Labor UntersuchungsauJrag und BefundmiMeilung. Virologische Diagnos4k. Eingangsfragen

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1 Virologische Diagnos4k Labor UntersuchungsauJrag und BefundmiMeilung Prof. Dr. Chris4an Jassoy Ins4tut für Virologie Medizinische Fakultät Universität Leipzig? Probe plus AuJragsformular (Kodierung) Befundbericht (Kodierung) Eingangsfragen Indika4onen: Wann gebe ich virologische Diagnos4k in AuJrag? Wann gebe ich virologische Diagnos4k in AuJrag? Welches Material und welche Informa4on sende ich ein? Was geschieht im virologischen Labor? Wie hilj mir/dem Pa4enten der Befund weiter? Klärung von klinischen Differenzialdiagnosen > Therapie > Hygienemaßnahmen > Diagnoseabschluss > Au]lärung/Prognose Ausschluss von bes4mmten Virusinfek4on Rötelninfek4on bei Schwangeren? Blut eines Spenders potenziell infek4ös? Klärung der Immunitätslage Bei Kinderwunsch: Besteht Immunschutz gegen Röteln? Vor Famulatur: Ist Hepa44s B Impfung erforderlich? Verlauf und Therapiekontrolle HIV Infek4on: Soll Therapie eingeleitet werden? 1

