Färbetechniken. Kultivierung auf Nährböden. Biochemische Tests. Wirksamkeit von Antibiotika. Übersicht Krankheitserreger

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1 Infektiologie - Kurs Färbetechniken Kultivierung auf Nährböden Biochemische Tests Wirksamkeit von Antibiotika Übersicht Krankheitserreger 1

2 Mikrobiologisches Praktikum - Färbetechniken für Bakterien Gramfärbung allgemein grampositiv gramnegativ Säurefestigkeits- Färbung allgemein Kinyoun-Färbung Neisser-Färbung MERKE Zellwand der meisten Eubakterien besteht aus Peptidoglykan, wobei grampositive Bakterien bis zu 40 Peptidoglykanschichten besitzen und bei gramnegativen Bakterien nur eine dünne Peptidoglykanschicht, dafür aber zusätzlich eine äußere Membran mit Lipopolysacchariden vorliegt dieser Unterschied wird in der Gramfärbung deutlich gemacht Vorgehen: nach Fixierung mit Methanol (3 min) wird der Ausstrich zunächst mit Kristallviolett gefärbt (1 min) -> nach Spülung mit Wasser mit Iod-Kaliumiodidlösung (Lugolsche Lösung) stabilisieren (1 min) -> Entfärbung mit 96%igem Alkohol (5-10 s überspülen) -> Gegenfärbung mit Safranin -> danach wieder mit Wasser überspülen und lufttrocknen lassen 2

3 Mikrobiologisches Praktikum - Färbetechniken für Bakterien Gramfärbung allgemein grampositiv gramnegativ Säurefestigkeits- Färbung allgemein Kinyoun-Färbung Neisser-Färbung Applikation von Kristallviolett Stabilisierung mit Iod-Kaliumiodidlösung Entfärbung mit Alkohol Applikation von Safranin 3

4 Mikrobiologisches Praktikum - Färbetechniken für Bakterien Gramfärbung allgemein grampositiv gramnegativ Säurefestigkeits- Färbung allgemein Kinyoun-Färbung Neisser-Färbung ANLEITUNG Durchführung der Gramfärbung: (1) Fixation des angefertigten Bakterienpräparats unter der Flamme des Bunsenbrenners (Hitzefixierung) oder durch dreiminütiges Einlegen in Methanol (2) Überbeschichtung der fixierten Präparate auf der Färbeschiene mit Kristallviolett (1 Minute) (3) Abspülen mit Leitungswasser (4) Beschichtung mit Jodstabilisierung (1 Minute) (5) Abspülen der Jodlösung mit Wasser (6) Überschichtung mit Entfärber über 5 Sekunden (7) Abspülen mit Wasser (8) Safraninfärbung (1 Minute) (9) Abspülen mit Wasser (10) Präparation lufttrocknen lassen oder mit Einwegtuch vorsichtig abtupfen (11) Mikroskopie unter Zuhilfenahme der Ölimmersion und dem 100er-Objektiv EXKURS beim Verfahren der Immersion bringt man zwischen Präparat und Objektiv eine Immersionsflüssigkeit (meist Öl) ein, mit dem Ziel, die optische Auflösung zu steigern und unerwünschte Reflexionen und hohe Brechungsindices zu umgehen da Immersionsmedien einen höheren Brechungsindex als Luft haben, verringert sich der unerwünschte Effekt der Ablenkung des Lichtes von der optischen Achse und der Raumwinkel des Lichtkegels, der vom Objekt ausgeht und in das Objektiv gelangt, erfährt eine Erweiterung Folge: Vergrößerung der numerischen Apertur und Steigerung der Auflösung durch zunehmenden Informationsgehalt des vermehrt einfallenden Lichtes 4

5 Mikrobiologisches Praktikum - Färbetechniken für Bakterien Gramfärbung allgemein grampositiv gramnegativ Säurefestigkeits- Färbung allgemein Kinyoun-Färbung Neisser-Färbung MIKROSKOPIE Kultur von Staphylokokkus aureus nach einer Gramfärbung: Haufenkokken sind tiefviolett gefärbt MERKE grampositive Bakterien erscheinen auf dem Objektträger wegen der dicken Peptidoglykanschicht tiefviolett und können nach der Alkoholbehandlung nicht entfärbt werden, so dass sie weiterhin das Kristallviolett des ersten Färbungsschrittes enthalten grampositive Bakterien: Actinomyces Streptomyces Staphylococcus Streptococcus Enterococcus Listeria Bacillus Clostridium Lactobacillus Erysipelothrix Corynebacterium EXKURS Durchführung der Gramfärbung bei Kulturen die etwa 24 Stunden gewachsen sind, da es bei älteren Kulturen oft uneinheitliche Ergebnisse gibt 5

6 Mikrobiologisches Praktikum - Färbetechniken für Bakterien Gramfärbung allgemein grampositiv gramnegativ Säurefestigkeits- Färbung allgemein Kinyoun-Färbung Neisser-Färbung MIKROSKOPIE Kultur von Escherichia coli nach einer Gramfärbung: Stäbchenbakterien sind stark rötlich gefärbt MERKE gramnegative Bakterien erscheinen auf dem Objektträger wegen der dünnen Peptidoglykanschicht stark rötlich, da sie sich das Kristallviolett durch den Alkohol auswaschen lässt und eine anschließende Anfärbung mit Safranin möglich ist gramnegative Bakterien: Escherichia coli Salmonella Shigella Klebsiella Proteus Enterobacter Pseudomonas Neisseria Chlamydia Leptospira Borrelia Treponema Rickettsia Pasteurella Bartonella Brucella Moraxella Vibrio Haemophilus Campylobacter Helicobacter 6

