Einfluss der Temperatur auf die Vitalität von Mikroorganismen

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1 V11 Einfluss der Temperatur auf die Vitalität von Mikroorganismen Thema: Mikroorganismen, Wärme 1. Einleitung Mikroorganismen spielen in unserem Leben eine wichtige Rolle. So sind Mikroorganismen mitverantwortlich für die Mineralisierung von organischem Material und somit für den natürlichen Stoffkreislauf. Beim Menschen können sie auch für Krankheiten verantwortlich sein, (z.b. wird Scharlach durch Bakterien verursacht). Weiterhin können sie Lebensmittel verderben (z.b. Schimmelpilze). Sie können jedoch auch gezielt eingesetzt werden, um bestimmte Stoffe herzustellen. So wird z.b. Alkohol durch Hefen produziert, Joghurt mit Hilfe von Bakterien hergestellt oder das Antibiotikum Penicillin durch einen Pilz. Bei diesen technischen Prozessen spielt deshalb das gezielte Handling von Mikroorganismen eine wesentliche Rolle. 2. Grundlagen Für ein gezieltes mikrobiologisches Arbeiten oder bei der Konservierung von Lebensmitteln ist die Abtötung von Mikroorganismen ein zentrales Thema. Hierbei geht es darum, die Mikroorganismen einerseits unschädlich zu machen, gleichzeitig sollen jedoch die im Produkt enthaltenen Wertstoffe (z.b. Vitamine) möglichst erhalten bleiben. In diesem Versuch soll untersucht werden, welchen Einfluss eine Wärmebehandlung auf die Vitalität von Mikroorganismen hat. Als Mikroorganismus wird hierbei die Hefe Saccheromyces cerevisiae eingesetzt, die allen als Backhefe bekannt ist. Weiterhin ist diese Hefe auch für die alkoholische Gärung (Wein-/Bierherstellung) von Bedeutung. In diesem Versuch soll über eine Färbung mit einem bestimmten Farbstoff, eine sogenannte Lebend-Tot-Färbung, der Vitalitätszustand der Zellen in Anbhängigkeit von der Temperatru durchgeführt werden. Für solche Färbungen kommen verschiedene Farbstoffe zum Einsatz. Info: Vitalität = Lebenskraft Info: Saccheromyces cerevisiae: Backhefe, Bierhefe V11-Tempertureinfluss_lebend_tot_ToTest Seite 1

2 Methylenblau: Methylenblau wird von den Enzymen der Hefezellen in farbloses Leukoform umgewandelt. D. h. Zellen, bei denen die Enzyme noch funktionieren, erscheinen im Mikroskop farblos, Zellen bei denen die Enzyme nicht funktionieren, erscheinen im Mikroskop violett [1]. lebend tot Abb. 1: Mit Methylenblau angefärbte Hefezellen nach der Erhitzung. In den hellen Zellen wurde der Farbstoff durch Enzyme abgebaut. Diese Zellen werden als lebend gewertet. Bei den dunkel gefärbten Zellen konnte der Farbstoff nicht abgebaut werden, diese werden als tot gewertet. Eosin /Trypanblau: Die Farbstoffe Eosin oder Trypanblau können die Zellwand intakter Zellen nicht durchdringen. Der Farbstoff kann somit nur in Zellen eindringen, deren Zellwand nicht mehr intakt ist. Diese erscheinen im Mikroskop blau-violett, die intakten Zellen sind farblos. Zellzahlbestimmung mittels Zählkammer Über eine Zellzahlbestimmung mittels Zählkammer kann die Anzahl der Zellen in einem Medium bestimmt werden. Eine Zählkammer ist ein (dickerer) Objektträger mit 3 quer verlaufenden Stegen (2 schmale an den Seiten und ein dickerer in der Mitte). Die beiden äußeren Stege sind genau 0,1 mm höher als die Oberfläche des Mittelstreifens. In die Oberfläche des etwas breiteren Mittelstreifens sind zwei kreuzförmige Netze Kurz gesagt: Die Zellen werden gefärbt und dann in eine Zählkammer eingebracht. In der Zählkammer befindet sich ein bestimmtes Volumen. Somit kann die ermittelte Zellzahl immer auf ein bestimmtes Volumen bezogen werden und man kann eine Konzentrationsangabe machen V11-Tempertureinfluss_lebend_tot_ToTest Seite 2

