem photometrisch sichtbaren Folgeprodukt weiter. Einfach dargestellt: Abb. 19: Gekoppelter optischenzymatischer UV-Test Beispiel für einen gekoppelten optischen Test mit Mess- und Indikatorreaktion ist die Bestimmung der Transaminase Alanin-Aminotransferase ALAT (GPT): a. Messreaktion: ALAT L-Alanin + 2-Oxoglutarat L-Glutamat + Pyruvat b. Indikatorreaktion: LD Pyruvat + NADH + H + Lactat + NAD + Beispiel für einen gekoppelten optischen Test mit Hilfs-, Indikator- und Messreaktion ist die Bestimmung der Creatinkinase (CK): a. Messreaktion: CK Creatinphosphat + ADP Creatin + ATP b. Hilfsreaktion: ATP + Glucose Hexokinase Glucose-6-P + ADP c. Indikatorreaktion: Glucose-6-P- Dehydrogenase Gluc-6-P + NADP + 6-Phosphogluconat + NADPH + H + 19

20 a. Messreaktion: Erster Schritt im Ablauf einer chemischen Reaktion, wobei das zu messende Enzym hier reagiert und Produkte entstehen. b. Hilfsreaktion: Ein oder mehrere Schritte nach der Messreaktion, um die Produkte aus der Messreaktion soweit umzuwandeln, dass dessen Konzentration in der Indikatorreaktion gemessen werden kann. Hier kommen sogenannte "Hilfsenzyme" zum Einsatz: D.h. dem Reagenz zugesetzte Enzyme, die den Umsatz der Edukte in der Hilfsreaktion (=Produkte aus der Messreaktion) katalysieren. c. Indikatorreaktion: Letzter Schritt im Testablauf, in welchem die Edukte zu Produkte reagieren. 20

21 D. ENZYMATISCHE TESTS 11. Enzymatische Substratbestimmung (Enzymatischer Test): Enzyme sind nicht nur unter diagnostischen Gesichtspunkten interessant, sondern auch wichtige Hilfsmittel zur Bestimmung von Substratkonzentrationen, da sie sehr spezifisch sind. Substrat (Protein, Lipid, Glucose usw.), das gemessen werden soll, wird mit Hilfe von Enzymen umgesetzt, so dass die Extinktionsänderung als Mass für die Substratkonzentration fotometrisch erfasst werden kann = Enzymatischer Test. Als Beispiel die Bestimmung der Harnsäure mittels einem Enzym: Für die Harnsäure gibt es ein ideales Enzym, das ist die Uricase. Die Uricase baut Harnsäure ab. Gibt man Uricase zum Serum dazu, wird die Harnsäure abgebaut. Irgendwann ist die ganze Harnsäure abgebaut und die Extinktion ändert sich nicht mehr. Da die Harnsäure bei 290 nm Licht absorbiert, kann man den Abbau im Fotometer beobachten. Die Messung der Harnsäurekonzentration kann auf zwei verschiedene Möglichkeiten ablaufen: Endpunkt-Methode: Dabei lässt man die Reaktion wie oben beschrieben ablaufen. Man misst die Extinktion zwei Mal: Einmal den Ausgangwert vor Zugabe des Enzyms und nach Erreichen des Endwertes. Die Differenz zwischen Ausgangswert und Endwert (multipliziert mit dem entsprechenden Faktor) entspricht der Harnsäurekonzentration Kinetische Methode: Diese hat folgende Grundlage: Unter geeigneten Bedingungen ist die Geschwindigkeit, mit der das Substrat (z.b. Harnsäure) abgebaut wird, proportional zur Menge vorhandenen Substrats. Man kann damit aus der Geschwindigkeit des Abbaus auf die Substratkonzentration schliessen. Man misst hier die Extinktion zweimal während die Reaktion läuft, also während des Abfalls der Substratkonzentration. Mittels geeigneter mathematischer Formeln lässt sich aus der Differenz der beiden gemessenen Extinktionen und der verstrichenen Zeit die Ausgangskonzentration berechnen. (Anmerkung: Vollautomaten messen nicht nur 2x, sondern viel öfters, was zu genaueren Resultaten führt.) 21

