Zur Erfassung trans-wirksamer Komponenten der Sauerstoff-abhängigen Gärungsregulation der Hefe Pichia stipitis

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1 Zur Erfassung trans-wirksamer Komponenten der Sauerstoff-abhängigen Gärungsregulation der Hefe Pichia stipitis Von der Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften der Rheinisch Westfälischen Technischen Hochschule Aachen zur Erlangung des akademischen Grades einer Doktorin der Naturwissenschaften genehmigte Dissertation vorgelegt von Diplom-Biologin Barbara Susanne Schruff aus Würselen Berichter: Universitätsprofessor Ulrich Klinner Universitätsprofessor Klaus Wolf Tag der mündlichen Prüfung: 25. Februar 2005 Diese Dissertation ist auf den Internetseiten der Hochschulbibliothek online verfügbar.

2 Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung Die Bedeutung von Sauerstoff für die Zelle Sauerstoff-abhängige Regulationssysteme Bakterien Hefen Säugetiere Sauerstoff-abhängige Gärungsregulation Gärungsregulation der Hefe P. stipitis Isolation und physiologische Funktion der PsADH-Gene Cis-regulatorische Elemente der PsADH-Promotoren Hinweise auf den Sauerstoffsensor und die Signaltransduktion der Gärungsregulation in P. stipitis Modell für die Erforschung der Sauerstoff-abhängigen Regulation bei Säugetieren: S. cerevisiae oder P. stipitis? Ziel der Arbeit Material und Methoden Mikroorganismen Nährmedien Plasmide und Plasmidkonstrukte Oligonukleotide Chemikalien, Puffer und Enzyme Mikrobiologische und biochemische Methoden Kultivierung von P. stipitis im Fermenter mit unterschiedlichen Belüftungsbedingungen Bestimmung von Enzymaktivitäten Bestimmung von Zucker- und Ethanolkonzentrationen Bestimmung der Zellkonzentration Molekularbiologische Methoden Reinigungsmethoden für DNA Gelelektrophoretische Trennung von DNA Nukleinsäurekonzentrationsbestimmung Transformation Polymerasekettenreaktion (PCR) Restriktion und Ligation von DNA Southern-Hybridisierung

3 Inhaltsverzeichnis Sequenzierung von DNA und Sequenzanalysen Genetische Methoden Bestimmung der Plasmidstabilität in Hefetransformanten UV-Mutagenese Kreuzung und Massensporenanalyse Ergebnisse Charakterisierung des Transformationswirts P. stipitis CBS 5774 PJH53 his3-1 trp Untersuchungen zum Verhalten bei unterschiedlichen Belüftungsbedingungen Charakterisierung des P. stipitis HIS3-Gens P. stipitis URA3 als Reportergen Überprüfung der 5-FOA-Resistenz von P. stipitis Versuche zur Gewinnung eines Transformationsstamms mit ura3-marke S. cerevisiae TRP5 als Reportergen Überprüfung der 5-FAA-Resistenz von P. stipitis Versuche zur Gewinnung eines Transformationsstamms mit stabiler trp5- Marke Konstruktionen zur Herstellung des Reportersystems Konstruktion der ends-out-kassette PsADH2::ScTRP5::PsADH2 mittels LFH- PCR Konstruktion des autonomen Reporterplasmids pbssw-rep Klonierung der Reporterkassette in den ends-in Vektor psfpsadh Konstruktion des integrativen Reporterplasmids prep-lfh Konstruktion des integrativen Vektors pbspshis3 zur REMI-Mutagenese des Reporterstamms Transformation der Reporterkonstrukte Versuche zur Transformation des LFH-PCR-Produkts Transformation des autonomen Reporterplasmids pbssw-rep und Nachweis der Expression des Reportergens REMI- Transformation des Vektors psfpsadh1-bsrep Transformation des integrativen Plasmids prep-lfh Charakterisierung des Reporterstamms Bestimmung der mitotischen Stabilität des Reporterstamms Untersuchungen zum Integrationsort der Konstrukte Untersuchungen zum DNA-Gehalt des Reporterstamms

4 Inhaltsverzeichnis 3.7 Vergleich der Transformationseffizienzen und Integrationsart verschiedener.. Derivate der integrativen Plasmide prep-lfh und pbspshis Transformation des Vektors pbspshis Bestimmung des Integrationsorts des 1,64 kb PsHIS3-Amplifikats mittels Southern-Hybridisierung Mutagenese des Reporterstamms Insertionsmutagenese UV-Mutagenese Diskussion Charakterisierung des Transformationswirts Charakterisierung des PsHIS3-Gens Verhalten des Transformationsstamms P. stipitis PJH his3-1 trp5-10 bei unterschiedlichen Belüftungsbedingungen Konstruktion des Reporterstamms Eignung verschiedener Reportergene Transformationseffizienz und Integrationsart verschiedener Reporterkonstrukte in P. stipitis Eignung der PCR zum Nachweis homologer Vektorintegration Mutagenese des Reporterstamms Selektion regulatorischer ADH2-Mutanten Zusammenfassung Literatur Anhang

5 1. Einleitung 1. Einleitung 1.1 Die Bedeutung von Sauerstoff für die Zelle Die Evolution der Photosynthese führte zur Entstehung einer sauerstoffhaltigen Erdatmosphäre. Während der letzten 1,4 Milliarden Jahre war ein großer Teil der evolutionären Entwicklung mit der Anpassung an dieses fast allgegenwärtige Molekül und mit seiner Nutzung beschäftigt. Durch seine Fähigkeit, Elektronen aufzunehmen, kann Sauerstoff an Redox-Reaktionen teilnehmen, die für die Oxidation von organischen Komponenten notwendig sind, um metabolische Energie zu gewinnen (Kasting, 1993; Graham et al., 1995). Mit der Ausnahme strikter Anaerobier und aerotoleranter Organismen sind alle Lebewesen von Sauerstoff als terminalem Elektronenakzeptor der Atmungskette zur aeroben Energiegewinnung abhängig. Darüber hinaus benötigen Eukaryonten Sauerstoff zur Synthese von zellulären Bestandteilen wie Sterolen, ungesättigten Fettsäuren, Ascorbinsäure und Häm (Bunn und Poyton, 1996). Seitdem Zellen erstmals Sauerstoff für den aeroben Metabolismus nutzbar machten, mussten sie gleichzeitig damit umgehen, dass reaktive Sauerstoffspezies (ROS, reactive oxygen species) lebenswichtige Zellfunktionen zerstören können. Während der Atmung werden in einem kontrollierten Prozess vier Elektronen der Elektronentransportkette zusammen mit vier Protonen auf molekularen Sauerstoff übertragen, wobei 2 Moleküle Wasser entstehen. Bei unvollständiger Reduktion des molekularen Sauerstoff entstehen nacheinander Superoxidradikale (O - 2 ), Wasserstoffperoxyd (H 2 O 2 ) oder Hydroxylradikale (OH ). Jedes dieser reaktiven Zwischenprodukte oxidiert umliegende, biologische Makromoleküle wie DNA, Proteine und Lipide (Morel und Barouki, 1999; Storz und Imlay, 1999). Darüber hinaus können bei Reaktion der ROS mit benachbarten Biomolekülen weitere starke Oxidantien wie Peroxynitrit (ONOO - ) oder Hypochlorsäure (HOCl) entstehen (Murphy et al., 1998). Ein Netzwerk antioxidierender Enzyme soll die ROS vollständig zu Wasser reduzieren. Dazu zählen die Superoxid-Dismutase, die Katalase, die Glutathion-Peroxidase sowie antioxidierend wirkende Vitamine (Sies et al., 1992). Die gleichzeitige Nutzung von Sauerstoff zur Energiegewinnung, die Gefahr durch Sauerstoffradikale geschädigt zu werden (oxidativer Stress oder Sauerstofftoxizität) und die Sicherung des Überlebens bei Sauerstoffmangelbedingungen führte zur Entwicklung eines komplexen genetischen Programms, das Sauerstoffkonzentrationen misst und angemessen auf Änderungen der intrazellulären Sauerstoffkonzentration antwortet (Bunn und Poyton, 1996). 5

6 1. Einleitung 1.2 Sauerstoff-abhängige Regulationssysteme Die Regulation von Genen als Antwort auf einen äußeren Stimulus erfolgt klassisch über eine Ligand-Rezeptor-Interaktion, gefolgt von chemischen Reaktionen, die das Signal transduzieren und zur Expression der entsprechenden Gene führen. Im Allgemeinen geschieht dies durch die Induktion oder Repression der Transkription, durch Änderung der mrna- Stabilität oder der Translationsrate (Bunn und Poyton, 1996). Sauerstoff-abhängige Regulationssysteme werden für Prokaryonten sowie niedere und höhere Eukaryonten beschrieben. Derzeit können über Sauerstoffsensoren, Signaltransduktion und die daraus resultierende Transkriptionsaktivierung nur wenige Aussagen getroffen werden. Weiterhin ist nicht bekannt, ob verschiedene taxonomische Gruppen ähnliche Sauerstoffmessmechanismen verwenden. Dennoch scheint Häm bei den meisten Systemen eine wichtige Rolle zu spielen (Kwast et al., 1999) Bakterien Obwohl viele Prokaryonten über aerobe Atmung verfügen, können die meisten auch anaerobe Atmungsketten mit alternativen Elektronenakzeptoren nutzen. Wenn keine geeigneten Elektronenakzeptoren verfügbar sind, nutzen sie Gärung zur Energiegewinnung. Jedoch ist Sauerstoff durch seine thermodynamischen und kinetischen Eigenschaften auch bei Bakterien der bevorzugte Elektronenakzeptor (Poole, 1994). Die Verfügbarkeit von Sauerstoff ist eins der wichtigsten regulatorischen Signale bei fakultativ anaeroben Bakterien. Man unterscheidet in der Regel zwischen Ein- und Zwei- Komponenten Sensor/Regulator Systemen, die die Expression des aeroben und anaeroben Metabolismus Sauerstoff-abhängig kontrollieren. Die meisten Sensorproteine haben Häm oder Eisen als Cofaktoren, die mit Sauerstoff entweder durch Bindung oder durch Redox- Reaktionen interagieren (Unden et al., 1995). Zu den bei Bakterien besser verstandenen Sauerstoff-abhängigen Regulationssystemen zählen das Arc-Netzwerk, das den aeroben Metabolismus bei E. coli reguliert, und die FNRabhängige Expressionsregulation, die den anaeroben Stoffwechsel kontrolliert (Bunn und Poyton, 1996). Das Arc (aerobic respiratory control)-zweikomponenten-signaltransduktionssystem ermöglicht fakultativ anaeroben Bakterien den Redox-Status der Zelle zu messen und entsprechend den respiratorischen Wachstumsbedingungen die Genexpression von mehr als 30 Operons (Arc-Modulons) anzupassen (Lynch und Lin, 1996). Das System besteht aus dem cytosolischen Regulator-Protein ArcA und der Sensor-Kinase ArcB. Der N-Terminus von ArcB ist in der Cytoplasmamembran verankert, während das C-terminale Ende drei katalytisch aktive cytosolische Domänen aufweist: die Transmitter-Domäne mit einem 6

7 1. Einleitung konservierten His(292)-Rest, ein zentrales Receiver-Modul mit einem konservierten Asp(576)-Rest und eine zweite C-terminale Transmitter-Domäne mit einem konservierten His(717)-Rest. ArcB wird an dem His(292)-Rest mit ATP als Phosphorylgruppen-Donor autophosphoryliert. Danach wird der Phospatrest nacheinander auf den Asp(576)-Rest, den His(717)-Rest und schließlich auf den konservierten Asp(54)-Rest des Receiver-Moduls von ArcA übertragen. Die Übertragung des Phosphatrests kann durch einen ArcB-vermittelten Prozess wieder in die andere Richtung ablaufen (Iuchi, 1993; Kwon et al., 2000). Unter aeroben Bedingungen werden Chinon-Elektronentransporter in der oxidierten Form in der Zelle angehäuft und inhibieren die ArcB-Autophosphorylierung. Als Konsequenz nimmt auch die Anzahl phosphorylierter ArcA-Proteine ab. Dadurch werden viele Operons, deren Produkte am respiratorischen Metabolismus beteiligt sind, dereprimiert und die Expression verschiedener Operons des fermentativen Metabolismus deaktiviert (Georgellis et al., 2001). Unter anaeroben Bedingungen werden glycolytische Produkte wie D-Lactat, Pyruvat und Acetat in der Zelle akkumuliert. Sie sind nicht das Hauptsignal der ArcB-Kinase-Aktivität, verstärken aber als allosterische Effektoren die ArcB-Autophosphorylierung, wodurch die Menge an phosphoryliertem ArcA wieder ansteigt und den zellulären Metabolismus von Atmung zu Gärung umschaltet (Rodriguez et al., 2004). ArcA erfährt durch die Phosphorylierung eine Konformationsänderung, die seine Bindungsaffinität an die Sequenz GTTAATTAAATGNNA der Zielpromotoren stark erhöht und zur Repression oder Aktivierung der Transkription führt (McGuirre et al., 1999). Der Sauerstoffsensor und der mit Sauerstoff interagierende Cofaktor dieses Systems sind bisher nicht bekannt. Das FNR (fumarate nitrate reductase regulation)-protein gehört zu den Ein-Komponenten- Systemen der Sauerstoff-abhängigen Regulation mit einer DNA- und einer Effektor- Bindungsdomäne. Der Transkriptionsfaktor kontrolliert die Synthese von bis zu 125 Genen (Kiley und Beinert, 1999). FNR aktiviert unter anderem Enzyme der anaeroben Oxidation von C-Quellen (z.b. Formiatdehydrogenasen), Enzyme, die die anaerobe Reduktion alternativer terminaler Elektronenakzeptoren (z.b. Nitrat-, Fumarat-, Dimethylsulfoxid-Reduktasen) katalysieren und Transportproteine dieser C-Quellen und Elektronenakzeptoren. Es reprimiert die Synthese von Enzymen, die für die aerobe Atmung notwendig sind, wie z. B. die der NADH-Dehydrogenase (Guest et al., 1996). Unter anaeroben Bedingungen liegt FNR als homodimerer Komplex mit einem [4Fe-4S] 2+ -Cluster je Untereinheit in der aktiven Form vor. Der [4Fe-4S] 2+ -Cluster dient nicht nur als Sauerstoffsensor, sondern ist für die FNR-Funktion essentiell (Unden und Schirawski, 1997). Er fördert die Dimerisierung und ermöglicht so die spezifische DNA-Bindung des Transkriptionsfaktors an die Konsensusequenz TTGAT...ATCAA der Zielpromotoren (Bell et al., 1989). Mit zunehmender Sauerstoffkonzentration wird [4Fe-4S] 2+ -FNR über einen monomeren [2Fe-2S] 2+ -Status zum inaktiven Apoprotein degradiert. Es konnte nachgewiesen werden, dass für die Destabilisierung des [2Fe-2S] 2+ -Clusters Superoxid, ein Nebenprodukt des aeroben Metabolismus, verantwortlich ist (Sutton et al., 2004). 7

8 1. Einleitung Hefen Wie bei Bakterien, wird auch der Metabolismus von Hefen stark durch Sauerstoff beeinflusst. Die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae ist schon seit langem ein bevorzugtes Forschungsobjekt und der Modellorganismus niederer Eukaryonten. Nach Abschluss des Sequenzierprojekts (Mewes et al., 1997) zeigten Vergleiche, dass zwischen S. cerevisiae und vielzelligen Organismen relativ große Ähnlichkeit besteht. Bei einem Sequenzvergleich des gesamten S. cerevisiae Genoms mit dem des Menschen wurden zu 105 Genen, die mit menschlichen Krankheiten in Verbindung gebracht werden, Hefehomologe identifiziert (Foury, 1997). Da Hypoxie und ROS die Ursache vieler menschlicher Krankheiten darstellen (Semenza, 1998), ist es nicht verwunderlich, dass die Sauerstoff-abhängige Regulation niederer Eukaryonten vor allem bei S. cerevisiae untersucht wird (Bunn und Poyton, 1996). Bei Sauerstoffmangel wird die Transkription von ca. 360 Genen bei S. cerevisiae signifikant hoch- oder runterreguliert (Ter Linde et al., 1999). Man unterscheidet zwei Kategorien von Genen, die Sauerstoff-abhängig reguliert werden: Gene, die unter normoxischen Bedingungen optimal transkribiert werden, und Gene, die bei niedrigen Sauerstoffkonzentrationen oder unter anoxischen Bedingungen exprimiert werden. Die unter aeroben Bedingungen induzierten Gene kodieren respiratorische Funktionen und werden meist durch Häm als Cofaktor aktiviert. Dazu zählen die oxidative Phosphorylierung (Cytochromuntereinheiten) und die Antwort auf oxidativen Stress (Katalase, Superoxid-Dismutase). Die unter hypoxischen Bedingungen induzierten Gene werden in der Regel durch Häm reprimiert. Ihre Funktionen beziehen sich auf die Verwendung von Sauerstoff im Elektronentransport oder auf die Membran- und Hämbiosynthese (Zitomer und Lowry, 1992; Zitomer et al., 1997). Ein Häm abhängiger Transkriptionsaktivator ist HAP1 (heme activation protein). Er besteht aus verschiedenen funktionellen Regionen: einer Zink-Finger DNA-Bindungsdomäne, einer Domäne, die für die Dimerisierung von HAP1 benötigt wird, einer Region für die Transkriptionsaktivierung und zwei regulatorischen Domänen (Pfeifer et al., 1989). In der Abwesenheit von Häm liegt HAP1, vermittelt durch eine der regulatorischen Domänen, als Komplex mit weiteren zellulären Proteinen vor und ist inaktiv. Im Zusammenhang mit den komplexierten Proteinen ist die Aktivierung durch Häm unklar (Bunn und Poyton, 1996), sie führt jedoch zur Bindung von HAP1 an die sogenannten UAS (upstream activation sites). Dabei handelt es sich um cis-regulatorische Elemente der Zielgen-Promotoren mit der Konsensussequenz CGGN 3 TANCGGN 3 TA (Ha et al., 1996). Das Genprodukt HAP1 aktiviert außerdem unter aeroben Bedingungen, zusammen mit weiteren, bisher unbekannten Transkriptionsaktivatoren, die Expression des ROX1-Gens (Kwast et al., 1998). ROX1 kodiert für einen Repressor, der bei Sauerstoffanwesenheit die Expression der hypoxischen Gene hemmt, indem er an die entsprechenden UAS mit der Konsensussequenz YYYATTGTTCT bindet. Die Bindung kann nur im Komplex mit den Transkriptionsfaktoren SSN6 und TUP erfolgen. Zusammen mit ROX1 ist das Vorhandensein oder das Fehlen einer Bindungsstelle 8

9 1. Einleitung für MOT3 in diesen Promotoren für die differenzierte Reprimierung der hypoxischen Gene verantwortlich, da die Bindung von MOT3 die ROX1 Repression verstärkt (Kastaniotis et al., 2000). Bei Sauerstoffmangel oder unter anaeroben Bedingungen wird die Hämsynthese eingestellt. So kann kein aktives HAP1 mehr gebildet werden und die ROX1 abhängigen Gene werden dereprimiert. Wie Häm in die Transkriptionsregulation eingreift, ist noch unklar. Es werden folgende Möglichkeiten diskutiert: 1) Häm ist ein Cofaktor verschiedener Transkriptionsfaktoren, wodurch die Hämkonzentration die Transkription kontrolliert; 2) Häm dient als Redox-sensitive prosthetische Gruppe der Transkriptionsfaktoren oder weiterer Effektoren, die die Aktivität der Transkriptionsfaktoren regulieren; 3) Häm als Sauerstoffsensor reguliert Transkriptionsfaktoren direkt oder indirekt durch den Redox-Status des zentralen Eisenatoms (Kwast et al., 1998). Weitere hypoxische Gene werden durch die antagonistische Interaktion des Repressors ORD1 und des Transkriptionsaktivators YAP1 Häm- und ROX1-unabhängig reguliert. YAP1 ist ein wichtiger Aktivator der oxidativen Stressantwort der Zelle. Gleichzeitig induziert YAP1 die Expression des hypoxischen Gens SRP1, das für die Zellwandintegrität unter hypoxischen Bedingungen notwendig ist, was vermuten lässt, dass Hypoxie für Hefezellen Stress bedeutet. Dieses System ist sehr komplex und bisher wenig untersucht (Bourdineaud et al., 2000; Kwast et al., 2002). In den Promotoren einiger hypoxischer Gene findet man sogenannte LORE (low oxygen response elements) mit der Konsensussequenz ACTCAACAA. Sie dienen der verstärkten Transkriptionsaktivierung bei einer bestimmten niedrigen Sauerstoffkonzentration, unmittelbar vor dem Erreichen anaerober Bedingungen. Durch die Zugabe von Kobalt oder Nickel und Eisenchelatoren wird die verstärkte Expression dieser Gene auch unter aeroben Bedingungen induziert. Kohlenmonoxid blockiert die Induktion dieser Gene unter hypoxischen Bedingungen. Diese Eigenschaften sprechen dafür, dass ein Hämprotein wie die Cytochrom c Oxidase bei diesem Regulationssystem als Sauerstoffsensor fungiert. Es wird daher auch als Häm-Sensor-System bezeichnet (Kwast et al., 1999; Vasconcelles et al., 2001). 9

10 1. Einleitung Säugetiere Die Regulation der Sauerstoffhomöostase ist in höheren Eukaryonten wesentlich komplexer als in Einzellern. Die Sauerstoff-abhängige Regulation auf Zellniveau, die den Glucosetransport, die Glycolyse, die Gluconeogenese sowie die ROS-Entgiftung betrifft, ist der der einzelligen Organismen sehr ähnlich. Zusätzlich findet man auf Gewebeniveau eine Hypoxie abhängige Expressionsregulation verschiedener Gene für Adhäsionsmoleküle und für Cytokinin- und Endothelzellgene. Auf Ganzkörperniveau führt Hypoxie durch Regulation der Ventilation und Erythrozytenmenge zur Optimierung des Sauerstofftransports (Bunn und Poyton, 1996). Als zentraler Regulationsfaktor der Prozesse, die dem Organismus helfen, die Sauerstoffhomöostase beizubehalten, gilt bei Säugern der Transkriptionsfaktor HIF-1 (hypoxia inducible factor) (Ambrosini et al., 2002). HIF-1 wurde als nukleäres Protein identifiziert, das bei Hypoxie an ein HRE (hypoxia response element) mit der Konsensussequenz TACGTGCT im Enhancer des menschlichen Erythropoetin-Gens (EPO) zur Transkriptionsaktivierung in Leber und Niere bindet (Semenza und Wang, 1992; Semenza, 1998). EPO kodiert einen Wachstumsfaktor, der die Erythropoese und damit die Sauerstofftransportkapazität des Blutes reguliert (Wang et al., 1995). Auch die Glycolyserate wird in hypoxischen Zellen HIF-1 vermittelt gesteigert. Außerdem induziert Hypoxie die Expression einer Reihe von Cytokiningenen sowie den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF), der eine wichtige Rolle bei der Wundheilung, bei ischämischen Erkrankungen 1 und bei der Tumorbildung spielt. Zunächst wird das Tumorwachstum bei einigen Millimetern Größe durch mangelnde Sauerstoffdiffusion limitiert. Als Anpassung an die Hypoxie wird VEGF induziert und aktiviert die Angiogenese 2, wodurch weiteres Wachstum ermöglicht wird (Semenza, 1998; Ferrara, 1999; Semenza, 2000). HIF-1 ist ein α/β-heterodimer, dessen Untereinheiten zu der basischen Helix-loop-Helix- PAS-Superfamilie (bhlh-pas-superfamilie) gehören. Durch die Dimerisierung der Untereinheiten über die HlH-Domäne stehen die basischen N-terminalen Reste der DNA- Bindung zur Verfügung. Die Funktion der PAS-Domäne ist bei Hif-1 noch ungeklärt. Bei anderen Mitgliedern der bhlh-pas-superfamilie dient sie der Dimerisierung sowie der Zielgenspezifität (Taylor und Zhulin, 1999). Der HIF-1α Faktor stellt die durch Sauerstoff regulierte Untereinheit dar (Fedele et al., 2002). Liegt kein Sauerstoffmangel vor, wird HIF- 1α schnell abgebaut. Dieser Abbau wird durch die Sauerstoff-abhängige Degradationsdomäne ODD, die in einer zentralen Region von HIF-1α liegt, über den Ubiquitinproteosom-Weg kontrolliert (Huang et al., 1998). Durch die Hydroxylierung konservierter Prolin-Reste dieser 1 Ischämische Erkrankungen: Krankheiten, die aus mangelnder Blutzufuhr resultieren 2 Angiogenese: Gefäßbildung 10

11 1. Einleitung Region wird die α-untereinheit durch das von Hippel Lindau Tumor Suppressor Protein pvhl 3 ubiquitiniert und so für die schnelle Degradation unter normoxischen Bedingungen markiert. Da die Prolylhydroxylase nur bei Sauerstoffanwesenheit aktiv ist, kann sie als direkter Sauerstoffsensor fungieren (Lando et al., 2003; Michiels, 2004). Am carboxyterminalen Ende von HIF-1α befinden sich Transkriptionsaktivierungsdomänen (TADs), deren Aktivität durch Hypoxie induziert wird (Semenza, 1998). Eine Asparaginylhydroxylase, die nur bei Sauerstoffanwesenheit aktiv ist, hydroxyliert in dieser Region den Asn803-Rest und verhindert so die Anlagerung des Coaktivators CBP/p300 unter normoxischen Bedingungen (Dann et al., 2002; Lando et al., 2003; Michiels, 2004). Neben der Sauerstoff-abhängigen Prolyl- und Asparaginylhydroxylierung gibt es viele Hinweise darauf, dass ein Cytochrom b mit NADPH-Oxidase-Funktion als Sensor agiert. Sauerstoff bindet hier reversibel an die Eisenatome der Hämproteine und wird zu reaktiven Sauerstoffintermediaten (ROIs) wie Superoxid reduziert. Die Entstehung der ROIs wird durch freie Eisenionen über eine Fentonreaktion (OH - +. OH + Fe 3+ ) katalysiert. Die Sauerstoffradikale führen vermutlich zu einer Oxidation der HIF-1-Sulfhydrylgruppen, wodurch Disulfidbrücken entstehen. Die daraus resultierende Konformationsänderung verhindert die Bindung an HREs und damit die Transkriptionsaktivierung. Bei Sauerstoffmangel werden die Disulfidbrücken reduktiv gespalten und HIF-1 wird aktiv (Semenza, 1998). Auch eine Phosphorylierung des Proteins scheint Einfluss auf die Aktivität zu haben (Minet et al., 2001). 3 Das von Hippel Lindau Krebs Syndrom wird durch die Inaktivierung von pvhl ausgelöst, die zu einer konstitutiven Expression von Hif-1α und seiner Zielgene führt. Unter anderem kommt es durch die kontinuierliche Expression von VEGF zur verstärkten Angiogenese und damit zum verstärkten Tumorwachstum (Michiels, 2004). 11

12 1. Einleitung 1.3 Sauerstoff-abhängige Gärungsregulation Wie bereits in den Abschnitten 1.1 und 1.2 angedeutet wurde, ist die Sauerstoff-abhängige Regulation bei einzelligen Organismen, aber auch auf zellulärem Niveau vielzelliger Lebewesen, sehr wichtig für die Sicherstellung der metabolischen Energiegewinnung, um Sauerstoffmangelsituationen zu überleben. Die Gärung als ATP regenerierender Stoffwechselweg ist hierbei weit verbreitet und der entwicklungsgeschichtlich älteste Prozess der Energiegewinnung (Graham et al., 1995; Bunn und Poyton, 1996). In Abwesenheit von Sauerstoff als terminalem Elektronenakzeptor werden bei der Gärung Redoxäquivalente, die im Fructosebisphosphat-Weg bei der Oxidation des 3-Phosphoglycerinaldehyds zum 1.3- diphosphoglycerat entstehen, regeneriert. Dazu wird der Acetaldehyd, der durch die Decarboxylierung des Pyruvats entsteht, zu Ethanol reduziert. Auf diese Weise kann die Zelle durch Substratphosphorylierung ATP regenerieren. Die Induktion der Gärung unter hypoxischen oder anaeroben Bedingungen findet man bei Bakterien (Bunn und Poyton, 1996), im Wurzelgewebe von Pflanzen (Geigenberger, 2003), im tierischen Gewebe (Hermes-Lima und Zenteno-Savín, 2002), in strikt aeroben filamentösen Pilzen und in Hefen (Lockington et al., 1997). Bei respiratorischen Hefen wie Candida utilis und Kluyveromyces lactis wurde ebenfalls ein Sauerstoff-abhängiger Wechsel zwischen Atmung und Gärung nachgewiesen. Über dafür zuständige Regulationsmechanismen ist aber nur wenig bekannt (Kaliterna et al., 1995; Kiers et al., 1998) Gärungsregulation der Hefe P. stipitis Die respiratorische Hefe P. stipitis fand zum ersten Mal zu Beginn der 1980er Jahre durch ihre Fähigkeit, neben Glucose auch Xylose zu vergären, biotechnologisches Interesse (Du Preez und Prior, 1985). Hierbei erreicht sie Ausbeuten, die dem theoretischen Ethanolertrag bei Xylosevergärung sehr nahe kommen (Olsson und Hahn-Hägerdal, 1996). Da Xylose nach Glucose den zweithäufigsten Zucker der pflanzlichen Biomasse darstellt, wäre die Xylosevergärung für die Gesamtökonomie der fermentativen Ethanolproduktion aus Lignocellulose als regenerierbarem Rohstoff essentiell (Schneider, 1989; Wyman und Goodman, 1993; Lynd et al, 1996). Die kommerzielle Nutzung der Hefe zur Konversion von Lignocellulose zu Ethanol wird jedoch durch die physiologischen Eigentümlichkeiten der Hefe, die eine kostenintensive Prozessführung bedeuten würden, erschwert. Im Vergleich zu industriell genutzten Glucose vergärenden S. cerevisiae Stämmen ist die Toleranz gegenüber dem gebildeten Ethanol und auch die Ethanolbildungsrate bei P. stipitis gering (Du Preez, 1994; Hahn-Hägerdal et al., 1994). Untersuchungen der Hefe in Hinblick auf eine optimierte Ethanolproduktion zeigten, dass die Regulation der Gärung von P. stipitis sich von der der so genannten Modellhefe S. cerevisiae, die durch ihre traditionelle Nutzung und 12

