Aufgabenfelder in der Pathologie. Routinemethoden und Indikationen. anatomischen Diagnostik. Schritte in der pathologisch-anatomischen

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1 Pathologie I AP1: Technik und Methoden Aufgabenfelder in der Pathologie PD Dr. Dirk Theegarten THEMEN: 1. Routinediagnostik 2. Elektronenmikroskopie 3. Spezialfärbungen und Immunhistochemie weiterhin: Zytologie, Molekularpathologie 1 Biopsiediagnostik: Untersuchung von Gewebsproben und Operationspräparaten Zytodiagnostik: Untersuchung von Abstrichen, Punktaten und Flüssigkeiten Obduktionsdiagnostik: Leichenöffnung und Feststellung der Leiden und der Todesursache Schritte in der pathologisch-anatomischen anatomischen Diagnostik Klinische Angaben und Fragestellung evtl. radiologische Befunde (insb. bei Knochentumoren) Makroskopie (Zuschnitt) Mikroskopie Epikritische Stellungnahme Qualitätssicherung: Vergleich klinischer und pathologisch-anatomischer Diagnosen Routinemethoden und Indikationen Standartdiagnostik: Formalin-Fixierung und Paraffineinbettung Schnellschnittdiagnostik: intraoperative Gefrierschnittuntersuchung unfixierten Gewebes Zytodiagnostik (Zytologie) Möglich: Bildgebung, Morphometrie, Zytometrie 3 4

2 Ziele der pathologisch-anatomischen Diagnostik unter Berücksichtigung der klinischen Befunde Unklare Läsion: pathologisch-anatomische Diagnose Bekannte Läsion: Bestätigung der klinischen Diagnose (Qualitätskontrolle) Umfang der Läsion: Tumorart, Tumorstadium, Tumorfreiheit der Resektionsränder (mikroskopisch kontrollierte Chirurgie) Regeln der pathologisch-anatomischen anatomischen Diagnostik DieWahl der Biopsiestelle und der Umfang der Biopsie entscheiden über den diagnostischen Nutzen Treffersteigerung durch mehrfache genügend große Biopsien, Meidung von Nekrosezonen Gewebequetschung vermeiden (führt zu Artefakten) Rasche Fixierung nach der Entnahme (sonst Autolyse, Ausnahme: Schnellschnitt): Hohlorgane eröffnen, große Proben einschneiden, adäquate Fixantienmenge Größe der Probe: wenn möglich Histologie statt Zytologie anstreben 5 6 Prinzipien histologischer Technik: Fixierung Grund: Autolyse, Verwesung, Fäulnis Ziel: Insolubilisierung der organischen Matrix Wege: Perfusion, Instillation, Immersion Mechanismen: Denaturierung und Vernetzung von Proteinen Fixiermittel: 3,5-7%iges Formaldehyd (gepuffert), Azeton, Ethanol, Methanol, Kaliumdichromat, Essigsäure, Glutaraldehyd, Osmiumtetroxid, Pikrinsäure, Gemische Temperatur: o Celsius Dauer: 2h-über Nacht-Tage, direkt nach Entnahme 7 Durchlauf der Proben im Labor Probeneingang: Prüfung auf Vollständigkeit, Identität, Registrierung, Kodierung Einpacken (MTLA) bzw. Zuschnitt (Arzt) Einbettung (meist über Nacht), bei Knochen zuvor Entkalkung Schneiden (Mikrotom) und Aufziehen auf Objektträger Färben (Hämatoxylin-Eosin-Färbung, ggf. Spezialfärbungen) und Eindeckung 8