22 E. ISOENZYME Enzyme mit gleicher Substratspezifität und enzymatischer Wirkung (d.h. sie katalysieren die gleichen Reaktionen), aber mit unterschiedlicher Proteinstruktur, bezeichnet man als Isoenzyme. Bei Isoenzymen handelt es sich zum Beispiel um mitochondriale und zytoplasmatische Formen des gleichen Enzyms (z.b. ASAT) oder um Enzymvarianten, die gewebespezifisch vorkommen (z.b. Knochen-ALP und plazentäre-alp) oder auch um Enzymvarianten, die rassenspezifische Unterschiede zeigen. Beispiele: Das Enzym LDH (LD) hat 5 Isoenzyme (LDH-1, LDH-2, LDH-3, LDH-4, LDH- 5). Die LDH setzt sich aus zwei verschiedenen genetisch determinierten Untereinheiten A und B zusammen. Das Enzym besteht jeweils aus 4 Untereinheiten, so dass fünf Kombinationen möglich sind. Alle fünf Formen katalysieren dieselbe Reaktion, sind also Isoenzyme. Das Enzym CK hat 3 Isoenzyme: CK-MM, CK-MB, CK-BB. Die relativen Mengen der verschiedenen Isoenzyme sind je nach Organ unterschiedlich. Die üblichen Enzymtestverfahren erfassen alle Isoenzymformen eines Enzyms gemeinsam. Die Quantifizierung von Isoenzymen gewinnt zunehmende diagnostische Bedeutung und ist mittels verschiedener Methoden möglich. Die am häufigsten anzutreffenden sind: Immunologische Bestimmungsverfahren: Die Bestimmung erfolgt mit hochspezifischen monoklonalen Antikörpern (z.b. CK-MB-Masse). Elektrophoretische Trennverfahren (siehe klinische Chemie, Proteine): Aufgrund der unterschiedlichen Proteinstruktur der Isoenzyme zeigen sie charakteristische elektrophoretische Wandereigenschaften; jedes Isoenzym weist eine eigene Bande auf. Dieses Verfahren wird für die Isoenzymbestimmung nur selten durchgeführt. 22

23 F. ENZYME IM EINZELNEN Auf den folgenden Seiten finden Sie eine Zusammenstellung der einzelnen Enzyme, welche im Labor am häufigsten bestimmt werden. Die Referenzbereiche, Probenmaterialien sowie die Präanalytik muss den Packungsbeileger entnommen werden es wird hier nicht näher darauf eingegangen. 12. Alanin-Aminotransferase ALAT/ALT bzw. GPT (Glutamat-Pyruvat-Transaminase): Der Name Transaminase beschreibt die physiologische Funktion des Enzyms Alanin- Aminotransferase (ALAT, früher GPT): Es ermöglicht den Transfer von stickstoffhaltigen Gruppen von einer AS auf eine andere Vorkommen: Die ALAT/GPT ist ein in vielen Geweben vorkommendes Zellenzym. Es ist im Zytoplasma lokalisiert, so dass es bereits bei geringgradigen Störungen der Membranpermeabilität zu einem Anstieg der ALAT im Blut kommt. Die ALAT kommt in grosser Konzentration vor allem in der Leber vor und besitzt somit grosse diagnostische Bedeutung als Leitenzym für die Erkennung, Differenzierung und Verlaufsbeurteilung von Erkrankungen der Leber und Gallenwege. In kleiner Konzentration kommt die ALAT auch in Skelettmuskel, Herz, Niere, Pankreas und Erythrozyten vor, d.h. auch bei diesen Organerkrankungen kann die ALAT im Blut erhöht sein jedoch nur leicht! Parallele Bestimmungen von ALAT und ASAT werden zur Unterscheidung zwischen Leber- und Herz-/Muskelschäden durchgeführt: Als spezifisches Leberenzym ist ALAT nur bei hepatobiliären Erkrankungen signifikant erhöht. Erhöhte ASAT-Werte aber können sowohl mit Erkrankungen der Herz- und Skelettmuskulatur als auch des Leberparenchyms zusammenhängen. In diesem Zusammenhang werden in einigen Spitälern der sogenannte De-Ritis-Quotient (ASAT/ALAT-Quotient) ausgerechnet, um solche Einschränkungen zu machen (siehe später). ALAT ist jedoch bei Lebererkrankungen das spezifischere Enzym als ASAT; ausserdem hält die Erhöhung der ALAT-Aktivität länger an als die der ASAT-Aktivität. Organ: Leber und Gallenwege: Erkrankung und Verhalten der ALAT: bei Lebererkrankungen, z.b.: Hepatitis, Zirrhose, toxische Leberschäden durch z.b. Alkohol, Lebertumor usw. bei Gallenwegerkrankungen, z.b.: Cholestase Geringfügig erhöhte Werte der ALAT können auch durch häufigen Alkoholgenuss und die Einnahme bestimmter Medikamente bedingt sein. 23