7 Mikrobiologisches Praktikum - Färbetechniken für Bakterien Gramfärbung allgemein grampositiv gramnegativ MIKROSKOPIE Gefärbtes Präparat von Mycobacterium tuberculosis: säurefeste, stäbchenförmige Zellen erscheinen rötlich gefärbt MIKROSKOPIE Pseudomonas aeruginosa ist eine nicht säurefeste Art und erscheint im Mikroskop blau gefärbt Säurefestigkeits- Färbung allgemein Kinyoun-Färbung Neisser-Färbung MERKE mit Hilfe der Säurefestigkeitsfärbung lassen sich Bakterien zuordnen, die einen hohen Gehalt an hydrophoben Substanzen in der Zellwand aufweisen und daher auf die gewöhnliche Gramfärbung nicht ansprechen dafür wird allerdings Karbolfuchsin aufgenommen, allerdings auch durch ein Waschen mit einem Salzsäure-Ethanol-Gemisch nicht wieder freigesetzt, so dass man solche Arten als säurefest bezeichnet Arten ohne hohen Anteil an hydrophoben Substanzen lassen sich durch das Säure-Ethanol-Gemisch entfärben und mit Methylenblau nachfärben Kinyoun-Färbung ist Standard-Färbung - > Ziel: Identifizierung von säurefesten Arten der Gattung Mycobacterium 7

8 Mikrobiologisches Praktikum - Färbetechniken für Bakterien Gramfärbung allgemein grampositiv gramnegativ EXKURS Joseph Kinyoun Säurefestigkeits- Färbung allgemein Kinyoun-Färbung Neisser-Färbung Salzsäure-Alkohol als Entfärber (links), Karbolfuchsin (Mitte) und Malachit-Grün- Lösung (rechts) ANLEITUNG Durchführung der modifizierten Kinyoun-Färbung: (1) Hitzefixierung des angefertigten Bakterienpräparats (2) Überbeschichtung mit Karbolfuchsin über 5 Minuten (3) Abspülen mit Wasser (4) Entfärbung mit Salzsäure-Alkohol (5) Färbung mit Malachitgrün über 2 Minuten (6) Abspülen mit Wasser und Präparat lufttrocknen lassen -> bei der Mikroskopie erscheinen die Mykobakterien rot 8

9 Mikrobiologisches Praktikum - Färbetechniken für Bakterien Gramfärbung allgemein grampositiv gramnegativ EXKURS Maximilian Neisser ( ) deutscher Bakteriologe MIKROSKOPIE Präparat von Corynebacterium diphtheriae als Erreger der Diphtherie nach Neisser-Färbung: die Polkörperchen aus Polyphosphat und Calcium erscheinen als dunkelblau gefärbte endständige Auftreibungen; das übrige Bakterium stellt sich gelbbraun dar und lagert sich oft V- und Y-artigen Formationen zusammen Säurefestigkeits- Färbung allgemein Kinyoun-Färbung Neisser-Färbung ANLEITUNG Durchführung der Neisser-Färbung: (1) Fixierte Präparate werden in den vorbereiteten Küvetten gefärbt (2) Neisser I und II über 2 Minuten: enthält Eisen-Methylenblau und Kristallviolett (3) ohne Abspülen für 2 Minuten in zweite Küvette mit Neisser III geben: enthält Chrysoidin als Gegenfärbung (4) nicht Abspülen und lufttrocknen lassen 9

10 Mikrobiologisches Praktikum - Kultivierung von Bakterien Temperaturansprüche MERKE Aerobes/Anaerobes Wachstum Plattenausstrich Staphylococcus aureus-kulturen auf Blut-Agar nach 24 Stunden bei 35, 25 und 5 um ein rasches Wachstum der Erreger sicherzustellen, müssen die Kulturen bei möglichst optimaler Temperatur bebrütet werden feste Nährböden: Sabouraud- Dextrose-Agar (SDA) die meisten Bakterien sind mesophil (= bevorzugen Temperaturen zwischen 20 und 40 C), so auch diese aus dem menschlichen Körper mit einem Wachstumsoptimum bei 35 C Nutrient-Agar Blut-Agar Kochblut-Agar in der Nähe des Temperaturoptimums stärkere Zellteilung mit höheren Zellzahlen -> sichtbare Kolonien Colistin- Nalidixinsäure-Agar Mannitol-Salz-Agar Endo-Agar MacConkey-Agar Hektoen-Agar Winkle-Agar Salmonella-Shigella- Agar Leifson-Agar Brutschrank mit Bakterienkulturen Schaedler-Agar 10

11 Mikrobiologisches Praktikum - Kultivierung von Bakterien Temperaturansprüche Aerobes/Anaerobes Wachstum Plattenausstrich feste Nährböden: Sabouraud- Dextrose-Agar (SDA) Nutrient-Agar Blut-Agar Kochblut-Agar MERKE aerobe oder fakultativ aerobe Bakterien wachsen bei normaler atmosphärischer Luft unter Anwesenheit von Sauerstoff Neisseria gonorrhoeae und Haemophilus influenzae wachsen am besten, wenn die Luft nicht nur einen geringen Sauerstoffgehalt aufweist, sondern mit Kohlenstoffdioxid angereichert ist -> kapnophile Bedingungen (erreichbar mit Kerzentopf) Campylobacter jejuni benötigt mikroaerophile Bedingungen, wächst also nur unter reduziertem Sauerstoffgehalt -> mikroaerophile Bedingungen (erreichbar mit Bio-Bags) anaerobe Bedingungen, wie etwa Clostridium-Arten benötigen eine Atmosphäre ohne Sauerstoff -> anaerobe Bedingungen erreicht man durch eine Anaerobenkammer Colistin- Nalidixinsäure-Agar Mannitol-Salz-Agar Endo-Agar MacConkey-Agar Hektoen-Agar Winkle-Agar Salmonella-Shigella- Agar Anaerobenkammer, deren Atmosphäre auch Kohlenstoffdioxid oder Wasserstoff beigemischt Werden können Leifson-Agar Schaedler-Agar 11