13 1. Einleitung biotechnologische Relevanz als Ethanolproduzent sehr gut untersucht ist, grundlegend unterscheidet (Zitomer et al., 1997). S. cerevisiae ist eine Crabtree-positive Hefe, das heißt, bei nicht-limitierten Konzentrationen vergärbarer C-Quellen beginnen die Zellen, unabhängig von der Sauerstoffverfügbarkeit zu gären. Als Ursachen hierfür werden eine Katabolitrepression der Atmungsenzyme und das Überschreiten der Atmungskapazität der Zellen diskutiert. Die Gärungsenzyme Alkoholdehydrogenase (ADH) und Pyruvatdecarboxylase (PDC) werden durch die Anhäufung später glykolytischer Metabolite Sauerstoff-unabhängig aktiviert (Boles et al., 1993; Müller et al., 1995; Pronk et al., 1996). Die fermentative Hefe nutzt unter anaeroben Bedingungen in Anwesenheit von Ergosterol und ungesättigten Fettsäuren die Gärungsenergie zum Wachsen (Andreasen und Stier, 1953, 1954; Visser et al., 1990). Bei der respiratorischen Hefe P. stipitis kann unter aeroben Bedingungen keine Ethanolbildung nachgewiesen werden. Unter Sauerstoff limitierenden Bedingungen ist der Ethanolertrag am höchsten, unter strikt anaeroben Bedingungen nur gering. Die Wachstumsrate sinkt proportional zur Sauerstoffversorgung, so dass optimale Fermentationsbedingungen stark vermindertes Wachstum bewirken (Skoog und Hahn-Hägerdal, 1990; Skoog et al., 1992). Auch in Anwesenheit von Ergosterol und ungesättigten Fettsäuren zeigt P. stipitis kein anaerobes Wachstum (Rizzi et al., 1989). Passoth et al. (1996) konnten demonstrieren, dass die Gärungsenzyme von P. stipitis nicht durch Signale der Glykolyse, sondern Sauerstoffabhängig reguliert werden. P. stipitis zeigt demnach keinen Crabtree-Effekt Isolation und physiologische Funktion der PsADH-Gene In Komplementationsversuchen von S. cerevisiae ADH - - Mutanten mit einer P. stipitis- Genbank des Stamms CBS 5774 wurden zwei PsADH-Gene isoliert, die zu weiteren ADHhomologen Hefestrukturgenen Nukleotid-Sequenzähnlichkeiten von 60% bei Schizosaccharomyces pombe bis zu 77 % bei Kluyveromyces lactis aufweisen. Die Ähnlichkeit der PsADH-Gene zueinander beträgt ca. 80%. Beide Gene kodieren wahrscheinlich für cytoplasmatische, zinkabhängige Alkoholdehydrogenasen (Passoth et al., 1998). In P. stipitis CBS 6054 wurden mit Hilfe einer Sonde zu dem S. cerevisiae ADH1-Gen die gleichen Gene isoliert. Southern-Hybridisierungen zeigten jedoch mindestens drei Loci in der genomischen DNA dieses Stamms, die homolog zu ScADH2 sind (Cho und Jeffries, 1998). Beim Vergleich der Transkriptmengen der Isoenzyme mit der ADH-Aktivität bei unterschiedlichen Kultivierungsbedingungen zeigte sich, dass die ADH-Aktivität auf Transkriptionsebene induziert wird. Die ADH2 dient der Ethanolassimilation und ist unter semiaeroben Bedingungen für die Ethanolbildung verantwortlich (Passoth et al., 1998; Cho und Jeffries, 1998). Das PsADH1-Transkript ist unter aeroben Bedingungen bei Wachstum auf fermentierbaren C-Quellen nachweisbar, dennoch scheint die ADH1 weder an der Ethanolassimilation noch an seiner Bildung beteiligt zu sein (Passoth et al., 1998). Cho und Jeffries (1999) hingegen konnten unabhängig von den Belüftungsbedingungen keine ADH1-13

14 1. Einleitung Transkription feststellen. Disruptionsversuche demonstrierten, dass für das Wachstum auf Ethanol eines der beiden ADH-Gene ausreichend ist. Gleiches gilt für die Xylosevergärung, jedoch führt die Disruption des ADH2-Gens zu einer geringeren Ethanolbildungs- und Wachstumsrate als die ADH1-Disruption. Bei Disruption beider Gene liegt die Ethanolbildungsrate aus Xylose bei 13% der Rate des Wildtypstamms. Unter diesen Bedingungen kommt es demnach zur Expression einer dritten ADH. Eine Ethanolveratmung ist aber nicht mehr möglich (Cho und Jeffries, 1998). Die Disruption des ADH2-Gens führt unter aeroben Bedingungen auf nicht-fermentierbaren C-Quellen zu einer stark erhöhten ADH1-Expression, was darauf hindeutet, dass die ADH1 einer Autoregulation unterliegt, wie man sie von den PDC1 und PDC5-Genen von S. cerevisiae kennt (Cho und Jeffries, 1999) Cis-regulatorische Elemente der PsADH-Promotoren Die Regionen um den putativen Translationsstart beider PsADH-Gene entsprechen, mit Ausnahme des 1 Nucleotids relativ zum Translationsstart der PsADH2, der für S. cerevisiae beschriebenen Konsensussequenz A/YAA/TA (Cigan und Donahue, 1987), was für einen konservierten Mechanismus der Translationsregulation von P. stipitis und S. cerevisiae spricht. Jedoch findet man in den 5 Regionen beider PsADH-Gene keine cis-wirksamen Elemente der Sauerstoff-abhängigen Regulation, keine Homologie zu regulatorischen Sequenzen der glykolytischen Enzyme einschließlich der ADH1 und keine UAS (upstream activation sequence) der ADH2 von S. cerevisiae (Passoth et al., 1998). Im PsADH1- Promotor befindet sich ein Sequenzmotiv (TGGTTT), das für die hypoxische Aktivierung der ADH1 von Mais (Olive et al., 1991) und für die Induktion des ADHIII-Gens von Aspergillus nidulans verantwortlich ist (Kelly et al., 1990). Durch die Konstruktion eines Reporterstamms, bei dem das Gen für ein künstliches grünfluoreszierendes Protein yegfp (Cormack et al., 1997) unter die Kontrolle des PsADH2- Promotors gebracht wurde, konnten durch Promotordeletionsanalysen cis-wirksame Elemente, die für die hypoxische Aktivierung der ADH2 verantwortlich sind, identifiziert werden (Passoth et al., 2003). Die Deletion der 600 bis 400bp Region stromaufwärts des Translationsstarts reduzierte die Reportergenaktivität unter semiaeroben Bedingungen um ca. ein Drittel. In dieser Region befindet sich ein AGGGG-Motiv, das bei S. cerevisiae ein generelles Stress-Antwort-Element darstellt, aber in den ScADH-Promotoren nicht vorkommt (Mager und De Kruijff, 1995). Durch weitere Deletionsversuche und electrophoretic mobility shift assays (EMSA) wurde eine 15 bp lange Sequenz identifiziert (AACATACGATCCGTT von -401 bis 387bp), die bei Sauerstoffmangel mit einem Protein interagiert und für die hypoxische Aktivierung der ADH2 essentiell ist. In diesem Motiv befinden sich die HIF-1-Bindungs-Konsensussequenzen TACG und TCCG, die man unter anderem auch in den Promotoren der humanen Phosphoglycerat-Kinase 1 und der Lactatdehydrogenase A der Maus gefunden hat (Semenza et al., 1994; Firth et al., 1995). Es wurden auch weitere Konsensussequenzen der HRE, an die der Transkriptionsfaktor HIF-1 14

15 1. Einleitung zur Sauerstoff-abhängige Regulation in Säugetieren bindet (Abschnitt 1.2.3), im PsADH2- Promotor gefunden. Hierbei handelt es sich um folgende Sequenzmotive: CACAG von 503 bis 498bp und von 417 bis 412bp, AACAG von 471 bis 466bp und GCGTG von 305 bis 300bp (Semenza, 1998) Hinweise auf den Sauerstoffsensor und die Signaltransduktion der Gärungsregulation in P. stipitis Wie in Abschnitt 1.2 bereits erläutert wurde, spielt Häm als Redox-sensitive prosthetische Gruppe, als Cofaktor oder als Sauerstoffsensor bei der Sauerstoff-abhängigen Regulation eine entscheidende Rolle, da seine Biosynthese an die Anwesenheit von Sauerstoff gekoppelt ist (Zitomer und Lowry, 1992). Die Gärungsregulation von P. stipitis wird ebenfalls durch Häm beeinflusst. Die PsADH2-Transkription wird unter fermentativen Bedingungen bei Zugabe von Hämproteinen stark reprimiert. Gleichzeitig mit der Induktion von PsADH2 wird die Expression des Cytochrom C-Gens (CYC1) von P. stipitis reprimiert. Die Sauerstoffabhängige ADH2-Expression kann demnach Häm vermittelt sein (Cho und Jeffries, 1999). Im Häm-Sensor-System von S. cerevisiae und im HIF-1-abhängigen Regulationssystem von Säugern findet unter aeroben Bedingungen bei Zugabe von Co 2+, nicht aber bei Zugabe von Cyanid, eine Aktivierung hypoxischer Gene statt (Kwast et al., 1999; Vasconcelles et al., 2001). Dieser Effekt - die aerobe Induktion des hypoxischen PsADH2-Gens - wurde auch bei P. stipitis beobachtet und spricht ebenfalls für die Beteiligung eines Hämproteins an der Signaltransduktion (Passoth et al., 2003). Jedoch konnte Passoth, V. (persönliche Mitteilung) keine aerobe Induktion der PsADH2-Transkription durch die Zugabe des Eisenchelators Desferrioxamin feststellen, was gegen die Beteiligung eines Hämsensors spricht. In Säugern sind sowohl reaktive Sauerstoff- (Abschnitt 1.2.3) wie auch reaktive Stickstoffintermediate an der Sauerstoff-abhängigen Signaltransduktion beteiligt und werden in einer NADPH-abhängigen Reaktion aktiviert (Huang et al., 1999; Droge, 2002; Bracken et al., 2003). Die NO-Synthase (NOS) katalysiert unter NADPH-Verbrauch die Bildung von Zitrullin und NO aus Arginin und O 2 (Wilken und Huchzermeyer, 1999; Mungrue et al., 2003). Das NO-Radikal inhibiert die Prolylhydroxylase, die unter aeroben Bedingungen durch Ubiquitinierung die Degradation von HIF-1α einleitet (Abschnitt 1.2.3). Auf diese Weise kommt es zur Expression hypoxischer Gene unter normoxischen Bedingungen (Metzen et al., 2003). Da die NOS-Aktivität im tierischen Gewebe in einem weiten Bereich der Sauerstoffkonzentration proportional ist, wird die NO-Synthase, genau wie Häm, als ein möglicher Sauerstoffsensor betrachtet (Stuehr, 1999). In P. stipitis ist ebenfalls eine NO- Synthase-Aktivität nachweisbar. Durch die Zugabe von NO-Radikalen werden die PDC- und ADH-Induktion bei einem Shift der Sauerstoffspannung von 80% auf 20% synergistisch verstärkt. Daher ist auch die Beteilung reaktiver Stickstoff-Spezies an der Sauerstoffabhängigen Regulation von P. stipitis wahrscheinlich und ein Einfluss auf die 15

16 1. Einleitung Gärungsregulation denkbar (Klinner et al., 2004). Ein weiterer Hinweis, dass in P. stipitis Sauerstoff- und Stickstoffradikale Komponenten der Signaltransduktion darstellen, ist ihr großer Bedarf an dem Redoxäquivalent NADPH. Im Unterschied zu S. cerevisiae weist P. stipitis eine sehr hohe Pentosephosphat-Weg-Aktivität auf (Metzger und Hollenberg, 1994; Fiaux et al., 2002). Beim einmaligen Umlauf des Zyklus werden durch die Oxidation von drei Molekülen Glucose-6-phosphat zu zwei Molekülen Fructose-6-Phosphat und einem Molekül Glycerinaldehyd-3-phosphat sechs Moleküle NADPH 2 regeneriert. Diese könnte P. stipitis zur Aktivierung von Sauerstoff und Stickstoff nutzen (Martini und Ursini, 1996) Modell für die Erforschung der Sauerstoff-abhängigen Regulation bei Säugetieren: S. cerevisiae oder P. stipitis? In der nicht-konventionellen Hefe P. stipitis sind Untersuchungen auf molekularer Ebene, genau wie in höheren Eukaryonten, erschwert, da nur unzureichende Kenntnisse über das genetische System vorliegen und nur wenige Gensequenzen bekannt sind (Klinner und Schäfer, 2004). Das Betreiben reverser Genetik in P. stipitis, unter anderem durch die Entwicklung von Reportersystemen zu Genexpressionsanalysen, erfordert, gentechnologische Methoden für diese Hefe zu etablieren bzw. zu optimieren (Hagedorn, 1990; Passoth et al., 2003). Ein wichtiger Ansatzpunkt ist dabei die Verbesserung der Transformationseffizienz in P. stipitis, da bei gezielter Insertionsmutagenese mit ends-in und ends-out Vektoren die nichthomologe Integration sehr häufig stattfindet (Schruff et al., 2004; Klinner und Schäfer, 2004). Vergleicht man S. cerevisiae mit P. stipitis bezüglich ihrer Eignung als Modellorganismen, so scheint es grundsätzlich sinnvoll, die Bäckerhefe durch die Sequenzierung ihres Genoms und durch die Etablierung zahlreicher molekulargenetischer Methoden als Objekt der angewandten und Grundlagenforschung zu bevorzugen. Betrachtet man jedoch die im Folgenden aufgeführten Aspekte der Sauerstoff-abhängigen Regulation beider Hefen, so wird das Potential von P. stipitis als Modellhefe deutlich. Bei vielen Säugetiergenen, die durch Sauerstoffmangel induziert werden, kann der hypoxische Effekt, genau wie bei der Häm-abhängigen Regulation von S. cerevisiae (Abschnitt 1.2.2), ebenfalls durch Kobalt, Nickel und Eisenchelatoren nachgeahmt bzw. durch CO blockiert werden. Dies läßt vermuten, dass bestimmte Mechanismen der Sauerstoffabhängigen Transkriptionsregulation bei Eukaryonten hoch konserviert sind (Kwast et al., 1999; Vasconcelles et al., 2001). Dennoch ähnelt die Sauerstoff-abhängige Regulation von S. cerevisiae wenig der der meisten anderen Hefearten oder höheren Eukaryonten, die bei O 2 Anwesenheit einen respiratorischen Stoffwechsel durchführen (Zitomer et al., 1997; Visser et al., 1990). In der Bäckerhefe wurden keine glykolytischen oder fermentativen Enzyme gefunden, die durch die bei S. cerevisiae bekannten Sauerstoff-abhängigen Regulationssysteme (Hap/Rox-, ORD1/Yap1-, Häm-Sensor-System) aktiviert werden. In Säugern werden viele dieser Enzyme durch HIF-1 induziert (Semenza, 1998). In S. cerevisiae 16

17 1. Einleitung sind in den entsprechenden Promotoren keine HREs der HIF-1α abhängigen Regulation vorhanden (Zitomer et al., 1997). Daher scheint die fermentative Hefe S. cerevisiae als Modellorganismus zur Erforschung grundlegender Mechanismen der Sauerstoff-abhängigen Regulation bei Eukaryonten nur bedingt geeignet zu sein. Alle bei Säugern durch HIF-1 regulierten Gene werden durch Hypoxie oder unter aeroben Bedingungen in Anwesenheit von CoCl 2, jedoch nicht durch Cyanid induziert. Des Weiteren befinden sich in den Promotoren HREs mit mindestens einer HIF-1-Bindungsstelle, deren Mutationen zum Verlust der transkriptionalen Antwort auf Hypoxie führen (Semenza, 1998; Ivan et al., 2001). Die genannten Eigenschaften des HIF-1-Regulationssystems treffen alle auf die ADH2-Regulation von P. stipitis zu (Passoth et al., 2003). Darüber hinaus besitzt P. stipitis eine NOS-Aktivität und die Sauerstoff-abhängige Gärungsregulation wird, genau wie die HIF-1 abhängige Signaltransduktion bei Säugern, durch NO-Radikale beeinflusst (Klinner et al., 2004). Diese Befunde zeigen, dass die Gärungsregulation von P. stipitis der Sauerstoffabhängigen Regulation höherer Eukaryonten viel ähnlicher ist als der von S. cerevisiae. Man kann vermuten, dass ein HIF-1 homologes Protein über einen ähnlichen Regulationsmechanismus wie bei höheren Eukaryonten an der Sauerstoff-abhängigen Gärungsregulation von P. stipitis beteiligt ist, bzw. dass die Mechanismen der Sauerstoffmessung und Signaltransduktion zwischen respiratorischen Eukaryonten konserviert sind (Klinner et al., 2005). HIF-1 funktionell homologe Proteine wurden auch in Drosophila und Caenorhabditis gefunden und sind demnach nicht auf Säuger beschränkt (Nagao et al., 1996; Shen und Powell-Coffman, 2003). Daher scheint P. stipitis als Modellorganismus für die Grundlagenforschung der Sauerstoff-abhängigen Regulation geeigneter als S. cerevisiae. Neben den cis-regulatorischen Elementen des PsADH2-Promotors und einigen Hinweisen auf Faktoren, die an der Sauerstoff-abhängigen Signaltransduktion beteiligt sind, sind die Natur des Sauerstoffsensors sowie trans-wirksamer Faktoren der Signaltransduktion dieses Systems unbekannt (Passoth et al., 2003; Klinner et al., 2005). Nähere Kenntnisse oder die Identifizierung beteiligter Komponenten würden neue Angriffspunkte für die molekulargenetische Optimierung der Xylosevergärung durch P. stipitis sowie der durch Hypoxie induzierbaren Expressionssysteme bieten, wodurch das biotechnologische Potential der Hefe besser genutzt werden kann (Cho und Jeffries, 1998; Lu et al., 1998; Passoth und Hahn- Hägerdal, 2000). Darüber hinaus können Kenntnisse über molekulare Mechanismen als Antwort auf Sauerstoffmangel und über den Umgang von Zellen mit gefährlichen Sauerstoffund Stickstoffradikalen der Medizin neue Behandlungsmethoden eröffnen (Foury, 1997; Semenza et al., 1998). Aufgrund der dargestellten Aspekte der Gärungsregulation von P. stipitis bietet sie sich mit allen Vorteilen eines einzelligen Organismus zur Untersuchung der Sauerstoff-abhängigen Regulation an. 17

18 1. Einleitung 1.4 Ziel der Arbeit Das Ziel der Arbeit bestand in der Entwicklung eines Reportersystems, das es ermöglicht, trans-wirksame Komponenten des Sauerstoff-abhängigen Transkriptions-Regulationssystems von P. stipitis zu detektieren. Zu diesem Zweck sollte ein rekombinanter P. stipitis Stamm konstruiert werden, der sich für die Selektion von PsADH2-Regulationsmutanten eignet. In dem Stamm sollte ein Reporterstrukturgen unter die Kontrolle des PsADH2-Promotors gebracht werden, das dann abhängig vom Sauerstoffangebot exprimiert wird. Nach Mutagenese des Reporterstamms sollten konstitutive ADH2-Regulationsmutanten auch unter nicht induzierenden, also aeroben Bedingungen, durch die Expression des Reportergens, die zum prototrophen Phänotyp führt, selektierbar sein. Bei Mutanten, in denen es unter hypoxischen Bedingungen nicht mehr zur Induktion des ADH2-Promotors kommt, bleibt entsprechend die Expression des Reportergens aus. Solche nicht-dereprimierbaren Mutanten sollten bei Sauerstoffmangel anhand des auxotrophen Phänotyps selektiert werden. Zur Entwicklung des Reportersystems ergaben sich folgende Arbeitsschwerpunkte: 1) Charakterisierung des Transformationswirts In vorhergehenden Untersuchungen zeigten der Wildtyp-Stamm P. stipitis CBS 5774 und der daraus hervorgegangene Transformationswirt P. stipitis PJH53 his3-1 trp5-10, in dem das Reportersystem etabliert werden sollte, Unterschiede im Wachstumsverhalten, was neben den Auxotrophien auf weitere Mutationen von PJH53 schließen lässt. Da Abweichungen im Atmungs- und Gärungsverhalten des Transformationsstamms vom Wildtypstamm bei der Interpretation der mit Hilfe des Reportersystems gewonnenen Erkenntnisse berücksichtigt werden müssen, sollten wichtige Charakteristika wie das Wachstum, die Ethanolproduktion, der Glucoseverbrauch sowie die ADH- und PDC-Aktivität der Stämme unter aeroben und Gärungs-aktivierenden Bedingungen verglichen werden. Dazu wurde in Batch- Fermentationen die Sauerstoffspannung von aeroben zu semiaeroben und anaeroben Bedingungen reduziert und zu unterschiedlichen Zeitpunkten vor und nach dem Shift die genannten Parameter bestimmt. Zur weiteren Charakterisierung des Transformationsstamms sollte das HIS3-Gen von P. stipitis sequenziert werden, da die Sequenz des Gens für weiterführende Untersuchungen im Rahmen dieser Arbeit benötigt wurde. 2) Untersuchungen zur Eignung möglicher Reportergene Als Reporter kommt nur ein Gen in Frage, bei dem neben dem prototrophen Phänotyp auch der auxotrophe Phänotyp positiv selektierbar ist. Bei S. cerevisiae wird die Selektion von ura3- und verschiedenen trp-auxotrophen Mutanten beschrieben. Durch die Giftung bestimmter Substanzen durch Enzyme, die jeweils an der Uracil- oder Tryptophanbiosynthese beteiligt sind, sterben Wildtypstämme ab. Die entsprechenden Auxotrophien ermöglichen aber bei Zugabe des nicht-toxischen Endprodukts zum Medium das Wachstum. Um zu klären, 18

19 1. Einleitung ob diese Selektionssysteme auch in P. stipitis anwendbar sind, sollte die Resistenz gegenüber den Antimetaboliten ermittelt und Möglichkeiten, die entsprechenden Auxotrophien stabil in den Transformationswirt PJH53 einzuführen, untersucht werden. 3) Konstruktion und Integration der Reporterkassette P. stipitis ist durch eine geringe Transformationseffizienz und eine bevorzugte ektopische Integration gekennzeichnet. Daher sollte untersucht werden, welche Vektortypen (zirkuläre oder linearisierte ends-in oder ends-out Vektoren) sich zur stabilen Integration der Reporterkassette in den Transformationsstamm P. stipitis PJH53 his3-1 trp5-10 eignen und ob weitere Faktoren wie die Kotransformation einzelsträngiger oder doppelsträngiger DNA die Transformationseffizienz verbessern können. Da der PsADH2-Promotor vermutlich nur bei Hypoxie ausreichend stark induziert wird, sollte überprüft werden, unter welchen Kultivierungsbedingungen die Selektion von Transformanten möglich ist. 4) Nachweis der Integration der Reporterkassette Unter den erhaltenen Transformanten sollten homologe Integranten, in denen es durch die Insertion der Reporterkassette zur Disruption des ADH2-Gens gekommen ist, mittels der Polymerasekettenreaktion identifiziert werden. Southern-Hybridisierungen mit Sonden zum PsADH2-Promotor und zum Reportergen sollten mit DNA der Transformanten, in denen die Reporterkassette laut PCR homolog integriert ist, durchgeführt werden, um die ADH2- Disruption durch die Reporterkassette zu bestätigen. 5) Mutagenese des Reporterstamms und Selektion von PsADH2-Regulationsmutanten Im Reporterstamm sollten Mutationen durch REMI-tagging (restriction enzyme mediated integration; Schiestl und Gietz, 1991) eines bakteriellen Plasmids oder durch UV-Mutagenese induziert werden. Es sollte untersucht werden, inwieweit sich die Methoden zur Induktion von PsADH2-Regulationsmutanten eignen. REMI-tagging als Mutagenesemethode ist zu bevorzugen, da der Vektorintegrationsort markiert wird und somit das mutierte Gen isoliert werden kann. Dadurch wäre die direkte Isolation trans-wirksamer Komponenten der Sauerstoff-abhängigen PsADH2-Regulation möglich. 19

20 2. Material und Methoden 2. Material und Methoden 2.1 Mikroorganismen Die verwendeten Mikroorganismen sind in Tabelle 2.1 zusammengefasst. Tabelle 2.1: Verwendete Hefe- und Bakterienstämme Hefen Stammbezeichnung RWTH- Nummer Bemerkungen / Herkunft P. stipitis CBS NRRL* (Y-11542) P. stipitis CBS NRRL (Y-7124) P. stipitis PJH53 trp5-10 his (Hagedorn, 1990) P. stipitis CBS 5774 PJH53 his3-1 trp5-10 adh1::his (Fluthgraf et al., 2003) P. stipitis CBS 5773 trp-4 his-5 80 RWTH** P. stipitis CBS 5773 trp-4 leu-1 81 RWTH P. stipitis CBS 5773 trp-4 lys-6 82 RWTH P. stipitis CBS 5773 trp-4 lys-7 83 RWTH P. stipitis CBS 5773 trp-4 lys-8 84 RWTH P. stipitis CBS 5773 asn-1 trp-2 71 RWTH P. stipitis CBS 5773 asn-1 trp-3 73 RWTH P. stipitis CBS 5775 trp RWTH P. stipitis CBS 5776 ade-4 lys RWTH P. stipitis CBS 5776 arg-1 his RWTH P. stipitis FPL-UC7 ura zur Verfügung gestellt von T. W. Jeffries (Dep. of Bacteriology, P. stipitis FPL-LU10 ura3-3 leu University of Wisconsin, USA) (Lu et al., 1998) S. cerevisiae 41α ade2-119 trp5 ilv RWTH S. cerevisiae ATCC RWTH Bakterien RWTH; für die Vermehrung von Escherichia coli DH5α 795 Plasmiden *: ARS Culture Collection, Nothern Regional Research Laboratory (Peoria, Illinois, USA) **: Rheinisch Westfälische Technische Hochschule Aachen 20