3 von Linien eingeätzt, die als Flächenorientierung bei der Zählung verwendet werden. die den Grundriss der Kammern bilden. Zu beiden Seiten des Mittelstreifens, jeweils auf der anderen Seite der tiefen Rinnen, befindet sich ein etwas schmalerer Steg. Die Oberflächen dieser beiden äußeren Stege sind ebenfalls plangeschliffen und liegen 0,1 mm höher als die Oberfläche des Mittelstreifens. Abb. 2: Thoma-Zählkammer: In der Mitte der etwas tiefer gelegene Steg mit den Liniennetzen zum Zählen (die Liniennetze sind in der Aufnahme nicht sichtbar). Rechts und links davon die etwas höher gelegenen Stege. Durch Auflegen eines dicken, plangeschliffenen Deckglases auf diese beiden höheren Stege entsteht ein Zwischenraum definierter Größe (Grundfläche x Höhe), in welche die Probe eingefüllt wird. Die auf einer bestimmten Fläche des Netzes liegenden Zellen werden ausgezählt. Sie können somit auf das Volumen der Zählkammern bezogen werden, womit die Angabe einer Zellkonzentration möglich wird. Die Zellkonzentration wird nach folgender Formel berechnet: Info: Eine Konzentration muss in diesem Versuch nicht ermittelt werden, da nur das Verhältnis lebender Zellen im Vergleich zu der Gesamtzellzahl berechnet wird. Die Angaben zur Fläche und Kammertiefe findest du auf der Zählkammer [2] V11-Tempertureinfluss_lebend_tot_ToTest Seite 3

4 3. Versuchsdurchführung 3.1 Versuchsvariante 1 Lebend-/Tot-Färbung Material: Zellsuspension (z.b. Hefen im Apfelsaft) Objektträger, Deckgläschen 0,1 %-ihr Methylenblaulösung (in H 2 O) Pasteurpipette oder Pipette (1 ml) Reagenzglas oder Reaktionsgefäß Vorsicht: Methylenblauflecken lassen sich nur schlecht entfernen. Aufgabenstellung: Führe eine Lebend-/Tot-Färbung der Mikroorganismen durch und betrachte diese unter dem Mikroskop. Versuchsdurchführung: Mische die Zellsuspension mit der gleichen Menge 0,1%igen Methylenblaulösung. Beobachtung: Betrachte die gefärbten Zellen nach einer Einwirkzeit von 5 min unter dem Mikroskop Aufgabe: a) Notiere die Beobachtung in Deinem Heft. b) Warum sind die lebenden Zellen farblos und die toten blau? V11-Tempertureinfluss_lebend_tot_ToTest Seite 4

5 3.2 Versuchsvariante 2 Teilversuch 1 Bestimmung des Zusammenhangs zwischen Zeiteinstellung und Temperatur in der Mikrowelle Material Mikrowelle Stoppuhr Thermometer (Temperatur sollte sehr schnell ablesbar sein) 1 Schüssel mit Eiswasser 7x Erlenmeyerkolben (250 ml) Aufgabe Bestimme, wie lange du einen Erlenmeyerkolben mit 100 ml Flüssigkeit in die Mikrowelle stellen musst, um bestimmte Temperaturen zu erreichen. Versuchsdurchführung Erlenmeyerkolben mit 100 ml Leitungswasser (Raumtemperatur) füllen Die Mikrowelle auf volle Leistung stellen Bei der Mikrowelle eine längere Zeit einstellen, die exakte Zeit wird mittels Stoppuhr und durch das Öffnen der Mikrowellentür vorgegeben Die Temperatur des Wassers in Abhängigkeit von verschiedenen Zeiten ermitteln Aufgaben und Messwerte: a) Dokumentiere die ermittelten Werte in einer Tabelle in deinem Heft. b) Erstelle eine Graphik, in der der Zusammenhang veranschaulicht wird. c) Wie lange muss jeweils erwärmt werden, um Temperaturen in der Größenordnung von 20 C, 30 C, 40 C, 50 C, 60 C, 70 C und 80 C zu erhalten? Achtung: Der Temperaturbereich zwischen Raumtemperatur und 80 C sollte abgedeckt sein. Achtung: Da es in der Mikrowelle punktuelle Temperaturunterschiede gibt (so genannte Hot Spots) muss der Erlenmeyerkolben immer auf dieselbe Stelle platziert werden (Markierung vornehmen) V11-Tempertureinfluss_lebend_tot_ToTest Seite 5