12 Mikrobiologisches Praktikum - Kultivierung von Bakterien Temperaturansprüche Aerobes/Anaerobes Wachstum Erregerisolierung und Plattenausstrich feste Nährböden: Tupfer mit steriler Transporthülse Sabouraud- Dextrose-Agar (SDA) Nutrient-Agar Blut-Agar Kochblut-Agar Colistin- Nalidixinsäure-Agar Mannitol-Salz-Agar Endo-Agar MacConkey-Agar Hektoen-Agar Winkle-Agar Salmonella-Shigella- Agar Leifson-Agar Schaedler-Agar Aerobic/Anaerobic Cultural Bottles MERKE Bakterien von menschlichen Körperoberflächen (Haut/Schleimhaut) lassen sich mithilfe steriler Abstrichtupfer gewinnen Tupfer verbleiben bis zum Ausstrich auf Nährböden in steriler Hülse für den Nachweis von Erregern in Blutproben werden flüssige Nährmedien verwendet: hierbei benutzt man handelsübliche mit Nährlösung gefüllte Kulturfläschchen (Aerobic/Anaerobic Culture Bottles) -> bei positiven Anzeichen bakteriellen Wachstums (Trübung, Gasbildung, Farbumschlag am Gefäßboden) kann man das Medium zum Animpfen geeigneter Nährböden verwenden, um die Keime zu vereinzeln 4-Ösen-Ausstrich: einer ausgewählten vorgezüchteten Kolonie werden mit der Impföse einige Zellen entnommen und diese im oberen Teil einer frischen Agarplatte verteilt (1) -> anschließend streicht man mit neuer Öse aus dem Randbereich des gerade durchgeführten Ausstrichs erneut aus (2) -> diesen Vorgang wiederholt man noch zweimal (3), (4) Impf-Öse 12

13 Mikrobiologisches Praktikum - Kultivierung von Pilzen Temperaturansprüche Aerobes/Anaerobes Wachstum Plattenausstrich feste Nährböden: Sabouraud-Dextrose- Agar (SDA) Nutrient-Agar Blut-Agar Kochblut-Agar Colistin- Nalidixinsäure-Agar Mannitol-Salz-Agar Endo-Agar MacConkey-Agar Hektoen-Agar Winkle-Agar Sabouraud-Dextrose-Agar mit Pilzkolonien MERKE Pilze werden durch die schnelle Ausbreitung von Bakterien auf einem Nährboden am Wachstum gehindert, so dass sie sich auf einer Agarplatte nur dann ansiedeln können, wenn dort nur wenige Bakterien wachsen der Sabouraud-Dextrose-Agar (SDA) unterstützt pilzähnliches Wachstum, weil es sehr viel Dextrose enthält und zudem einen ph-wert von 5,6 aufweist außerdem werden dem Nährboden antibiotische Substanzen zugegeben (z.b. Gentamicin), um das bakterielle Wachstum einzuschränken Salmonella-Shigella- Agar Leifson-Agar Schaedler-Agar Dip Slide-Nährboden 13

14 Mikrobiologisches Praktikum - Kultivierung von Pilzen Temperaturansprüche Aerobes/Anaerobes Wachstum Plattenausstrich Ausstrich von Citrobacter freundii auf Nutrient-Agar: Kolonien sind rund, konvex, glatt, glänzend, cremefarben Ausstrich von Escherichia coli auf Nutrient-Agar: Kolonien sind rund, konvex, glatt, glänzend, groß, gelbbraun feste Nährböden: Sabouraud-Dextrose- Agar (SDA) Nutrient-Agar Blut-Agar Kochblut-Agar Colistin- Nalidixinsäure-Agar Mannitol-Salz-Agar Endo-Agar MacConkey-Agar Hektoen-Agar Winkle-Agar Salmonella-Shigella- Agar Leifson-Agar Schaedler-Agar Dip Slide-Nährboden MERKE als Fangplatten für die bakterielle Belastung der Umgebungsluft eignet sich der Fleischextrat und Pepton enthaltener Nutrient-Agar, auf dem zahlreiche heterotrophe Bakterien wachsen können, die in der Luft, im Erdboden vorkommen gehört zu den nicht selektiven Agarplatten Medium zur Anzucht von Candida albicans 14

15 Mikrobiologisches Praktikum - Kultivierung von Bakterien Temperaturansprüche Aerobes/Anaerobes Wachstum Plattenausstrich Blut-Agar-Platte, die mit Sputum beimpft wurde Ausstrich von Enterobacter aerogenes auf Blut-Agar feste Nährböden: Sabouraud-Dextrose- Agar (SDA) Nutrient-Agar Blut-Agar Kochblut-Agar Colistin- Nalidixinsäure-Agar Mannitol-Salz-Agar Endo-Agar MacConkey-Agar Hektoen-Agar Winkle-Agar Salmonella-Shigella- Agar Leifson-Agar Schaedler-Agar Dip Slide-Nährboden MERKE für die Anzucht von Bakterien aus klinischen Proben werden normalerweise komplexe Medien wie Blut-Agar und Kochblut-Agar verwendet Blut-Agar besteht aus einem Hirn-Herz- oder Tryptic-Soy-Basalmedium sowie aus 5-10% defibriniertem menschlichem oder tierischem Blut (Schaf-, Pferde- oder Kaninchenblut) und wird als Medium zur Isolierung von Erregern aus Sputum, Mund- und Rachenraum oder Hautabstrichen verwendet eignet sich als Differenzierungsmedium bezüglich der Eigenschaften von Bakterien zur Auflösung von Blutkörperchen (Hämolyse) 15