21 2. Material und Methoden 2.2 Nährmedien Die Lagerung der Stämme erfolgte bei 70 C in Flüssigmedium, das im Verhältnis 1:1 mit Glycerin versetzt war. Als Hefe-Vollmedium (YEP) diente ein Hefeextrakt-Pepton-Medium mit 2% Glucose (Ausubel et al., 1991), für E. coli wurde LB-Medium (Ausubel et al., 1991) verwendet. Plasmidhaltige Stämme wurden in Selektivmedium gelagert. Das verwendete Minimalmedium für Hefen (YNB) war wie folgt zusammengesetzt: 1,7 g/l yeast nitrogen base w/o amino acids and ammonium sulfate (Difco) 5 g/l (NH 4 ) 2 SO 4 20 g/l Glucose Yeast nitrogen base wurde getrennt vom übrigen Medium filtersterilisiert. Bei Bedarf wurden dem Medium folgende Substanzen zugegeben: 60 mg/l Adenin, 50 mg/l Arginin, 50 mg/l Asparagin, 50 mg/l Histidin, 50 mg/l Isoleucin, 60 mg/l Leucin, 60 mg/l Lysin, 50 mg/l Methionin, 50 mg/l Serin, 50 mg/l Threonin, 120 mg/l Tryptophan, 50 mg/l Uracil, 0,75 g/l 5- FOA (Apollo Scientific LTD), 0,5 g/l 5-FAA (Aldrich) Bei plasmidhaltigen E. coli-stämmen wurden dem LB-Medium folgende Substanzen zugesetzt: 100 µg/ml Ampicillin (LBA), 100 µg/ml X-Gal, 4mM IPTG. Anzucht und Stammhaltung für weiterführende Versuche wurden in den entsprechenden Medien ohne Glycerin mit verklonten Stämmen durchgeführt. Zur Verfestigung der Medien wurden 15 g/l Agar-Agar (Roth) zugegeben. Fermentationsversuche wurden in einem Minimalmedium für P. stipitis (PMM) (nach Dellweg et al., 1984) mit folgender Zusammensetzung durchgeführt: 18,75 g/l KH 2 PO 4 6 g/l (NH 4 ) 2 HPO 4 1,13 g/l MgSO 4 x 7H 2 O, ph 5,0 (konz. HCl) 1,7 g/l yeast nitrogen base (Difco) 50 g/l Glucose Die C-Quelle und yeast nitrogen base wurden getrennt vom übrigen Medium sterilisiert. Das Medium wurde mit 1500 mg/l Tryptophan und 1500 mg/l Histidin supplementiert. 2.3 Plasmide und Plasmidkonstrukte Die verwendeten Plasmide sind in Tabelle 2.2, die im Rahmen der Arbeit konstruierten Plasmide in Tabelle 2.3 aufgelistet. Plasmid-DNA wurde in 10 mm Tris-HCL, ph 8,5 gelöst und bei 20 C gelagert. 21

22 2. Material und Methoden Tabelle 2.2: Plasmide Plasmidbezeichnung puc 19 puc 4K Beschreibung amp R, oriv, lacz, Polycloning-site im lacz-gen (Yanish-Peron et al., 1985) amp R, kan R von Pharmacia pjh-s-1 amp R, oriv, SwARS1, PsHIS3 (Hagedorn, 1990) pswat-1 amp R, oriv, SwARS1, ScTRP5 (Pinotek et al., 1998) es wurden 3,5 kbp bis 20 kbp große Fragmente partiell mit Sau3A verdauter DNA des Stamms P. stipitis CBS 5774 in die BamHI- YEp-TW-Bank Schnittstelle von Yep24 (amp R, oriv, 2µ ARS, ScURA3; Botstein et al., 1979) inseriert (konstruiert von T. Weierstall, Labor M. Ciriacy, Düsseldorf) die Amplifikate der Regionen von 180 bp bis +319 bp als BamHI / SacI-Fragment und von +361 bp bis bp wurden als SacI / pakpsura3 BamHI-Fragment des PsURA3-Gens in puc19 kloniert (Kirchhoff, 1999) In den Vektor pbspshis3 (Tabelle 2.3) wurde ein BamHI / SacIpSFPsADH1 Fragment des PsADH1-Gens von +250 bp bis +829 bp kloniert (Fluthgraf et al., 2003) Tabelle 2.3: Plasmidkonstrukte Plasmidbezeichnung Konstruktion im Vektor pswat-1 wurde die ScTRP5-Promotorregion von 490 bp pbssw-rep bis 40 bp gegen die Promotorregion des PsADH2-Gens von 481 bp bis 1 bp ausgetauscht das 2,8 kb große PsHIS3 tragende EcoRI-Restriktionsfragment des pbspshis3 Vektors pjh-s-1 wurde in puc19 kloniert die mittels LFH-PCR hergestellte Reporterkassette psfpsadh1-bsrep PsADH2::ScTRP5::PsADH2 wurde als NarI-Restriktionsfragment in den Vektor psfpsadh1 inseriert der PsADH2-Promotor (-481 bp bis 1 bp) wurde über eine ClaI- Schnittstelle an den ScTRP5-Bereich von 40 bp bis bp fusioniert; das Fusionsprodukt wurde als SacI / BamHI-Restriktionsfragment in puc19 kloniert. Es resultierte der Vektor prep; die prep-lfh PsADH2-Region von +838 bp bis bp wurde als BamHI / SphI- Fragment in prep ligiert ein 699 bp großes EcoRI / XbaI-Restriktionsfragment des Vektors pbs1 pjh-s-1 wurde in puc19 kloniert ein 1,6 kb großes XbaI-Restriktionsfragment des Vektors pjh-s-1 pbs2 wurde in puc19kloniert ein 1 kb großes SalI / EcoRI-Restriktionsfragment des Vektors pjh-spbs3 1 wurde in puc19 kloniert 22

23 2. Material und Methoden 2.4 Oligonukleotide Die verwendeten Oligonukleotide wurden von der Firma MWG Biotech bezogen. Die Sequenzen und ihre Positionen bezüglich des Translationsstartpunkts sind in Tabelle 2.4 aufgelistet. Bei Klonierungen wurden Primer mit geeigneten Linkersequenzen am 5 Ende verwendet. 23

24 2. Material und Methoden Tabelle 2.4: Oligonukleotidsequenzen Bezeichnung: Sequenz 5 3 : 5 Position: PsADH2-5 -XbaI aaa tctaga agc tca tcg tga aca gcc aga t -481 bp PsADH2-5 li tgt ctg agt tgt tct gac atg ata att tgg atg gat cgc agc -1 bp PsADH2-3 li aag aag acc cat ctg cct aaa caa gcc gtg cta gat agt gct bp PsADH2-3 -SalI agg gtcgac atg gcg tct acg aca tct ca bp PsADH2-5 -NarI aaa ggcgcc agc tca tcg tga aca gcc aga t -481 bp PsADH2-3 -NarI agg ggcgcc atg gcg tct acg aca tct ca bp PsADH2Pro-5 -BamHI aaa ggatcc agc tca tcg tga aca gcc aga t -481 bp PsADH2-3 -ClaI cgc gcg atcgat gat aat ttg gat gga tcg ca -1 bp PsADH2-5 -SacI gat cga t gagctc gag ctc atc gtg aac agc ca -482 bp ScTRP5-3 -BamHI tat ata ta ggatcc tca acg gtg gca gat gcc ag bp PsADH2-5 -BamHI cca agg ttg ggatcc cag tgt tcg atg ccg ttg tc +838 bp PsADH2-3 -SphI ttc tta ga gcatgc tca cca tct tta ctt cac gg bp pucrev cag gaa aca gct atg ac - pucuni tgt aaa acg acg gcc agt - PsHIS3-5 -ClaI agg aaa atcgat cgt aga gaa atg tga ata cg -476 bp PsHIS3-3 -EcoRI tat ggg gaattc tcc aag ttc ctc atc gtt ca bp PsHIS3-5 cgt aga gaa atg tga ata cg -476 bp PsHIS3-3 tcc aag ttc ctc atc gtt ca bp ScTRP5-5 hom ctg gca tct gcc acc gtt ga bp PsADH2-3 hom gcc gcc taa ttg ata gcc tc bp ScTRP5-5 ORF atg tca gaa caa ctc aga ca +1 bp ScTRP5-3 ORF tta ggc aga tgg gtc ttc tt bp PsADH2-5 ORF-BamHI ata tag ggatcc tgc cgt aca ggc tgc cag ac +398 bp PsADH2-3 ORF-SacI atc gcg gagctc ggt gtc aac aac gta tct ac bp puc-rev cgg ctc gta tgt tgt gtg ga - puc-uni caa ggc gat taa gtt ggg ta - ScTRP5-5 DIG cca ttg gtc ctc acc cat a bp ScTRP5-3 DIG agg tct acc ggc agt tag a bp PsHIS3-5 DIG cca tat gct cca tgc ctt ag +194 bp PsHIS3-3 DIG tgg aca aat cta cga cgg ca +414 bp Yep24li ttg aat cta gag cga tca tgg cga cca cac ccg tcc - Yep24re taa ttt cta gag atg ccg gcc acg atg cgt ccg gcg - 24

25 2. Material und Methoden 2.5 Chemikalien, Puffer und Enzyme Chemikalien für Nährmedien wurden, soweit nicht anders vermerkt, von Fluka, Merck oder Sigma bezogen. Alle verwendeten Puffer wurden wie in Ausubel et al. (1991) beschrieben, hergestellt. Die Herkunft der Enzyme ist in Tabelle 2.5 aufgelistet. Tabelle 2.5: Enzymherkunft Enzyme Taq-Polymerase DyNAzyme EXT TM Polymerase Restriktionsendonukleasen SphI Turbo TM NarI T4-Ligase Alkalische Phosphatase Lyticase Rnase A Klenow-Fragment Hersteller Promega Finnzymes Roche BioLabs Promega Roche USB Sigma Sigma Roche 2.6 Mikrobiologische und biochemische Methoden Kultivierung von P. stipitis im Fermenter mit unterschiedlichen Belüftungsbedingungen Die Zellen wurden für 16 bis 18 h in 100 ml YNB-Medium in 1 l Schikanekolben bei 200 rpm und 30 C vorkultiviert. Die Fermentationen wurden in einem vollautomatischen Braun Biostat DCU-300 Fermenter unter folgenden Bedingungen durchgeführt: Arbeitsvolumen: 2 l Temperatur: 25 C ph: 5,0; Regulation mit 3 M NaOH Medium: PMM Sauerstoffspannung: 80 %; Regulation durch Variation der Rührerdrehzahl Antischaummittel: Antifoam (Accepta) Inokulat: 100 ml der Vorkultur Nach Erreichen einer OD 623nm von 2,0 wurde die Sauerstoffspannung durch Verminderung der Rührerdrehzahl auf 20 % gesenkt und durch Veränderung der Belüftungsrate konstant gehalten oder durch Begasung mit Stickstoff auf 0 % reduziert und für die Dauer des Experiments weiterhin mit N 2 begast. 25

26 2. Material und Methoden Bestimmung von Enzymaktivitäten Die Enzymaktivitäten wurden in einem Pharmacia LKB Biochrom 4060 Photometer bei 340 nm und 30 C gemessen. Die spezifischen Enzymaktivitäten wurden mit der folgenden, aus dem Lambert-Beerschen Gesetz abgeleiteten Formel berechnet (Bergmeyer, 1974): Spezifische Aktivität = V x E [U/mg] ε x d x v c P t V: Testvolumen [ml] ε: Molarer Extinktionskoeffizient (für NAD + /NADH bei 340 nm = 6,22 cm 2 /µmol) v: Probevolumen im Test [ml] c P : Proteinkonzentration der Probelösung [mg/ml] E / t: Extinktionsänderung über die Zeit [min -1 ] Probenahme und Herstellung zellfreier Rohextrakte Proben von je 100 ml wurden unmittelbar vor dem Shift der Sauerstoffspannung sowie 2 und 4 h nach dem Shift aus der Fermentationsbrühe entnommen. Die Zellsuspensionen wurden direkt auf 0 C gekühlt, indem die Entnahme durch einen im Eisbad gekühlten Schlauch erfolgte. Die Zellen wurden bei 6000 x g und 4 C geerntet und einmal mit einem Rohextraktpuffer folgender Zusammensetzung gewaschen. 100 mm Triethanolamin 0,5 mm EDTA 0,5 mm DTT Zum Puffer wurden nach Angaben des Herstellers Protease Inhibitor Cocktail Tabletten (Complete ) der Firma Roche gegeben. 0,5 bis 1 g des nassen Zellpellets wurden mit der gleichen Menge an Glassperlen in Anwesenheit des Rohextraktpuffers (10 ml / g nasses Zellpellet) für 5 min bei 8 C gevortext und dann für 5 min auf Eis inkubiert. Dieser Vorgang wurde 4 mal wiederholt. Zur Entfernung von Zellresten und unaufgeschlossenen Zellen wurde die Probe bei 5000 x g und 26

27 2. Material und Methoden 4 C zetrifugiert. Der Rohextrakt wurde bei 4 C gelagert und die enzymatische Aktivität innerhalb der nächsten Stunde gemessen Aktivität der Alkoholdehydrogenase (ADH) Die Aktivität der ADH wurde nach Bergmeyer (1974) bestimmt: Der gemessenen Extinktionsänderung, die durch die Reduktion von NAD + zu NADH verursacht wird, liegt folgende Reaktion zu Grunde: Ethanol + NAD + ADH Acetaldehyd + NADH Diese Reaktion ist reversibel und die Richtung stark ph-abhängig. Im alkalischen Bereich verläuft sie in Richtung des Acetaldehyds. Auf das Abfangen des Acetaldehyds durch Semicarbazid wurde verzichtet, da Semicarbazid die ADH-Aktivität von S. cerevisiae hemmt und ein ähnlicher Effekt bei P. stipitis vorliegen kann. Der Reaktionsansatz hatte folgende Zusammensetzung: 100 mm Glycin, ph 9,0 5,0 mm NAD + 1,7 M Ethanol (Startreagenz) Aktivität der Pyruvatdecarboxylase (PDC) Die Aktivität der PDC wurde nach Postma et al. (1989) bestimmt. Der gemessenen Extinktionsänderung, die durch die Oxidation von NADH zu NAD + verursacht wird, liegen folgende Reaktionen zu Grunde: PDC Pyruvat Acetaldehyd + CO 2 ADH Acetaldehyd + NADH Ethanol + NAD Bestimmung der Proteinkonzentration Die Proteinkonzentration wurde mit dem Coomassie Protein Assay Reagenz (Fa. Pierce) nach Angaben des Herstellers bestimmt. Die Eichkurven wurden mit Rinderserumalbumin erstellt. 27

28 2. Material und Methoden Bestimmung von Zucker- und Ethanolkonzentrationen Glucose- und Ethanolkonzentrationen in der Fermentationsbrühe zum Zeitpunkt der Probenahmen wurden mittels HPLC (Waters, Milford, USA) bestimmt. Die HPLC-Proben wurden vor der Messung gefiltert (0,2 µl, Advantech, Pleasanton, USA). Die Auftrennung der Substanzen erfolgte mit einer Wasserstoffsäule (Aminex HPX-87H, Biorad, Richmond, USA) bei 45 C. Als mobile Phase diente 5 mm H 2 SO Bestimmung der Zellkonzentration Die Zelltrockenmasse (TGW) wurde gravimetrisch bestimmt. Indirekt wurde die Zelldichte photometrisch bei einer Wellenlänge von 623 nm bestimmt. Eine OD 623nm von 0,1 entspricht einer Zellzahl von 1 x 10 7 /ml (Mergler, 1999). Die so ermittelten Zellkonzentrationen wurden zur Berechnung der Wachstumsrate und der Generationszeit eingesetzt. In einer Batch-Fermentation verhält sich das mikrobielle Wachstum während der exponentiellen Phase nach folgender Kinetik: N = N 0 x e µ x t Für µ und t g gilt: µ = ln N ln N 0 t N: Zellzahl zum Zeitpunkt t N 0 : Zellzahl zum Zeitpunkt t 0 µ: Wachstumsrate [h -1 ] t: Zeit [h] t g : Generationszeit [h] t g = ln 2 µ 2.7 Molekularbiologische Methoden Reinigungsmethoden für DNA Isolation genomischer DNA aus P. stipitis Die DNA-Isolation erfolgte nach der von Campbell und Duffus (1988) beschriebenen Methode. Die Protoplastierung wurde mit 0,5 mg/ml Lyticase durchgeführt. 28

29 2. Material und Methoden Plasmidisolation aus Hefen Die Plasmidisolation aus Hefen erfolgte nach einem für Schizosaccharomyces pombe entwickelten Verfahren (B. Schäfer, pers. Mitteilung). Eine genaue Beschreibung der Methode ist in Passoth (1998) gegeben Plasmidisolation aus E. coli Plasmid-DNA wurde aus E. coli DH5α mit Hilfe des PerfectPrep Plasmid Midi-Kits der Firma Eppendorf nach Angaben des Herstellers isoliert. Die bei Klonierungen erhaltenen rekombinanten Bakterien wurden auf das Vorhandensein der in die Vektoren ligierten Inserts mittels der TELT Plasmid-Minipräparation (Ausubel et al., 1991) überprüft Isolation von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen Zur Isolation von DNA-Fragmenten wurde die restringierte DNA gelelektrophoretisch aufgetrennt. Je nach Fragmentgrößen wurde 0,8 bis 1,2 % SeaKem GTG Agarose (Cambrex) verwendet. Die Extraktion erfolgte nach Angaben des Herstellers mittels des NucleoSpin Extract Kits der Firma Macherey-Nagel Gelelektrophoretische Trennung von DNA Die Auftrennung der DNA-Moleküle nach ihren Größen wurde in 0,8 bis 1 %igen Agarosegelen (Fa. Roth) in TBE-Puffer bei 80 V durchgeführt. Die im Gel fixierten Fragmente wurden nach Ethidiumbromid-Färbung im UV-Durchlicht (256 nm) detektiert Nukleinsäurekonzentrationsbestimmung Photometrische Konzentrationsbestimmung Die photometrische Absorptionsmessung zur Bestimmung der DNA-Konzentration einer wässrigen Lösung erfolgte bei 260 nm. Laut Sambrook et al. (1989) entspricht 1 A 260nm - Einheit bei doppelsträngiger DNA (dsdna) einer Konzentration von 50 µg/ml. Hieraus ergibt sich folgende Formel: [dsdna] = A 260nm -Einheit x Verdünnung x 50 µg/ml Bestimmung des DNA-Gehalts pro Zelle Der DNA-Gehalt pro Hefe-Zelle wurde mit der Diphenylamin-Methode (Burton et al., 1956) nach Extraktion löslicher Nukleotide (Herbert et al., 1971) bestimmt. Eine genaue Beschreibung der Methode ist in Schruff (1999) zu finden. 29

30 2. Material und Methoden Zytometrische Untersuchungen Zytometrische Untersuchungen zur Bestimmung des DNA-Gehalts verschiedener Hefestämme im Vergleich zu haploiden Referenzstämmen wurden mit einem Durchflusszytometer der Firma Becton Dickison durchgeführt. Unter der Voraussetzung einer stöchiometrischen Interkalation des Farbstoffs ist die durch das Zytometer gemessene Fluoreszenz direkt proportional zum DNA-Gehalt der Zellen (Carr et al., 1998). Die DNA wurde nach einem Protokoll von Vindelov et al., (1983) mit Propidiumjodid angefärbt. Die genaue Durchführung der Färbereaktion ist in Schruff (1999) gegeben. Die Messergebnisse wurden mit Hilfe der Software Cell Quest TM ausgewertet und in Histogrammform dargestellt (Darzynkiewicz und Crissman, 1990). Die bei den Messungen registrierten und klassierten Signalintensitäten wurden auf der Histogrammabszisse linear aufgetragen. Die Skalierung der Signalintensitäten wurde hierbei willkürlich festgelegt. Die Anzahl der untersuchten Zellen, die den Signalintensitätsklassen zuzuordnen war, befindet sich in linearer Auftragung auf der Ordinate. Bei dieser Häufigkeitsverteilung sieht man charakteristische Peaks. Der erste Peak stellt die Zellen dar, die sich in der G 0 - oder der G 1 -Phase des Zellzyklus befinden. Der zweite Peak repräsentiert die Zellen der G 2 - oder M-Phase. Geräteeinstellung bei DNA-Untersuchungen mit Propidiumjodid als Fluoreszenzfarbstoff: Auflösung der Klassierung: 1024 lineare Signalverstärkung roter Messkanal als Schwellenparameter Detektor FSC E= Verstärkung: 3 Detektor FL2-A Spannung: 890 V; Verstärkung: 2 Anzahl der pro Messung untersuchten Zellen: Transformation Transformation von S. cerevisiae Transformationen in S. cerevisiae wurden nach dem Lithium-Acetat / einzelstrang-carrier- DNA / Polyethylenglycol-Protokoll durchgeführt (Agatep et al., 1998). Es wurden zwischen 0,5 und 1 µg DNA pro 1 x 10 8 Zellen transformiert. 30

31 2. Material und Methoden Transformation von P. stipitis P. stipitis-zellen wurden nach einem optimierten Protokoll der Gefriermethode von Hagedorn (1990) transformiert: Vorkultur: 50 ml YEP-Flüssigmedium in 300 ml Erlenmeyer-Kolben mit ca 2 x 10 8 Zellen des Transformationsstamms animpfen; Inkubation: 16 bis 18 h schüttelnd bei 28 C Hauptkultur: 200 ml YEP-Flüssigmedium in 1000 ml Erlenmeyer-Kolben (auf 28 C vortemperiert) mit 5 ml der Vorkultur animpfen; Inkubation: bei 28 C schüttelnd bis eine OD 623nm von 0,4 erreicht ist Zellen 5 min mit 4500 x g bei 20 C ernten, in 20 ml Lösung A waschen und das Pellet in 1 ml Lösung A resuspendieren Aliquots zu je 100 µl zusammen mit 5,5 µl DMSO in 2 ml Eppendorfreaktionsgefäßen bei - 70 C für 1 h einfrieren 1 µg der zu transformierenden DNA auf die gefrorenen Zellen geben, 80 s bei 37 C auftauen 1,2 faches Volumen der Lösung B zugeben, leicht vortexen und 90 min bei 28 C inkubieren Zellen 5 min mit 4500 x g bei 20 C ernten und 2 mal mit 500 µl Lösung C waschen Pellet in 2 ml YEP-Flüssigmedium (auf 28 C vortemperiert) suspendieren und 90 min bei 28 C inkubieren Zellen 5 min mit 4500 x g bei 20 C ernten und mit 500 µl steriler 0,9 %iger NaCl-Lösung waschen Pellet in 50 µl steriler 0,9 %iger NaCl-Lösung aufnehmen und auf YNB-Selektivmedium ausplattieren; Inkubation für mindestens 4 d bei 28 C Die Lösungen A, B und C wurden wie in Hagedorn (1990) beschrieben hergestellt und vor Gebrauch auf 28 C temperiert. Wegen der Instabilität der trp-marke des Transformationswirts P. stipitis PJH53 his3-1 trp5-10 und des daraus hervorgegangenen Stamms P. stipitis PJH53 his3-1 trp5-10 adh1::his3 wurden bei der Selektion auf TRP-Prototrophie, wenn nicht anders vermerkt, die Vor- und Hauptkulturen zur Herstellung kompetenter Zellen mit 0,2 g/l 5-FAA versetzt. Damit wurde die Anreicherung revertierter Zellen vermieden. Für weiterführende Versuche wurden die putativen Transformanten vereinzelt und verklont. Bei REMI (restriction enzyme mediated integration) -Transformationen wurde restringierte DNA in Anwesenheit der aktiven Restriktionsendonuklease transformiert. Es wurden 10 U pro µg DNA eingesetzt. 31

32 2. Material und Methoden Transformation von E. coli E. coli DH5α wurde nach einer Methode von Sambrook et al. (1989) mittels Temperaturschock transformiert Polymerasekettenreaktion (PCR) Die in vitro Amplifikation von DNA wurde in einem Personal Cycler der Firma Biometra durchgeführt. Das Gesamtvolumen der PCR-Ansätze betrug bei qualitativen Untersuchungen 25 µl. Bei Verwendung der Amplifikate in weiterführenden Versuchen betrug das Volumen 50 µl. Die vervielfältigte DNA wurde mit dem Nucleo Spin Extract 2 in 1 Kit der Firma Macherey-Nagel aufgereinigt oder zur Entfernung des Templates aus einem Agarosegel isoliert. Der nach den Herstellerangaben verdünnte Reaktionspuffer enthielt 10 bis 100 ng Template-DNA, 1 U Taq-Polymerase, 2 mm MgCl 2, 0,4 mm dntp und 0,4 µm des jeweiligen Primers. Bei der Verwendung chromosomaler Hefe-DNA als Template wurde die Taq-Polymerase erst nach einem einleitenden Denaturierungsschritt (3 min bei 99 C) zum Reaktionsgemisch zugegeben. Die Reaktionsbedingungen wurden wie folgt gewählt: Denaturierung 1 min bei 94 C, Anlagerung der Primer 1 min bei 50 bis 60 C, Elongation 1 min / 1000 bp bei 72 C; nach 30 Wiederholungen dieses Temperaturprogramms erfolgte eine Abschlusselongation für 10 min bei 72 C. Die Primeranlagerungstemperatur wurde nach Lachmund und Sachse (1994) 5 C unter der vom Hersteller errechneten Schmelzpunkttemperatur gewählt. Die ends-out Reporterkassette wurde in 2 Polymerasekettenreaktionen in Anlehnung an die Long Flanking Homology Regions (LFH)-PCR nach Wach (1996) hergestellt. Nach Optimierung der PCR-Bedingungen ergab sich die im Folgenden geschilderte Durchführung. Die erste PCR wurde entsprechend den oben gemachten Angaben mit Taq-Polymerase durchgeführt. Die Amplifikate wurden zur Reinigung aus einem Agarosegel isoliert. In der zweiten PCR beinhaltete der Reaktionsansatz (50 µl) folgende Komponenten: 3 U DyNAzyme EXT TM Polymerase in Reaktionspuffer verdünnt nach Angaben des Herstellers, 1,5 mm MgCl 2, 0,4 mm dntp, jeweils 360 ng der Amplifikate aus PCR 1, 1 µm des jeweiligen Primers und 50 ng Template-DNA. Die Polymerase wurde erst nach einem Denaturierungsschritt von 2 min bei 99 C zugegeben. Folgendes Temperaturprogramm wurde gewählt: Denaturierung 1 min bei 94 C, Anlagerung der Primer 30 s bei 50 C, Elongation 3 min bei 72 C; nach 25 Wiederholungen dieses Temperaturprogramms erfolgte eine Abschlusselongation für 4 min bei 72 C. Bei Versuchen zur Optimierung der LFH-PCR wurde den Reaktionsansätzen 5 % DMSO (Fa. Finnzymes) zur besseren Template-Denaturierung im Falle von GC-reichen oder ausloopenden Sequenzen zugefügt. 32

33 2. Material und Methoden Restriktion und Ligation von DNA DNA wurde mit Restriktionsendonukleasen nach den jeweiligen Angaben der Hersteller geschnitten. Die Restriktasen wurden mit dem NucleoSpin Extract Kit der Firma Macherey- Nagel entfernt oder die entsprechenden Restriktionsfragmente aus einem Agarosegel isoliert. Die bei der Restriktion entstandenen 3 -überhängenden Enden wurden bei Bedarf durch die 3-5 -Exonukleaseaktivität des Klenow-Fragments (2 U, 37 C, 1 h) in SuReCut -Puffer H (Fa. Roche, nach Herstellerangaben verdünnt) abgedaut. Die Ligation von DNA-Fragmenten erfolgte mit T4-Ligase entsprechend dem Herstellerprotokoll. Bei der Ligation eines Vektors mit einem Insert unter Benutzung nur einer Schnittstelle wurde der restringierte Vektor mit alkalischer Phosphatase dephosphoryliert (1 U, 37 C, 1h), um die Vektorreligation zu vermeiden. Das molare Verhältnis von Vektor zu Insert betrug bei Ligationen 1 : 3. Das Reaktionsgemisch wurde für 18 h bei 18 C inkubiert und anschließend in E. coli transformiert. Die Klonierung wurde nach Isolation der Plasmide durch Restriktionsanalysen und gegebenenfalls durch Sequenzierung auf Korrektheit überprüft Southern-Hybridisierung Die DNA wurde gelelektrophoretisch aufgetrennt, mittels Kapillarblot auf eine positiv geladene Nylonmembran (Fa. Boehringer-Mannheim) transferiert (Southern, 1975) und durch 30 minütiges Backen bei 120 C fixiert. Die Sonden wurden mit Hilfe des PCR DIG probe synthesis Kits hergestellt und vor Verwendung aus einem Agarosegel isoliert. Die Prähybridisierungen (3 h) und Hybridisierungen (über Nacht) erfolgten bei 42 C mit dem Easy-Hyb-System. Die Filter wurden unter stringenten Bedingungen gewaschen (mit 2 x SSC / 0,1 % SDS 5 min bei 20 C, danach mit 0,1 x SSC / 0,1 % SDS 15 und 30 min bei 20 C und anschließend 2 x 15 min bei 68 C). Für die Detektion durch Chemilumineszenz wurde mit dem DIG luminescent detection Kit gearbeitet. Alle verwendeten Kits wurden von der Firma Boehringer-Mannheim bezogen und nach Angaben des Herstellers verwendet Sequenzierung von DNA und Sequenzanalysen Sequenzierungen wurden von der Firma Zeda Sequencing Service (RWTH Aachen, Biologie VII) durchgeführt. Sequenzanalysen erfolgten mit dem DNasis/Prosis-Programmpaket (Hitachi). Sequenzvergleiche wurden mit dem BLAST-Service des NCBI-Servers durchgeführt (Altschul et al., 1997). Zur Erstellung von Stammbäumen wurde der EBI ClustalW-Service verwendet ( Phylogenetische Distanzen wurden als Substitutionen pro 100 Aminosäuren mit der Kimura-Methode (Kimura, 1983) berechnet. Der Stammbaum wurde mit Hilfe der Neighbour-Joining -Methode nach Saitou und Nei erstellt. 33