2 Indika4onen: Wann gebe ich eher keine virologische Diagnos4k in AuJrag? ProzesskeMe der virologischen Labordiagnos4k banaler, selbst limi4erender Infekt (z. B. Atemwege, gastrointes4nal) Untersuchungs aujrag Proben gewinnung Transport Präanaly4k Diagnos4k hat keine therapeu4schen Konsequenzen oder Hygienemaßnahmen zur Folge Kosten sind unverhältnismäßig hoch Arbeitsplatz Listen (Eingangs Labor) Testungen Technische Validierung Analy4k Diagnose ist klinisch eindeu4g (Bsp.: Windpocken, Gürtelrose) häufig: Kombina4on mehrerer Faktoren, Einzelfallentscheidungen Zusammen führung der Ergebnisse Medizinische Validierung Freigabe Befund übermimlung Postanaly4k Nach Oeding et al. in B. Neumeister et al. Mikrobiologische Diagnos4k, G. Thieme Verlag StuMgart 2009 Untersuchungs aujrag Der virologische UntersuchungsauJrag Universitätsklinikum Leipzig Institut für Virologie gangsdatum Auftragsnumm Univ.-Prof. Dr. med. U. G. liebert Johannisallee 30, Leipzig Eingangslabor Tel: (0341) , FAX Befundinterpretation Tel: (0341) , Ärztl. Rufbereitschaft Tel: PATIENT (ggfs. Etikett mit Barcode) Antrag auf virologische Untersuchung Name, Vorname.. Geburtsdatum. Anschrift. Kassen-Nummer. Versicherten-Nr. EINSENDER (Stempel und Arztunterschrift) r A ;7 stel"1p Jr1 IJ 1t r"chr Anforderungs-Nr. o rivat 0 Ärztl. Wahlleistun FAX f. Befundübermittlung... f,,, r1er tlket t Untersuchungsmaterial Entnahme-Datum: 0 Notfall o Serum 0 Liquor 0 Fetal-/Nabelschnurblut 0 Stuhl o BAL 0 Trachealsekret 0 Nasenabstrich 0 Rachenabstrich 0 Abstrich (Lokalisation: ) o Biopsie 0 Abklatschpräparat (z.b. Celluloseacetatfolie) 0 Sonstiges.. Klinische Angaben (unvollständige Angaben verzögern u.u. eine optimale Bearbeitung) Verdachtsdiagnose/aktuelle Symptomatik, Immunsuppression, Gabe von Blutprodukten, Impfungen, Immunglobulinen, Abgeschlagenheit, Übelkeit, Fieber, Türkeiaufenthalt bis vor 10 Tagen, V. a. Hepa44s A Virustatika, etc.... Nadelstichverletzung: Olndexperson o Exponierte Person Antikörpernachweis (Untersuchungsmaterial: Serum oder Serum-liquor-Paar) o HIV 1 & 2 0 Cytomegalievirus (CMV) 0 Influenza AlB-Virus o Rötelnvirus 0 Herpes-Simplex-Virus (HSV 1 & 2) 0 Parainfluenzavirus (PIV) OMasernvirus 0 Varizella-Zoster-Virus (VZV) 0 RS-Virus (RSV) o Mumpsvirus 0 Epstein-Barr-Virus (EBV) 0 Adenovirus (ADV) o Parvovirus B19 0 HHV-6 (Hum. Herpesvirus Typ 6) 0 Hantavirus o HTLV 1 & 2 0 HHV-8 (Hum. Herpesvirus Typ 8) 0 Denguevirus Typ 1-4 Erregernachweis Nukleinsäurenachweis o HSV 1 & 2 0 Hepatitis A Virus o HIV o CMV 0 Hepatitis B Virus OMasernvirus o VZV 0 Hepatitis C Virus o Mumpsvirus o EBV 0 Hepatitis D Virus o Rötelnvirus o HHV-6 0 Hepatitis E Virus o FSME-Virus o Parvovirus B19 OlnfluenzavirenA/B o West-Nil-Virus o Papillomviren 0 Parainfluenzavirus o Dengue-Virus o BK/JC-Virus 0 RS-Virus o Rift-Valley-Virus o Norovirus 0 Metapneumovirus. o Rotavirus 0 Coronavirus. o Adenovirus 0 Rhinovirus. o Astrovirus 0 Bocavirus o Sapovirus 0 Enteroviren(Coxsackie-, Echo-, Enterovirus) Antigennachweis o CMV (pp65/edta-blut*) o Rotavirus 0 Norovirus(PcR) o Astrovirus 0 SapovirUS(pCR) o Adenovirus o Enteroviren o RS-Virus o Parainfluenzavirus Typ 1-3 o InfluenzavirenA/B o HSV 1 & 2 OVZV o andere:.. o.. o Coxsackie-AlB-Viren o ECHO-Viren o Poliomyelitisviren o LCM-Virus o FSME-Virus Virusisolation Transport so rasch wie möglich, gekühlt auf 4 C Viren bitte angeben: o. Virushepatitis und Resistenztests o Verdacht akut 0 vor Impfung Hepatitis AlB 0 unter Therapie Welche Virustatika, seit wann?.. Verdacht chronisch 0 nach Impfung Hepatitis AlB 0 vor Therapie.. o gesichert. o anti HBc 0 anti-hav 0 HBV-PCR 0 HIV-Resistenztest 0 sonstiges o anti-hbs 0 anti-hcv 0 HBV-Genotyp 0 HBV-Resistenztest o anti-hbe 0 anti-hdv 0 HCV-PCR OCMV-Resistenztest o HBs-Ag 0 anti-hev 0 HCV-Genotyp 0 HSV-Resistenztest o HBe-Ag 0 lnfluenzavirus-resistenztest * EDTA-Blut (7-9 ml) muß Innerhalb von 3hzur Bearbeitung Im Labor sem! Häufige Untersuchungsmaterialien Blut Serum Plasma für PCR/RT PCR Nasenspülflüssigkeit, Rachenabstrich Stuhl Liquor Urin Bläscheninhalt, Biopsie 2