6 Teilversuch 2 Erhitzen von Hefezellsuspensionen Material Aufgabe: Mikrowelle Stoppuhr Thermometer (Temperatur sollte sehr schnell ablesbar sein) 1 Schüssel mit Eiswasser 7x Erlenmeyerkolben (250 ml) 2x Erlenmeyerkolben 1 l 2 l A-Saft 2 Päckchen Backhefe Erhitze verschiedene Hefezellsuspensionen auf ca. 20 C, 30 C, 40 C, 50 C, 60 C, 70 C und 80 C Achtung: Da es in der Mikrowelle punktuelle Temperaturunterschiede gibt (so genannte Hot Spots) muss der Erlenmeyerkolben immer auf dieselbe Stelle platziert werden (Markierung vornehmen). Versuchsdurchführung 1 Päckchen Backhefe und 500 ml Apfelsaft werden über Nacht vorkultiviert (bei Raumtemperatur). Der Kolben sollte dabei ein Volumen von mindestens 1 l fassen, damit die Sauerstoffversorgung der Hefe gewährleistet ist. Wenn alle o.g. Temperaturen untersucht werden, muss dieser Ansatz doppelt gemacht werden, da für jede Temperatur 100 ml benötigt werden. Am Versuchstag werden in die 7 Erlenmeyerkolben je 100 ml der Hefe- /Apfelsaftsuspension gegeben. Einen Kolben nicht erhitzen, die anderen Kolben für die oben ermittelten Zeiten auf ca. 20 C, 30 C, 40 C, 50 C, 60 C, 70 C und 80 C in der Mikrowelle erhitzen, danach sofort die Temperatur messen und die Kolben in Eiswasser auf Raumtemperatur abkühlen. Achtung: Die Hefesuspension muss am Tag zuvor angesetzt werden. Achtung: Vergiss nicht, die Kolben entsprechend zu beschriften. Aufgaben und Messwerte: a) Notiere die ermittelten Temperaturen in deinem Heft V11-Tempertureinfluss_lebend_tot_ToTest Seite 6

7 Teilversuch 3 Bestimmung des Anteils vitaler /lebender Zellen Material Hefezählkammer (z.b. Thomazählkammer oder Neubauer improved) mit Deckgläschen 0,1 %-ige Methylenblaulösung Reagenz- oder Zentrifugenröhrchen Pasteurpipetten oder Pipetten Aufgabe Ermittle den Anteil vitaler Zellen in Abhängigkeit von der Erhitzungstemperatur. Versuchsdurchführung Probenvorbereitung 1 ml Hefesuspension und 1 ml Methylenblaulösung in ein Röhrchen pipettieren. Probe gut schütteln (falls vorhanden Vortexer verwenden) Probe 5 min stehen lassen Mikroskopische Auswertung Deckglas auf Zählkammer legen Die Außenstege mit destilliertem Wasser befeuchten und das Deckglas mit sanftem Druck von vorn auf die Zählkammer schieben. Probe gut mischen und mit einer Pipette einen Tropfen entnehmen. Den Tropfen vorsichtig an die Stelle zwischen Deckglas und Kammerboden bringen. VORSICHT!: Das Deckgläschen ist leicht zerbrechlich. Info: Durch die Kpillarwirkung füllt sich der Spalt zwischen Deckglas und Kammerboden Abb. 3: Befüllen der Thoma-Zählkammer Sind Luftblasen sichtbar oder ist die Flüssigkeit über die Ränder in die Rinnen übergequollen, so muss die Kammer gereinigt und nochmals befüllt werden V11-Tempertureinfluss_lebend_tot_ToTest Seite 7

8 Die Zellen werden unter dem Mikroskop bei 400-facher Vergrößerung gezählt. Dabei wird die Kultursuspension so verdünnt, dass man in einen zählbaren Bereich kommt. Die verdünnte Kultursuspension wird dabei auf einen speziellen Objektträger, die Zählkammer pipettiert. Auszählen: Abb. 5 Thoma- oder Neubauer improved- Zählkammer mit 25 Großquadraten. Ausgezählt werden die 5 diagonal verlaufenden Großquadrate Abb. 4: Ausschnit eines Großquadrates mit 16 Kleinquadraten Das Liniennetz der Thomazählkammern hat 25 Großquadrate. Ausgezählt werden die 5 diagonal verlaufenden (s. Abb.). Die Großquadrate sind ferner in 16 Kleinquadrate unterteilt. Hier werden alle Zellen innerhalb des definierten Messbereiches gezählt. Mitgezählt werden die an 2 (!) Kanten aufliegenden Zellen (schwarz). Die an den anderen beiden Kanten aufliegenden Zellen werden nicht gezählt. Der Zählvorgang erfolgt in der Reihenfolge, wie durch die Pfeile angegeben. Aufgaben: a) Notiere die ermittelten Zellzahlen (lebend und tot in deinem Heft) b) Berechne den prozentualen Anteil der lebenden Zellen an der Gesamtzellzahl c) Erstelle ein Diagramm, in dem der Anteil der lebenden Zellen über der Erhitzungstemperatur aufgetragen wird. d) Erläutere dieses Diagramm. e) Warum sind auch bei der nichterhitzten Probe tote Zellen vorhanden? f) In der Umwelt kommen Hefezellen überall vor. Auch auf Äpfeln sind sie natürlicherweise vorhanden. Wie würdest Du Deinen Apfelsaft behandeln, damit er nicht zu gären anfängt? V11-Tempertureinfluss_lebend_tot_ToTest Seite 8