34 2. Material und Methoden 2.8 Genetische Methoden Bestimmung der Plasmidstabilität in Hefetransformanten Die Hefetransformanten wurden in 50 ml YNB-Flüssigmedium, das mit Histidin supplementiert wurde, bei 28 C bis zu einer OD 623nm von 1 inkubiert (entspricht 1 x 10 8 Zellen / ml). 100 µl-aliquots der Verdünnungen 10-4 und 10-5 wurden auf Selektiv- und nicht- Selektiv-Medium (YEP) ausplattiert und bei 28 C bebrütet. Nach Wachstum wurde durch Vergleich der Kolonienzahl auf beiden Mediensorten der Prozentsatz plasmidhaltiger Zellen in der Kultur ermittelt. Zur Berechnung des Plasmidverlusts pro Generation wurden selektiv gewachsene Kulturen für 8 Generationen in Vollmedium vermehrt und anschließend der Prozentsatz an plasmidhaltigen Zellen ermittelt. Der Plasmidverlust pro Generation wurde nach folgender Formel berechnet (Dani und Zakian, 1983): X = (1 e r ) x 100 ln (A / B) r = n X: Plasmidverlust pro Generation n: Generationen in nicht-selektivem Medium A: % plasmidhaltige Zellen nach n Generationen in nicht-selektiv-medium B: % plasmidhaltige Zellen in Selektivmedium UV-Mutagenese Zur Steigerung der Mutationshäufigkeit durch UV-Bestrahlung wurden ca. 3 x 10 9 Zellen einer Vollmedium-Platte in 10 ml 0,9 %iger NaCl-Lösung suspendiert und mit einer UV- Licht-Dosis bestrahlt, die in Vorversuchen eine Abtötungsrate von 99 % ergab. Auxotrophe Mutanten wurden, wie in Böttcher und Samsonova (1977) beschrieben, isoliert. Die Selektion von ura-auxotrophen Kolonien erfolgte auf YNB-Medium, dem Histidin, Uracil und 5-FOA zugegeben wurde. Die Selektion von trp-mutanten wurde auf dem entsprechenden Medium mit Tryptophan und 5-FAA durchgeführt Kreuzung und Massensporenanalyse Die Kreuzungen wurden nach einem für P. stipitis optimierten Kreuzungsprotokoll durchgeführt (Schruff et al., 2003). Die Sporenanreicherung zur Massensporenanalyse erfolgte entweder durch eine Nystatinbehandlung (Samsonova et al., 1985) oder durch die Paraffinmethode nach Emeis und Gutz (1958). Die Segregantenphänotypen wurden auf entsprechend supplementiertem YNB-Medium erfasst. 34

35 3. Ergebnisse 3. Ergebnisse 3.1 Charakterisierung des Transformationswirts P. stipitis CBS 5774 PJH53 his3-1 trp Untersuchungen zum Verhalten bei unterschiedlichen Belüftungsbedingungen Zur Konstruktion des Reporterstamms sollte die Reporterkassette Rep-LFH PsADH2::ScTRP5::PsADH2 in den Transformationsstamm P. stipitis CBS 5774 PJH53 his3-1 trp5-10 und in den daraus hervorgegangenen Stamm P. stipitis CBS 5774 PJH53 his3-1 trp5-10 adh1::his3 inseriert werden. Vorhergehende Experimente zeigten ein abweichendes Wachstumsverhalten des Wildtypstamms P. stipitis CBS 5774 im Vergleich zu P. stipitis CBS 5774 PJH53 his3-1 trp5-10 (Klinner et al., 2005). Da die genetischen Marker des Stamms P. stipitis CBS 5774 PJH53 his3-1 trp5-10 durch UV-Bestrahlung induziert wurden, waren weitere Mutationen nicht auszuschließen. Das Verhalten des Transformationsstamms und des Wildtypstamms wurde in Batch- Fermentationen unter aeroben sowie sauerstofflimitierten Bedingungen verglichen. Nachdem die Kulturen im Fermenter eine OD 623nm von 2,0 erreicht hatten, wurde die Sauerstoffspannung von aeroben zu semiaeroben (von 80% auf 20%) und anaeroben Bedingungen (von 80% auf 0%) reduziert. Die ADH- und PDC-Aktivitäten wurden unmittelbar vor dem Shift sowie 2 und 4 Stunden nach dem Shift der Sauerstoffspannung gemessen. Diese Versuchsdurchführung wurde gewählt, da vorhergehende Untersuchungen mit P. stipitis CBS 5776 gezeigt hatten, dass eine Reduktion der Sauerstoffspannung zur Induktion der Gärungsenzyme führt und dass die Enzymaktivitäten 4 Stunden nach einem solchen Shift ein Maximum erreichen (Passoth et al., 1996). Zur weiteren Charakterisierung der in dieser Arbeit verwendeten Stämme wurden ergänzend zum Zeitpunkt der Probenahme die Zelldichten sowie der Glucoseverbrauch und die Ethanolbildung bestimmt. Die erhaltenen Daten wurden auf ihre Reproduzierbarkeit untersucht. Die in den Abbildungen 3.1 bis 3.5 dargestellten Ergebnisse stellen Mittelwerte zweier Messungen dar. Die dazu gehörenden Einzelwerte befinden sich im Anhang (Tabelle 7.1). Zunächst wurden die Unterschiede zwischen dem Transformationsstamm und dem Wildtyp- Stamm nach Reduktion der Sauerstoffspannung von 80% auf 20% untersucht. P. stipitis CBS 5774 und P. stipitis CBS 5774 PJH53 his3-1 trp5-10 wiesen unter aeroben Bedingungen (80% Sauerstoffspannung) im Fermenter Generationszeiten t g von 4 und 3 Stunden mit Wachstumsraten µ von 0,231 und 0,173 auf. Nach dem Shift auf 20% war weiterhin 35

36 3. Ergebnisse Belüftung der Kulturen notwendig, um die Sauerstoffspannung konstant zu halten. Die zwei Stämme wuchsen jedoch mit verminderten Wachstumsraten µ (Tabelle 3.1). Tabelle 3.1: Wachstumsparameter unter aeroben Bedingungen und 4h nach Shift der Sauerstoffspannung von 80% auf 20% Stamm nach 4 bis 8 stündiger 4 h nach Shift der Wachstumsparameter Kultivierung mit Sauerstoffspannung von 80% Sauerstoffspannung 80% auf 20% P. stipitis CBS 5774 µ [h -1 ] 0,231 0,133 t g [h] 4,1 5,22 P. stipitis CBS 5774 µ [h -1 ] 0,173 0,165 PJH53 his3-1 trp5-10 t g [h] 3,02 4,21 Die Produktion von Ethanol war unter semiaeroben Bedingungen bei keinem der Stämme nachweisbar. Der Shift auf 20% Sauerstoffspannung induzierte die ADH-Aktivität (Abbildung 3.1). Vor der Reduktion der Sauerstoffspannung, also unter aeroben Bedingungen, wurde bei P. stipitis PJH53 his3-1 trp5-10 eine spezifische ADH-Aktivität von ca. 200 mu/mg Protein gemessen. Die Aktivität sank zwei Stunden nach dem Shift zunächst auf 11 mu/mg ab, bevor sie nach 4 Stunden unter semiaeroben Bedingungen 270 mu/mg Protein betrug und damit beinahe der spezifischen ADH-Aktivität des Wildtyps mit 279 mu/mg Protein entsprach. 0,3 0,279 0,273 Spezif. Aktivität [U/mg] 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 0,219 0,21 0, h 2 h 4 h P. stipitis CBS 5774 P. stipitis PJH53 his3-1 trp5-10 Zeit nach Shift der Sauerstoffspannung Abbildung 3.1: Aktivierung der ADH des Transformationsstamms im Vergleich zum Wildtyp-Stamm nach Shift der Sauerstoffspannung von 80% auf 20% 36

37 3. Ergebnisse In Abbildung 3.2 ist die spezifische PDC-Aktivität nach Reduktion der Sauerstoffspannung von 80% auf 20% dargestellt. Nach 4 Stunden erreichten der Wildtyp-Stamm und P. stipitis PJH53 his3-1 trp5-10 Aktivitäten von ca. 350 mu/mg Protein. Die Induktion der PDC war unter aeroben Bedingungen nicht nachweisbar. 0,4 0,35 0,353 0,339 Spezif. Aktivität [U/mg] 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0, ,169 0,157 P. stipitis CBS 5774 P. stipitis PJH53 his3-1 trp h 2 h 4 h Zeit nach Shift der Sauerstoffspannung Abbildung 3.2: Aktivierung der PDC des Transformationsstamms im Vergleich zum Wildtyp-Stamm nach Shift der Sauerstoffspannung von 80% auf 20% Die Reduktion der Sauerstoffspannung auf 0% dauerte maximal 30 Sekunden. Nach 2 Stunden unter anaeroben Bedingungen stellten die untersuchten Stämme das Wachstum allmählich ein. Der Glucoseverbrauch des Wildtyps stieg im Vergleich zu dem unter semiaeroben Bedingungen um das 10-fache an (Abbildung 3.3). P. stipitis CBS 5774 PJH53 his3-1 trp5-10 verbrauchte ungefähr 6-mal mehr Glucose. Vier Stunden nach dem Shift war Ethanol im Medium nachweisbar. Die Ethanolbildung von P. stipitis CBS 5774 PJH53 his3-1 trp5-10 war nur etwa halb so groß wie die des Wildtyps (Tabelle 3.2). Tabelle 3.2: Ethanolbildung nach Shift der Sauerstoffkonzentration von 80% auf 0% Stamm Ethanolbildung [mg/l] P. stipitis CBS P. stipitis CBS 5774 PJH53 his3-1 trp

38 3. Ergebnisse 10 9,3 Glucoseverbrauch [g/l] ,92 1,46 8,31 P. stipitis CBS 5774 P. stipitis PJH his3-1 trp5-10 Shift von 80% auf 20% Sauerstoffspannung Shift von 80% auf 0% Sauerstoffspannung Abbildung 3.3: Glucoseverbrauch des transformierten Stamms und des Wildtyp-Stamms nach Reduktion der Sauerstoffspannung von 80% auf 20% bzw. auf 0%; die Glucosekonzentration im Medium wurde unmittelbar vor und 4 Stunden nach dem Shift bestimmt. Die spezifische ADH-Aktivität des Wildtyp-Stamms lag nach 4 Stunden unter anaeroben Bedingungen bei 1,28 U/mg Protein. Im Vergleich dazu zeigte der Transformationsstamm eine Aktivität von ca. 0,2 U/mg Protein (Abbildung 3.4). Daraus kann man schlussfolgern, dass P. stipitis PJH53 his3-1 trp5-10 bereits einen Defekt in der ADH-Regulation trägt. Nach dem Shift von 80% auf 0% Sauerstoffspannung zeigte P. stipitis CBS 5774 PJH53 his3-1 trp5-10 im Vergleich zum Wildtyp mit 192 mu/mg Protein eine 2,6-fach geringere PDC- Aktivität (Abbildung 3.5). 38

39 3. Ergebnisse 1,4 1,281 1,2 Spezif. Aktivität [U/mg] 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0,168 0,505 0,215 0,227 P. stipitis CBS 5774 P. stipitis PJH53 his3-1 trp h 2 h 4 h Zeit nach Shift der Sauerstoffspannung Abbildung 3.4: Aktivierung der ADH der Transformationsstämme und des Wildtyp-Stamms nach Shift der Sauerstoffspannung von 80% auf 0% 0,6 Spezif. Aktivität [U/mg] 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,362 0,5 0,192 P. stipitis CBS 5774 P. stipitis PJH53 his3-1 trp ,013 0 h 2 h 4 h Zeit nach Shift der Sauerstoffspannung Abbildung 3.5: Aktivierung der PDC des Transformationsstamms und des Wildtyp-Stamms nach Shift der Sauerstoffspannung von 80% auf 0% Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass sich der Transformationsstamm P. stipitis CBS 5774 PJH53 his3-1 trp5-10 unter den gewählten Versuchsbedingungen bei unterschiedlichen Belüftungsverhältnissen abweichend vom Wildtyp-Stamm verhielt. Unter aeroben Bedingungen (80% Sauerstoffspannung) war im Vergleich zum Wildtyp-Stamm eine ADH- 39

40 3. Ergebnisse Aktivität nachweisbar. Vier Stunden nach dem Shift der Sauerstoffspannung zu anaeroben Bedingungen waren die ADH- und PDC-Aktivitäten bei P. stipitis CBS 5774 PJH53 his3-1 trp5-10 deutlich geringer als die des Wildtyps Charakterisierung des P. stipitis HIS3-Gens Das Imidazolglycerolphosphat-Dehydratase-Gen (HIS3) von P. stipitis ist einer der in dieser Arbeit verwendeten Selektionsmarker. Die Sequenz des Gens war bisher unbekannt. Ein 2,8 kb langes Fragment genomischer P. stipitis DNA, welches his3-mutationen in S. cerevisiae komplementiert, wurde von Hagedorn (1990) zur Herstellung des Vektors pjh-s-1 kloniert und restriktionskartiert. Basierend auf dem Plasmid pjh-s-1 und dem Transformationsstamm P. stipitis PJH53 his3-1 trp5-10 wurde ein Transformationssystem mit PsHIS3 als homologem Selektionsmarker entwickelt. Da der zur REMI-Mutagenese des Reporterstamms verwendete Vektor pbspshis3 ebenfalls diesen Selektionsmarker trägt (Abschnitt 3.4.5), sollte die Sequenzierung des Gens zur besseren Charakterisierung der REMI-Transformanten beitragen. Des Weiteren wurde die Sequenz zur Konstruktion einer PsHIS3-spezifischen Sonde benötigt (Abschnitt 3.7.2). Das His3-Gen von S. cerevisiae ist ca. 1 kb groß (Struhl und Davis, 1981). Setzt man voraus, dass das entsprechende P. stipitis-gen eine ähnliche Größe hat, lässt sich PsHIS3 auf dem Insert weiter eingrenzen. Mit dem auf die notwendige Sequenz verkürzten HIS3 könnte ein möglichst kleiner Vektor mit dem Gen als Selektionsmarker konstruiert werden. Dieser würde sich im Vergleich zu größeren Plasmiden durch eine höhere Transformationseffizienz auszeichnen. Ein derartiger Vektor könnte dann zur Herstellung einer P. stipitis Genbank eingesetzt werden Subklonierung und Sequenzierung der PsHIS3-tragenden Fragmente Der Vektor pjh-s-1 wurde mit den in Tabelle 3.3 aufgeführten Restriktasen vollständig verdaut. Die resultierenden Fragmente des PsHIS3-Inserts wurden durch eine Gelextraktion aufgereinigt und über die entsprechenden Restriktionsschnittstellen in puc19 kloniert. Die Fragmente BS2 und BS3 überlappen in einem 551 bp langen Bereich. Die Sequenzierungsreaktionen der subklonierten Fragmente wurden mit Hilfe der Primer pucrev und pucuni durchgeführt. 40

41 3. Ergebnisse Tabelle 3.3: Subklonierte Fragmente des 2,8 kb PsHIS3-Inserts in puc19 zur Klonierung Erkennungsstelle der Fragment- Größe des klonierten verwendete Restriktasen im Bezeichnung Fragments [bp] Restriktasen 2,8 kb Fragment [bp] BS1 EcoRI / XbaI 1 / BS2 XbaI 699 / BS3 SalI / EcoRI 1799 / Codonnutzung von PsHIS3 Eine Sequenzanalyse zeigte in Fragment BS2 einen 666 bp großen offenen Leserahmen ohne Intronsequenzen, der für ein 222 Aminosäuren langes Protein codiert. Die abgeleitete Aminosäuresequenz des Gens ist in Abbildung 3.7 im Einbuchstaben-Code dargestellt. Tabelle 3.4 zeigt die Codonnutzung. Es werden 52 der 61 möglichen Tripletts verwendet. Für das PsHIS3-Gen wurde ein "codon bias index" 4 (CBI) von 0,28 berechnet (Bennetzen und Hall, 1982). Nicht alle der 25 von S. cerevisiae bevorzugten Codons werden auch in PsHIS3 am häufigsten verwendet. Ausnahmen bilden die Tripletts GTA, GTG, CAT, TCG, CAG, GAG und AGT, die mit gleicher Häufigkeit oder häufiger als die entsprechend von S. cerevisiae bevorzugten Codons in PsHIS3 vorkommen. Diese Codons werden in stark exprimierten Genen von S. cerevisiae wie z.b. im ScADH1-Gen (CBI 0,92; Bennetzen und Hall, 1982), aber auch in PsADH1, PsADH2, PsTKT (CBI 0,71), PsXYL1 (CBI 0,87) und PsXYL2 (CBI 0,8) vermieden (Kötter et al., 1990; Metzger und Hollenberg, 1994; Cho und Jeffries, 1998; Passoth et al., 1998). Für die kodierenden Regionen von PsLEU2 und PsURA3 wurden "codon bias indices" von 0,54 bzw. 0,46 berechnet und 51 bzw. 52 der 61 möglichen Tripletts verwendet. Eine deutlich stärkere Nutzung von nicht-bevorzugten Codons, wie es in PsHIS3 der Fall ist, konnte jedoch nicht festgestellt werden. Eine weniger starke Nutzung der bevorzugten Codons und eine entsprechend weniger starke Expression wurde auch für ScURA3 (Cho und Jeffries, 1998) und das URA3-Gen von K. lactis nachgewiesen (Shuster et al., 1987). Die Codonnutzung im HIS3-Gen von S. cerevisiae erfolgt fast völlig zufällig. Der 4 Das Codon, das in S. cerevisiae am häufigsten für eine bestimmte Aminosäure genutzt wird, ist meist komplementär zur Anticodonsequenz der häufigsten Isoakzeptor-tRNA für diese Aminosäure. Als Konsequenz gibt es 25 bevorzugte Codons. Codons, die GC-Basenpaarungen zwischen dem Codon und dem trna-anticodon verursachen, werden - wenn möglich - vermieden, genauso wie Codons, die zu 100% aus G, C, A, T, GC oder AT bestehen. Dadurch ist die Codon-Anticodon- Bindungsenergie für alle bevorzugten Tripletts beinahe gleich. Der Codon bias index ist ein Maß für die Codonneigung in Relation zu den 25 bevorzugten Tripletts. Ein Wert von 1 zeigt, dass alle Tripletts der mrna nur bevorzugte Codons nutzen, ein Wert von 0, dass eine zufällige Wahl erfolgt. Der Grad der Codonneigung für die 25 bevorzugten Tripletts korreliert in S. cerevisiae und in E. coli in jedem Gen mit der Menge der mrna im Cytoplasma (Bennetzen und Hall, 1982). 41

42 3. Ergebnisse CBI beträgt hier nur 0,01, was auf eine sehr schwache Expression des Gens hindeutet (Struhl, 1985). Auch bei PsHIS3 ist der CBI mit 0,28 sehr niedrig, jedoch erfolgt die Codonnutzung nicht völlig zufällig. Beim Vergleich der Codonnutzung verschiedener P. stipitis Gene (PsHIS3, PsURA3, PsLEU2, PsADH1, PsADH2, PsXYL2) zeigte sich, dass die für Arginin kodierenden Tripletts CGC, CGA und CGG nie verwendet werden. Tabelle 3.4: Codonnutzung von PsHIS3 Codon Anzahl Codon Anzahl Codon Anzahl Codon Anzahl TTT Phe TTC Phe TTA Leu TTG Leu CTT Leu CTC Leu CTA Leu CTG Leu ATT Ile ATC Ile ATA Ile ATG Met GTT Val GTC Val GTA Val GTG Val TCT Ser TCC Ser TCA Ser TCG Ser CCT Pro CCC Pro CCA Pro CCG Pro ACT Thr ACC Thr ACA Thr ACG Thr GCT Ala GCC Ala GCA Ala GCG Ala TAT Tyr TAC Tyr TAA Ochre TAG Amber CAT His CAC His CAA Gln CAG Gln AAT Asn AAC Asn AAA Lys AAG Lys GAT Asp GAC Asp GAA Glu GAG Glu Die von S. cerevisiae bevorzugten Codons sind unterstrichen TGT Cys TGC Cys TGA Opal TGG Trp CGT Arg CGC Arg CGA Arg CGG Arg AGT Ser AGC Ser AGA Arg AGG Arg GGT Gly GGC Gly GGA Gly GGG Gly

43 3. Ergebnisse Funktionelle Elemente der ermittelten Sequenzen Im 5 Bereich des offenen Leserahmens kommen typische eukaryontische Promotorelemente wie eine mögliche GC-Box (-482 bp bis 475 bp), eine CAAT-Box (-311 bp bis 308 bp) und putative TATA-Boxen von -294 bp bis 290bp und von 78 bp bis 73 bp vor (Goldberg, 1979; Buchner und Trifonov, 1986). In der Region von -270 bp bis 265 bp vor dem Translationsstart befindet sich das Hexamer TGACTC, das der Bindungs-Konsensussequenz des Transkriptionsaktivators AP-1 in Säugetieren entspricht. Hierbei kann es sich aber auch um eine putative GCN4-Bindungsstelle handeln. Dieser Transkriptionsfaktor des Leucin- Zipper-Typs kontrolliert in anderen Hefen wie Saccharomyces kluyveri und S. cerevisiae die Antwort auf Aminosäuremangel (Hinnebusch, 1988). Das Motiv weicht nur an einer Position von der entsprechenden Konsensussequenz in S. cerevisiae ab (TGACTA). Des Weiteren wurden putative cis-regulatorische Signale, die die Formation des 3 -Endes unterstützen, gefunden. Hierzu gehört das sogenannte stromaufwärts-element mit der Konsensussequenz TATATA, das im PsHIS3-Gen zweimal vorhanden ist (-326 bp bis 321bp und 78 bp bis 73 bp). Es verstärkt in S. cerevisiae die Effektivität der weiteren, für die Polyadenylierung verantwortlichen Sequenzen. Ein mögliches stromabwärts-element mit der Konsensussequenz AAGAA befindet sich in PsHIS3 von Nukleotid bp bis bp. Dieses Signal ist bei S. cerevisiae für die Positionierung des poly(a)-schwanzes verantwortlich (Russo et al., 1993; Mahadevan et al., 1997). Die eigentliche Polyadenylierungsstelle mit der generellen Konsensussequenz TAYRTA (Irniger und Braus, 1994) liegt vermutlich zwischen den Nukleotiden bp bis bp. Die genannten funktionellen Elemente der 5 - und 3 -Regionen des PsHIS3-Gens sind in Abbildung 3.6 dargestellt. Die so eingegrenzte 1681 bp lange Sequenz wurde als P. stipitis HIS3-Gen in der EMBL-Datenbank hinterlegt (Accession number AF348970). 43

44 3. Ergebnisse -506 gaaataggga ttgcgtgcag gaaa ggcgcg cgtagagaaa tgtgaatacg agaaatagtg -446 aaaatagtga gagtaaagaa aaattagagc tagcgagaga atagcgagaa tagtgaaagc -386 ccaaactaaa agaagaaaga cttttgaaag ttgttacggg aacatacgac tatttgacac -326 tatatattag catgccaata tagcattttc aatataaata ttttcaatag ttgtgctgac -266 tacaggcagt ttggcagaga cacagttttc agtgcttgtc accgtagaac ctttctcttt -206 tttctcaccc cagatcggcc cgactgagtc atcgtaatca taatcgcata taccagattt -146 ttcatttgtt cagtttttca cttctccaga cttctccaga cttccacttc ttgcaagctc -86 tctttcgata tatagcacta ttctggctat atctacagct taagagcata ctatttctca -26 cttcaactaa actgcaaata gtgaaa aagtc cataaactgt aatataagaa gataatgaaa agatgtagag ggcagacgag agttcttatt tgtgttggag gttggagcat agcagtagaa tcgcttcaag tatggaaaat actaaggata cggctctcag tcaaaaatgt aatttctttt gaaaccatta gagacttcta tatttcaatc aaactatccc attaatatag aaacatacat atatatatat ttctatcctc ctttcacatt ctcttccgcc tagttctatc ctttttttgg gtgcaattat tttttttctg tgagcatcgt gaaaaattta aactgagtaa cgaattgttt atgtggagaa actaaacctt tacagtctta ctatcagttt tcaatctcgc agaaccataa ttagcaatat cgtagatgtg ttctagaaca gtgttcagcc gaaatttcgg ggtctggagt tgaacgatga ggaacttgga cttgttccca taaagcctgt tttttaaacc t Abbildung 3.6: Nukleotidsequenzen der 5 - und 3 -nicht-translatierten Regionen des PsHIS3- Gens; mögliche cis-regulatorische Elemente, die die Transkription initiieren, sind fett gedruckt und unterstrichen; möglichen Polyadenylierungskonsensussequenzen sind durch Fettdruck hervorgehoben. Weitere Erklärungen befinden sich im Text Ähnlichkeiten der Nukleotid- und der abgeleiteten Aminosäuresequenz des PsHIS3-Gens mit HIS3-Genen weiterer Hefen Ein Vergleich der Sequenz des PsHIS3-Strukturgens mit den in der EMBL-Datenbank verfügbaren Sequenzen zeigte auf Nukleotidebene Ähnlichkeiten zu anderen ascomycetalen Hefen zwischen 63% bei Schizosaccharomyces pombe und 72% bei S. kluyveri. Auf Aminosäuresequenzebene war ein sehr hoher Grad der Sequenzkonservierung zwischen PsHIS3 und homologen Strukturgenen ascomycetaler Hefen feststellbar. Die geringste Ähnlichkeit zu PsHIS3p bestand mit 76% bei S. pombe, die größte mit 93 % bei D. hansenii (Tabelle 3.5). Die HIS3p-Aminosäuresequenzen verschiedener Hefen werden in Abbildung 3.7 mit P. stipitis verglichen. Die Proteinlängen variieren zwischen 210 Aminosäuren bei Candida glabrata und 233 Aminosäuren bei S. kluyveri. Diese Längenunterschiede resultieren hauptsächlich aus den Variationen am N-Terminus der Proteine. 44

45 3. Ergebnisse Tabelle 3.5: Ähnlichkeiten der Nukleotid- und abgeleiteten Aminosäuresequenzen von PsHIS3 und HIS3 homologen Genen der Hefen C. glabrata (Cg), S. cerevisiae (Sc), S. kluyveri (Sk), S. pombe (Sp), P. pastoris (Pp), Zygosaccharomyces rouxii (Zr), Candida albicans (Ca) und D. hansenii (Dh) Nukleotidsequenz [%] Aminosäuresequenz [%] PsHIS CgHIS ScHIS SkHIS SpHIS PpHIS ZrHIS CaHIS DhHIS

46 3. Ergebnisse 30 PsHIS3 M A R T A T I K R D T N E T K I Q CgHIS3 M A F V K R V T Q E T N I Q ScHIS3 M T E Q K A L V K R I T N E T K I Q SkHIS3 M T E P A Q K K Q K Q T V Q E R K A F I S R I T N E T K I Q SpHIS3 M R R A F V E R N T N E T K I S PpHIS3 M T G E H K R S S L I K R I T N E T K I Q ZrHIS3 M I P E Q G E H K A F V Q R N T N E T K I Q CaHIS3 M S E A L I N R I T N E T K I Q DhHIS3 M A K T A T I K R D T N E T K I Q 60 PsHIS3 I A L S L D G G F L A V E E S I F K K R K I D D D D E H A K CgHIS3 L A L D L D G G S V S V R E S I L G K E Y A S G D G ScHIS3 I A I S L K G G P L A I E H S I F P E K E A E A V A E SkHIS3 I A I S L N G G Y I Q I K D S I L P A K K D D D D V A S SpHIS3 V A I A L D K A P L P E E S N F I D E L I T S K H A N PpHIS3 I A L S L D G G P V S L A Q S L F K D K D Y S A E H A A ZrHIS3 I A I S L N G G H I E I P E S I I G K K R V E S D G V R T CaHIS3 I A L N L D G G K L E L K E S I F P N Q S I I I D H H H A K DhHIS3 I A I S L E G G H I A L E E S I F K N S A N E T D D S H A T 90 PsHIS3 Q A T S S Q V I N V Q S G I G F L D H M L H A L A K H A G W CgHIS3 Q T I H V H T G V G F L D H M L T A L A K H G G W ScHIS3 Q A T Q S Q V I N V H T G I E F L D H M I H A L A K H S G W SkHIS3 Q A T Q S Q V I D I H T G V G F L D H M I H A L A K H S G W SpHIS3 Q K G E Q V I Q V D T G I G F L D H M Y H A L A K H A G W PpHIS3 Q A T S S Q F I S V N T G I G F L D H M L H A L A K H G G W ZrHIS3 Q A T S S Q T I D I H T G V G F L D H M I H A L A K H S G W CaHIS3 Q V S G S Q Y I N V Q T G I G F L D H M I H A L A K H S G W DhHIS3 Q A T S T Q V I Q V Q T G I G F L D H M L H A L A K H S G W 120 PsHIS3 S L I V E C I G D L H I D D H H T A E D V G I T L G I A F K CgHIS3 S L I L E C I G D L H I D D H H T V E D C G I A L G Q A F K ScHIS3 S L I V E C I G D L H I D D H H T T E D C G I A L G Q A F K SkHIS3 S L I V E C I G D L H I D D H H T T E D C G I A L G Q A F K SpHIS3 S L R L Y S R G D L I I D D H H T A E D T A I A L G I A F K PpHIS3 S V I I E C V G D L H I D D H H S A E D T G I A L G M A F K ZrHIS3 S L I V E C I G D L H I D D H H T T E D C G I A L G D A F K CaHIS3 S L I V E C I G D L H I D D H H T A E D V G I S L G M A F K DhHIS3 S L I I E C I G D I H I D D H H T A E D V G I T L G L A F H 150 PsHIS3 Q A L G Q V K G V K R F G S G F A P L D E A L S R A V V D L CgHIS3 E A L G S V R G I K R F G H G F A P L D E A L S R A V V D F ScHIS3 E A L L A R G V K R F G S G F A P L D E A L S R A V V D L SkHIS3 E A N G A V R G V K R F G T G F A P L D E A L S R A V V D L SpHIS3 Q A M G N F A G V K R F G H A Y C P L D E A L S R A V V D L PpHIS3 E A L G H V R G I K R F G S G F A P L D E A L S R A V I D M ZrHIS3 Q A L G Q V R G V K R F G F G F A P L D E A L S R A V V D L CaHIS3 Q A L G Q I K G V K R F G H G F A P L D E A L S R A V V D L DhHIS3 K A L G Q V K G V K R F G C G F A P L D E A I S R A V V D L 46