3 Proben gewinnung Probengewinnung: Welches Material sende ich ein? Transport Probentransport 1. Material, in dem möglicherweise Virus ist: Atemwegsinfekt: Rachenabstrich, Nasen /Rachenspülflüssigkeit, Endotrachealaspirat, Bronchoalveoläre Lavage Flüssigkeit Enteri4s und Durchfall: Stuhl Vesikuläre Läsionen: Vesikelflüssigkeit Hepa44s: Blut HIV Therapieverlaufskontrolle: Blut ZNS Störungen: Liquor, Rachenabstrich Exanthem: Rachenabstrich PosMransplanta4onssyndrom: Rachenabstrich, Urin Angeborene Anomalie: Rachenabstrich, Urin außerdem: Biopsien 2. Blut (Serum), Liquor, Speichel: An4körper Bes4mmung wenn Virusnachweis nicht möglich oder nicht zielführend für die Immunitätslage Op4male Vorbereitung des LaborauJrags Zusammenfassung Präanaly4k Probe plus AuJragsformular (Kodierung) Indika4onen für virologische Untersuchungen sind mögliche Therapie und Hygienemaßnahmen, Klärung der Immunitätslage und Therapiekontrolle? Für Virusuntersuchungen erforderlich sind AuJragsformblaM und Probe Probenmaterial zum Virusnachweis stammt von den betroffenen Organen, aus dem Blut und ggf. zusätzlich aus Rachen und/oder Urin Virus An4körpernachweis aus Blut (Serum/Plasma), ggf. aus Speichel, Liquor Befundbericht (Kodierung) Korrekte Probe, rasche Probenzusendung und klare Informa4onen sind wich4g für Testung und prak4schen Wert der Untersuchungsergebnisse 1. Material entspricht den Anforderungen an die Fragestellung 2. Klinische Informa4on und Fragestellung wurden ausreichend dargestellt 3. Material gelangt in gutem Zustand ins Labor 3

4 Arbeitsplatz Listen (Eingangs Labor) Eingangslabor Film Testungen Methoden: Wie untersucht das Labor? Material, in dem möglicherweise Virus ist: EM Virus Isola4on (Anzüchtung) Nukleinsäure Nachweis (PCR, RT PCR) Virusprotein Nachweis (An4gen ELISA, IFT, Agglu4na4onstest) quan4ta4ver Nukleinsäuretest An4körper: Enzyme Immunoassay (EIA,ELISA) Immunfluoreszenztest (IFT) Immunblot (Western Blot) Komplementbindungsreak4on (KBR) Hämagglu4na4ons Hemmtest (HAH/HHT) Neutralisa4onstest Sensi4vität und Spezifität von Virusnachweisverfahren Virusisolierung an der Sicherheitswerkbank Nachweismethode Sensi4vität Spezifität Elektronenmikroskopie (+) + Virusisolierung (+) +++ An4gen Immunfluoreszenztest + ++ An4gen ELISA Nukleinsäuretest R. Braun in B. Neumeister et al., Mikrobiologische Diagnos4k G. Thieme Verlag StuMgart

5 Virus Proteinnachweis ( An4gen Test ): Enzyme linked Immunosorbent Assay, ELISA/ Enzyme Immuno Assay, EIA Virusisolierung: zytopathischer Effekt An4körper, z. B. gegen Influenza Virus HeLa-Zellen Adenovirus Probe mit Influenza Virus 2. An4körper gegen Influenza Virus MRC-5-Zellen Herpes-SimplexVirus 1 An4körper gegen An4körper Virus Nukleinsäurenachweis: Polymerase KeMenreak4on DNA Amplifizierung durch Polymerase KeMenreak4on Virus DNA Polymerase KeMenreak4on RT PCR: Reverse Transkrip4on plus Polymerase KeMenreak4on Primer 2 Taq Polymerase Primer 1 2. Zyklus 1. Zyklus Zyklus: 94 C 1 Minute 56 C 1 Minute 72 C 1 Minute 3. Zyklus DNA Doppelstrangaurruch ( Mel4ng ) Anlagerung der Primer ( Annealing ) DNA Synthese 5

6 Durchführung und Analyse der PCR Kon4nulierliche DNA Amplifikat Quan4fizierung während der PCR durch Hybridisierungssonden und Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer (FRET) Messung ( Real Time PCR ) 5 Nt Hybridisierung ( Annealing ) λ = 470 nm Detektor Anregung Fluorescein LC Red Detektor DNA Elonga4on Taq Pol. Real Time PCR Ergebnis und Light Cycler Anwendung der quan4ta4ven PCR Verlaufskontrolle und Therapiemonitoring bei HIV Infek4on Therapiemonitoring bei HBV und HCV Infek4on Analyse der Reak4vierung von Herpesviren (CMV, EBV, HSV, VZV, HHV 6) bei Immunsupprimierten 6