16 Mikrobiologisches Praktikum - Kultivierung von Bakterien Temperaturansprüche Aerobes/Anaerobes Wachstum Links: durch Streptococcus pyogenes hervorgerufene ß-Hämolyse auf Blut-Agar Rechts: durch Streptococcus pneumoniae hervorgerufene α-hämolyse mit Vergrünung Plattenausstrich feste Nährböden: Sabouraud-Dextrose- Agar (SDA) Nutrient-Agar Blut-Agar Kochblut-Agar Colistin- Nalidixinsäure-Agar Mannitol-Salz-Agar Endo-Agar MacConkey-Agar Hektoen-Agar Winkle-Agar Salmonella-Shigella- Agar Leifson-Agar Schaedler-Agar Dip Slide-Nährboden γ-hämolyse bei Enterococcus faecalis auf Blut-Agar MERKE α-hämolyse: Vergrünung -> Bakterien produzieren keine Hämolysine, und führen zu keiner echten Hämolyse, sondern zu einem Kaliumverlust der Erythrozyten und einer Reduktion des Hämoglobins zu Biliverdin -> grünliche Zonen sichtbar ß-Hämolyse: Bakterien produzieren Streptolysin O und S und sind von einer klaren Hämolysezone umgeben -> Hämoglobin wird vollständig abgebaut und es handelt sich um eine echte und vollständige Hämolyse mit Zerstörung der roten Blutzellen γ-hämolyse: kein Hämolyseverhalten, Agar um die Kolonien bleibt unverändert 16

17 Mikrobiologisches Praktikum - Kultivierung von Bakterien Temperaturansprüche Aerobes/Anaerobes Wachstum Bakterielles Wachstum von Haemophilus influenzae auf Koch-Blut-Agar Plattenausstrich feste Nährböden: Sabouraud-Dextrose- Agar (SDA) Nutrient-Agar Blut-Agar Kochblut-Agar Colistin- Nalidixinsäure-Agar Mannitol-Salz-Agar Endo-Agar MacConkey-Agar Hektoen-Agar Winkle-Agar Salmonella-Shigella- Agar Leifson-Agar Schaedler-Agar Dip Slide-Nährboden MERKE der hauptsächlich Pepton und Blut enthaltene Kochblut-Agar (= Schokoladen-Agar) wird ebenfalls als Medium zur Isolierung und Kultivierung von Bakterien wie Neisseria gonorrhoeae und Haemophilus influenzae verwendet durch kurzzeitiges Erhitzen des Agars auf 80 C wird eine Lyse der Erythrozyten erreicht -> durch die Lyse werden Hämin und NAD in den Agar freigesetzt und können dort von Bakterien verstoffwechselt werden 17

18 Mikrobiologisches Praktikum - Kultivierung von Bakterien Temperaturansprüche Aerobes/Anaerobes Wachstum Nutrient-Agar (links) und ein Colistin-Nalidixinsäure-Agar (rechts), die beide mit Staphylococcus aureus (SA) und Escherichia coli (EC) beimpft wurden -> Wachstum von E. coli wird auf CNA-Agar gehemmt Plattenausstrich feste Nährböden: Sabouraud-Dextrose- Agar (SDA) Nutrient-Agar Blut-Agar Kochblut-Agar Colistin- Nalidixinsäure-Agar Mannitol-Salz-Agar Endo-Agar MacConkey-Agar Hektoen-Agar Winkle-Agar Salmonella-Shigella- Agar Leifson-Agar Schaedler-Agar Dip Slide-Nährboden MERKE Colistin-Nalidixinsäure-Agar (CNA) enthält neben Blut vor allem Colistin und Nalidixinsäure beide Substanzen hemmen das Wachstum gramnegativer Bakterien, so dass sich das Medium gut zur Isolierung von grampositiven Bakterien, wie Staphylococcus aureus eignet 18

19 Mikrobiologisches Praktikum - Kultivierung von Bakterien Temperaturansprüche Aerobes/Anaerobes Wachstum Plattenausstrich Mannitol-Salz-Agar, der mit Staphylococcus aureus (links) und Staphylococcus epidermidis (rechts) beimpft wurde -> nur Staphylococcus aureus kann das Mannit zu sauren Zwischenprodukten abbauen -> gelbe Färbung feste Nährböden: Sabouraud-Dextrose- Agar (SDA) Nutrient-Agar MERKE Mannitol-Salz-Agar (MSA) enthält 7,5 % NaCl, dass die meisten Bakterien hemmt, bis auf die Staphylokokken, die sich auf diesem Medium durch ihre Fähigkeit zur Verwertung von Mannit unterscheiden lassen Blut-Agar Kochblut-Agar Colistin- Nalidixinsäure-Agar Mannitol-Salz-Agar durch die Verstoffwechslung von Mannit durch Staphylococcus aureus fällt der ph und der rote ph-indikator verfärbt das Medium gelblich Staphylococcus epidermidis kann Mannit nicht verwerten -> kein Farbumschlag Endo-Agar MacConkey-Agar Hektoen-Agar Winkle-Agar Salmonella-Shigella- Agar Leifson-Agar Schaedler-Agar Dip Slide-Nährboden 19

20 Mikrobiologisches Praktikum - Kultivierung von Bakterien Temperaturansprüche Aerobes/Anaerobes Wachstum Plattenausstrich Endo-Agarplatte, die mit einem Lactose-positiven (E. coli, links) und einem Lactose-negativen Stamm (Shigella flexneri, rechts) beimpft ist -> die Laktoseverwertende Art erscheint rot feste Nährböden: Sabouraud-Dextrose- Agar (SDA) Nutrient-Agar Blut-Agar Kochblut-Agar Colistin- Nalidixinsäure-Agar Mannitol-Salz-Agar MERKE Endo-Agar enthält basisches Fuchsin, das grampositive Bakterien in ihrem Wachstum hemmt -> selektives Anreicherungsmedium für gramnegative Arten Differenzierungsmedium, um Laktosepositive und Laktose-negative Bakterien zu unterscheiden Laktose-negative Bakterien (Shigella flexneri) bleiben farblos! Ähnlichkeiten zum MacConkey-Agar! Endo-Agar MacConkey-Agar Hektoen-Agar Winkle-Agar Salmonella-Shigella- Agar Leifson-Agar Schaedler-Agar Dip Slide-Nährboden 20