24 12.2. Bestimmungsverfahren: Die Alanin-Aminotransferase katalysiert die Übertragung der Aminogruppe von L- Alanin auf 2-Oxoglutarat unter Bildung von Glutamat und Pyruvat. In der nachgeschalteten Indikatorreaktion wird das Pyruvat mit Hilfe von NADH zu Lactat reduziert; diese Reaktion wird durch die Lactatdehydrogenase (LDH) katalysiert. Gemessen wird die Absorptionsabnahme (bei 340 nm, 334 nm oder 365 nm) in der Indikatorreaktion aufgrund des NADH-Verbrauchs (die Abnahme der NADH- Konzentration ist der Enzymaktivität proportional). Es handelt sich dabei um einen gekoppelten, optisch-enzymatisch UV-Test, mittels kinetischer Messung: a. Messreaktion: L-Alanin + 2-Oxoglutarat ALAT L-Glutamat + Pyruvat b. Indikatorreaktion: LDH Pyruvat + NADH + H + L-Lactat + NAD + Bei der ALAT-Bestimmung (wie bei ASAT) können folgende Störungen auftreten, welchen folgendermassen entgegengewirkt wird : Vor dem Start der spezifischen Messreaktion mit 2-Oxoglutarat wird das Coenzym der Transaminasen (Pyridoxalphosphat) dem Reaktionsansatz zugefügt, um etwa in der Probe vorhandene inaktive Apo-ALAT (Enzym ohne gebundenes Pyridoxalphosphat = PLP; ungebunden, weil in der Probe zu wenig des Coenzyms PLP vorhanden ist und so das Enzym ALAT nicht aktiviert werden kann) durch Bildung des Holoenzyms (Apo-ALAT + Pyridoxalphosphat) zu aktivieren. Dieser Zusatz von Pyridoxalphosphat vermeidet falsch niedrige Werte in Proben von Patienten mit Myokardinfarkt, Lebererkrankungen, Intensivpatienten und Patienten mit Vitamin-B6-Mangel, die zu wenig endogenes Pyridoxalphosphat enthalten. Das Pyridoxalphosphat muss dem Reagenz zusätzlich beigefügt und separat bestellt werden aus Kostengründen gibt es Labors, welche kein Pyridoxalphosphat zugeben und den Ansatz ohne Pyridoxalphosphat durchführen. Die Referenzwerte variieren dann einwenig. Wird dem Reagenz kein Pyridoxalphosphat zugefügt, so kann die Serumaminotransferaseaktivität bei obigen Patienten falsch vermindert sein. 24

25 Lactatdehydrogenase (LDH/LD) wird zugegeben, um während der Vorinkubationszeit das in der Probe vorhandene Pyruvat zu reduzieren, damit es nicht durch Reaktion des endogenen Pyruvats konkurrierend zur Indikatorreaktion zu einem unspezifischen NADH-Verbrauch kommt. Endogenes Pyruvat kommt z.b. vermehrt bei Diabetikern vor: Durch Störungen im Glukosestoffwechsel fällt bei ihnen viel Pyruvat an, welches in der Reaktion auch NADH verbraucht und so zu falsch erhöhten Resultaten führen kann. Abb. 20: Reaktionsablauf bei der Bestimmung der ALAT mit Pyridoxalphosphat. 25