3 Prinzipien der histologischen Färbung Farbstoffe: natürliche, synthetische Chromophore: Atomgruppen, die mit Farbphänomenen einhergehen (C=C, C=O, C=S, C=N, N=N, N=O, NO 2 ) Bindung an aromatische Verbindungen basische Farbstoffe: NH 2, NH(CH) 3, N(CH 3 ) 2, NH saure Farbstoffe: COOH, OH, NO 2, SO 2 OH Substratbindung: direkt oder indirekt über Metallionen Hämatoxylin-Eosin Eosin-Färbung Hämatoxylin Ursprung: Etherextrakt aus dem roten Kernholz des Campechebaumes (Mittelamerika) Farbstoff: Oxidationsprodukt Hämatein, durch Zugabe von Kalialaun entsteht Hämalaun Ergebnis: selektive Kernfärbung (tiefblau) Eosin Eosin Y: Tetrabrom-Fluorescein (saurer Anilinfarbstoff) Ergebnis: Plasma(Gegen-)färbung (rosa-hellrot) 9 10 Hämatoxylin-Eosin-Färbung Nebenschilddrüse: Schnellschnitt 11 12

4 Nebenschilddrüse: Paraffineinbettung Elektronenmikroskopie Transmissionselektronenmikroskopie (TEM): = Ultrastrukturpathologie Erfassung von subzellulärer Veränderungen (Zellorganellen, Interstitium) Darstellung von Mikroorganismen Rasterelektronenmikroskopie (REM): Erfassung von oberflächlichen Veränderungen bzw. Anschnitten Röntgenmikroanalyse (EDX / WDX): Erfassung chemischer Elemente und ihre Verteilung Transmissions- elektronen- mikroskop (TEM) Routine: Nephropathologie, Ziliendyskinesie, Erregerdiagnostik (Negativkontrast) 15 Aufarbeitung für die Elektronenmikroskopie: 1. TEM Fixierung kleiner Proben in 2,5 %igem gepuffertem Glutaraldehyd über mindestens 24 h Nachfixierung und Kontrastierung mit Schwermetallen (Osmium-, Uran-, Bleisalzen) Einbettung in Kunststoff (Epon) Schneiden am Ultramikrotom Semidünnschnitte: 1µm Dicke, Färbung mit Methylenblau / basischem Fuchsin, Aufziehen auf Glasobjektträger (Lichtmikroskop) Ultradünnschnitte: 0,1-0,2 µm Dicke, Aufziehen auf Kupfernetzchen (TEM) 16

5 Aufarbeitung für die TEM: Ultramikrotom Glomerulonephritis Ziliendyskinesie BGM-Zellkultur: Coxiella burnettii = Verlust der 9+2 Tubulusstruktur Semidünnschnitt Ultradünnschnitt Primär: genetisch Sekundär: entzündlich 19 20

6 Ultrastruktureller Nachweis einer Chlamydien-Infektion beim Emphysem Experimentelle Adenovirus Typ 3 Infektion Rasterelektronenmikroskop (REM) Aufarbeitung für die Elektronenmikroskopie: 2. REM Fixierung mit 3,5% Formaldehyd Entzug von Wasser (erst Methanol, dann Amylacetat) Trocknung am kritischen Punkt in einer temperaturgeregelten Überdruckkammer Befestigung auf Aluminiumträgern Bedampfung (Besputterung) mit Gold unter einer Argon-Schutzatmosphäre oder mit Kohle Routine: Staubanalysen mit EDX 23 24

7 Aufarbeitung für die REM: Besputterung Lungenemphysem: REM Pathol Res Pract 1999; 195: Lungenemphysem: REM Arterienwand 27 28

8 Staubanalyse durch energiedispersive Röntgenmikroanalyse (EDX) im Rasterelektronenmikroskop Acquisition Time:09:07:52, Date:11-Jan-2007 EDAX ZAF Quantification, Standardless, Element, Wt %, At %, K-Ratio, Z, A, F C K, 6.75, 10.96, , , , O K, 46.35, 56.48, , , , SiK, 46.90, 32.56, , , , Total, , Element, Net Inte., Bkgd Inte., Inte. Error, P/B C K, 12.18, 3.57, 4.66, 3.42 O K, , 5.05, 0.81, SiK, , 11.65, 0.64,