9 4. Weiterführende Literatur: [1] Praktikum Mikro- und Zellbiologie im Modul Biobasics BPT1, 4. Auflage, 2010, Hochschule Furtwangen: Hochsieder, G.; Lachner, K.; Paatsch, T.; Salat, U.; Seidinger, H.; Kunzelmann, H. [2] LO - Laboroptik Ltd, Information über Zählkammern V11-Tempertureinfluss_lebend_tot_ToTest Seite 9

10 Prozesshilfsmittel Lehrerseiten 5. Kurzbeschreibung In diesem Versuch wird der Einfluss der Temperatur auf die Vitalität der Hefezellen untersucht. Hierzu werden die Zellen unterschiedlich stark erhitzt, anschließend eine Vitalitätsfärbung durchgeführt und mikroskopisch ausgewertet. Zur Quantifizierung wird mit einer Zählkammer gearbeitet. 6. Lernziel - Grundlagen Konservierung - Erhitzung - Arbeiten mit Mikroorganismen - Mikroskopie 7. Versuchsdauer Kalibrierung der Mikrowelle 1 Unterrichtsstunde Lebend- /Tot Färbung: 1 Doppelstunde V11-Tempertureinfluss_lebend_tot_ToTest Seite 10

11 Prozesshilfsmittel Lehrerseiten 8. Beispiellösungen Versuchsvariante 1 Lebend-/Tot-Färbung Aufgabe: c) Notiere die Beobachtung in Deinem Heft. Ein Teil der Hefezellen ist blau gefärbt, ein Teil ungefärbt. d) Warum sind die lebenden Zellen farblos und die toten blau? In den lebenden Zellen wird der Farbstoff Metyhlenblau umgebaut zu Leukoform, welche farblos ist. Versuchsvariante 2 Teilversuch 1 Bestimmung des Zusammenhangs zwischen Zeiteinstellung und Temperatur in der Mikrowelle Aufgaben und Messwerte: Die Kalibrierung muss für jede Mikrowelle individuell durchgeführt werden. a) Dokumentiere die ermittelten Werte in einer Tabelle in deinem Heft. b) Erstelle eine Graphik, in der der Zusammenhang veranschaulicht wird. Temperatur [ C] Zeit Mikrowelle [s] V11-Tempertureinfluss_lebend_tot_ToTest Seite 11

12 Prozesshilfsmittel Lehrerseiten c) Wie lange muss jeweils erwärmt werden, um Temperaturen in der Größenordnung von 20 C, 30 C, 40 C, 50 C, 60 C, 70 C und 80 C zu erhalten? Zei t [s] Temp. [ C] , , , , , , ,5 Teilversuch 2 Erhitzen von Hefezellsuspensionen a) Notiere die ermittelten Temperaturen in deinem Heft. Die ermittelten Temperaturen sollten größenordnungsmäßig den Werten der ermittelten Kalibrierkurve entsprechen. Teilversuch 3 Bestimmung des Anteils vitaler /lebender Zellen a) Notiere die ermittelten Zellzahlen (lebend und tot in deinem Heft) Temperatur [C ] Zellen insgesamt lebende Zellen Anteil lebender Zellen [%] % % % % % % % b) Berechne den prozentualen Anteil der lebenden Zellen an der Gesamtzellzahl V11-Tempertureinfluss_lebend_tot_ToTest Seite 12