26 13. Aspartat-Aminotransferase ASAT/AST bzw. GOT (Glutamat-Oxalacetat-Transaminase): Der Name Transaminase beschreibt die physiologische Funktion des Enzyms Aspartat-Aminotransferase (ASAT, früher GOT): Es ermöglicht den Transfer von stickstoffhalten Gruppen von einer AS auf eine andere Vorkommen: Die ASAT/GOT ist ein in vielen Geweben vorkommendes Zellenzym, das sowohl zytosolisch (zu 1/3) gelöst als auch an mitochondriale Strukturen (zu 2/3) gebunden vorliegt. Die ASAT kommt daher erst dann stärker ins Blut, wenn Zellen vollständig zerstört sind. ASAT kommt in Leber, Herz, Skelettmuskel, Gehirn, Niere, Pankreas, Lunge und Erythrozyten vor. Diagnostische Bedeutung besitzt die ASAT für die Erkennung, Differenzierung und Verlaufsbeurteilung von Erkrankungen der Leber und Gallenwege, sowie darüber hinaus bei der Differenzialdiagnose von Erkrankungen der Skelett- und Herzmuskulatur, beim Lungeninfarkt und der hämolytischen Anämie. Geringfügig erhöhte Werte der ASAT können auch durch häufigen Alkoholgenuss und die Einnahme bestimmter Medikamente bedingt sein. Parallele Bestimmungen von ALAT und ASAT werden zur Unterscheidung zwischen Leber- und Herz-/Muskelschäden durchgeführt: Als spezifisches Leberenzym ist ALAT nur bei hepatobiliären Erkrankungen signifikant erhöht. Erhöhte ASAT-Werte aber können sowohl mit Erkrankungen der Herz- und Skelettmuskulatur als auch des Leberparenchyms zusammenhängen. Ist die ASAT stark erhöht (gleich hoch wie ALAT oder höher), so weist dies auf mitochondriale Schädigung und somit auf eine starke Zellschädigung hin. Organ: Leber und Gallenwege: Skelettmuskel: Herz: Lunge: Blut: Erkrankung und Verhalten der ASAT: bei Lebererkrankungen, z.b.: Hepatitis, Zirrhose, toxische Leberschäden durch z.b. Alkohol, Lebertumor usw. bei Gallenwegerkrankungen, z.b.: Cholestase bei z.b.: Muskeldystrophie, Krampfanfälle, Entzündungen, schwere körperliche Anstrengung Herzinfarkt (keine Organspezifität!) Lungeninfarkt hämolytische Anämie Bestimmungsverfahren: Die Aspartat-Aminotransferase katalysiert die Übertragung der Aminogruppe von L- Aspartat auf 2-Oxoglutarat unter Bildung von L-Glutamat und Oxalacetat. In der nachgeschalteten Indikatorreaktion wird das Oxalacetat mit Hilfe von NADH zu L- Malat reduziert; diese Reaktion wird durch die Malatdehydrogenase (MDH) katalysiert. Gemessen wird die Absorptionsabnahme (bei 340 nm, 334 nm oder 365 nm) in der Indikatorreaktion aufgrund des NADH-Verbrauchs (die Abnahme der NADH-Konzentration ist der Enzymaktivität proportional). Es handelt sich hierbei um einen gekoppelten, optisch-enzymatischen UV-Test, mitels kinetischer Messung: 26