7 Befund übermimlung Aussagemöglichkeiten von Virusnachweisen Zusammenfassung II zeigt akute/persis4erende Infek4on bei persis4erenden Viren (Herpesviren) Virusnachweis nur bedingt aussagekräjig Besser: quan4ta4ver Nachweis Virusinfek4onen werden im Labor durch Virus oder An4körpernachweis untersucht Der direkte Virusnachweis geschieht über die Untersuchung von Proteinen (An4genen), Nukleinsäuren (DNA, RNA) und die Infek4osität (Virusisolierung) Der Nukleinsäurenachweis ist die sensi4vste Virusnachweismethode Quan4ta4ve Virusnachweisverfahren dienen der Diagnos4k von Reak4vierungen persis4erender Viren und der Verlaufskontrolle chronischer Infek4onen Testungen An4körper Tests Qualita4ver und quan4ta4ver An4körpertest aus Blut/Serum Speichel (z. B. RSV, HIV) Liquor (neurologische Erkrankungen) Qualita4v: posi4v oder nega4v Beispiele: HIV Test IgM Tests Quan4ta4v: An4körper Titer, An4körper Einheiten Beispiele: Hämagglu4na4onstest für Röteln Immunitätsstatus nach Hepa44s B Impfung 7

8 Sensi4vität und Spezifität von An4körpernachweisen An4körper Nachweisverfahren: ELISA Nachweismethode Sensi4vität Spezifität An4körper ELISA +++ (< 1 ng/ml) ++/+++ Immunblot Indirekter Immunfluoreszenztest Komplementbindungsreak4on + (1 µg/ml) + Hämagglu4ona4onshemmtest + (15 30 µg/ml) +++ Neutralisa4onstest + (µg/ml Bereich) +++ Agglu4na4on (+) (1 mg/ml) An4gen Probe, z. B. Serum 2. An4körper mit Enzym Nach R. Braun in B. Neumeister et al., Mikrobiologische Diagnos4k, G. Thieme Verlag StuMgart 2009 und Murray et al. Manual of Clinical Microbiology, 9. Aufl. ASM Press Washington D. C., 2007 ELISA Automat Arten des An4körper und An4gen Nachweises Indirekter An4körpernachweis Sandwich ELISA zum An4gen Nachweis HRP HRP HRP HRP HRP HRP Ag Ag Ag Ag 8

9 An4körper Nachweisverfahren: Immunblot Immunblot Film Breite der HIV An4körperantwort (Immunblot) An4körper Nachweisverfahren: Hämagglu4na4ons Hemmtest Erythrozyten + Virus + An4körper Erythrozyten + Virus z Sedimenta4on Agglu4na4on Serum 1 Serum 2 9

10 An4körper Nachweisverfahren: Immunfluoreszenztest Immunfluoreszenztest Film 1. Serum 2. An4körper FITC FITC FITC FITC FITC FITC An4 Human An4körper (2. Ak) Serum mit An4körpern Ag Ag Ag Ag Ag 3. Mikroskopie Immunfluoreszenztest Ergebnis Zusammenfassung III ELISA, Immunblot, IFT und seltener HAH und Neutralisa4onstest werden zum Nachweis und zur Quan4fizierung der An4körperantwort eingesetzt Neutralisa4ons und mit Einschränkung auch Hämagglu4na4onstest messen neutralisierende An4körper 10

11 Befund übermimlung Aussagemöglichkeiten serologischer Tests Unterscheidung akuter Erkrankungen von früheren Infekten durch serologische Tests akute oder zurückliegende Infek4on, wenn IgG posi4v akute Infek4on, wenn IgM posi4v, An4körper Avidität niedrig IgG Titerans4eg (4 fach): Kontrollserum nach 1 2 Wochen IgM Nachweis An4körper (IgG) Aviditätsbes4mmung (Röteln, CMV, Toxoplasma) Konzentra4on des An4gen spezifischen IgM und IgG nach Infek4on im Serum Aviditätsbes4mmung Avidität ist die Gesamtheit der Affinitäten bei bi oder polyvalenten Bindungen Affinität Bes4mmung des An4körper Titers ohne und mit Waschen der ELISA PlaMe mit Harnstoff c IgM IgG Infek4on Diagnos4sche Lücke t Avidität 11