47 3. Ergebnisse 180 PsHIS3 S N R P F A V V E L G L K R E K I G D L S C E N I P H V L E CgHIS3 S N R P F A V V E L G L K R E R I G Q L S T E M I P H F L E ScHIS3 S N R P Y A V V E L G L Q R E K V G D L S C E M I P H F L E SkHIS3 S N R P F A V I D L G L K R E M I G D L S T E M I P H F L E SpHIS3 S G R P Y A V I D L G L K R E K V G E L S C E M I P H L L Y PpHIS3 S N R P Y A V V D L G L K R E K I G D L S C E M I P H V L E ZrHIS3 S N R P Y S V I E L G L K R E K I G D L S C E M I P H F L E CaHIS3 S N R P F A V I E L G L K R E K I G D L S T E M I P H V L E DhHIS3 S N R P Y A V I E L G L K R E K I G D L S C E M I P H V M E 210 PsHIS3 S F A Q G A H I T T H V D C L R G F N D H H R A E S A F K A CgHIS3 S F A T E G R I T M H V D C L R G T N D H H R S E S G F K A ScHIS3 S F A E A S R I T L H V D C L R G K N D H H R S E S A F K A SkHIS3 S F A E A A R I T L H V D C L R G F N D H H R S E S A F K A SpHIS3 S F S V A A G I T L H V T C L Y G S N D H H R A E S A F K S PpHIS3 S F A Q G A H V T M H V D C L R G F N D H H R A E S A F K A ZrHIS3 S F T E A A R L T V H V D C L R G F N D H H R S E S A F K A CaHIS3 S F A G A V G I T I H V D C L R G F N D H H R A E S A F K A DhHIS3 S F A Q G A A I T I H V D C I R G F N D H H R A E S A F K A PsHIS3 L A V A I R E A I S S N G T N D V P S T K G V L F CgHIS3 L A I A I R E A R T P T G R D D V P S T K G V L A ScHIS3 L A V A I R E A T S P N G T N D V P S T K G V L M SkHIS3 L A V A I R E A I S S N G T N D V P S T K G V L M SpHIS3 L A V A M R A A T S L T G S S E V P S T K G V L PpHIS3 L A I A I K E A I S S N G T D D I P S T K G V ZrHIS3 L A V A L R E A T S P N G T N D V P S T K G V L M CaHIS3 L A I A I K E A I S K T G K N D I P S T K G V L S K DhHIS3 L A V A I K E A T S S N G T D D V P S T K G V L F Abbildung 3.7: Vergleich der Aminosäuresequenzen von HIS3p-homologen zwischen P. stipitis (Ps), C. glabrata (Cg), S. cerevisiae (Sc), S. kluyveri (Sk), S. pombe (Sp), P. pastoris (Pp); Z. rouxii (Zr); C. albicans (Ca) und D. hansenii (Dh). Die mit PsHIS3p identischen Regionen sind grau unterlegt. Es wurde eine taxonomische Analyse von 12 HIS3-homologen Hefegenen, die auf Aminosäuresequenzebene Ähnlichkeiten über 76 % zeigten, durchgeführt und ein phylogenetischer Stammbaum erstellt (Abbildung 3.8). P. stipitis bildete hier zusammen mit D. hansenii und C. albicans eine Gruppe. Die engste Verwandtschaft von PsHIS3p bestand zum HIS3-homologen Protein von C. albicans. Weitere P. stipitis Gene (LEU2, URA3, ADH2) wurden auf entsprechende Weise auf ihre phylogenetische Distanz zu homologen Genen ascomycetaler Hefen untersucht. Die dazu gehörigen Neighbour joining - Stammbäume befinden sich im Anhang (Abbildung 7.1). Bei LEU2p bildet P. stipitis zusammen mit C. maltosa und C. albicans eine eng verwandte Gruppe. PsURA3p ist laut der Neighbour joining -Analyse am engsten mit den homologen Genen von C. maltosa und P. 47

48 3. Ergebnisse anomala verwandt und PsADH2p mit ADH1p von K. marxianus. Mit Ausnahme von K. marxianus wurden die hier festgestellten verwandtschaftlichen Beziehungen von P. stipitis zu C. albicans, C. maltosa und P. anomala durch die Analyse des Divergenzgrades in der variablen D1 / D2-Domäne der 26S rdna bereits beschrieben (Kurtzman und Robnett, 1998). evolutionäre Distanz Abbildung 3.8: Phylogenetische Beziehung zwischen PsHIS3p und HIS3 homologen Proteinen 11 weiterer Hefespezies der EMBL-Datenbank (Accession numbers: S. pombe NP_595932; Kluyveromyces lactis XP_455123; Kluyveromyces marxianus AAQ73313; S. cerevisiae CAE52227; S. kluyveri CAA78497; D. hansenii XP_458336; P. stipitis AAK27156; C. albicans EAK91359; C. glabrata XP_448899; Z. rouxii CAB62291; P. pastoris AAB18319; Pichia jadinii CAA73207). Die evolutionäre Distanz wurde mit Hilfe der Kimaru-Methode berechnet (Kimaru, 1983) und ist als Aminosäuresubstitution angegeben. Der Stammbaum wurde nach der nearest neighbour joining -Methode erstellt (Saitou und Nei, 1987) Untersuchungen zur Anzahl der HIS3-Gene im P. stipitis Genom und zur Vollständigkeit der ermittelten Sequenz Um zu klären, ob die durch die Sequenzierung ermittelte PsHIS3-Sequenz zu einem funktionstüchtigen Genprodukt führt, wurde das 1681 bp große HIS3-Gen amplifiziert und in P. stipitis PJH53 his3-1 trp5-10 transformiert. Die DNA der HIS-prototrophen Transformanten wurde in einer Southern-Hybridisierung mit einer PsHIS3-spezifischen Sonde untersucht. Hybridisierungsexperimente dieser Sonde mit dem Wildtypstamm zeigten, dass nur ein HIS3-Gen in P. stipitis vorhanden ist. Die Ergebnisse dieser Experimente werden in Abschnitt näher erläutert. 48

49 3. Ergebnisse 3.2 P. stipitis URA3 als Reportergen URA3-Stämme von S. cerevisiae generieren bei Zugabe von 5-Fluor-Orotsäure (5-FOA) ins Medium einen toxischen Metaboliten. Durch Supplementierung eines Minimalmediums wie YNB mit Uracil können Orotidin-5-mono-phosphat-Decarboxylase-Mutanten selektiert werden (Boeke et al., 1984). Da das bei Saccharomyces cerevisiae häufig verwendete URA3- ura3-selektionssystem auch für P. stipitis CBS 6054 beschrieben wurde und die Sequenz des Gens bekannt ist (Yang et al., 1994), sollte URA3 als Reportergen eingesetzt werden. Daher sollte die ura3-marke zunächst durch Disruption des Gens oder durch Kreuzung in den Transformationsstamm P. stipitis PJH53 his3-1 trp5-10 eingeführt werden Überprüfung der 5-FOA-Resistenz von P. stipitis Wildtypstämme von P. stipitis sowie der Transformationsstamm zeigten bei einer Konzentration von 0,75 g/l 5-FOA in festen Medien kein Wachstum mehr. P. stipitis PSLU10 ura3-3 leu2 wuchs auf dieser 5-FOA-Konzentration nach 2 Tagen zu normal großen Kolonien heran, P. stipitis FPL-UC7 ura3-3 benötigte dazu 1 Woche. Ura-auxotrophe Mutanten wurden entsprechend auf YNB-Medium mit 0,75 g/l 5-FOA, Uracil und weiteren benötigten Supplementen selektiert Versuche zur Gewinnung eines Transformationsstamms mit ura3-marke Versuche zur Selektion spontaner Mutanten Spontane ura3 Mutanten treten auf 5-FOA-Medium bei S. cerevisiae mit einer Frequenz von 10-7 auf (Boeke et al., 1984). Unter 4 x 10 9 getesteten Zellen das Stammes P. stipitis PJH53 his3-1 trp5-10 (Elternstamm P. stipitis CBS 5774) konnten 10 Kolonien auf 5-FOA-Medium anwachsen. Bei diesen Kolonien war keine Ura3-Auxotrophie nachweisbar. Eine Selektion spontaner Orotidin-5-mono-phosphat-Decarboxylase-Mutanten von P. stipitis PJH53 his3-1 trp5-10 war unter den gewählten Bedingungen nicht möglich Versuche zur Selektion von Mutanten nach UV-Mutagenese Ca 3 x 10 9 Zellen des Stamms P. stipitis PJH53 his3-1 trp5-10 wurden mit UV-Licht mutagenisiert. Nach der Mutagenese wurden die Zellen entweder direkt auf 5-FOA-Medium ausgestrichen, oder sie wurden zum Ausverdünnen der Orotidin-5-mono-phosphat- Decarboxylase in den ura3-mutanten für ca. 16 h in Vollmedium zwischenkultiviert. In weiteren Versuchen wurde das 5-FOA-Medium anstelle von Uracil mit 100 µg / ml Uridin supplementiert (Yang et al., 1994). Unter den Überlebenden (jeweils ca. 3 x 10 7 Zellen) konnten keine ura3-mutanten selektiert werden. 49

50 3. Ergebnisse Versuche zur Selektion von Mutanten nach Disruption des PsURA3-Gens Um das URA3 Gen in P. stipitis PJH53 his3-1 trp5-10 mittels Insertionsmutagenese zu disruptieren, wurde ein ca. 1,3 kb langes Fragment des Gens (-180 bp bis bp) aus dem Vektor pakpsura3 mit BamHI ausgeschnitten (Abbildung 3.9). Zur Konstruktion des Vektors wurden die Amplifikate der Regionen von 180 bp bis +319 bp und von +361 bp bis bp (die Angaben beziehen sich auf den Translationsstartpunkt) des URA3-Gens über SacI-Schnittstellen ligiert und in puc19 kloniert. Auf diese Weise wurde der offene Leserahmen zentral um 23 bp verkürzt (Kirchhoff, 1999). Nach Transformation der linearen Disruptionskassette in die Hefe führt eine homologe Integration zu einer Leserastermutation, wodurch ein nonsense -Protein entstehen kann. In Tabelle 3.6 sind die Ergebnisse der Transformationen zusammengefasst. Die Transformationsplatten wurden nach Anwachsen von Kolonien auf Minimalmedium ohne und mit Uracil gestempelt, um Ura-Auxotrophe von 5-FOA-resistenten Kolonien unterscheiden zu können. Bam HI Sac I 3500 PsURA3-ORF 500 Sca I 3000 ampr Bam HI ori Abbildung 3.9: Physikalische Karte des Vektors pakpsura3 50

51 3. Ergebnisse Tabelle 3.6: Transformation der linearen URA3-Disruptionskassette in P. stipitis PJH53 his3-1 trp5-10 transformierte Komponente Experiment KBE auf 5-FOA-haltigem Medium nach Transformation durchschnittl. Anzahl der KBE bei 4 x 10 8 transformierten Zellen URA3- Disruptionskassette 1 (1 µg) 2 URA3- Disruptionskassette 1 (5 µg) 2 H 2 O / 7 / 7 / 6 / 5 / 4 7,3 6 / 8 / 10 / 7 / 5 / 7 / 15 / 5 7,9 3 / 2 / 8 / 5 4,5 n. u. - 3 / 8 5,5 2 / 1 1,5 Die durch Schrägstrich getrennten Daten zeigen Ergebnisse von Parallelversuchen einer Transformation; n. u.: nicht untersucht Bei den nach der Transformation entstandenen Kolonien konnte keine Ura-Auxotrophie nachgewiesen werden. Drei der nach der Transformation der Disruptionskassette entstandenen Kolonien wurden vereinzelt und erneut mit 1 µg bis 5 µg der linearen Disruptionskassette transformiert. Unter der Annahme, dass der Transformationsstamm eventuell zwei Kopien des URA3-Gens besitzt, könnte eine wiederholte Transformation zur Disruption beider Kopien führen. Auch nach diesen Transformationen konnten keine Uraauxotrophen Mutanten isoliert werden. Transformationsexperimente mit Derivaten des integrativen Plasmids prep-lfh (Abschnitt 3.5.4; Abbildung 3.17) zeigten, dass sich die Transformationseffizienz stark erhöhte, wenn der Vektor vor der Transformation mit ScaI linearisiert wurde. Die Restriktion führte zu einer Vektorkonfiguration, in der die ends-out Disruptionskassette von puc19-sequenzen eingerahmt wurde. Um die Transformantenausbeute zu erhöhen, wurde der Vektor pakpsura3 (Abbildung 3.9) daher mit ScaI verdaut. 1 µg des linearisierten Plasmids wurde in P. stipitis PJH53 his3-1 trp5-10 transformiert. Unter den nach der Transformation entstanden Kolonien konnten keine ura-mutanten nachgewiesen werden (Tabelle 3.7). 51

52 3. Ergebnisse Tabelle 3.7: Transformation des ScaI-linearisierten Vektors pakpsura3 in P. stipitis PJH53 his3-1 trp5-10 durchschnittl. Anzahl der transformierte Transformation Medium nach Transformation KBE auf 5-FOA-haltigem KBE bei 4 x 10 8 Komponente transformierten Zellen pakpsura3 mit ScaI inaktiv linearisiert / 2 / 6 / 8 7 / 2 / 7 / ,5 H 2 O 1 3 / 6 / 3 / 7 4, / 9 / 9 / 5 7,75 Die durch Schrägstrich getrennten Daten zeigen Ergebnisse von Parallelversuchen einer Transformation. ScaI wurde vor der Transformation inaktiviert. 52

53 3. Ergebnisse Einkreuzen des ura3 Markers Die Stämme P. stipitis PSLU10 ura3-3 leu2 und P. stipitis FPL-UC7 ura3-3 wurden mit auxotrophen P. stipitis-stämmen mit dem Ziel gekreuzt, die ura3-marke in den Transformationsstamm P. stipitis PJH53 his3-1 trp5-10 einzuführen. Die Markerstabilität der Kreuzungsstämme wurde untersucht. Die Reversionsrate aller Stämme lag unter 2 x 10-9, mit Ausnahme des trp5 Markers von P. stipitis PJH53 his3-1 trp5-10. Hier lag die Reversionsfrequenz bei 8 x Zur Kontrolle der Hybridbildung wurden gleichzeitig als gut kreuzbar geltende Stämme gekreuzt (Melake et al., 1996; Schruff et al., 2003). Die Kreuzungen wurden nach einem für P. stipitis optimierten Protokoll durchgeführt (Schruff et al., 2003). Die Konjugation der Kreuzungspartner wurde anhand der durch Komplementation zurückgewonnenen Prototrophie der diploiden Hybriden nachgewiesen und in Tabelle 3.8 dargestellt. Tabelle 3.8: Anzahl prototropher Kreuzungsprodukte unterschiedlicher Kreuzungsversuche Anzahl durchgeführte Kreuzungen prototropher Kreuzungsprodukte P. stipitis CBS 5776 arg-1 his-1 >1000 P. stipitis PJH53 his3-1 trp5-10 X P. stipitis CBS 5776 ade-4 lys-5 0 P. stipitis FPL-UC7 ura3-3 0 P. stipitis FPL-LU10 ura3-3 leu2 0 P. stipitis PSLU10 ura3-3 leu2 X P. stipitis CBS 5776 arg-1 his-1 >1000 P. stipitis CBS 5776 ade-4 lys-5 >1000 P. stipitis FPL-UC7 ura3-3 X P. stipitis CBS 5776 arg-1 his P. stipitis CBS 5776 ade-4 lys-5 50 P. stipitis CBS 5776 arg-1 his-1 X P. stipitis CBS 5776 ade-4 lys Da beide ura-mutanten nicht direkt mit dem Transformationsstamm kreuzten, sollte die Marke zunächst in P. stipitis CBS 5776 arg-1 his-1, einem mit P. stipitis PJH53 his3-1 trp5-10 kreuzbaren Stamm, übertragen und anschließend in PJH53 eingekreuzt werden. Um rekombinante ura3-phänotypen isolieren zu können, wurde mit einigen vereinzelten Hybriden eine Massensporenanalyse durchgeführt. Die Phänotypen der ausgekeimten, auxotrophen Ascosporen wurden mit Hilfe einer Auxanographie untersucht. In den folgenden Tabellen 3.9 bis 3.11a sind die Aufspaltungsverhältnisse der genetischen Marker aufgeführt. Die prozentualen Anteile der Segreganten pro Phänotyp sind in den Tabellen in Klammern angegeben. 53

54 3. Ergebnisse Tabelle 3.9: Segregationsmuster der Hybriden der Kreuzung P. stipitis PSLU10 ura3-3 leu2 x P. stipitis CBS 5776 arg-1 his-1 Phänotypen Anzahl der Sporen (prozentualer Anteil) der Hybride 1 Hybride 2 Hybride 3 Hybride 3 Segreganten Nystatinmethode Nystatinmethode Nystatinmethode Paraffinmethode arg 95 (31,3%) 34 (25,84%) 24 (13,6 %) 12 (17,4 %) leu 97 (32,%) 54 (41%) 59 (33,3 %) 20 (29 %) ura his (5,1 %) 4 (5,8 %) his leu ( 5,6 %) 5 (7,2 %) arg leu 129 (42,6%) 43 (32,5%) 44 (24,9 %) 24 (34,8 %) arg his 0 1 (0,8 %) 6 (7,8 %) 0 arg ura ura leu ura his arg leu his 7 (2,3%) 0 12 (6,8 %) 3 (4,3 %) arg leu ura arg his ura his leu ura arg leu his ura Anzahl auxotropher Segreganten 330 (100%) 132 (100%) 177 (100 %) 69 (100 %) Um abzuklären, ob eventuell die Nystatinbehandlung mit dem Ausbleiben Ura-auxotropher Segreganten in Zusammenhang steht, wurden die Segreganten der Hybriden 3 (Tabelle 3.9) ebenfalls mit der Paraffinmethode angereichert. Jedoch war auch hiermit der ura-phänotyp nicht nachweisbar. Von insgesamt 708 Segreganten von Hybriden der Kreuzung P. stipitis PSLU10 ura3-3 leu2 x P. stipitis CBS 5776 arg-1 his-1 besaß keine einen Ura-auxotrophen Phänotyp. Auch von Hybriden der Kreuzung P. stipitis FPL-UC7 ura3-3 x P. stipitis CBS 5776 arg-1 his-1 konnten keine Uracil-Auxotrophen isoliert werden. Die weiteren Marker der Kreuzungsstämme segregierten jedoch. 54

55 3. Ergebnisse Tabelle 3.10 Segregationsmuster der Hybriden der Kreuzung P. stipitis FPL-UC7 ura3-3 x P. stipitis CBS 5776 arg-1 his-1 Phänotypen der Segreganten Anzahl der Sporen (prozentualer Anteil) ura 0 arg 7 (14,5%) his 29 (60,4%) ura arg 0 ura his 0 arg his 12 (25%) ura arg his 0 Anzahl auxotropher Segreganten 48 (100%) Um zu untersuchen, ob die nicht nachweisbare Segregation des ura-allels eventuell durch die Mutante P. stipitis CBS 5776 arg-1 his-1 verursacht wurde, wurde der Stamm mit P. stipitis CBS 5776 ade-4 lys-5 gekreuzt. Hierbei zeigte sich, dass die Hybriden dieser Kreuzungen wie Hybriden anderer Stammkombinationen bei P. stipitis segregierten (Melake et al., 1996) (Tabelle 3.11a). Tabelle 3.11b zeigt das Verhältnis der Plus- und Minusallele der Segreganten. Das Segregationsverhältnis der Mutanten- und Wildtypallele sollte bei Segreganten einer diploiden Zygote 1 - : 1 + (Quotient =1) betragen. Signifikante Abweichungen dieses Verhältnisses, z. B. durch die bevorzugte Segregation der rezessiven Allele ade und lys, wurden bereits bei vorhergehenden Kreuzungsexperimenten festgestellt (Schruff, 1999). 55

56 3. Ergebnisse Tabelle 3.11a: Segregationsmuster der Hybriden der Kreuzung P. stipitis CBS 5776 arg-1 his-1 x P. stipitis CBS 5776 ade-4 lys-5 Phänotypen der Segreganten Anzahl der Sporen (prozentualer Anteil) arg his 6 (3,4 %) ade lys 30 (17,3%) ade arg 3 (1,7%) ade his 7 (4%) arg lys 10 (5,7%) his lys 8 (4,6%) ade 15 (8,6%) his 9 (5,2%) arg 9 (5,2%) lys 10 (5,7%) arg his ade 4 (2,3%) arg his lys 8 (4,6%) arg ade lys 18 (10,4%) ade his lys 16 (9,2%) arg his ade lys 21 (12%) Anzahl auxotropher Segreganten 174 (100%) Tabelle 3.11b: Verhältnisse der + und - Allele der Segreganten der Kreuzung P. stipitis CBS 5776 arg-1 his-1 x P. stipitis CBS 5776 ade-4 lys-5 Allele ade : ADE Verhältnis Quotient Allele lys : LYS Verhältnis Quotient Allele arg : ARG Verhältnis Quotient Allele his : HIS Verhältnis Quotient 114 : 60 1,9 121 : 53 2,28 79 : 95 0,83 79 : 95 0,83 56

57 3. Ergebnisse 3.3 S. cerevisiae TRP5 als Reportergen Beim Wachstum von TRP-Stämmen der Hefe S. cerevisiae auf Medium mit 5-FAA entsteht, ähnlich wie bei URA3-Stämmen auf 5-FOA, ein für die Zellen toxisches Produkt. Durch die Zugabe von Tryptophan ist die Selektion von trp-auxotrophen Kolonien auf solchen Medien jedoch möglich. Hierbei macht man sich die antimetabole Wirkung von 2-Amino-5- Fluorbenzoesäure (5-FAA) durch die an der Konversion von Anthranilat zu Tryptophan beteiligten Enzyme (Trp1p, Trp3p, Trp4p, Trp5p) zunutze (Toyn et al., 2000). Da der Transformationsstamm P. stipitis PJH53 his3-1 trp5-10 bereits eine Mutation im Tryptophansynthetasegen trägt, würde bei der Verwendung des TRP5/trp5-Selektionssystems das Einkreuzen oder die Disruption eines trp Gens entfallen. Weiterhin wäre von Vorteil, dass das S. cerevisiae TRP5 Gen in P. stipitis Expressionsvektoren bereits erfolgreich zur Selektion eingesetzt wurde (Piontek et al., 1998) Überprüfung der 5-FAA-Resistenz von P. stipitis Zur Überprüfung, ob P. stipitis gegenüber 5-FAA sensibel ist, wurden verschiedene P. stipitis-stämme der RWTH-Stammsammlung auf dem von Toyn et al. (2000) beschriebenen Medium mit unterschiedlichen 5-FAA Konzentrationen im Vergleich zu S. cerevisiae getestet. Die untersuchten Stämme sind in Tabelle 3.12 aufgelistet. Wie man in Abbildung 3.10 sieht, war eine Selektion Trp-Auxotropher des Transformationsstamms (Nr. 9) sowie des Stamms Nr. 6 bei einer 5-FAA-Konzentration von 0,5 g/l möglich. Weitere getestete trp- Stämme (Nr. 1, 2, 3, 4, 5, 7 und 8) konnten nur auf niedrigeren 5-FAA Konzentrationen selektiert werden. Stamm Nr. 12 war phänotypisch Trp-prototroph und schien daher eine 5- FAA Resistenz aufzuweisen. 57

58 3. Ergebnisse Tabelle 3.12: Überprüfung der 5-FAA-Resistenz verschiedener P. stipitis und S. cerevisiae Stämme auf Festmedium mit unterschiedlichen 5-FAA-Konzentrationen 5-FAA Konzentration: Stämme: (Wachstum nach zwei / drei Tagen Inkubation ) Nr. 0,25 g/l 0,4 g/l 0,5 g/l 1 g/l 1 P. stipitis CBS 5773 trp-4 his-5 ++ / ++ - / + - / - - / - 2 P. stipitis CBS 5773 trp-4 leu-1 ++ / ++ + / ++ - / - - / - 3 P. stipitis CBS 5773 trp-4 lys-6 - / - - / - - / - - / - 4 P. stipitis CBS 5773 trp-4 lys-7 - / + - / - - / - - / - 5 P. stipitis CBS 5773 trp-4 lys-8 ++ / ++ - / - - / - - / - 6 P. stipitis CBS 5775 trp-5 ++ / / / ++ - / - 7 P. stipitis CBS 5773 asn-1 trp-2 - / - - / - - / - - / - 8 P. stipitis CBS 5773 asn-1 trp-3 - / - - / - - / - - / - 9 P. stipitis CBS 5773 PJH53 his3-1 trp / / ++ + / ++ - / - 10 P. stipitis CBS / - - / - - / - - / - 11 P. stipitis CBS 5776 ade-4 lys-5 ++ / ++ - / - - / - - / - 12 P. stipitis CBS 5776 arg-1 his-1 ++ / / / ++ - / - 13 P. stipitis FPL-UC7 ura3-3 - / - - / - - / - - / - 14 P. stipitis PSLU10 ura3-3 leu2 - / + - / + - / - - / - 15 S. cerevisiae 41α ade2-119 trp5 ilv / / / ++ - / + 16 S. cerevisiae ATCC / + - / - - / - - / - -: kein Wachstum +: schwaches Wachstum ++: normales Wachstum 58

59 3. Ergebnisse Abbildung 3.10: Überprüfung der 5-FAA-Resistenz verschiedener P. stipitis und S. cerevisiae Stämme auf YNB- Festmedium mit 0,25 g/l, 0,4 g/l, 0,5 g/l oder 1,0 g/l 5-FAA Die Aufnahmen wurden nach einer Inkubationszeit von 2 Tagen auf 5-FAA-Medium angefertigt. Die Stammbezeichnung ist in Tabelle aufgelistet. Nach vier Tagen Inkubation waren alle getesteten Stämme in der Lage, auf 5-FAA-haltigem Medium zu wachsen. Demnach verliert 5-FAA in Festmedium nach 3 bis 4 Tagen Inkubation seine Wirksamkeit. In Flüssigmedium konnte das Wachstum von TRP-prototrophen Stämmen bei einer 5-FAA Konzentration von 0,2 g/l unterdrückt werden. Zur Selektion von Mutanten wurden entsprechend 0,5 g/l 5-FAA in YNB-Festmedium, das mit Tryptophan supplementiert wurde, verwendet. 59