13 Prozesshilfsmittel Lehrerseiten c) Erstelle ein Diagramm, in dem der Anteil der lebenden Zellen über der Erhitzungstemperatur aufgetragen wird. Anteil lebender Zellen 100% 80% 60% 40% 20% 0% Erhitzungstemperatur [ C] d) Erläutere dieses Diagramm. Mit zunehmender Erhitzungstemperatur nimmt der Anteil der lebenden Zellen ab. g) Warum sind auch bei der nichterhitzten Probe tote Zellen vorhanden? Auch Hefezellen werden nicht unendlich alt. In einer Kultur sind stets Zellen in verschiedenen Stadien vorhanden, Zellen die sich vermehren und Zellen die abgestorben sin. e) In der Umwelt kommen Hefezellen überall vor. Auch auf Äpfeln sind sie natürlicherweise vorhanden. Wie würdest Du Deinen Apfelsaft behandeln, damit er nicht zu gären anfängt? Erhitzen, auf mindestens 80 C 9. Anmerkungen für projektorientiertes / forschendes Arbeiten Der Zusammenhang zwischen Temperatur und Zeit in der Mikrowelle kann auch sehr frei formuliert werden, so dass Schüler der Schüler sich seine Vorgehensweise selbst überlegen muss. Dier Erhitzung kann auch auf andere Art (z.b. in Reagenzröhrchen in einem Wasserbad) realisiert werden. Die Vorgehensweise wurde hier so gewählt, weil die Prozedur dann vergleichbar mit dem Versuch Einfluss der Temperatur auf die Aktivität von Mikroorganismen ist, und die Ergebnisse verglichen werden können V11-Tempertureinfluss_lebend_tot_ToTest Seite 13

14 Prozesshilfsmittel Lehrerseiten Zur Vereinfachung könnten auch normale Objektträger eingesetzt werden, und die Zellen in einigen mikroskopischen Gesichtsfeldern ausgezählt werden. Der Versuch kann insgesamt arbeitsteilig durchgeführt werden. (z.b. jede Gruppe eine andere Temperatur) Es könnte auch so umgesetzt werden, dass jede Schülergruppe einen anderen Versuch zum Thema durchführt (eine Gruppe wertet über die Lebend- / Tot-Färbung aus, eine Gruppe untersucht die Aktiviät der Mirkoorganismen über die Gasbildung (Versuch: Einfluss der Temperatur auf die Aktivität von Mikroorganismen) Eine Gruppe streicht Platten aus (Versuch geplant). Oder alternativ: Eine Gruppe untersucht jeweils: den Einfluss der Temperatur auf Mikroorganismen den Einfluss der Temperatur auf Enzyme (Versuch zum Einfluss der Temperatur auf Polyphenoloxidasen (sind für die enzymatische Bräunung des Apfels zuständig) ist geplant. Dem Einfluss der Temperatur auf Vitamine (Versuch zu Vit. C ist geplant) 10. FAQ / Tips & Tricks Eine Hefesuspension muss bereits am Tag zuvor angesetzt werden! Alternativ zu Methylenblau können auch die Farbstoffe Eosin oder Trypanblau eingesetzt werden. Achtung!: Hefesuspension am Tag vorher ansetzen!!! 10. Anmerkungen In Zusammenhang mit diesem Versuch gibt es weiter die Versuche: Einfluss der Temperatur auf die Aktivität von Mikroorganismen (als Maß für die Aktivität wird die Gasbildung von Hefen gemessen) und Einfluss der Temperatur auf das Wachstum der Zellen (hier werden die Proben auf Nährmedien ausplattiert). Dieser Versuch soll eine Vorbereitung auf den Gesamtzusammenhang des Einsatzes unterschiedlicher Erhitzungsverfahren (Pasteurisation, UHT-Erhitzung, Sterilisation, ) sein. Es sind weitere Versuche geplant, die den Einfluss der Hitzeeinwirkung auf weitere Produktinhaltsstoffe, z.b. Vitamine oder Enzyme zeigen. Die übergeordnete Fragestellung ist; Wie kann ich Mikroorganismen ausreichend inaktivieren und dabei andere Produktinhaltsstoffe schonen? V11-Tempertureinfluss_lebend_tot_ToTest Seite 14

15 Prozesshilfsmittel Lehrerseiten 11. Bezugsquellen Apfelsaft und Backhefe könne im Supermarkt bezogen werden. Thoma- oder Neubauer Zählkammer: im Laborbedarf erhältlich. Es sind spezielle, dafür vorgesehene Deckgläschen erforderlich. Preis: Zählkammer ca. 30,00 10 Deckgläschen: ca. 16, Versuchslegende Herausgeber: Technikinitiative NwT Hochschule Furtwangen Furtwangen University Jakob-Kienzle-Str Villingen-Schwenningen Autor: Dipl.-Ing. (FH) Ursula Eschenhagen Erstellt: Juni 2012 In Zusammenarbeit mit: Severin Gylstorff V11-Tempertureinfluss_lebend_tot_ToTest Seite 15