27 a. Messreaktion: L-Aspartat + 2-Oxoglutarat ASAT Oxalacetat + L-Glutamat b. Indikatorreaktion: MDH Oxalacetat + NADH + H + L-Malat + NAD + Bei der ASAT-Bestimmung (wie bei ALAT) können folgende Störungen auftreten, welchen folgendermassen entgegengewirkt wird : Vor dem Start der spezifischen Reaktion wird das Coenzym der Transaminasen (Pyridoxalphosphat) dem Reaktionsansatz zugefügt, um etwa in der Probe vorhandene inaktive Apo-ASAT (Enzym ohne gebundenes Pyridoxalphosphat = PLP; ungebunden, weil in der Probe zu wenig des Coenzyms PLP vorhanden ist und so das Enzym ASAT nicht aktiviert werden kann) durch Bildung des Holoenzyms (Apo-ASAT + Pyridoxalphosphat) zu aktivieren. Dieser Zusatz von Pyridoxalphosphat vermeidet falsch niedrige Werte in Proben von Patienten mit Myokardinfarkt, Lebererkrankungen, Intensivpatienten und Vitamin-B6-Mangel, die zu wenig endogenes Pyridoxalphosphat enthalten. Das Pyridoxalphosphat muss dem Reagenz zusätzlich beigefügt und separat bestellt werden aus Kostengründen gibt es Labors, welche kein Pyridoxalphosphat zugeben und den Ansatz ohne Pyridoxalphosphat durchführen. Die Referenzwerte variieren dann einwenig. Wird dem Reagenz kein Pyridoxalphosphat zugefügt, so kann die Serumaminotransferaseaktivität bei Patienten mit Vitamin-B6-Mangel vermindert sein. Lactatdehydrogenase (LDH/LD) wird zugegeben, um während der Vorinkubationszeit das in der Probe vorhandene Pyruvat zu reduzieren, damit es nicht durch Reaktion des endogenen Pyruvats konkurrierend zur Indikatorreaktion zu einem unspezifischen NADH-Verbrauch kommt. Endogenes Pyruvat kommt z.b. vermehrt bei Diabetikern vor: Durch Störungen im Glukosestoffwech sel fällt bei ihnen viel Pyruvat an, welches in der Reaktion auch NADH verbraucht und so zu falsch erhöhten Resultaten führen kann. Abb. 21: Reaktionsablauf bei der Bestimmung der ASAT mit Pyridoxalphosphat.. 27

28 14. Alkalische Phosphatase ALP/AP: Unter der Bezeichnung Alkalische Phosphatase (ALP/AP) wird eine Gruppe von Enzymen zusammengefasst, die Phosphatester spalten und am besten bei einem ph > 7.0, also im alkalischen Milieu wirken Vorkommen: Die alkalischen Phosphatasen im Blut kommen vorwiegend aus dem Knochen (zu ca. 50%) und der Leber (zu ca. 50%), vor allem das Gallengansgewebe besitzt sehr viel AP-Aktivität. Bei einem Viertel der Menschen stammen ca. 10% aus dem Dünndarm. Bei Schwangeren kommt ein Teil der alkalischen Phosphatase aus der Plazenta. Alkalische Phosphatasen sind membranständige Zellenzyme. Von ihnen existieren verschiedene Isoenzyme, welche aus verschiedenen Geweben stammen und auch so benannt werden: Leber-AP Knochen-AP Dünndarm-AP (auch intestinale-ap) Plazenta-AP Diese AP-Isoenzyme können mit speziellen Tests einzeln gemessen werden. Je nach Methode lassen sich noch einige andere Untergruppen unterscheiden. Wenn man aber von der Alkalischen Phosphatase spricht, so ist damit die Gesamtaktivität aller im Blut befindlichen Alkalischen Phosphatasen gemeint genauer müsste man dies "Gesamt-AP" nennen. Meist reicht die Bestimmung der Gesamt-AP aus, für spezielle Fragestellungen oder Situationen muss man einzelne AP-Isoenzyme bestimmen. Das kann eine unklare Gesamt-AP Erhöhung sein, bei der man wissen möchte, ob sie von der Leber oder vom Knochen verursacht wurde. Oder man möchte die Knochen-AP bei bekannter Lebererkrankung abschätzen. Auch wenn man den Verlauf der AP bei einer Erkrankung kontrollieren möchte gelingt dies exakter durch Bestimmung des interessierenden AP-Isoenzyms. Die Konzentration der Alkalischen Phosphatase im Blut wird meist bei Verdacht auf Leber-, Gallenwegs- oder Knochenkrankheiten bestimmt, sowie zur Beobachtung des Verlaufs dieser Erkrankungen. Bei Verschlüssen der Gallenwege findet man die höchsten Werte, bei Erkrankungen der Leber findet man weniger starke Erhöhungen. Auch Erkrankungen der Knochen können Ursache einer Erhöhung sein. Bei Kindern und in der Schwangerschaft findet man auch normalerweise höhere AP-Spiegel. Organ: Leber und Gallenwege: Knochen: Erkrankung und Verhalten der ALP: bei Lebererkrankungen, z.b.: Hepatitis, Lebertumor und metastasen usw. bei Gallenwegerkrankungen, z.b.: Cholestase bei Knochenerkrankungen als Folge gesteigerter osteoblastischer Aktivität, z.b.: Morbus Paget (entzündliche Knochendystrophie), Osteomalazie (generalisierte Knochenerweichung), Knochentumoren und metastasen 28