60 3. Ergebnisse Versuche zur Gewinnung eines Transformationsstamms mit stabiler trp5- Marke Die spontane Revertantenrate des trp5-markers von P. stipitis CBS 5774 PJH53 his3-1 trp5-10 liegt bei 8 x Bei einer Transformationskontrolle mit Wasser stieg die Revertantenrate bei 6 getesteten Klonen im Durchschnitt auf 6 x 10-7 an, während der his3-marker stabil war. Da die Instabilität des trp-markers bei Transformationen ein umfangreiches Screening auf Transformanten mit sich bringen würde, wurde versucht, eine stabile trp5-mutation herzustellen. Kolonien, die nach der Mutagenese in der Lage waren, auf 5-FAA-haltigem Medium zu wachsen, wurden auf Minimalmedium ohne und mit Tryptophan übertragen, um trp-auxotrophe von 5-FAA-resistenten Kolonien unterscheiden zu können Versuche zur Selektion spontaner Mutanten Die Frequenz von 10-7, mit der spontane ura3 Mutanten von S. cerevisiae auf 5-FOA Medium selektiert werden können (Punkt ), wird auch für die Selektion spontaner Trp- Auxotropher auf 5-FAA beschrieben. Die gefundenen trp-mutanten gehörten alle zur trp5- Komplementationsgruppe (Toyn et al., 2000). Unter je 4 x 10 9 getesteten TRP5-Revertanten der Stämme P. stipitis CBS 5773 PJH53 his3-1 trp5-10 und P. stipitis CBS 5773 PJH53 his3-1 trp5-10 adh1::his3 konnten keine stabilen Trp5-Auxotrophen nachgewiesen werden Versuche zur Selektion von Mutanten nach UV-Mutagenese Trp5-Revertanten der Stämme P. stipitis CBS 5774 PJH53 his3-1 trp5-10 und P. stipitis CBS 5774 PJH53 his3-1 trp5-10 adh1::his3 wurden mit UV-Licht bestrahlt. Unter den Überlebenden (ca. 3 x 10 7 Zellen je Stamm) konnten keine stabilen trp5-mutanten auf 5- FAA-haltigem Medium selektiert werden Versuche zum Einkreuzen des trp5-markers Die zur Resistenzuntersuchung eingesetzten, auf 5-FAA-haltigem Medium selektierbaren Stämme (Punkt 3.3.1) wurden mit dem Vektor pswat-1 transformiert. Dieses Plasmid trägt das S. cerevisiae TRP5 Gen als selektierbaren Marker sowie eine autonom replizierende Sequenz (ARS) von Schwanniomyces occidentalis, die auch in P. stipitis als Replikationsstartpunkt funktioniert (Piontek et al., 1998). Die trp-mutationen der Stämme konnten jedoch nicht durch das S. cerevisiae TRP5-Protein komplementiert werden, so dass sie sich zum Einkreuzen des Markers nicht eigneten Versuche zur Selektion von Mutanten nach Disruption des PsTRP5-Gens Zur Ermittlung der P. stipitis TRP5 Sequenz wurde die YEp-TW-Bank in S. cerevisiae 41α ade2-119 trp5 ilv1-92 transformiert. Diese Genbank enthält Sau3A verdaute DNA des Stamms P. stipitis CBS 5774 in der BamHI-Schnittstelle von YEp24, einem Vektor, der sich durch eine 2µ ARS in S. cerevisiae autonom vermehrt. Unter 10 9 transformierten Zellen waren 16 in der Lage, auf Tryptophanmangelmedium zu wachsen. Die 16 Transformanten 60

61 3. Ergebnisse wurden vereinzelt und eventuell vorhandene Plasmide isoliert. Da YEp24 ebenfalls einen Replikationsstartpunkt für E. coli (ori v) sowie ein Ampicillinresistenzgen besitzt, wurden die vermutlichen Plasmidisolate zur Vermehrung in E. coli DH5α transformiert. Es entstanden keine Ampicillin-resistenten Transformanten, was vermuten läßt, dass es sich bei den auf Tryptophanmangelmedium gewachsenen Kolonien um Revertanten handelte. Auch die Amplifikation eines Inserts mit YEp24 spezifischen Primern (Yep24li und Yep24re) und Gesamt-DNA der 16 TRP-prototrophen Transformanten war nicht möglich. 3.4 Konstruktionen zur Herstellung des Reportersystems Konstruktion der ends-out-kassette PsADH2::ScTRP5::PsADH2 mittels LFH-PCR Eine Methode zur Herstellung einer Disruptionskassette zur gezielten Insertionsmutagenese bei S. cerevisiae ist die so genannte LFH (long flanking homology regions)-pcr, mit der in zwei Amplifikationsreaktionen ein Markergen mit Sequenzen fusioniert wird, die zum Zielgen 5 - und 3 - homolog sind (Wach, 1996). Zur Konstruktion einer ends-out Reporterkassette wurde entsprechend der LFH-PCR in der ersten Reaktion der PsADH2-Promotor mit dem Primerpaar PsADH2-5 -XbaI / PsADH2-5 li (-481 bp bis 1 bp) sowie die PsADH2-Terminationsregion mit den Primern PsADH2-3 li und PsADH2-3 -SalI (+1047 bp bis bp) amplifiziert. Als Template diente die DNA des Stamms P. stipitis CBS Die Primer wurden so konstruiert, dass sich am 5 Ende von PsADH2-5 li ein 20 bp langer Homologiebereich zum Translationsstart (+1 bp bis +20 bp) und bei Primer PsADH2-3 li eine homologe Sequenz zum Translationsende (+2123 bp bis bp) des ScTRP5-Gens befinden. In der zweiten Polymerasekettenreaktion wurde der Vektor pswat-1 als Template-DNA verwendet. In Abbildung 3.11 ist die gelelektrophoretische Auftrennung der einzelnen Amplifikate dargestellt. Da die Herstellung der Reporterkassette mittels LFH-PCR auch immer zur Bildung eines unspezifischen 2 kb großen Produktes führte, wurde das putative 2,8 kb große Reportermodul nach gelelektrophoretischer Auftrennung zur Weiterverwendung eluiert. 61

62 3. Ergebnisse A 1 GS1 2 kbp 3 GS2 4 kbp B 3,5 2,0 1,9 0,5 0,4 0,3 0,2 Abbildung 3.11: Gelelektrophoretische Auftrennung der Amplifikate der LFH-PCR zur Herstellung einer ends-out-reporterkassette; (A) Promotor- (1) und Terminationsregion (2) des PsADH2-Gens; (B) LFH-PCR-Produkt (3); in Spur 4 wurden die Produkte der zweiten PCR, die ohne Template-DNA (pswat-1) entstanden sind, aufgetrennt; als Größenstandards dienten die Hyperladder IV der Firma Bioline (GS1) und λ-dna, die mit den Restriktasen EcoRI und HindIII vollständig verdaut wurde (GS2). Ein Verdau des LFH-PCR-Produkts mit den Restriktionsendonukleasen HindIII und NcoI sollte Aufschluss darüber geben, ob die Reporterkassette vollständig amplifiziert wurde. Die Restriktion mit HindIII sollte bei korrekter Amplifikation zu einem 1,8 kb und einem 1 kb großen Fragment führen. Die gelelektrophoretische Auftrennung dieses Verdaus (Abbildung 3.12A) zeigt neben dem ungeschnittenen Amplifikat und dem erwarteten 1,8 kb großen Fragment ein mit 0,8 kb um ca. 0,2 kb zu kleines Teilstück. Die Restriktion mit NcoI teilt die Reporterkassette theoretisch in ein 2,2 kb und ein 0,6 kb großes Fragment. Durch die gelelektrophoretische Auftrennung werden auch hier die ungeschnittene Kassette, ein den Erwartungen entsprechendes 2,2 kb Fragment sowie ein 0,4 kb Fragment, das ebenfalls um 0,2 kb zu klein ist, sichtbar (Abbildung 3.12B). Die durch LFH-PCR entstandene Reporterkassette ist demnach in der 3 Region um ca. 200 bp zu kurz, so dass die Gesamtlänge bei ungefähr 2,6 kb liegt. Zur besseren Denaturierung der Template-DNA wurde der PCR DMSO zugesetzt, jedoch brachte auch dieser Ansatz nicht das erwartete 2,8 kb große 62

63 3. Ergebnisse Amplifikat hervor. Ob die so entstandene Disruptionskassette nach Integration in P. stipitis PJH53 his3-1 trp5-10 zur Expression des ScTRP5-Gens führt, sollte durch Komplementation der trp5 -Auxotrophie nach Transformation des Reportermoduls geklärt werden (Abschnitt 3.5.1). kbp GS1 1 GS2 2 kbp GS3 3 A B 3,5 2,3 2,0 1,5 2,5 2,0 0,9 0,8 0,4 Abbildung 3.12: Restriktionsanalyse des LFH-PCR-Produkts; die eluierte Kassette wurde mit HindIII verdaut (A) und gelelektrophoretisch aufgetrennt (1); in Spur 2 sieht man das unverdaute Produkt; der Restriktionsansatz mit NcoI (B) wurde in Spur 3 aufgetragen; als Größenstandards dienten EcoRI / HindIII- (GS1) und HindIII-verdaute λ-dna (GS2) sowie der DNA-Ladder-Mix von MBI. 63

64 3. Ergebnisse Konstruktion des autonomen Reporterplasmids pbssw-rep Das autonome Plasmid pswat-1 wurde mit BamHI verdaut, um auf diese Weise das Selektionsmarkergen ScTRP5 vom übrigen Vektor zu trennen. Beide Fragmente wurden nach gelelektrophoretischer Auftrennung eluiert. Durch eine ClaI-Restriktion wurde die ScTRP5 Promotorregion bis 40 bp entfernt und das verbleibenden ScTRP5 Gen durch Gelextraktion aufgereinigt. Der PsADH2 Promotor wurde mit den Primern PsADH2Pro-5 -BamHI und PsADH2-3 -ClaI amplifiziert. Als Template diente P. stipitis CBS 5774 DNA. Nach Restriktion des Promotoramplifikats mit BamHI und ClaI wurden der PsADH2 Promotor und das ScTRP5 Fragment in den Vektor ohne Selektionsmarker ligiert. Der resultierende Vektor pbssw-rep ist in Abbildung 3.13 dargestellt. BamHI ClaI SwARS PsADH pbssw-rep 7673 bps 2000 ScTRP5 ScaI ampr ori BamHI Abbildung 3.13: Physikalische Karte des autonomen Reporterplasmids pbssw-rep 64

65 3. Ergebnisse Das Ligationsprodukt wurde mit der Restriktase XbaI verdaut. Bei korrekter Klonierung sollte diese Restriktion zu einem 5,12 kb, einem 2,22 kb und einem 0,35 kb großen Fragment führen. Unter 18 getesteten Klonen zeigte das Plasmid eines Klons das entsprechende Restriktionsmuster (Abbildung 3.14). Neben den Restriktionsfragmenten wurden zwei weitere, größere DNA-Moleküle gelelektrophoretisch aufgetrennt, die Konfigurationen des zirkulären Vektors darstellen. kbp GS 1 5,1 2,0 0,6 0,35 Abbildung 3.14: Gelelektrophoretische Auftrennung des autonomen Reporterplasmids pbssw-rep nach XbaI-Verdau (1); als Größenstandard diente λ-dna, die mit den Restriktasen EcoRI und HindIII vollständig verdaut wurde (GS). Das autonome Reporterplasmid wurde zusätzlich durch eine Sequenzierung des Kassettenmoduls überprüft. Die Sequenzierungsreaktion wurde mit dem Primer PsADH2Pro- 5 -BamHI durchgeführt und führte zu einer über 1026 bp lesbaren Nukleotidabfolge. Beim Vergleich der Sequenz mit den in der EMBL-Datenbank verfügbaren Sequenzen wurden die erwartete Homologie zu PsADH2 im Bereich von 481 bp bis 1 bp, die ClaI- Erkennungssequenz, über die die Fragmente ligiert wurden sowie die Homologie zu ScTRP5 im Bereich von 40 bp bis zum Ende der sequenzierten Region bestätigt. 65

66 3. Ergebnisse Klonierung der Reporterkassette in den ends-in Vektor psfpsadh1 Die durch LFH-PCR hergestellte ends-out Disruptionskassette führte unter den gewählten Transformationsbedingungen nicht zu Transformanten (Abschnitt 3.5.1). Entweder kam es nicht zur Integration des Vektors in den Transformationsstamm P. stipitis PJH53 his3-1 trp5-10, oder es wurde nach der Integration der Kassette kein funktionstüchtiges ScTRP5-Protein exprimiert. Eine Möglichkeit, die Transformationseffizienz zu erhöhen, bestand in der Verwendung des ends-in Vektors psfpsadh1 (Fluthgraf et al., 2003), der linearisiert bei Transformation in Anwesenheit der aktiven Restriktase mit hoher Frequenz integriert. Die Klonierung des LFH-PCR-Produkts in dieses Plasmid hatte den Vorteil, den in psfpsadh1 vorhandenen Histidinmarker und nicht den ScTRP5-Marker zur Selektion von Integranten zu nutzen. Auf diese Weise brauchte zunächst auf die eventuell notwendige Einstellung von sauerstofflimitierenden Bedingungen zur stärkeren Induktion des PsADH2::ScTRP5- Konstrukts keine Rücksicht genommen zu werden. Zur Amplifikation der Reporterkassette wurde das LFH-PCR-Produkt als Template zusammen mit dem Primerpaar PsADH2-5 -NarI/ PsADH2-3 -NarI verwendet. Das entstandene Amplifikat wurde in die NarI- Erkennungssequenz des Vektors psfpsadh1 kloniert. Der resultierende Vektor psfpsadh1-bsrep1 ist in Abbildung 3.15 dargestellt. NarI ampr PsADH ScTRP5 Bam HI ori 6000 ADH1 Fragment 8789 bps 2000 PsADH2 ClaI Sac I EcoRI 4000 PsHIS3 NarI EcoRI Abbildung 3.15: Physikalische Karte des integrativen Reporterplasmids psfpsadh1-bsrep1 66

67 3. Ergebnisse Die Klonierungsprodukte wurden mit NarI verdaut. Die gelelektrophoretische Auftrennung der verdauten Plasmide zeigte, dass bei 3 von 18 untersuchten Klonen Fragmente der Größe der Reporterkassette (2,6 kb) aus dem 6079 bp großen Vektor ausgeschnitten werden konnten (Abbildung 3.16A). Die Plasmide der 3 Klone wurden zusammen mit dem Primerpaar PsADH2-5 -NarI / PsADH2-3 -NarI in eine PCR eingesetzt. Die Amplifikation eines 2,6 kb Fragments war bei den getesteten Plasmiden psfpsadh1-bsrep1 / 2 und 3 möglich (Abbildung 3.16B). kbp GS1 1 2 GS2 kbp A 21 B 5,1 2,0 23 6,6 4,4 2,3 Abbildung 3.16: Ergebnisse der Restriktion des Vektors psfpsadh1-bsrep1 mit NarI (A, 1) und Amplifikation des 2,6 kb großen Kassettenmoduls (B, 2); als Größenstandard diente EcoRI / HindIII- (GS1) und HindIII-verdaute λ-dna (GS2). 67

68 3. Ergebnisse Konstruktion des integrativen Reporterplasmids prep-lfh Der PsADH2 Promotor (-481 bp bis 1 bp) wurde bei der Herstellung des autonomen Reporterplasmids pbssw-rep unter Benutzung der ClaI- Schnittstelle des ScTRP5- Promotors (-40 bp bis 36 bp) an das ScTRP5- Strukturgen und seine Terminationsregion fusioniert (-40 bp bis +2471bp). Zur Amplifikation der Reporterkassette wurden die Primer PsADH2-5 -SacI und ScTRP5-3 -BamHI zusammen mit pbssw-rep als Template DNA eingesetzt. Die PsADH2 3 Region (+838 bp bis bp) wurde mit dem Primerpaar PsADH2-5 -BamHI / PsADH2-3 -SphI und P. stipitis CBS 5774 als Template DNA mittels PCR hergestellt. Das PsADH2-ScTRP5-Fusionsprodukt wurde nach Restriktion mit SacI und BamHI in den entsprechend verdauten Vektor puc19 kloniert. Es resultierte das Plasmid prep. Das Amplifikat der PsADH2 3 Region wurde dann über die BamHI- und SphI- Erkennungsstellen in prep ligiert (Abbildung 3.17). 5658, Sca I Nde I, 183 Eco RI, 396 Sac I, 402 ampr 6000 PsADH2 Cla I, prep-lfh 1000 ori bps ScTRP5 Eco RI, 1702 Eco RI, , SphI PsADH2 Eco RI, , Bam HI Abbildung 3.17: Physikalische Karte des integrativen Reporterplasmids prep-lfh 68

69 3. Ergebnisse Zur Überprüfung der korrekten Klonierung des Plasmid prep-lfh wurde eine Restriktion mit SphI und SacI durchgeführt, bei der das 3,5 kb große Kassettenmodul PsADH2::ScTRP5::PsADH2 aus puc19 (2,7 kb) ausgeschnitten wurde. Die gelelektrophoretische Auftrennung des verdauten Reporterplasmids zeigte, neben dem ungeschnittenen Plasmid, die erwarteten Fragmente der Größen 3,5 kb und 2,7 kb (Abbildung 3.18A). Das Plasmid wurde mit den Primerpaaren PsADH2-5 -SacI / ScTRP5-3 -BamHI und PsADH2-5 -BamHI / PsADH2-3 -SphI in eine PCR eingesetzt. Die Amplifikation der Kassettenbestandteile PsADH2::ScTRP5 mit ca. 3 kb Größe und der PsADH2 3 -Region mit 519 bp Größe war möglich (Abbildung 3.18B). 1 GS1 kbp 2 GS2 3 kbp A B 3,5 2,5 3,5 2,0 0,6 Abbildung 3.18: Ergebnisse der Restriktionen des Vektors prep-lfh mit SphI und SacI (A, 1) und Amplifikation der Kassettenbestandteile PsADH2::ScTRP5 (B, 2) sowie der PsADH2 3 -Region (B, 3); als Größenstandards dienten die O RangeRuler 500 bp DNA-Leiter der Firma MBI (GS1) sowie EcoRI / HindIII verdaute λ-dna (GS2). Es wurde eine Sequenzierung der Reporterkassette des integrativen Vektors prep-lfh mit den Primern pucuni und pucrev durchgeführt. Beide Reaktionen führten zu ca. 1 kb langen lesbaren Nukleotidabfolgen, die beim Vergleich mit den in der EMBL-Datenbank verfügbaren Sequenzen die erwarteten Homologien zu PsADH2 (-481 bp bis 1 bp) und ScTRP5 ( 40 bp bis bp) aufwiesen. Die ClaI-Erkennungssequenz, über die der PsADH2-Promotor mit dem ScTRP5- Gen fusioniert wurde, befand sich, wie erwartet, unmittelbar vor dem Translationsstart des ADH2-Gens und 40 bp vor dem des TRP5-Gens. 69

70 3. Ergebnisse Konstruktion des integrativen Vektors pbspshis3 zur REMI- Mutagenese des Reporterstamms Zur Konstruktion von pbspshis3 wurde eine 2,8 kb lange Sequenz, auf der das PsHIS3-Gen kodiert ist, mit Hilfe der Restriktase EcoRI aus dem Vektor pjh-s-1 (Hagedorn, 1990) geschnitten. Das so entstandene EcoRI-Fragment wurde in puc19 kloniert. In Abbildung 3.19 ist die physikalische Karte des integrativen Plasmids dargestellt. 5513, EcoRI XbaI, , ScaI 5000 SphI, 957 ampr 4000 pbspshis bps 1000 PsHIS3 SphI, HindIII, SalI, HindIII SphI PstI SalI XbaI BamHI SmaI KpnI SacI EcoRI , XbaI XbaI, 2359 Abbildung 3.19: Physikalische Karte des Vektors pbspshis3 70

71 3. Ergebnisse 3.5 Transformation der Reporterkonstrukte Versuche zur Transformation des LFH-PCR-Produkts Je 1 µg des aufgereinigten LFH-PCR-Produkts wurde in P. stipitis PJH53 his3-1 trp5-10 transformiert. Die Selektion der Transformanten wurde auf mit Histidin supplementiertem YNB-Festmedium durchgeführt. In Tabelle 3.13 ist die Anzahl TRP-prototropher Kolonien (KBE) aufgelistet. Da nicht bekannt war, ob die basale Expression des ADH2-Promotors (Abschnitt 3.1.1; Passoth et al., 1998) zur Bildung einer für normales Wachstum ausreichenden Menge an TRP5-Protein führt, wurde die Inkubationszeit von 4 Tagen auf bis zu 14 Tage verlängert. Wie Tabelle 3.13 zeigt, brachte die Transformationskontrolle mit Wasser in zwei unabhängigen Versuchen eine ähnliche Anzahl Trp-prototropher Kolonien wie die Transformation mit dem LFH-PCR-Produkt hervor, was vermuten ließ, dass es sich bei den entstandenen Kolonien ausschließlich um Revertanten handelte. Bei weiteren Transformationen wurden die Selektionsfestmedien mit Agar-Agar (1,5 %) überschichtet, um sauerstofflimitierende Bedingungen einzustellen, bei denen der ADH2-Promotor stärker exprimiert wird (Passoth, 1998). Jedoch konnten auch in diesem Versuchsansatz keine Transformanten selektiert werden. Die mittels LFH-PCR hergestellte Disruptionskassette wurde entweder nicht integriert oder es kam nicht zur Expression des ScTRP5-Gens, da die Kassette in der 3 Region nicht vollständig amplifiziert wurde (Abschnitt 3.4.1). Tabelle 3.13: Anzahl Trp-prototropher Kolonien (KBE) nach Transformation des LFH-PCR Produkts transformierte Komponente LFH-PCR-Produkt H 2 O pswat-1 Transformation Anzahl Trp-prototropher KBE / µg DNA Mittelwert 1 14 / 9 / 11 / / 28 / 37 / 48 / 13 / 34 / 35 34, / 10 / 14 / 17 13, / 23 / 20 / 33 / 37 28, Die durch Schrägstrich getrennten Daten zeigen Ergebnisse von Parallelversuchen einer Transformation. Bei der Herstellung kompetenter Zellen wurde den Flüssigkulturen 0,2 g/l 5- FAA zugegeben, um die Anreicherung von TRP-Revertanten zu vermeiden. 71

72 3. Ergebnisse Transformation des autonomen Reporterplasmids pbssw-rep und Nachweis der Expression des Reportergens Die Transformation von jeweils 1 µg Plasmid DNA in den Transformationsstamm P. stipitis PJH53 his3-1 trp5-10 führte zu den in Tabelle 3.14 dargestellten Ergebnissen. Die Transformanten wurden auf Tryptophanmangelmedium selektiert. Die pbssw-rep Transformanten zeigten im Vergleich zu den pswat-1 Transformanten kein verlangsamtes Wachstum. Unter Berücksichtigung der Tryptophan-Revertanten (Kolonien, die nach der Kontrolltransformation mit Wasser anstelle von DNA entstanden sind), transformierte der Vektor pbssw-rep durchschnittlich 6,69 x 10-7 Zellen und pswat-1 8,94 x 10-7 Zellen pro µg DNA. Tabelle 3.14: Anzahl Trp-prototropher Kolonien nach Transformation des autonomen Plasmids pbssw-rep transformierte Komponente pbssw-rep H 2 O pswat-1 Transformation Anzahl Trp-prototropher KBE / µg DNA Mittelwert 1 ca. 130 / 150 / , / 277 / ,7 3 ca. 500 / ca Die durch Schrägstriche getrennten Daten zeigen Ergebnisse von Parallelversuchen einer Transformation. Bei der Herstellung kompetenter Zellen wurde den Flüssigkulturen 0,2 g/l 5- FAA zugegeben, um die Anreicherung von TRP-Revertanten zu vermeiden. Da die Transformationen mit dem integrativen Reporterplasmid prep-lfh (Abschnitt 3.5.4) sowie mit dem autonomen Reporterplasmid pbssw-rep (Abschnitt 3.5.2) auch ohne das Einstellen semiaerober Bedingungen gut wachsende Trp-prototrophe Transformanten hervorbrachten, sollte geklärt werden, ob für die Expression des ScTRP5- Gens der ADH2- Promotor verantwortlich ist. Ein Plasmidverlust-Test sollte zeigen, ob die Anwesenheit des autonomen Vektors pbssw-rep zur Komplementation der Trp-Auxotrophie des Transformationsstamms führte. 72

73 3. Ergebnisse Der Stamm P. stipitis PJH53 his3-1 trp5-10 wurde mit dem autonomen Reporterplasmid pbssw-rep transformiert. Bei drei Hefetransformanten wurde die Plasmidstabilität untersucht. In Selektiv-Medium wachsende Transformanten besaßen durchschnittlich zu 49% Plasmide. Nach Kultivierung für 8 Generationen unter nicht-selektiven Bedingungen sank der Anteil plasmidhaltiger Zellen in der Kultur auf 33,5%. Dies entspricht einer Plasmidverlustrate von ca. 4,6% pro Generation. Es läßt sich schlussfolgern, dass die Anwesenheit von pbssw-rep bei den Transformanten die Komplementation der TRP- Auxotrophie des Transformationsstamms hervorruft und dass das ScTRP5-Gen unter der Kontrolle des PsADH2-Promotors exprimiert wird REMI- Transformation des Vektors psfpsadh1-bsrep1 Die Integration des ends-in Vektors psfpsadh1-bsrep1 in P. stipitis PJH53 his3-1 trp5-10 erfolgte über die ClaI-Schnittstelle im ADH1-Fragment. Die Transformation von 1 µg des ClaI restringierten Plasmids in Anwesenheit des aktiven Enzyms (REMI) konnte die Transformationseffizienz im Vergleich zur Transformation des LFH-PCR-Produkts deutlich steigern. Die Selektion der Transformanten erfolgte auf Histidinmangelmedium. Die Anzahl der Histidin-prototrophen Kolonien ist in Tabelle 3.15 angegeben. Die Transformantenrate des Plasmids psfpsadh1-bsrep1 lag bei 1,98 x 10-6 und damit im Größenbereich des autonomen Vektors pjh-s-1 mit 2,25 x 10-6 transformierten Zellen. Wachstum der Transformanten auf Tryptophanmangelmedium wurde nicht beobachtet, was zeigt, dass das LFH-PCR-Produkt nicht zur Expression eines funktionstüchtigen ScTRP5p führt. Tabelle 3.15: Anzahl His-prototropher Kolonien nach Transformation des ends-in Vektors psfpsadh1-bsrep 1 transformierte Anzahl His-prototropher KBE / µg Komponente DNA psfpsadh1-bsrep H 2 O 0 pjh-s

74 3. Ergebnisse Transformation des integrativen Plasmids prep-lfh Die Transformationen des Plasmids prep-lfh und verschiedener Derivate des Vektors erfolgten in P. stipitis PJH53 his3-1 trp5-10 oder in den daraus hervorgegangenen Stamm P. stipitis PJH53 his3-1 trp5-10 adh1::puc19/his3 (Fluthgraf et al., 2003). Die Selektion der Transformanten wurde auf Tryptophanmangelmedium durchgeführt. Die Transformationsergebnisse sind in den Tabelle 3.16, 3.17 und 3.19 zusammengefasst. Die Transformationskontrollen mit Wasser führten in allen Experimenten zu einer ähnlichen Ausbeute Trp-prototropher Kolonien wie die Transformation mit dem zirkulären Vektor prep-lfh (Tabelle 3.16 und 3.17), was vermuten ließ, dass es sich bei den entstandenen Kolonien ausschließlich um Revertanten handelte. Ein leichter Anstieg der Transformationseffizienz konnte beobachtet werden, wenn nur das Reportermodul transformiert wurde. Dazu wurde der Vektor prep-lfh mit SphI und SacI verdaut und die 3,52 kb große Disruptionskassette aus einem Agarosegel extrahiert. Von der so aufgereinigten Reporterkassette wurden entsprechend dem Protokoll nach Wach (1996) je 5 µg in die Transformation eingesetzt. Unter Berücksichtigung der TRP-Revertanten, transformierte die Reporterkassette Rep-LFH durchschnittlich 8 x 10-8 Zellen in P. stipitis PJH53 his3-1 trp5-10 und 3,75 x 10-8 Zellen in P. stipitis PJH53 his3-1 trp5-10 adh1::puc19/his3 pro 5 µg DNA (Tabelle 3.16). Die Transformation von 1 µg der Rep-LFH-Kassette führte im Vergleich zu der Kontrolltransformation mit Wasser nicht zu einer Zunahme an Trp-prototrophen Kolonien (Tabelle 3.17). Ein weiterer Transformationsansatz basierte auf einer Beobachtung, die während Insertionsmutagenese-Experimenten in Kluyveromyces lactis gemacht wurde. Bei dieser Hefe konnte die Transformationseffizienz mit einem linearen Vektor stark erhöht werden, wenn die in K. lactis zu integrierende homologe DNA in T-DNA des Ti-Plasmids von Agrobacterium tumefaciens eingebettet war (Bundock et al., 1999). Die Restriktion von prep-lfh mit dem blunt-end schneidenden ScaI führt zu einer ähnlichen Konfiguration des Reporterplasmids, in der die Reporterkassette auf beiden Seiten von nicht zu P. stipitis homologen puc19- Sequenzen eingerahmt ist. Das ScaI-linearisierte Reporterplasmid transformierte in unterschiedlichen Experimenten zwischen 2,2 x 10-6 Zellen pro µg DNA (Tabelle 3.17) und 2 x 10-5 Zellen pro 5 µg DNA (Tabelle 3.16). Vergleicht man diese Werte mit denen, die mit der SphI und SacI verdauten Kassette erzielt wurden, so ist die Transformationseffizienz mit dem ScaI-linearisierten Vektor mindestens 100-fach erhöht. Hierbei war kein Unterschied zwischen Ansätzen, in denen die Restriktase vor der Transformation inaktiviert wurde (ScaI inaktiv ) und Ansätzen, bei denen mit dem aktiven Enzym (ScaI aktiv ) transformiert wurde (Tabelle 3.16 und 3.17), zu erkennen. Eine Erklärungsmöglichkeit der verbesserten Transformantenrate von K. lactis war der durch die nicht-homologen Flanken vermittelte Schutz vor schnellem Nukleaseabbau der Kassette. Falls diese Theorie auch bei P. stipitis 74