21 Mikrobiologisches Praktikum - Kultivierung von Bakterien Temperaturansprüche Aerobes/Anaerobes Wachstum Plattenausstrich Laktose-positive Stämme (E. coli, links) und Lactose-negative Stämme (Shigella flexneri, rechts) auf MacConkey-Nährboden -> Laktose-positive Bakterien nehmen eine rosa und rötliche Färbung an Wachstum von Staphylococcus aureus (SA) auf MAC-Agar wird gehemmt, während E. coli (EC) gut wächst feste Nährböden: Sabouraud-Dextrose- Agar (SDA) Nutrient-Agar Blut-Agar Kochblut-Agar Colistin- Nalidixinsäure-Agar Mannitol-Salz-Agar Endo-Agar MacConkey-Agar Hektoen-Agar Winkle-Agar MERKE MacConkey-Agar enthält Gallensalze und Kristallviolett, die beide das Wachstum grampositiver Bakterien hemmen und sich zum Isolieren gramnegativer Arten eignen Differenzierungsmedium, um Laktosepositive und Laktose-negative Bakterien zu unterscheiden Salmonella-Shigella- Agar Leifson-Agar Schaedler-Agar Dip Slide-Nährboden EXKURS Enterobacter aerogenes bildet auf MAC-Agar rote Kolonien ohne dunkle Mitte 21

22 Mikrobiologisches Praktikum - Kultivierung von Bakterien Temperaturansprüche Aerobes/Anaerobes Wachstum Plattenausstrich feste Nährböden: Sabouraud-Dextrose- Agar (SDA) Nutrient-Agar Blut-Agar Kochblut-Agar Colistin- Nalidixinsäure-Agar Mannitol-Salz-Agar Endo-Agar MacConkey-Agar Hektoen-Agar Winkle-Agar Mit Escherichia coli (links) sowie Shigella flexneri (rechts) beimpfter Hektoen- Agar: Laktose-positives E. coli-bakterium erscheint orangefarben, während Laktose-negative Shigellen grünlich gefärbt sind MERKE Hektoen-Agar (HE) enthält mit Gallensalzen, Bromthymolblau und saurem Fuchsin drei Substanzen, die grampositive Bakterien, aber auch z.t. gramnegative Bakterien hemmen eignet sich für Kultur der Salmonella- und Shigella-Arten Differenzierungsmedium bezüglich Laktosestoffwechsel Laktose-negativ: Grünfärbung Salmonella-Shigella- Agar Leifson-Agar Schaedler-Agar 22

23 Mikrobiologisches Praktikum - Kultivierung von Bakterien Temperaturansprüche Aerobes/Anaerobes Wachstum Plattenausstrich Mit Escherichia coli beimpfte Winkle-Platte: Laktose-positives E. coli- Bakterium verfärbt Winkle-Agar gelb MERKE Winkle-Agar eignet sich nur für Kultur der gramnegativen Bakterien, grampositive Spezies, wie Staphylococcus aureus oder Staphylococcus epidermidis zeigen kein Wachstum und somit keinen Farbumschlag feste Nährböden: Sabouraud-Dextrose- Agar (SDA) Nutrient-Agar Blut-Agar Kochblut-Agar Colistin- Nalidixinsäure-Agar Mannitol-Salz-Agar Endo-Agar MacConkey-Agar Hektoen-Agar Winkle-Agar Salmonella-Shigella- Agar Leifson-Agar Schaedler-Agar Dip Slide-Nährboden Differenzierungsmedium bezüglich Laktosestoffwechsel zur Lactosespaltung befähigte Bakterien (z.b. E. coli) bewirken eine Ansäuerung des Nährmediums, in dessen Folge der Farbindikator Bromthymolblau nach Gelb umschlägt Keime der Salmonella-Shigella-Gruppe wachsen in glasig-grünen Kolonien Proteus wird am Schwärmen gehindert 23

24 Mikrobiologisches Praktikum - Kultivierung von Bakterien Temperaturansprüche Aerobes/Anaerobes Wachstum Plattenausstrich Salmonella-Shigella-Agar (SS) mit Escherichia coli (links, rosa gefärbt) und Salmonella typhimurium (rechts, schwarz gefärbt) feste Nährböden: Sabouraud-Dextrose- Agar (SDA) Nutrient-Agar MERKE Salmonella-Shigella-Agar (SS) enthält mit Gallensalzen, Natriumcitrat und dem Farbstoff Brillliantgrün drei Substanzen, die das Wachstum grampositiver Bakterien hemmen Blut-Agar Kochblut-Agar Colistin- Nalidixinsäure-Agar Wachstumsvorteil für Salmonella- und Shigella-Arten Differenzierungsmedium bezüglich Laktosestoffwechsel: Escherichia coli ist Laktose-positiv -> rosa gefärbt Mannitol-Salz-Agar Endo-Agar Schwarzfärbung der Salmonella-Kolonien durch die Bildung von Schwefelwasserstoff MacConkey-Agar Hektoen-Agar Winkle-Agar Salmonella-Shigella- Agar Leifson-Agar Schaedler-Agar Dip Slide-Nährboden 24