12 Quan4ta4ve Maße für An4körper An4körper Titer Titer: Wert oder reziproker Wert der An4körper Verdünnung, bei der gerade noch ein Messsignal nachweisbar ist. Abhängig von Testsensi4vität Wert oder reziproker Wert der An4körper Verdünnung, bei der gerade noch ein Messsignal nachweisbar ist. Abhängig von Testsensi4vität Grenz4ter: Wert, bei dem die An4körperkonzenta4on in einer Probe Signifikanz erreicht Ak (µg/ml) Titer Titer Testspezifische Einheit: Rela4ves Maß für An4körperkonzentra4on im Vergleich mit Standard Reagenz. Maßeinheit: Einheiten (Units)/ml Nachweisgrenze Nachweisgrenze Verdünnung HIV spezifische An4körper4ter im Serum (ELISA) bei Infizierten Grenz4ter Wert, bei dem die An4körperkonzenta4on in einer Probe Signifikanz erreicht Signal posi4v Grenz4ter (x+ 3 σ) x grenzwer4g nega4v Nega4ve Proben Messproben 12

13 Testspezifische Einheiten Rela4ves Maß für An4körperkonzentra4on im Vergleich mit Standard Reagenz Maßeinheit: Interna4onale Einheiten (I. E.)/Interna4onal Units (IU)/ml Diagnos4sche Herausforderung bei An4körpertests: Kreuzreak4vität Kreuzreak4vität ist die Bindung von An4körpern an Proteine von verwandten Viren Signal (OD 450 ) Standardkurve Signal (OD 450 ) Beispiele für Kreuzreak4vität in angewandten Tests Mumpsvirus und Parainfluenzaviren Denguevirus und andere Flaviviren (West Nil Virus, Gelbfiebervirus) mi.e./ml Standardproben Messproben Diagnos4sche Herausforderung bei An4körpertests: Falsch posi4ve und falsch nega4ve Resultate BefundübermiMlung Falsch posi4v: Test ist posi4v, Pa4ent hat keine akute Infek4on oder Immunität Ursachen: Kreuzreak4vität, andere testspezifische Limita4onen Konsequenzen: Testwiederholung, Bestä4gungstest mit höherer Spezifität auch: keine Röteln IgM Untersuchung zur Immunitätsbes4mmung in SchwangerschaJ Falsch nega4v: Test ist nega4v, Pa4ent hat jedoch akute Infek4on oder Immunität Ursachen: niedrige An4körperkonzentra4on/diagnos4sches Fenster testspezifische Limita4onen Konsequenzen: 2. Testung mit späterer Probe ggf. Virusnachweis (HIV, HCV) Virusnachweise: qualita4v und Angabe des Nachweisverfahrens, z. B. HSV PCR posi4v Influenza A An4gennachweis nega4v Virusisolierung Mumpsvirus Serologie: qualita4v und quan4ta4v (Titer und Einheiten) und ggf. Angabe des Testverfahrens z. B. Hepa44s C Virus An4körper (EIA) nega4v 13

14 Befundbericht Zusammenfassung III Für den serologischen Nachweis einer akuten Infek4on werden IgM oder An4körper Aviditätsbes4mmung durchgeführt Die diagnos4sche Lücke ist der Zeitraum zwischen Infek4on und frühestem Ak Nachweis Der An4körper4ter ist ein Maß für die Probenverdünnung, bei der noch ein posi4ves Signal aujrim. Er hängt außer von der Probe vom Testverfahren ab Bei Analyse der testspezifischen Einheiten wird mit einem Referenzserum verglichen Kreuzreak4vitäten von An4körpern mit verwandten Viren sind möglich und erfordern besondere diagnos4sche Aufmerksamkeit 14