Immunologie in der Labormedizin

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1 Immunologie in der Labormedizin Konteptvorlesung 2 Themenblock 8 Beda M. Stadler Diese Folien stehen auch als PPT Files zum download bereit unter: Einige der Folien werden als Illustration verwendet und sind nicht Lernstoff. Sie sind so wie hier entweder orange unterlegt oder umrandet KV2 im Überblick Lernziele: Immunologie in der Labormedizin Was sind Immunassays? Was versteckt sich hinter den Abkürzungen? Assay Beispiele um immunologische Prinzipien zu vertiefen Aussagekraft von Labordaten Vertrauensgrenzen KV

2 Was ankreuzen? KV KV

3 Selbststudium: de.wikipedia.org/wiki/immunoassay Allgemeine Grundlagen Analyt Detektionstechniken Feste Phase Quantifizierung Assay-Prinzipien Kompetitiver Assay Nicht-kompetitiver Assay Direkter Assay KV KV2 im Überblick Immunologie in der Labormedizin Präzipitationsteste Agglutinations Teste Antigen-Antikörper Teste Allgemein Allergie Diagnostik Flowzytometrie HLA Diagnostik Autoimmun Diagnostik Sensitivität und Spezifität von Labortesten KV

4 Immunkomplex Immunodiffusion (Ouchterlony Gel) A A A Keine Identität Identität Partielle Identität A 1 2 Antigen Kontrollserum Testserum KV Präzipitinkurve B A C + Anti-B Anti-A Anti-C Antigen Antikörper Immunkomplex Prozone Äquivalenz Postzone Antigen KV

5 Radiale Immunodiffusion Antikörper im Gel Ag Ag Ag Ag Diameter 2 Antigen Konzentration KV Globuline Serum Elektrophorese gamma beta alpha2 - alpha1 Albumin + Paraproteinämie-Patient KV

6 Immun-Elektrophorese Albumin Transferrin IgM IgA IgG Normales Serum + - Antikörper gegen Serumproteine Patienetenserum mit IgA Mangel Beispiel KV Direkter Coombs Test KV

7 Der indirekte Coombs Test Step 1 Step 2 Patienten Serum + Erythrozyten + Coombs Reagens (Antiglobulin) z.b. anti-rhd Antikörper KV Passive Hämagglutination (Beispiel: Anti-Syphilis Antikörper) KV

8 Latex Agglutination KV Blutgruppenbestimmung: Geltechnik monoklonaler Antikörper gegen Blutgruppen A Antigen in der oberen Gelmatrix Resultat: Blutgruppe A RhD neg KV

9 z.b. Schwangerschaftstest rapid determination of human chorionic gonadotropin (hcg) in urine specimens Primary antibodies (anti-hcg labelled or on solid phase) Secondary antibodies (anti-ig on solid phase) KV Allergieserologie: welcher Test? Analyse Messprinzip Masseinheit Referenzbereich Anti-b2-Glycoprotein 1 (IgG) ELISA U/ml <15 Cardiolipin-Antikörper (IgG) SYNELISA GPL-U/ml <12 ECP ("eosinophil cationic protein") FEIA g/l Tryptase FEIA g/l Methylhistamin RIA µg/g Kreatinin Total IgE FEIA kiu/l (altersabhängig) Allergen-spezifisches IgE (RAST) FEIA Rastklassen Allergen-spezifisches IgG FEIA mg/l < 50 mg/l Präzipitine Immundiffusion qualitativ negativ KV

10 KV Immun Assay: RIA & ELISA Radio Immuno Assay Isotop Antigen markierter Antikörper Enzyme Antikörper Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay Messung der Radioaktivität oder Enzymaktivität KV

11 ELISA Markierter Antikörper Anti-A Enzym Substrat A Produkt KV Sandwich ELISA Anti-Antikörper Enzym Substrat Anti-A Produkt A KV

12 Standardisierung KV Beispiel: Flowzytometrie Analyse Messprinzip Masseinheit Referenzbereich HLA-B27 Zytofluorometrie qualitativ positiv/negativ Lymphozyten Zytofluorometrie Zellen/ l CD3 absolut Zytofluorometrie Berechnung Zellen/ l % der Lymphozyten CD4 absolut Zytofluorometrie Berechnung Zellen/ l % der Lymphozyten CD8 absolut Zytofluorometrie Berechnung Zellen/ l % der Lymphozyten NK-Zellen Zytofluorometrie Berechnung Zellen/ l % der Lymphozyten B-Zellen Zytofluorometrie Berechnung Zellen/ l % der Lymphozyten KV

13 sample nozzle sheet flow prism laser FACS red fluorescence green fluorescence right angle scatter Fluorescence Activated Cell Sorter forward scatter sorted cells KV Zellpopulationen? KV

14 CD-Antikörper CD Antigen Funktion Vorkommen CD 2 CD 3 CD 4 Rezeptor für CD 58 (LFA-3), alternativer Aktivierungsweg von T-Lymphozyten T-Zell-Rezeptor-assoziierte polypeptidketten, Signaltransduktion assoziative Erkennungsstruktur (Bindung an MHC-Klasse II Moleküle), HIV-Rezeptor unreife und reife T-lymphozyten reife T-Lymphozyten T-Helferzellen, Monozyten, Makrophagen CD 8 Bindung an MHC-Klasse I Moleküle zytotoxische T-Lymphozyten CD 14 CD 16 Rezeptor für bakterielles Endotoxin (LPS=Lipopolysacharid) Fc-gamma Rezeptor III Monozyten, Makrophagen NK-Zellen, Monozyten-Subpopulationen, Makrophagen CD 23 niedrig affiner (bindender) Rezeptor für IgE B-Lymphos, follikuläre dendritische Zellen (=FDC) CD 25 Interleukin-2-Rezeptor aktivierte T-Lymphozyten IgM Antigenrezeptor unreife + reife B-Lymphos IgD Antigenrezeptor reife B-Lymphos HLA-DR MHC-Klasse II Moleküle, Bindung von Antigenpeptiden AG-präsentierende Zellen (dendritische Zellen, Monozyten, B-Zellen), aktivierte T-Lymphos KV Eine Immunantwort verfolgen KV