25 Mikrobiologisches Praktikum - Kultivierung von Bakterien Temperaturansprüche Aerobes/Anaerobes Wachstum Plattenausstrich Leifson-Agar mit Anzucht pathogener Darmkeime 1 feste Nährböden: Sabouraud-Dextrose- Agar (SDA) Nutrient-Agar Blut-Agar Kochblut-Agar Colistin- Nalidixinsäure-Agar Mannitol-Salz-Agar Endo-Agar MacConkey-Agar Hektoen-Agar Winkle-Agar 2 3 Salmonella-Shigella- Agar Leifson-Agar Schaedler-Agar Dip Slide-Nährboden MERKE Desoxycholat-Citrat-Agar = Leifson-Agar 25

26 Mikrobiologisches Praktikum - Kultivierung von Bakterien Temperaturansprüche Aerobes/Anaerobes Wachstum Plattenausstrich Schaedler-Agar mit Wachstum von obligat anaeroben Bakterienstämmen feste Nährböden: Sabouraud-Dextrose- Agar (SDA) Nutrient-Agar Blut-Agar Kochblut-Agar Colistin- Nalidixinsäure-Agar Mannitol-Salz-Agar Endo-Agar MERKE Schaedler-Agar mit 5 % Schafblut ist ein nährstoffreiches Medium, welches speziell für das Wachstum von obligaten Anaerobiern, wie z.b. Lactobacillen, Streptokokken, Clostridien und Bacteroides, entwickelt wurde Kanamycin hemmt gramnegative fakultativ anaerobe Stäbchen und einige andere fakultative Bakterien, während Vancomycin grampositive Bakterien hemmt -> Zusatz dieser antimikrobiellen Substanzen macht das Medium selektiv für gramnegative obligate Anaerobier, wie z.b. Bacteroides und Prevotella MacConkey-Agar Hektoen-Agar Winkle-Agar Salmonella-Shigella- Agar Leifson-Agar Schaedler-Agar Dip Slide-Nährboden 26

27 Mikrobiologisches Praktikum - Kultivierung von Bakterien Temperaturansprüche Aerobes/Anaerobes Wachstum Plattenausstrich Dip Slide Nährboden nach Inkubation mit Mittelstrahlurin MERKE das dreiseitige Dip Slide (Eintauch- Objektträger) ist beschichtet mit Medien zum Nachweis von grampositiven und gramnegativen Bakterien sowie Pilzen (rote Fläche) im Urin (Uricult-Verfahren) feste Nährböden: Sabouraud-Dextrose- Agar (SDA) Nutrient-Agar Blut-Agar Kochblut-Agar Colistin- Nalidixinsäure-Agar Mannitol-Salz-Agar Endo-Agar MacConkey-Agar Hektoen-Agar Winkle-Agar grampositive und gramnegative Erreger Rötlich: gramneg. Erreger Gelb: Pilznachweis entsprechend der Dichte der Eintauchkulturen kann der Keimbesatz bewertet und das Vorliegen einer Infektion abgeschätzt werden Salmonella-Shigella- Agar Leifson-Agar Schaedler-Agar Dip Slide-Nährboden 27

28 Mikrobiologisches Praktikum - Biochemische Tests zur Identifizierung von Bakterien Katalase-Test Koagulase-Test Simmons-Citrat-Agar H 2 S-Nachweis Indolproduktion Test mit Eisen- Zweizucker-Agar (Kligler) Urease-Nachweis Katalase-Test auf einem Objektträger: Aufschäumen als Katalasepositive Reaktion bei Staphylococcus epidermidis (rechts) und keine Reaktion bei Enterococcus faecalis (links) MERKE während der aeroben Atmung entsteht Wasserstoffperoxid, das mit Hilfe der Katalase zu Wasser und Sauerstoff (aufsteigende Bläschen) gespalten werden kann einigen Bakteriengattungen fehlt dieses Enzym jedoch (Streptococcus und Enterococcus) -> daher lassen sich diese Bakterien leicht von Katalasepositiven Organismen (Staphylococcus, Micrococcus) unterscheiden Durchführung: man tropft Katalase-Reagenz (3%-ige Wasserstoffperoxid-Lösung) auf eine mit der Öse auf den Objektträger aufgetragene Kultur und beobachtet, ob es zu einer Gasbildung kommt MERKE 28

29 Mikrobiologisches Praktikum - Biochemische Tests zur Identifizierung von Bakterien Katalase-Test Koagulase-Test Simmons-Citrat-Agar Koagulase-Test auf einem Objektträger: Agglutination als Koagulase-positive Reaktion bei Staphylococcus aureus (unten) und keine Reaktion bei Staphylococcus epidermidis (oben) H 2 S-Nachweis Indolproduktion Test mit Eisen- Zweizucker-Agar (Kligler) Urease-Nachweis MERKE mit dem Objektträgerkoagulase-Test lässt sich der zellwandständige Clumping factor von Staphylococcus aureus nachweisen Erreger kann damit gegen die Gruppe der Koagulase-negativen Staphylokokken (Staphylococcus epidermidis und Staphylococcus saprophyticus) abgegrenzt werden auf Objektträger wird ein Tropfen Kaninchenplasma mit dem Probenmaterial verrieben -> enthält dieses Staphylococcus aureus resultiert innerhalb von 1-2 Minuten eine mit bloßen Auge sichtbare Verklumpung Koagulase wandelt zusammen mit Thrombin Fibrinogen in Fibrin um -> Ausfällung 29

30 Mikrobiologisches Praktikum - Biochemische Tests zur Identifizierung von Bakterien Katalase-Test Koagulase-Test Simmons-Citrat-Agar H 2 S-Nachweis Indolproduktion Test mit Eisen- Zweizucker-Agar (Kligler) Urease-Nachweis Simmons-Citrat-Agarplatte, die mit Escherichia coli (links) und Enterobacter aerogenes (rechts) beimpft wurde -> E. Coli besitzt keine Citrat-Lyase, während Enterobacter aerogenes Citrat verwertet und das Medium blau verfärben; unten: Citrat-Röhrchen mit Simmons-Agar MERKE MERKE Carbonsäure Citrat kann von Bakterien, die das Enzym Citratlyase besitzen (Enterobacter aerogenes, Salmonella typhi) als C-Quelle verwendet werden Nachweis: Schrägagarröhrchen oder Petrischalen mit Simmons- Citrat-Agar Nährböden enthält Natriumcitrat als Substrat und Bromthymolblau als ph-indikator: bei ph von 6,9 grüne Färbung und bei PH von 7,6 mit blauem Farbumschlag grüner Agar: keine Citratverwertung blauer Agar: Citratverwertung 30