75 3. Ergebnisse zutrifft, sollten kürzere Flanken zu einer Verminderung der Transformationsausbeute führen. In Versuchen hierzu wurde prep-lfh mit verschiedenen Restriktionsendonukleasen verdaut, die zu unterschiedlich langen, die Kassette flankierenden puc19-sequenzen führten. Eine Übersicht der transformierten Vektorderivate ist in Tabelle 3.18 dargestellt. 75

76 3. Ergebnisse Tabelle 3.16: Transformation von je 5 µg verschiedener prep-lfh- Derivate Anzahl Trp-prototropher KBE / 5 µg DNA transformierte Komponente Rep-LFH-Kassette # Transformation P. stipitis PJH53 his3-1 trp5-10 P. stipitis PJH53 his3-1 trp5-10 adh1::puc19/his Rep-LFH-Kassette # + ss carrier DNA prep-lfh mit ScaI inaktiv linearisiert 6 > 8000 > 8000 prep-lfh mit ScaI aktiv linearisiert prep-lfh mit ScaI inaktiv linearisiert + ss carrier DNA prep-lfh mit ScaI inaktiv linearisiert + ss carrier DNA + 35 % PEG prep-lfh H 2 O 6 > 8000 > Bei der Herstellung kompetenter Zellen wurden die YEP- Kulturen mit 0,2 g/l 5-FAA versetzt. Wenn nicht anders vermerkt, betrug die PEG- Konzentration im Transformationsansatz 22%. In die Ansätze mit carrier DNA wurden 500 µg denaturierte (ss) Heringssperma-DNA zugegeben, die vorab durch Ultraschallbehandlung fragmentiert wurde. Um die Reporterkassette Rep-LFH aus puc19 auszuschneiden wurde prep-lfh mit SphI und SacI verdaut und nach gelelektrophoretischer Auftrennung eluiert (#). Das linearisierte Reporterplasmid wurde mit aktivem (ScaI aktiv ) und inaktiviertem Enzym (ScaI inaktiv ) transformiert. 76

77 3. Ergebnisse Tabelle 3.17: Transformation von je 1 µg verschiedener prep-lfh- Derivate in P. stipitis PJH53 his3-1 trp5-10 transformierte Komponente Anzahl Trp-prototropher KBE / µg DNA Transformation: Rep-LFH-Kassette # n. u prep-lfh mit ScaI inaktiv linearisiert prep-lfh mit ScaI aktiv linearisiert 880 n. u. n. u. n. u. prep-lfh mit SphI inaktiv linearisiert n. u. n. u prep-lfh mit NarI inaktiv linearisiert n. u. n. u prep-lfh mit SacI inaktiv linearisiert n. u. n. u prep-lfh mit SphI inaktiv / ScaI inaktiv verdaut prep-lfh mit n. u. n. u SacI inaktiv / ScaI inaktiv verdaut Rep-LFH-Kassette # + puc19 n. u. n. u n. u. 792 n. u. 404 prep-lfh H 2 O Bei der Herstellung kompetenter Zellen wurden die YEP- Kulturen nicht mit 5-FAA versetzt. Um die Reporterkassette Rep-LFH aus puc19 auszuschneiden, wurde prep-lfh mit SphI und SacI verdaut und die Kassette anschließend aus einem Agarosegel eluiert (#). Bei der Transformation mit puc19 wurden SphI und SacI nach der Restriktion von prep-lfh inaktiviert, die resultierenden Fragmente wurden jedoch nicht mittels Gelextraktion aufgereinigt. Das linearisierte Reporterplasmid wurde mit aktivem (ScaI aktiv ) und inaktiviertem Enzym (ScaI inaktiv ) transformiert; n. u.: nicht untersucht 77

78 3. Ergebnisse Tabelle 3.18: Länge der die Reporterkassette flankierenden puc19-sequenzen verschieden restringierter prep-lfh-derivate, die in P. stipitis PJH53 his3-1 trp5-10 transformiert wurden Zur Linearisierung von Länge [bp] prep-lfh verwendete Restriktionsendonuclease 5 -Flanke 3 -Flanke ScaI SacI SphI NarI SacI / ScaI SphI / ScaI Die Restriktasen wurden vor der Transformation entfernt. Nach dem Doppel-Verdau von prep-lfh mit SacI / ScaI und SphI / ScaI wurden die gewünschten Restriktionsfragmente nach gelelektrophoretischer Auftrennung eluiert. Die Transformationsergebnisse sind in Tabelle 3.17 zusammengefasst. Bei den TRP-prototrophen Kolonien, die nach der Transformation des mit den Restriktasen SacI oder SphI linearisierten Vektors prep-lfh entstanden, handelte es sich wahrscheinlich um Revertanten. Die Restriktion mit NarI erzeugte, wie die mit ScaI, auf beiden Seiten der Kassette eine Flanke. Dennoch führte die Transformation des NarI-linearisierten Plasmids nicht zu einer deutlichen Erhöhung der Anzahl TRP-prototropher Kolonien im Vergleich zu der mit Wasser durchgeführten. Im Unterschied zu dem mit ScaI geschnittenen Vektor entstand bei der NarI-Restriktion ein Vektorderivat mit sticky-ends, das auf der 5 -Seite mit 167 bp eine sehr kurze puc19-flanke trug. Aus der Restriktion mit SacI / ScaI bzw. SphI / ScaI resultierten Reporterkassetten mit je einer langen, nicht-homologen Flanke mit einem glatten Ende. Bei der Transformation dieser Derivate entstanden signifikant mehr Trp-prototrophe Kolonien als auf den Selektionsplatten der Wasserkontrollen. Jedoch sank die Ausbeute an Transformanten im Vergleich zu der, die mit dem ScaI-linearisierten Vektor erzielt wurde, um ca. 50% bis 90%. Ähnliche Ausbeuten wurden auch mit dem SphI / SacI restringierten Reporterplasmid erzielt, bei dem der puc19- Anteil mit komplementären Enden nach Entfernung der Restriktasen kotransformiert wurde. In zusätzlichen Versuchen (Tabelle 3.16) wurde denaturierte Heringssperma-DNA kotransformiert, da die Verwendung von einzelsträngiger (ss) Carrier-DNA bei S. cerevisiae zu einer deutlichen Verbesserung der Transformationseffizienz führt (Schiestl und Gietz, 1989). Dieser Effekt ließ sich jedoch bei der Transformation von P. stipitis mit verschiedenen prep-lfh-derivaten nicht nachweisen. Auch eine PEG-Konzentration von 35% im 78

79 3. Ergebnisse Transformationsansatz, die sich bei der Gefriertransformation von S. cerevisiae als optimal erwiesen hat (Klebe et al., 1982), erhöhte die Transformationsausbeute bei P. stipitis nicht. Da die Verwendung von linearen Vektorderivaten mit einem oder zwei glatten Enden zu Transformanten führte, wurde untersucht, ob die Transformationseffizienz auch unabhängig von den, die Reporterkassette flankierenden puc19-sequenzen durch blunt-ends erhöht werden konnte. Zu diesem Zweck wurden die nach der Restriktion mit SphI und SacI entstandenen 3 -Überhänge der Kassette mit Hilfe der 3-5 -Exonukleaseaktivität des Klenow-Fragments abgedaut. In 2 unterschiedlichen Experimenten wurden mit diesem Reporterderivat Transformantenraten von ca. 6,6 x 10-7 und 4,8 x 10-7 erreicht (Tabelle 3.19), wohingegen die Reporterkassette mit sticky-ends nicht zu Transformanten führte. Tabelle 3.19: Transformation von je 1 µg Rep-LFH- Kassette mit sticky- oder blunt-ends in P. stipitis PJH53 his3-1 trp5-10 transformierte Komponente Rep-LFH-Kassette # mit sticky-ends Rep-LFH-Kassette ## mit blunt-ends Anzahl Trp-prototropher KBE / µg DNA Transformation: / 4 / 7 3 / 1 / / 135 / / 173 / 182 H 2 O 6 / 5 / 4 9 / 6 / 4 Bei der Herstellung kompetenter Zellen wurden die YEP- Kulturen mit 0,2 g/l 5-FAA versetzt Um die Reporterkassette Rep-LFH aus puc19 auszuschneiden, wurde prep-lfh mit SphI und SacI verdaut; die Kassette wurde anschließend aus einem Agarosegel eluiert (#). Nach Gelextraktion der mit SphI und SacI verdauten Reporterkassette Rep-LFH wurden die 3 Überhänge der sticky-ends durch die 3-5 -Exonukleaseaktivität des Klenow- Fragments zu blunt-ends abgedaut (##). 79

80 3. Ergebnisse 3.6 Charakterisierung des Reporterstamms Die Reporterstämme T79, T119, T126 und T223, in denen es nach Transformation des ScaI inaktiv linearisierten Vektors prep-lfh nachweislich zur Integration der Reporterkassette kam, wurden charakterisiert. T79 ist ein Derivat des Stamms P. stipitis PJH53 his3-1 trp5-10 adh1::puc19/his3. Die Transformanten T119, T126 und T223 sind Abkömmlinge des Stamms P. stipitis PJH53 his3-1 trp Bestimmung der mitotischen Stabilität des Reporterstamms Es wurde untersucht, ob die Transformation mit dem ScaI inaktiv linearisierten Vektor prep- LFH zur stabilen Integration der Reporterkassette führte. Hierzu wurden vier Transformanten für die Dauer von ca. 8 Generationen unter nicht-selektiven Bedingungen kultiviert. Wie in Tabelle 3.20 ersichtlich, konnten unter den getesteten Klonen dieser Kulturen keine Trp- Auxotrophen nachgewiesen werden. Tabelle 3.20: Stabilität der Transformanten mit integrierter Reporterkassette Anzahl Trpauxotropher Klone TRP- Anzahl Transformantenbezeichnunstamm Transformations- getesteter nach Kultivierung in Reversionsfrequenz Klone Vollmedium für 8 Generationen T119 ca < 1,5 x 10-4 P. stipitis PJH53 T126 ca < 1,5 x 10-4 his3-1 trp5-10 T223 ca < 1,4 x 10-4 P. stipitis PJH53 T79 his3-1 trp5-10 ca < 1,2 x 10-4 adh1::puc19/his3 Die Transformation wurde mit ScaI inaktiv linearisierten Vektor prep-lfh durchgeführt. Durch das zufällige Vorhandensein einer autonom replizierenden Sequenz (ARS) in prep- LFH könnte das Plasmid ohne Integration autonom in der Zelle existieren. Die mitotische Stabilität der Transformanten, das Ausbleiben von Transformanten bei der Transformation des zirkulären Plasmids prep-lfh (Abschnitt 3.5.4) sowie der Nachweis der Kassettenintegration durch Southern-Hybridisierungen (Abschnitt ) sprechen aber eindeutig gegen das Vorliegen eines autonomen Reporterplasmids. 80

81 3. Ergebnisse Untersuchungen zum Integrationsort der Konstrukte Nachweis des Integrationsorts der Reporterkassette mittels PCR Bei homologer Integration der ends-out Reporterkassette Rep-LFH sollte der Austausch des chromosomalen PsADH2-Gens gegen die in vitro durch das Reportergen disruptierte Kopie über ein zweifaches Crossover in den Homologieregionen stattfinden. Zum Nachweis dieses Ereignisses sollte ein 605 bp langes Fragment mit dem Primerpaar ScTRP5-5 hom / PsADH2-3 hom amplifiziert werden, welches von der ScTRP5-3 Region der Reporterkassette bis in die genomische 3 Region des PsADH2-Gens reicht. In Abbildung 3.20 ist die erwartete Konfiguration nach homologer Integration der Reporterkassette Rep-LFH dargestellt. Abbildung 3.21 zeigt stellvertretend die entsprechenden Nachweisamplifikate der Reporterstämme T79, T119, T126 und T223. SacI ClaI BamHI SphI ScTRP5-5 hom PsADH2-3 hom A B C chromosomale Regionen stromabwärts und stromaufwärts von PsADH2 PsADH2 5 Region der Reporterkassette A = 23 bp B = 522 bp C = 60 bp ScTRP5 Region der Reporterkassette PsADH2 3 Region der Reporterkassette Abbildung 3.20: Nachweis der homologen Integration von Rep-LFH mittels PCR; die homologe Integration der Reporterkassette wird durch die Amplifikation eines 605 bp langen Fragments mit dem Primerpaar ScTRP5-5 hom / PsADH2-3 hom, symbolisiert durch schwarze Pfeile, nachgewiesen. 81

82 3. Ergebnisse GS 5 kbp 0,6 Abbildung 3.21: Nachweis der homologen Integration der Reporterkassette Rep-LFH in den Reporterstämmen T79 (Spur 2), T119 (Spur 3), T126 (Spur 4) und T223 (Spur 5) mittels PCR; als Negativ-Kontrolle wurden ein DNA-Gemisch der untransformierten Elternstämme als Template mit den Nachweisprimern ScTRP5-5 hom / PsADH2-3 hom in die PCR eingesetzt (Spur 1); als Größenstandard diente EcoRI / HindIII-verdaute λ-dna (GS). Die Integrationseffizienz verschiedener Reporterkonstrukte wurde, wie oben beschrieben, untersucht und in Tabelle 3.21 zusammengefasst. Unter den Transformanten, bei denen die Amplifikation des 605 bp Fragments nicht möglich war, sollte die Möglichkeit der Amplifikation des ScTRP5-Strukturgens (Primerpaar ScTRP5-5 ORF / ScTRP5-3 ORF) einen Hinweis liefern, ob Teile der Kassette oder das ganze Konstrukt durch illegitime Integration ektopisch integriert war. Eine weitere Möglichkeit der Entstehung TRP-prototropher Transformanten ist die Konversion des Pstrp5-Gens durch ScTRP5. Genkonvertanten wurden bei der Amplifikation des offenen Leserahmens des ScTRP5-Gens eventuell miterfasst. Hinweise auf das Vorkommen von TRP5-Konvertanten lieferten die Ergebnisse der Southern- Hybridisierung (Abschnitt ). Die unterschiedlichen Derivate der Reporterkassette wurden demnach in bis zu 70 % der Transformanten sehr häufig homolog integriert. 82

83 3. Ergebnisse Tabelle 3.21: Integrationseffizienz verschiedener Reporterkonstrukte laut PCR-Analyse transformierte Anzahl Anzahl homologer Anzahl ektopischer Komponente untersuchter Integranten Integranten Transformanten (prozentualer Anteil) (prozentualer Anteil) psfpsadh1-bs- Rep1* (36%) n. u. Rep-LFH-Kassette# Rep-LFH-Kassette## mit blunt-ends (70%) 2 (10%) prep-lfh mit ScaI inaktiv linearisiert (54%) 34 (23%) Rep-LFH-Kassette + puc19 (###) (37%) 12 (32%) *: Es wurde die homologe Integration in das PsADH1-Gen untersucht; um die Reporterkassette Rep-LFH aus puc19 auszuschneiden wurde prep-lfh mit SphI und SacI verdaut und die Kassette dann aus einem Agarosegel eluiert (#) oder nach Inaktivierung der Restriktasen mit puc19 kotransformiert (###); nach Gelextraktion der mit SphI und SacI verdauten Reporterkassette Rep-LFH wurden die 3 Überhänge der sticky-ends mit dem Klenow- Fragment zu blunt-ends abgedaut (##); n. u.: nicht untersucht Bei drei der Integranten (T79, T119, T126), die durch Transformation mit dem ScaI inaktiv linearisierten Plasmid prep-lfh entstanden sind, wurde das 605 bp große Amplifikat sequenziert. Die Sequenzen der PCR-Produkte, die mit den Primern ScTRP5-5 hom und PsADH2-3 hom entstanden, wurden mit den in der EMBL-Datenbank verfügbaren Sequenzen verglichen. Die in Abbildung 3.20 dargestellte Konfiguration des Nachweis-Amplifikats bei homologer Integration konnte durch entsprechende Homologien der Sequenzen zu ScTRP5 (2452 bp bis 2471 bp) und PsADH2 (838 bp bis 1417 bp) nachgewiesen werden. Dennoch war es möglich, mit puc19 spezifischen Primern in Kombination mit Primern zum offenen Leserahmen des Reportergens Fragmente der erwarteten Größe zu amplifizieren. Mit dem Primerpaar pucuni / ScTRP5-3 ORF sollte ein 2605 bp großes und mit den Primern pucrev und ScTRP5-5 ORF ein 2642 bp großes Fragment entstehen. Zusätzlich wurden Primer verwendet (puc-rev / puc-uni), die jeweils zu puc19-sequenzen homolog sind und 20 bp vor den Homologieregionen von pucrev und pucuni liegen. Auf diese Weise wurden verschiedene Integranten untersucht (T79, T119, T126, T233). Eine Amplifikation der Fragmente war in jedem Fall möglich. Demnach wurden auch zur Kassette benachbarte Plasmidsequenzen integriert. Diese Ergebnisse deuteten auf einen illegitimen Rekombinationsvorgang hin und widersprachen den Daten der Sequenzierung des Nachweisamplifikats. In Abbildung 3.22 sieht man die mit den oben genannten Primerpaaren entstandenen PCR-Produkte. Stellvertretend werden hier nur die Ergebnisse, die die Integrante T79 lieferte, dargestellt. 83

84 3. Ergebnisse kbp 1 GS kbp ca. 2,64 ca. 2,6 1,0 0,5 Abbildung 3.22: Untersuchungen zur Integration von prep-lfh mit puc19 spezifischen Primern; in Bahn 1 und 6 wurde das Primerpaar pucuni / ScTRP5-3 ORF, in Bahn 2 und 4 pucrev / ScTRP5-5 ORF, in Bahn 3 puc-rev / ScTRP5-5 ORF und in Bahn 5 puc-uni / ScTRP5-3 ORF verwendet. In Bahn 1 und 2 diente P. stipitis CBS 5774-DNA als Template. In den Bahnen 3 bis 6 wurde DNA der Transformanten T79 in die PCR eingesetzt. Als Größenstandard diente die O RangeRuler 100 bp DNA-Leiter von MBI. Unter den laut PCR-Analyse als homologe Integranten ermittelten Transformanten wurde stichprobenartig untersucht, ob die Amplifikation eines 639 bp Fragments des PsADH2- Strukturgens möglich ist. Da bei homologer Integration der Reporterkassette der offene Leserahmen des PsADH2-Gens gegen den des ScTRP5-Gens ausgetauscht sein müsste, sollte dies nicht der Fall sein (Primer zur Amplifikation des 639 bp Fragments: PsADH2-5 ORF- BamHI / PsADH2-3 ORF-SacI). Bei den untersuchten Transformanten konnte dieses Fragment jedoch entgegen der Erwartung weiterhin amplifiziert werden. Daher wurden die so ermittelten homologen Integranten durch eine Southern-Hybridisierung mit Sonden homolog zum PsADH2-Promotor und zum ScTRP5-Gen näher untersucht. Wie in Abschnitt erläutert wird, stellte sich auch hier heraus, dass das PsADH2-Wildtypallel in allen untersuchten Integranten noch intakt vorlag. Weiterhin ließen die Größen, der mit den Sonden hybridisierenden Restriktionsfragmente mit einer Ausnahme nicht auf die Disruption einer zweiten PsADH2-Kopie schließen. Da es dennoch sehr häufig zur Bildung des 605 bp großen Amplifikats kam, wurden weitere PCR-Analysen durchgeführt, die Aufschluss über die Entstehungsmöglichkeiten falsch-positiver Nachweisamplifikate liefern sollten (Abschnitt ). 84

85 3. Ergebnisse Nachweis des Integrationsorts der Reporterkassette mittels Southern- Hybridisierung Da die PCR-Analysen zur Bestimmung des Integrationsorts der Reporterkassette zu widersprüchlichen Ergebnissen führten, wurden ergänzend Southern-Hybridisierungen mit einer PsADH2-Promotor-spezifischen Sonde (hergestellt mit Primerpaar PsADH2-5 SacI / PsADH2-3 ClaI) und anschließend mit einer ScTRP5-spezifischen Sonde (hergestellt mit Primerpaar ScTRP5-5 DIG / ScTRP5-3 DIG) durchgeführt. In Abbildung 3.17 sind die Erkennungssequenzen der zum DNA-Verdau verwendeten Enzyme in dem Vektor prep-lfh dargestellt. Bei homologer Integration des PsADH2::ScTRP5::PsADH2- Reporters (Rep-LFH) wird, wie in Abschnitt beschrieben, das PsADH2-Gen gegen die Reporterkassette ausgetauscht. Das auf diese Weise disruptierte ADH2-Gen sollte durch die Insertion des Reportergens um 1,46 kb verlängert sein. Bei der Verwendung von Restriktasen, die nicht im ScTRP5-Gen schneiden, hybridisieren die PsADH2-Sonde und die ScTRP5-Sonde an ein Restriktionsfragment, das um 1,46 kb größer ist als das Fragment, an das die PsADH2-Sonde im Wildtyp hybridisiert. Bei Verdopplung des ADH2-tragenden Chromosoms und Integration der Reporterkassette in eine der Kopien hybridisiert die PsADH2-Sonde mit dem ADH2-tragenden Wildtypfragment sowie mit einem um 1,46 kb größeren Fragment, mit dem auch die ScTRP5-Sonde hybridisiert. Die ektopische Integration der Reporterkassette führt dazu, dass die PsADH2-Sonde neben dem Wildtypfragment auch an ein Fragment unbestimmter Größe hybridisiert, zu dem auch die ScTRP5-Sonde homolog ist. Die Ursache für Fragmente, die nur mit der ScTRP5-Sonde hybridisieren, kann Genkonversion zwischen dem ScTRP5-Gen und dem Pstrp5-Gen sein. In den Abbildungen 3.23 bis 3.27 sind beispielhaft einige Autoradiogramme der Southern- Hybridisierungen dargestellt. Insgesamt wurden 121 Transformanten, in denen mittels PCR das ScTRP5-Strukturgen nachgewiesen werden konnte, und weitere 120 Transformanten, die nicht vorab auf das Vorhandensein des ScTRP5-Gens getestet wurden, in Hybridisierungsexperimenten eingesetzt. Zunächst wurden die Transformanten, die nach Integration des ScaI linearisierten Vektors prep-lfh entstanden sind, untersucht. In Abbildung 3.23 wurde der Reporterstamm P. stipitis T79, der aus einer Transformation in P. stipitis PJH53 his3-1 trp

86 3. Ergebnisse adh1::puc19/his3 resultierte, mit untransformierten Stämmen verglichen. Die DNA der Stämme wurde mit EcoRI verdaut. Im PsADH2-Gen befindet sich im offenen Leserahmen eine Erkennungssequenz für dieses Enzym (+303 bp bis +308 bp). Die PsADH2-Sonde hybridisiert an ein ca. 1,7 kb großes Fragment der Wildtyp-DNA. Die aus diesem Stamm konstruierten Stämme P. stipitis PJH53 his3-1 trp5-10 und P. stipitis PJH53 his3-1 trp5-10 adh1::puc19/his3 zeigen Hybridisierungssignale auf gleicher Höhe. Eine zu der ScTRP5- Sonde homologe Region war in diesen drei Stämmen autoradiographisch nicht nachweisbar, was die Spezifität der Sonde zum S. cerevisiae Tryptophansynthase-Gen belegt. Da die Integration der Reporterkassette laut PCR-Analyse mit benachbarten puc19-sequenzen erfolgte (Abschnitt ), sollte die Restriktion der integrierten Kassette mit EcoRI zu einem 1,3 kb großen Fragment führen, an welches die PsADH2-Sonde hybridisiert. Dieses Hybridisierungssignal zeigte, den Erwartungen entsprechend, nur der Reporterstamm. Dies belegt die illegitime Integration der die Kassette flankierenden puc19-sequenzen. Zusätzlich war das ADH2-Wildtyp-Hybridisierungssignal sichtbar, welches bei homologer Integration der Reporterkassette nicht entstehen kann. Durch die Restriktion mit EcoRI sollte die ScTRP5-Sonde an ein Fragment, das größer als 1,66 kb ist, hybridisieren, was mit einem Fragment zwischen 3,6 kb und 4,9 kb auch zutraf. 86

87 3. Ergebnisse GS kbp GS A B 8,57 4,9 3,6 2,8 1,95 1,5 1,16 Abbildung 3.23: Autoradiogramm einer Southern-Hybridisierung mit einer PsADH2- spezifischen Sonde (A) und einer ScTRP5-spezifischen Sonde (B) nach EcoRI-Verdau der Gesamt-DNA von P. stipitis CBS 5774 (1), P. stipitis PJH53 his3-1 trp5-10 (2), P. stipitis PJH53 his3-1 trp5-10 adh1::puc19/his3 (3) und P. stipitis T79 (4). Es wurde ein Digoxigenin-markierter Größenstandard (GS) verwendet (Nr. VII, Roche). Zusätzliche Southern-Hybridisierungen wurden nach Restriktionen mit PstI vorgenommen (Abbildung 3.24). PstI schneidet weder im PsADH2-Gen noch in der Reporterkassette. Die PsADH2-Sonde hybridisierte nach PstI-Verdau in allen untersuchten Stämmen an ein Fragment zwischen 3,6 kb und 4,9 kb Größe. Demnach ist das intakte ADH2-Gen in allen Stämmen vorhanden. Weitere Hybridisierungssignale sind bei den mit dem ScaI linearisierten Vektor prep-lfh transformierten Stämmen sichtbar. Die Sonde hybridisierte zusätzlich an PstI-Fragmente, die über 8, 57 kb groß sind. Die Hybridisierung der ScTRP5-Sonde führte zu Signalen mit Fragmenten gleicher Länge, was zeigt, dass sich die Reporterkassette auf diesen Fragmenten befand. In P. stipitis T79 ist die Reporterkassette demnach ektopisch integriert. 87

88 3. Ergebnisse GS GS 7 8 kbp A 8,57 4,9 3,6 B 8,57 4,9 3,6 Abbildung 3.24: Autoradiogramm einer Southern-Hybridisierung mit einer PsADH2- spezifischen Sonde (A) und einer ScTRP5-spezifischen Sonde (B) nach PstI- Verdau der Gesamt-DNA von P. stipitis CBS 5774 (4), P. stipitis PJH53 his3-1 trp5-10 adh1::puc19/his3 (5), P. stipitis T79 (6) und weiteren Transformanten, die nach der Transformation von ScaI inaktiv restringiertem prep-lfh entstanden sind (1 bis 3). Es wurde ein Digoxigenin-markierter Größenstandard (GS) verwendet (Nr. VII, Roche). In Spur 7 wurde als Positiv-Kontrolle das zirkuläre Plasmid prep-lfh aufgetrennt, in Spur 8 als Negativ-Kontrolle der Hybridisierung puc19. Weitere 120 Transformanten, die nicht vorab mittels PCR auf das Vorhandensein des ScTRP5-Gens getestet wurden, wurden in Gruppen von je 20 Transformanten vereinigt und nach DNA-Isolation mit SacI verdaut (Abbildung 3.25). Die Restriktion mit SacI führte im Wildtyp (Spur 1) zu einem 1955 bp großen PsADH2-Fragment, welches in allen untersuchten Stämmen mit der PsADH2-Sonde hybridisierte. Bei P. stipitis T79 hybridisierte zusätzlich ein ca. 9 kb großes Fragment, welches ebenfalls mit der ScTRP5-Sonde hybridisiert. Vorhergehende Untersuchungen (Abschnitt 3.5.4) zeigten, dass der ScaI linearisierte Vektor bei ca. 77% der Kolonien, die nach der Transformation auf Tryptophanmangelmedium wachsen konnten, integriert wurde. Daher war je Gruppen mit ungefähr 15 Integranten zu 88