15 CD-Marker bei der Diagnose von lymphohämopoietischen Erkrankungen Stammzelle Prä-B. frühe B. mittlere B. reife B. plasmozytoide B. Plasmazelle ALL PLL, Burkitt Lymphom CLL, foll. L. Haarzell- L. Waldenström Myelom CD19 CD 20 CD 34 CD 52 CD138 KV Beispiel: HLA Typisierung Analyse Messprinzip Masseinheit Referenzbereich HLA-B27 Zelllyse qualitativ positiv/negativ HLA-Typ I (A, B, C) (serologisch) Zelllyse qualitativ Phänotypisierung HLA-Typ I (A, B) PCR-SSP qualitativ Phänotypisierung HLA-Typ II (DR) PCR-SSP qualitativ Phänotypisierung HLA-Typ II (DQ) PCR-SSP qualitativ Phänotypisierung HLA-Typ II (DP) PCR-SSP qualitativ Phänotypisierung HLA-Typ Organempfänger PCR-SSP qualitativ Phänotypisierung T-Zell Cross-match Zelllyse qualitativ negativ B-Zell Cross-match Zelllyse qualitativ negativ Leukozytenantikörper Zelllyse qualitativ negativ KV

16 HLA Typisierung einst... KV Überlebensrate Nierentransplantate Number of HLA mismatches A & B DQ & DR 0 0 A & B DQ & DR 3 or 4 1 or 2 KV

17 HLA-B27 Typisierung mittels FACS KV HLA Typisierung serologisch KV

18 PCR KV HLA: Molekulare Diagnostik KV

19 Array Technologie DNA Chips KV Western Blot: Prinzip KV

20 HIV: Western Blot 1. Lane 1, HIV+ serum (positive control) 2. Lane 2, HIV- serum (negative control) 3. Lane A, Patient A 4. Lane B, Patient B 5. Lane C, Patient C KV Beispiel: Autoimmunserologie Analyse Messprinzip Masseinheit Referenzbereich Rheumafaktor Nephelometrie IU/ml < 20 Zellkerne (ANA) IIF Titer < 1:80 Thyreoidea Thyroglobulin Agglutination Titer < 1:400 C1-Esteraseinhibitor Fotometrie % des % (funktionell) Normwertes C1q-tragende Immunkomplexe ELISA g/ml < 35 Hautbiopsie DIF qualitativ negativ Schleimhautbiopsie DIF qualitativ negativ KV

21 Nephelometry KV Immunfluoreszenz Antinukleäre Antikörper (ANA) Fluorochrom markierter AK Ag Gewebe KV

22 In situ Hybridisierung KV FISH KV

23 FISH Beispiel Fluorescent in situ hybridisation of a small intestinal biopsy in a case of Whipple's disease (confocal laser scanning microscopy). Tropheryma whipplei rrna is blue, nuclei of human cells are green and the intracellular cytoskeletal protein vimentin is red. Magnification approximately 200 x. KV Immunhistochemie Human Papillomavirus DNA demonstrated by In Situ Hybridisation (pink) in epithelial cells identified by indirect immunofluorescence using antibody against cytokeratin (green) KV

24 Sensitivität und Spezifität Sensitivität (epidemiologisch) Sensitivität (analytisch) niedriger Titer Serokonversion Verdünnung KV oder... Sensitivität = Wahrscheinlichkeit, dass Test bei kranken Personen positiv ausfällt Spezifität = Wahrscheinlichkeit, dass Test bei gesunden Personen negativ ausfällt KV

25 Genauigkeit der Labordiagnostik Sensitivität = Anzahl richtig positiver (Anzahl richtig positiver + Anzahl falsch negativer) X 100% Spezifität = Anzahl richtig negativer Anzahl richtig negativer + Anzahl falsch positiver X 100% KV Beispiel Testergebnis positiv (krank) negativ (gesund) positiv (krank) richtig positiv 95 falsch negativ 5 Tatsächlicher Sachverhalt negativ (gesund) Gesamt falsch positiv richtig negativ Gesamt Sensitivität: 95 % Spezifität: 90 % KV

26 Aussagekraft der Labordiagnostik positiver prädiktiver Wert = echt Positive echt Positive + falsch Positive X 100% negativer prädiktiver Wert = echt Negative echt Negative + falsch Negative X 100% KV HIV Testung bei der Gesamtbevölkerung (82Mio) Falls Sensitivität und Spezifität = 99.9% HIV positiv HIV negativ HIV-Test positiv HIV-Test negativ 67 Summe ca. 82 Mio 82 Mio positive Vorhersagewert beträgt nur 45 %! KV

27 KV2 im Rückblick Immunologie in der Labormedizin Traditionelle Serologie Moderne immunologische Teste Molekularbiologische Methoden Outlook: Point-of-care testing? Immunologie Wahlpraktikum 3. Studienjahr 2004 Ein Einblick in die Labormedizin KV