31 Mikrobiologisches Praktikum - Biochemische Tests zur Identifizierung von Bakterien Katalase-Test Koagulase-Test Simmons-Citrat-Agar H 2 S-Nachweis Indolproduktion Test mit Eisen- Zweizucker-Agar (Kligler) Urease-Nachweis Tests auf H 2 S-Bildung mit SIM-Medien: Proteus vulgaris (links) ist H 2 S-positiv, Escherichia coli (Mitte) ist H 2 S-negativ, unbeimpfte Kontrolle (rechts) MERKE Bakterien verwenden das Enzym Cystein-Desulfarase, um aus der schwefelhaltigen Aminosäure Cystein Schwefelwasserstoff freizusetzen, aber auch um Thiosulfat zu H2S zu reduzieren -> Proteus vulgaris und Salmonella typhi besitzen dieses Enzym für den Test wird SIM-Agar verwendet, den man auch als Medium für die Überprüfung der Bewegungsfähigkeit von Bakterien und für den Indolnachweis benutzt -> Nährboden enthält neben Pepton (= Quelle für die Aminosäure Cystein), Fleischextrakt, Natriumthiosulfat, Eisensulfat (= liefert Eisen für die Nachweisreaktion) und Weichagar neben SIM-Agar kann man für den H 2 S-Nachweis auch Dreizucker- Eisen-Agar und den Kligler-Agar benutzen Kulturröhrchen werden mit einer sterilen Impfnadel beimpft und bei 35 C für Stunden inkubiert Eisen reagiert dem entstehenden H 2 S und es entsteht Eisensulfid, verbunden mit einer schwarzen Verfärbung des Mediums -> Schwärzung gilt als positives Testergebnis MERKE 31

32 Mikrobiologisches Praktikum - Biochemische Tests zur Identifizierung von Bakterien Katalase-Test Koagulase-Test Simmons-Citrat-Agar H 2 S-Nachweis Indolproduktion Test mit Eisen- Zweizucker-Agar (Kligler) Urease-Nachweis Indolnachweis in Röhrchen mit SIM-Agar: jede Kultur wurde mit 5 Tropfen Kovacs-Reagenz versetzt, dass sich auf der Agar-Oberfläche absetzt: Escherichia coli (links; Indolnachweis positiv) und Enterobacter aerogenes (Mitte; Indolnachweis negativ), rechts unbeimpfte Kontrolle MERKE Indolnachweis zur Charakterisierung von Enterobakterien Grundlage ist das Enzym Tryptophanase, mit dessen Hilfe bestimmte Bakterien die Aminosäure Tryptophan zu Indol, Pyruvat und Ammoniak abbauen können Arten mit Tryptophanase-Aktivität sind Escherichia coli und Proteus vulgaris, während Serratia marcescens und Enterobacter aerogenes dieses Enzym nicht produzieren Beimpfen der SIM-Agar-Röhrchen mit Kovacs-Reagenz, das Amylalkohol, Salzsäure und para-dimethylaminobenzaldehyd enthält (letzteres ruft in Reaktion mit Indol eine Rotfärbung hervor) bei Farbumschlag zu rot ist der Indolnachweis positiv MERKE 32

33 Mikrobiologisches Praktikum - Biochemische Tests zur Identifizierung von Bakterien Katalase-Test Koagulase-Test Simmons-Citrat-Agar H 2 S-Nachweis Indolproduktion Test mit Eisen- Zweizucker-Agar (Kligler) Spezies Laktose Glukose Gas H 2 S Citrat Indol Escherichia coli Klebsiella pneumoniae /- - Serratia marcescens Shigella Proteus vulgaris Salmonella Pseudomonas aeruginosa Urease-Nachweis Schrägschicht A - Bakterien ohne Laktose-Vergärung B - Bakterien mit Laktose-Vergärung C - Bakterien ohne Glukose-Vergärung D - Bakterien mit Glukose-Vergärung Hochschicht 33

34 Mikrobiologisches Praktikum - Biochemische Tests zur Identifizierung von Bakterien Katalase-Test Koagulase-Test Simmons-Citrat-Agar H 2 S-Nachweis Indolproduktion Test mit Eisen- Zweizucker-Agar (Kligler) Urease-Nachweis MERKE mit den beiden Medien Dreizucker-Eisen-Agar (TSI-Agar) und Eisen-Zweizucker-Agar nach Kligler (KIA- Agar) kann man die Vergärung von Kohlenhydraten als auch die Bildung von Schwefelwasserstoff nachweisen sowohl TSI- als auch KIA-Agar enthalten Fleisch- und Hefeextrakt sowie Pepton zur Unterstützung des bakteriellen Wachstums im TSI-Agar sind zusätzlich drei Zucker enthalten: Glucose, Lactose und Saccharose im KIA-Agar sind zusätzlich zwei Zucker enthalten: Glucose und Lactose Schwefelquelle für H2S-Produktion ist Natriumthiosulfat als ph-indikator dient in beiden Medien Phenolrot, dass sich bei sauren ph-werten gelb und bei alkalischen ph-werten dunkelrot färbt Beimpfung der Hochschicht (unterer Teil) als Stichkultur, anschließend streicht man die Impföse/Nadel auf der Schrägschicht (obere Schrägfläche des Agars) aus EXKURS durch den Glukoseabbau entsteht Säure und bei ph < 7 wird Phenolrot gelb -> nach Oxidation der Säuren an der Schrägfläche in Gegenwart von Luftsauerstoff wird der Agar im oberen Bereich realkalisiert (der ph-wert steigt über 7) und dieser Teil des Agars wird rot, es sei denn, auch Laktose wird gespalten, wodurch zusätzliche Säure gebildet wird -> dann bleibt der gesamte Agar durch die größere Säuremenge gelb geschehen die obigen Reaktionen ohne Verwendung von Sauerstoff (Gärung), so bildet sich CO 2, das als kleine bis große Gasblasen und Risse im Agar sichtbar wird Gebildetes H 2 S reagiert zu Eisensulfid, das als schwarzer Niederschlag ausfällt 34