89 3. Ergebnisse rechnen. Jedoch hybridisierten in den einzelnen Gruppen nur 2 bis 3 Fragmente mit Größen über 4,9 kb mit der PsADH2-Sonde. Es scheint demnach bevorzugte Integrationsorte für die Reporterkassette zu geben. Dafür sprachen auch die unterschiedlichen Intensitäten der Hybridisierungssignale. Beim Vergleich der Autoradiogramme der ScTRP5-Sonde mit denen der PsADH2-Sonde fällt auf, dass die ScTRP5-Sonde zu mehr Hybridisierungssignalen führte. Es kommt also nicht immer zur vollständigen Integration der Kassette, bzw. es findet Genkonversion zwischen ScTRP5 und Pstrp5 statt, was ebenfalls zu Tryptophan-prototrophen Transformanten führt. Da kein 3416 bp langes Restriktionsfragment (1955 bp bp) mit der ADH2-spezifischen Sonde zu Hybridisierungssignalen führte, befand sich unter den 120 untersuchten Tryptophan-Prototrophen keine homologe Integrante. Neben den in Abbildung 3.23 und 3.24 gezeigten wurden weitere 76 Transformanten, die durch die Transformation des ScaI-linearisierten Vektors prep-lfh entstanden und in denen mittels PCR das ScTRP5- Strukturgen nachgewiesen werden konnte, in Southern-Hybridisierungen untersucht. Jedoch handelte es sich auch hier ausschließlich um ektopische Integranten. 89

90 3. Ergebnisse GS GS kbp A A 8,57 6,1 4,9 3,6 1,95 B B 8,57 6,1 4,9 3,6 Abbildung 3.25: Southern-Hybridisierung mit einer PsADH2-spezifischen Sonde (A) und einer ScTRP5-spezifischen Sonde (B) nach SacI-Verdau der Gesamt-DNA von P. stipitis T79 (1), P. stipitis CBS 5774 (2), P. stipitis PJH53 his3-1 trp5-10 (3) und DNA-Pools zu 20 Transformanten, die nach der Transformation von ScaI inaktiv restringiertem prep-lfh entstanden sind. Es wurde ein Digoxigenin-markierter Größenstandard (GS) verwendet (Nr. VII, Roche). In Spur 10 wurde als Negativ-Kontrolle puc19 und in Spur 11 als Positiv- Kontrolle das zirkuläre Plasmid prep-lfh aufgetrennt. 90

91 3. Ergebnisse Neben der Transformation der von puc19-sequenzen eingerahmten Reporterkassette führte auch die Transformation des SacI und SphI restringierten Vektors prep-lfh zu einer höheren Transformantenrate. In diesen Ansätzen wurden die Restriktasen vor der Transformation inaktiviert und der puc19-anteil des Plasmids mit der Kassette kotransformiert. Die folgende Abbildung 3.26 zeigt ein Autoradiogramm von SacI restringierter DNA dieser Transformanten. Insgesamt wurden 14 der untersuchten Transformanten mittels PCR als homologe Integranten identifiziert und in Southern-Hybridisierungen eingesetzt. Es wurden stellvertretend 7 Transformanten mit dem Wildtyp-Stamm verglichen. Das hybridisierende 1955 bp große PsADH2-Wildtyp-Fragment war auch bei der Kotransformation des ends-out- Vektors mit puc19-dna bei allen untersuchten Transformanten sichtbar. Eine homologe Integration der Kassette war daher auszuschließen. Die PsADH2-Sonde sowie die ScTRP5- Sonde hybridisierten genau wie bei den Transformanten des ScaI-linearisierten Plasmids mit mindestens einem zusätzlichen Fragment, das häufig über 8,57 kb groß war. Die in Spur 9 aufgetragene Transformanten-DNA zeigt ein Hybridisierungssignal der Fragmentgröße von ca. 3,4 kb. Dieses Signal würde erwartet, wenn eine homologe Integration der Reporterkassette stattgefunden hat. Bei dieser Transformante könnte es demnach zur Verdopplung des ADH2-Gens gekommen sein. Die ektopische Integration der Kassette scheint jedoch bevorzugt stattzufinden. Die Transformation des ends-out-vektors ohne puc19-sequenzen führte nur nach Abdauen der durch die Restriktion mit SphI und SacI entstandenen klebrigen Enden mit Hilfe des Klenow-Fragments zu Transformanten. Wiederum wurden die laut PCR-Analyse als homologe Integranten geltenden Transformanten nach SacI-Verdau ihrer DNA mit der PsADH2- und der ScTRP5-Sonde hybridisiert. Abbildung 3.27 zeigt stellvertretend die Autoradiographien dreier Transformanten, die mit der von P. stipitis T79 identisch waren. Unter den untersuchten Transformanten kam es zur ektopischen Integration der Reporterkassette in eine bevorzugte chromosomale Region, jedoch nicht zu Mehrfachintegrationen. 91

92 3. Ergebnisse 1 GS GS kbp A 8,57 4,9 3,6 2,8 1,95 B 8,57 4,9 3,6 Abbildung 3.26: Southern-Hybridisierung mit einer PsADH2-spezifischen Sonde (A) und einer ScTRP5-spezifischen Sonde (B) nach SacI-Verdau der Gesamt-DNA von P. stipitis CBS 5774 (2) und von verschiedenen Integranten, die nach der Transformation von Rep-LFH zusammen mit puc19-dna entstanden sind (3-9). Es wurde ein Digoxigenin-markierter Größenstandard (GS) verwendet (Nr. VII, Roche). In Spur 1 wurde als Positiv-Kontrolle das zirkuläre Plasmid prep-lfh aufgetrennt. 92

93 3. Ergebnisse A GS 6 kbp 7 8 8,57 4,9 3,6 1,95 B 8,57 4,9 3,6 Abbildung 3.27: Southern-Hybridisierung mit einer PsADH2-spezifischen Sonde (A) und einer ScTRP5-spezifischen Sonde (B) nach SacI-Verdau der Gesamt-DNA von P. stipitis T79 (6) und verschiedener Integranten, die nach der Transformation von Rep-LFH mit blunt-ends entstanden sind (1, 2, 3). Als Positivkontrolle diente das zirkuläre Plasmid prep-lfh (5), als Negativkontrolle puc19 (4). Es wurde ein Digoxigenin-markierter Größenstandard (GS) verwendet (Nr. VII, Roche). 93

94 3. Ergebnisse Untersuchungen zur Entstehung falsch-positiver Amplifikate beim Nachweis der homologen Integration der Disruptionskassette Die in Abschnitt geschilderte Methode zum Nachweis der homologen Integration der Reporterkassette führte zur Fehlinterpretation der Transformationsdaten. Daher wurden die Bedingungen untersucht, die zur Bildung falsch-positiver Amplifikate führen bzw. sie begünstigen. In einem ersten Versuch wurde eine PCR durchgeführt, in der entweder nur Wildtyp-DNA (P. stipitis CBS 5774), nur prep-lfh-dna oder ein Gemisch aus beiden als Template zusammen mit den Nachweisprimern ScTRP5-5 hom / PsADH2-3 hom eingesetzt wurden. Die gelelektrophoretische Auftrennung der PCR-Produkte ist in Abbildung 3.28 dargestellt. Weder mit Wildtyp-DNA noch mit prep-lfh-dna kam es zur Amplifikation des 605 bp Fragments, da hier für jeweils einen der Primer keine Homologiesequenz zur Anlagerung vorhanden war. Das Vorliegen von prep-lfh in der Zelle als autonomes Plasmid wurde in vitro durch das Mischen der Templates simuliert. DNA einer Transformanten, bei der mit Hilfe der Southern-Hybridisierung die ektopische Integration der Reporterkassette nachgewiesen werden konnte, wurde ebenfalls als Template verwendet. Bei diesen Ansätzen wurde das Nachweisamplifikat jedoch gebildet. Die Produkte, die durch die Elongation beider Primer während des ersten Amplifikationszyklus entstehen, können sich durch komplementäre Basenpaarung der PsADH2-3 Region der Reporterkassette aneinander lagern. Wird die Elongation beider Primer durch einen Kettenabbruch unmittelbar hinter dem Homologiebereich beendet, entstehen freie 3 OH-Enden, die dann komplementär zu den nicht-homologen 5 Regionen des erwarteten Produkts verlängert werden. So sind die Voraussetzungen für die exponentielle Vermehrung des Nachweisamplifikats gegeben. Mit diesem Experiment konnte gezeigt werden, dass das Nachweisamplifikat nicht nur bei homologer Integration der Reporterkassette, sondern auch bei ektopischer Integration und beim Vorliegen der Disruptionskassette als autonomes Plasmid entstehen kann. 94

95 3. Ergebnisse GS 4 5 kbp 0,6 Abbildung 3.28: Entstehung falsch-positiver PCR-Produkte mit dem Primerpaar ScTRP5-5 hom / PsADH2-3 hom; in die PCR-Reaktion wurden folgende Templates eingesetzt: DNA einer ektopischen Integranten (1); 10 ng des Reporterplasmids prep-lfh (2); 50 ng des Reporterplasmids prep-lfh + P. stipitis CBS 5774-DNA (3); P. stipitis CBS 5774-DNA (4); 10 ng des Reporterplasmids prep-lfh + P. stipitis CBS 5774-DNA (5); als Größenstandard (GS) diente die O RangeRuler 200 bp DNA Leiter von MBI. In einem weiteren Versuch wurde der Einfluss der Anzahl der Amplifikationszyklen während der PCR auf die Bildung des Nachweisamplifikats untersucht. Die DNA von jeweils 10 der laut PCR-Analyse als homologe Integranten geltenden Transformanten wurde vereinigt und als Template-DNA zusammen mit dem Primerpaar ScTRP5-5 hom / PsADH2-3 hom bzw. mit dem Primerpaar ScTRP5-5 ORF / ScTRP5-3 ORF in die PCR eingesetzt. Die Reaktion wurde mit 20, 25 und 40 Amplifikationszyklen durchgeführt. In Abbildung 3.29 sieht man, dass 20 Amplifikationszyklen für die Bildung einer ausreichenden Menge des Strukturgens von ScTRP5 genügen. Das Nachweisamplifikat entsteht hingegen erst nach 40 Zyklen. Mit zunehmender Zahl an Amplifikationszyklen nimmt die Wahrscheinlichkeit zu, dass beide Primer zu DNA-Molekülen verlängert werden, die nicht über die gemeinsame Homologieregion hinausreichen. 95

96 3. Ergebnisse kbp GS GS GS A A 2,0 kbp 1 GS GS B 2,0 0,6 Abbildung 3.29: Einfluss der Anzahl der Amplifikationszyklen auf die Entstehung falschpositiver PCR-Produkte; Abbildung A zeigt die gelelektrophoretische Auftrennung der PCR- Ansätze mit 20 Amplifikationszyklen. In den Bahnen 1 bis 14 wurde das Primerpaar ScTRP5-5 ORF / ScTRP5-3 ORF verwendet. In den Bahnen 15 bis 28 sieht man die gleichen Ansätze mit dem Primerpaar ScTRP5-5 hom / PsADH2-3 hom. In Abbildung B werden die Ergebnisse nach 40 Amplifikationszyklen dargestellt. In Bahn 1 wurde das ScTRP5-Strukturgen amplifiziert, in den Bahnen 2 bis 15 konnte mit dem Primerpaar ScTRP5-5 hom / PsADH2-3 hom das Amplifikat, das die homologe Integration der Kassette nachweisen sollte, gebildet werden. Als Größenstandard (GS) diente die Hyperladder I von Bioline. 96

97 3. Ergebnisse Untersuchungen zum DNA-Gehalt des Reporterstamms Dieser Arbeit vorausgehende Untersuchungen zeigten, dass der Gesamt-DNA-Gehalt des Wildtypstamms P. stipitis CBS 5774 von ca. 20,4 fg pro Zelle im Größenbereich der haploiden Referenzstämme S. cerevisiae 41α (21,3 fg) und S. pombe M216h + (21,1 fg) liegt (Schruff, 1999). Ausgehend von der Annahme, dass bei diesen Hefen ungefähr gleiche Genomgrößen vorliegen, scheint es sich bei P. stipitis CBS 5774 um einen haploiden Stamm zu handeln. Untersuchungen bezüglich der Mutagenisierbarkeit dieses Stamms durch UV- Bestrahlung sprechen ebenfalls für das Vorkommen eines Chromosomensatzes (Melake et al., 1996). Dennoch konnte nach Integration der Reporterkassette in den Transformationsstamm bei allen untersuchten Transformanten das intakte PsADH2-Strukturgen nachgewiesen werden. Neben einer ektopischen Integration der Reporterkassette könnte dieses Ergebnis auch durch eine Diploidisierung des transformierten Stamms oder durch die Verdopplung des ADH2-Gens erklärt werden, da dann nach homologer Integration ebenfalls eine intakte Kopie des Gens vorliegen würde. Die Bestimmung des DNA-Gehalts sollte Aufschluss über den Ploidiegrad des Reporterstamms P. stipitis T79 geben Bestimmung des DNA-Gehalts pro Zelle Der DNA-Gehalt pro Zelle wurde mit der Diphenylamin-Methode (Burton, 1956) nach Extraktion löslicher Nukleotide (Herbert et al., 1971) bestimmt. Es wurden der Transformationsstamm P. stipitis CBS 5774 PJH53 his3-1 trp5-10, P. stipitis CBS 5774 PJH53 his3-1 trp5-10 adh1::his3 sowie der daraus hervorgegangene Reporterstamm P. stipitis T79 untersucht. Da über den Anteil mitochondrialer DNA am Gesamt-DNA-Gehalt pro Zelle bei P. stipitis bisher keine Angaben vorliegen, wurde er hier außer Acht gelassen. Abbildung 3.30 zeigt die DNA-Gehalte pro Zelle, die bei drei Messungen je Hefestamm ermittelt wurden. Jeder Einzelmesswert repräsentiert wiederum den Mittelwert aus drei Parallelansätzen. 97

98 3. Ergebnisse 30 27, ,4 25,1 23,4 25,4 21,9 21,5 24,8 fg DNA pro Zelle ,6 17,4 17,7 18,5 5 0 Messung 1 Messung 2 Messung 3 Mittelwerte schwarz: grau: weiss: P. stipitis CBS 5774 PJH53 his3-1 trp5-10 P. stipitis CBS5774 PJH53 his3-1 trp5-10 adh1::his3 P. stipitis T79 Abbildung 3.30: DNA-Gehalte pro Zelle Der durchschnittliche DNA-Gehalt pro Zelle von P. stipitis T79 lag bei 24,8 fg mit einer Standardabweichung von +/- 2,25 fg. Für P. stipitis CBS 5774 PJH53 his3-1 trp5-10 wurden DNA-Gehalte von 18,5 fg +/- 3,67 fg und für P. stipitis CBS 5774 PJH53 his3-1 trp5-10 adh1::his3 von 21,5 fg +/- 3,14 fg ermittelt. Betrachtet man die Standardabweichungen der 3 Einzelmessungen, können Messungenauigkeiten für die abweichenden DNA-Gehalte der drei Stämme verantwortlich sein. Auffallend ist jedoch, dass der DNA-Gehalt von P. stipitis T79 in allen drei Experimenten über dem der beiden anderen Stämme liegt. Im Vergleich mit dem für den Wildtypstamm P. stipitis CBS 5774 nach Burton bestimmten DNA-Gehalt von ca. 20,4 fg scheint es jedoch nicht zur Diploidisierung des Reporterstamms oder der zu seiner Konstruktion verwendeten Ausgangsstämme gekommen zu sein. Allerdings ist eine Hyperploidisierung mit disomem Vorkommen des ADH2-tragenden Chromosoms nicht auszuschließen. 98

99 3. Ergebnisse Zytometrische Bestimmung des DNA-Gehalts Zur Bestimmung der Ploidiestufe des Reporterstamms wurde die DNA der Stämme P. stipitis CBS 5774, P. stipitis CBS 5774 PJH53 his3-1 trp5-10, P. stipitis CBS 5774 PJH53 his3-1 trp5-10 adh1::his3 und P. stipitis T79 mit dem interkalierenden Fluorochrom Propidiumjodid angefärbt und durchflusszytometrisch untersucht. Die Abbildung 3.31 bis 3.34 zeigen die Messergebnisse in Histogrammdarstellung. Erläuterungen hierzu befinden sich in Abschnitt Zellzahl Signalintensität Abbildung 3.31: Durchflusszytometrische Ergebnisse von P. stipitis CBS 5774 Zellzahl Signalintensität Abbildung 3.32: Durchflusszytometrische Ergebnisse von P. stipitis CBS 5774 PJH53 his3-1 trp

100 3. Ergebnisse Zellzahl Signalintensität Abbildung 3.33: Durchflusszytometrische Ergebnisse von P. stipitis CBS 5774 PJH53 his3-1 trp5-10 adh1::his3 Zellzahl Signalintensität Abbildung 3.34: Durchflusszytometrische Ergebnisse von P. stipitis T79 100

101 3. Ergebnisse In Tabelle 3.22 sind die Ergebnisse der durchgeführten zytometrischen Untersuchungen zusammengefasst. Messergebnisse, die aus unterschiedlichen Färbereaktionen resultieren, werden separat genannt (1. Messung / 2. Messung). Der DNA-Gehalt, der pro Zelle angegeben wird, wurde mit Hilfe des mit der Diphenylamin-Methode (Burton, 1956) ermittelten DNA-Gehalts des Wildtypstamms P. stipitis CBS 5774 und der gemessenen Signalintensitäten der G 0 -/G 1 -Phase Zellen errechnet. Um Aussagen über die Genomgrößen der Hefen im Vergleich zum Wildtypstamm treffen zu können, wurde der Quotient der Signalintensität der G 0 -/G 1 -Phase Zellen des jeweiligen Stamms und der Signalintensität der G 0 -/G 1 -Phase Zellen von P. stipitis CBS 5774 ermittelt. Dieser Quotient wird in Tabelle 3.22 als DNA-Index aufgeführt. Tabelle 3.22: DNA-Gehalte durchflusszytometrisch untersuchter Stämme Stamm Signalintensität DNA-Gehalt der G 0 -/G 1 -Phase pro Zelle Zellen in fg 1. Messung / 2. Messung DNA-Index P. stipitis CBS / 80 20,4 1 P. stipitis CBS 5774 PJH53 his3-1 trp / 79 20,4 / 20,1 1 / 0,99 P. stipitis CBS 5774 PJH53 his3-1 trp5-10 adh1::his3 87 / 90 22,2 / 22,95 1,09 / 1,1 P. stipitis T / ,1 / 28,6 1,38 / 1,4 Geht man davon aus, dass es sich bei P. stipitis CBS 5774 um einen haploiden Stamm handelt, so spricht der errechnete DNA-Index von ca. 1 bei P. stipitis CBS 5774 PJH53 his3-1 trp5-10 ebenfalls für einen haploiden Status. Der DNA-Index von P. stipitis CBS 5774 PJH53 his3-1 trp5-10 adh1::his3, der bei ca. 1,1 liegt, könnte auf einen aneuploiden Chromosomensatz hinweisen. Da aber die nach unterschiedlichen Färbereaktionen gemessenen Signalintensitäten der Stämme, mit Ausnahme des Wildtyps, geringfügig voneinander abweichen, könnte die erhöhte Signalintensität auch durch Messungenauigkeiten zustande gekommen sein. Für den Reporterstamm P. stipitis T79 wurde eine ca. 1,39 fache Genomgröße des Wildtypstamms mit den gemessenen Signalintensitäten errechnet, so dass hier das Vorliegen eines hyperploiden Chromosomenstatus möglich ist. Das Vorkommen einer weiteren Kopie des PsADH2-Gens ist im Reporterstamm demnach denkbar. 101

102 3. Ergebnisse 3.7 Vergleich der Transformationseffizienzen und Integrationsart verschiedener Derivate der integrativen Plasmide prep-lfh und pbspshis3 Zur Überprüfung, ob die durch die Transformation von verschiedenen Derivaten des Vektors prep-lfh gewonnenen Erkenntnisse auch auf die Transformation anderer Plasmide übertragbar sind, und ob eventuell ein einheitlicher Integrationsmechanismus transformierter DNA in P. stipitis ableitbar ist, wurde ein weiterer Vektor unter gleichen Bedingungen wie prep-lfh transformiert. Zur Vereinfachung wurde auf die Konstruktion eines weiteren endsout Plasmids und auf die Verwendung der revertierenden trp-marke zur Selektion von Transformanten verzichtet. Stattdessen wurde der für die REMI-Mutagenese hergestellte Vektor pbspshis3 verwendet Transformation des Vektors pbspshis3 Die Transformationseffizienz verschiedener pbspshis3-derivate wurde in Tabelle 3.23 dargestellt. Es wurden jeweils 1 µg DNA und 4 x 10 8 Zellen des Stamms P. stipitis PJH53 his3-1 trp5-10 in die Transformation eingesetzt. Die höchste Transformantenausbeute wurde mit dem autonomen Vektor pjh-s-1 (Hagedorn, 1990), der die Schwanniomyces occidentalis ARS1-Region trägt, erreicht. Das Plasmid mit dem wirtseigenen HIS3-Gen als Selektionsmarker transformierte 5000 Zellen pro Ansatz, entsprechend einer Transformationseffizienz von 1,25 x Hingegen wurden mit dem autonomen Plasmid pbssw-rep (Abschnitt 3.5.2), bei dem der Selektionsmarker ScTRP5 unter die Kontrolle des PsADH2-Promotors gebracht wurde, ca. 300 Transformanten erzielt. Die Vektoren unterschieden sich kaum in ihrer Größe (7,2 kb gegenüber 7,7 kb). Auch Einflüsse von den übrigen Vektorsequenzen waren auszuschließen, da sie bis auf die Selektionsmarker identisch sind. Daher kann die bessere Transformationseffizienz von pjh-s-1 vermutlich dadurch erklärt werden, dass hier auf ein P. stipitis homologes Gen selektiert wurde. Eine ineffiziente Expression des ScTRP5-Gens in P. stipitis könnte zur Folge haben, dass der Gendefekt erst bei höherer Kopiezahl der Vektoren komplementiert werden kann. Bei der Transformation des zirkulären, integrativen Plasmids pbspshis3 entstanden auf Selektivmedium keine His-prototrophen Kolonien. Die Transformationseffizienz lag, genau wie bei prep-lfh, unter 4 x Unter den gewählten Transformationsbedingungen konnte weder die Integration der zirkulären Plasmide noch Genkonversion, die zur Komplementation der entsprechenden Auxotrophien führen kann, beobachtet werden. Für die Integration zirkulärer DNA steht den Zellen vermutlich kein effektiver Mechanismus zur Verfügung. Die Restriktion von pbspshis3 mit dem blunt-end schneidenden Enzym ScaI führte zu einer Vektorkonfiguration, in der das HIS3-Gen auf einer Seite von einer ca. 500 bp langen und auf der anderen Seite von einer ca. 1 kb langen puc19-sequenz flankiert ist. Die Transformation 102

103 3. Ergebnisse dieses Substrats führte durchschnittlich zu 3750 Transformanten. Ähnlich hohe Ausbeuten entstanden auch bei der Transformation des ScaI verdauten Plasmids prep-lfh. In einem weiteren Ansatz wurde das PsHIS3-Fragment aus pbspshis3 mit Hilfe der Restriktase EcoRI ausgeschnitten und mit dem kompatiblen puc19-ecori-fragment kotransformiert. Auch hier führte die Anwesenheit der zu P. stipitis nicht homologen puc19- DNA zu einer deutlichen Steigerung der Transformationseffizienz, die aber im Vergleich zu der des ScaI-linearisierten pbspshis3-plasmids um ca. 50 % reduziert war. Diese Abnahme der Transformanten wurde auch im entsprechenden Ansatz mit dem Vektor prep-lfh beobachtet. Bei der Transformation des 2,8 kb großen EcoRI-Fragments des Vektors pbspshis3, auf welchem das HIS3-Gen lokalisiert ist, entstanden im Durchschnitt 2,5 His-prototrophe Transformanten. Die Transformantenrate von 6,25 x 10-9 liegt im Größenbereich der Rate, die mit der SphI / SacI-verdauten Reporterkassette erzielt wurde und die unter 4 x 10-8 lag. Zur Überprüfung der Transformationsausbeute mit blunt-end Derivaten des Plasmids pbspshis3 wurden weitere Transformationen mit PsHIS3-PCR-Produkten durchgeführt. Das 2,8 kb PsHIS3-tragende Fragment wurde mit dem Primerpaar pucrev / pucuni und pbspshis3 als Template amplifiziert. Nach der Sequenzierung des 2,8 kb-fragments ließ sich das PsHIS3-Gen auf einer 1,64 kb großen Sequenz vermuten (Abschnitt 3.1.2). Daher wurde diese Region ebenfalls mittels PCR vervielfältigt (Primerpaar PsHIS3-5 / PsHIS3-3 ). Das kürzere PsHIS3-Amplifikat transformierte mit einer Transformantenrate von 8,5 x 10-6 ungefähr so viele Zellen wie der ScaI-linearisierte Vektor pbspshis3, wohingegen das 2,8 kb große Amplifikat nur zu ca. 1/6 dieser Ausbeute führte. Die Transformantenrate betrug hier 1,5 x Im Vergleich hierzu lag die Transformationseffizienz der 3,5 kb großen Reporterkassette Rep-LFH mit glatten Enden bei 5,7 x Zunächst läßt sich feststellen, dass die Transformation von Sequenzen ohne sticky-ends die Transformantenanzahl deutlich erhöht. Es muss jedoch beachtet werden, dass die PsHIS3-Amplifikate mit einer Taq-DNA- Polymerase hergestellt wurden. Dieses Enzym hinterlässt an seinen Reaktionsprodukten Überhänge von einzelnen 3 -da-nukleotiden (Clarke, 1988). Das Anhängen eines Adenosintriphosphats an das 3 Ende scheint aber die Integrationsfrequenz nicht negativ zu beeinflussen. Von diesen Ergebnissen läßt sich weiterhin ableiten, dass mit zunehmender Größe der transformierten DNA die Transformantenausbeute reduziert wird. 103

104 3. Ergebnisse Tabelle 3.23: Transformation verschiedener pbspshis3- Derivate bzw. des Vektors pjh-s-1 in P. stipitis PJH53 his3-1 trp5-10 transformierte Komponente Anzahl His-prototropher Mittelwert KBE / µg DNA pbspshis3 0 / 0 0 pbspshis3 mit ScaI linearisiert 3000 / PsHIS3 # 5 / 0 2,5 PsHIS3 # + puc / ,5 1,64 kb PsHIS3- Amplifikat ## 3000 / ,5 2,8 kb PsHIS3- Amplifikat ### 490 / ,5 pjh-s / n.u. - H 2 O 0 / 0 0 Die durch Schrägstriche getrennten Daten zeigen Ergebnisse unterschiedlicher Transformationen; um PsHIS3 aus puc19 auszuschneiden wurde pbspshis3 mit EcoRI verdaut; das PsHIS3 tragende 2,8 kb Fragment wurde dann aus einem Agarosegel eluiert(#); bei der Transformation mit puc19 wurde EcoRI nach der Restriktion von pbspshis3 inaktiviert, die resultierenden Fragmente wurden jedoch nicht durch eine Gelextraktion aufgereinigt; das 1,64 kb PsHIS3- Fragment wurde mit Hilfe einer PCR mit dem Primerpaar PsHIS3-5 -ClaI / PsHIS3-3 -EcoRI hergestellt (##); das 2,8 kb PsHIS3- Fragment wurde mittels PCR mit dem Primerpaar pucrev / pucuni hergestellt (###); n. u.: nicht untersucht 104

105 3. Ergebnisse Bestimmung des Integrationsorts des 1,64 kb PsHIS3-Amplifikats mittels Southern-Hybridisierung Bei Untersuchungen zum Integrationsort verschiedener Derivate der Reporterkassette Rep- LFH wurden keine homologen Integranten gefunden (Abschnitt 3.6.2). Entsprechende Untersuchungen wurden mit fünf der HIS-prototrophen Kolonien, die nach der Transformation des 1,64 kb großen PsHIS3-Amplifikats entstanden sind, durchgeführt. Die DNA der Transformanten sowie des Wildtypstamms P. stipitis CBS 5774 wurde mit XbaI vollständig restringiert. Die Hybridisierung wurde unter stringenten Bedingungen mit einer PsHIS3-homologen Sonde (Primerpaar zur Sondenamplifikation: PsHIS3-5 DIG / PsHIS3-3 DIG) durchgeführt. Abbildung 3.35 zeigt das Autoradiogramm des Southern-Blots. In Spur 6 wurde die Wildtyp-DNA aufgetrennt. Die Sonde hybridisiert an ein 1,6 kb großes Fragment des XbaI-Verdaus. Eine Restriktionskartierung des Vektors pjh-s-1 (Hagedorn, 1990) zeigte, dass XbaI-Erkennungssequenzen ein entsprechend großes Fragment des PsHIS3-Gens einrahmen. Da keine weiteren Hybridisierungssignale auftraten, ist die Spezifität der Sonde belegt. kbp GS GS 6 8,6 3,6 2,8 1,9 1,5 Abbildung 3.35: Southern-Hybridisierung mit einer PsHIS3-spezifischen Sonde nach XbaI- Verdau der Gesamt-DNA von P. stipitis CBS 5774 (6) und verschiedener HIS-Prototropher, die nach Transformation des 1,64 kb großen PsHIS-Amplifikats (1 bis 5) entstanden sind. Es wurde ein Digoxigenin-markierter Größenstandard (GS) verwendet (Nr. VII, Roche). 105