9 Grundlagen von Spezialfärbungen: Farbstoffe Azofarbstoffe: Orange G, Kongorot, Sudan III Oxazine: Brillantkresylblau, Nilblau Azine: Neutralrot, Safranin O Thiazine: Azur, Methylenblau Xanthene: Eosin, Pyronin Anthrachinone: Alizarinrot, Kernechtrot Nitro- u. Nitrosofarbstoffe: Pikrinsäure Triphenylmethane: Anilinblau, Fuchsin, Lichtgrün, Gentianaviolett, Malachitgrün Phthalocyanine: Alicianblau, Luxol Fast blue Fluorochrome: Acridinorange, Auramin O, DAPI Naturfarbstoffe: Hämatoxylin, Karmin, Orcein Spezialfärbungen Knochen: Van-Gieson Gieson-Färbung Ziel: Anfärbung bestimmter Stoffgruppen Nervengewebe: Kresylviolett, Klüver-Barrera Bindegewebe: Kollagen (van Gieson, Masson-Goldner), elastische Fasern (Elastica), Retikulinfasern (Gomorri) Kohlenhydrate: Periodsäure Schiff Reagenz (PAS), Alzianblau, Kongorot Lipide: Sudan III, Oil Red Pigmente und Mineralien: Berliner Blau (Fe), Rhodanin (Cu), von Kossa (Ca-Phosphat, -karbonat, -oxalat) Mikroorganismen: Orcein (HBs), Ziehl-Neelsen (säurefeste Stäbchen), Warthin-Starry (Spirochäten), mod. Giemsa (Helicobacter), Gimenez (Chlamydien, Coxiellen), Grocott (Pilze) 35 36

10 Mucopolysaccharide: Periodic-Acid Acid-Schiff-Reaktion Eisen: Berliner-Blau Blau-Färbung Säurefeste Stäbchen: Ziehl-Neelsen Neelsen-Färbung Erregernachweis: Giemsa-Färbung Plazenta - Magen 39 40

11 Pilznachweis: Gomorri-Färbung Immunhistochemie 41 Ziel: selektive farbliche Darstellung von Zellstrukturen mit tierischen polyklonalen Antiseren oder monoklonalen Antikörpern Prinzip: a.) Primärantikörper (z.b. Maus) gegen die zu markierende Struktur, b.) Sekundärantikörper gegen den Primärantikörper (z.b. Kaninchen gegen Maus), c.) Detektionssystem oder direkte Kopplung an b.) Möglichkeiten: Verwendung von unterschiedlichen Farbmarkierungen und Fluorochromen Kombinationen: Mehrfachmarkierungen auch mit DNA/RNA-Farbstoffen (DAPI), Lektinen und der insitu-hybridisierung 42 Immunhistochemie: Sandwich-Technik Immunhistochemie: : Feuchte Kammer Detektionssystem (z.b. Avidin-Biotin- Complex) Sekundärantikörper (z.b. Ziege-Anti- Kaninchen) Primärantikörper (z.b. Kaninchen-Anti- Cytokeratin-pan) Antigen DAKO 44 43

12 Einsatz der Immunhistochemie 1. Erregerdiagnostik: - gegen alle Erreger (PC, HSV, CMV, HPV usw.), Problem der Spezifität 2. Tumordiagnostik: - CD-Rezeptoren bei Lymphomen (CD3, CD20) - Intermediärfilamente rfilamente zur Abklärung der Histogenese von Tumoren (Vimentin( Vimentin, Aktin, Desmin, Cytokeratin) - Tumorprodukte (Hormonrezeptoren, CEA) 3. Andere: Embryologie, Biologie Markierungsorte: Zellmembran (HER2neu/c-erb erb), Zytoplasma (Cytokeratin( Cytokeratin, Intermediärfilamente rfilamente), Zellkern (Hormonrezeptoren), Interstitium (Kollagen) 45 Beispiel: Lymphknotenvergrößerung 46 CD 20: B-Zellen B CD3: T-ZellenT Cytokeratin (AE1-AE3) AE3) Karzinommetastase 47 48

13 Mammakarzinom: HER2neu-Expression Expression Hormonrezeptor-Expression Epifluoreszenzmikroskopie und konfokale Laserrastermikroskopie Adenovirus Typ 3 Infektion (AdV-Hexon, Ck19) 48 h p.i. Nachweis von Chlamydien-LPS bei der Arteriosklerose (links) und in Adenoiden (rechts) grün: Chlamydia LPS 51 rot: Chlamydia LPS, blau: DAPI 52