29 14.2. Bestimmungsverfahren: Die Alkalische Phosphatase katalysiert in Gegenwart von Magnesiumionen die Hydrolyse des farblosen p-nitrophenylphosphat zu Phosphat und p-nitrophenol, welches im alkalischen Bereich eine gelbe Farbe aufweist, deren Farbintensität bei ca. 405 nm bestimmt wird. Die Geschwindigkeit der Bildung von p-nitrophenol und somit deren Farbintensität ist direkt proportional zur ALP-Aktivität. Gemessen wird die Gesamt-ALP. Es handelt sich demnach um einen kinetischen Farbtest (Enzymtest): a. Messreaktion: p-nitrophenylphosphat + H 2 O ALP p-nitrophenol + Phosphat Abb. 22: Reaktionsablauf bei der Bestimmung der ALP. 29

30 15. Gamma-Glutamyltransferase y-gt/ggt: Die γ-gt hilft Glutamyl-Reste von einem Stoff (z.b. von Glutathion) auf einen anderen (z.b. eine AS) zu übertragen, also zu transferieren Vorkommen: Die Gamma-Glutamyltransferase (γ-gt) findet sich gebunden an die Zellmembran (Zellenzym). Sie kommt in sehr vielen Organen vor. Die γ-gt, die man im Blut messen kann, stammt aber praktisch nur aus der Leber und in der Leber sind es vor allem die Zellen, die die kleinen Gallengänge auskleiden (also Gallengansgewebe), auf denen man besonders viel GGT-Aktivität findet. Die GGT im Blut ist also ein sehr empfindlicher Anzeiger und somit ein Leitenzym für Erkrankungen der Leber und Gallenwege. Organ: Leber und Gallenwege: Erkrankung und Verhalten der ASAT: bei Lebererkrankungen, z.b.: Hepatitis, toxische Leberschäden durch z.b. Alkohol, Leberzirrhose, Fettleber, Lebertumor und metastasen usw. bei Gallenwegerkrankungen, z.b.: Cholestase Zusammen mit anderen Enzymen wie ALAT, ASAT, AP und Cholinesterase ist die γ- GT ein wertvoller Test zur Differentialdiagnose bei Lebererkrankungen Bestimmungsverfahren: Die Gamma-Glutamyltransferase katalysiert die Übertragung der L-γ-Glutamylgruppe von L- γ-glutamyl-3-carboxy-4-nitranilid (Glucana) auf Glycylglycin. Dabei bilden sich L- γ-glutamyl-glycylglycin und 5-Amino-2-nitrobenzoat. Gemessen wird das gelbe Reaktionsprodukt 5-Amino-2-nitrobenzoat bei ca. 405 nm. Die Geschwindigkeit der Bildung von 5-Amino-2-nitrobenzoat ist direkt proportional zur γ-gt-aktivität. Es handelt sich hierbei um einen kinetischen Farbtest (Enzymtest): a. Messreaktion: γ-gt L- γ-glutamyl-3-carboxy-4-nitranilid + Glycylglycin L-γ-Glutamyl-Glycylglycin + 5-Amino-2-nitrobenzoat 30 Abb. 23: Reaktionsablauf bei der Bestimmung der Gamma-GT.