35 Mikrobiologisches Praktikum - Biochemische Tests zur Identifizierung von Bakterien Katalase-Test Koagulase-Test Simmons-Citrat-Agar H 2 S-Nachweis Indolproduktion Test mit Eisen- Zweizucker-Agar (Kligler) Urease-Nachweis MERKE da keine Säuren produziert wurden, ist der ph-wert des Mediums nicht abgesunken Hochschicht und Schrägschicht bleiben rot gefärbt Beispiele: Pseudomonas aeruginosa, Yersinia pestis 35

36 Mikrobiologisches Praktikum - Biochemische Tests zur Identifizierung von Bakterien Katalase-Test Koagulase-Test Simmons-Citrat-Agar H 2 S-Nachweis Indolproduktion Test mit Eisen- Zweizucker-Agar (Kligler) Urease-Nachweis MERKE Glukosevergärung führt zur Säureproduktion, die den ph-wert der Hochschicht (unterer Teil) senken, welcher sich daraufhin gelb verfärbt, während der Schrägagar rot bleibt 36

37 Mikrobiologisches Praktikum - Biochemische Tests zur Identifizierung von Bakterien Katalase-Test Koagulase-Test Simmons-Citrat-Agar H 2 S-Nachweis Indolproduktion Test mit Eisen- Zweizucker-Agar (Kligler) Urease-Nachweis MERKE wenn sowohl eine Glukosegärung als auch eine H 2 S-Produktion stattgefunden hat, verfärbt sich der untere Teil des Agarröhrchens schwarz und gelb (! Schwarz überfärbt oftmals das Gelb) während der Schrägagar rot bleibt 37

38 Mikrobiologisches Praktikum - Biochemische Tests zur Identifizierung von Bakterien Katalase-Test Koagulase-Test Simmons-Citrat-Agar H 2 S-Nachweis Indolproduktion Test mit Eisen- Zweizucker-Agar (Kligler) Urease-Nachweis MERKE Vergärung von Laktose und Glukose führt zur Säurebildung, wodurch der ph-wert im gesamten Röhrchen sinkt und beide Agarteile eine Gelbfärbung annehmen 38

39 Mikrobiologisches Praktikum - Biochemische Tests zur Identifizierung von Bakterien Katalase-Test Koagulase-Test Simmons-Citrat-Agar H 2 S-Nachweis Indolproduktion Test mit Eisen- Zweizucker-Agar (Kligler) Urease-Nachweis MERKE wenn Vergärung von Laktose und Glukose zusammen mit Produktion von H 2 S- auftritt, verfärbt sich der untere Teil des Kligler-Röhrchens schwarz und gelb, während im oberen Teil eine Gelbfärbung entsteht 39

40 Mikrobiologisches Praktikum - Biochemische Tests zur Identifizierung von Bakterien Katalase-Test Koagulase-Test Simmons-Citrat-Agar Testreihe mit Eisen-Zweizucker-Agar nach Kligler (KIA-Agar); Hinweis: bei Yersinia pestis ähnlich wie bei Pseudomonas aeruginosa kein Farbumschlag im Vergleich zur umbeimpften Kontrolle H 2 S-Nachweis Indolproduktion Test mit Eisen- Zweizucker-Agar (Kligler) Urease-Nachweis 40

41 Mikrobiologisches Praktikum - Biochemische Tests zur Identifizierung von Bakterien Katalase-Test Koagulase-Test Simmons-Citrat-Agar H 2 S-Nachweis Indolproduktion Test mit Eisen- Zweizucker-Agar (Kligler) Urease-Nachweis Ureasenachweis in Kulturröhrchen, die mit Proteus vulgaris (links; positives Ergebnis) und Escherichia coli (Mitte; negatives Ergebnis) beimpft wurden -> rechtes Röhrchen ist die unbeimpfte Kontrolle MERKE einige Bakterien produzieren das Enzym Urease, das die Spaltung von Harnstoff katalysiert der Nährboden enthält Hefeextrakt, Harnstoff und den ph-indikator Phenolrot, der bei einem ph-wert von 6,8 gelborange ist und sich bei Werten um 8,4 rosa bis rötlich verfärbt positives Ergebnis bei Proteus-Arten und Helicobacter pylori MERKE 41

42 Mikrobiologisches Praktikum - Wirksamkeit antimikrobieller Substanzen Kirby-Bauer- Methode Epsilometer-Test Links: Wirksamkeit von acht Antibiotika gegen das grampositive Stäbchenbakterium Bacillus cereus Rechts: Wirksamkeit von acht Antibiotika gegen das gramnegative Stäbchenbakterium Escherichia coli Optochin-Test Novobiocin-Test MERKE Agardiffusionstest nach Kirby-Bauer mit acht verschiedenen Antibiotika: Ampicillin (AM 10), Chloramphenicol (C 30), Erythromycin (E 15), Gentamicin (GM 10), Penicillin G (P 10), Polymyxin B (PB 300), Streptomycin (S 10) und Tetracyclin (TE 30) man legt Filterplättchen auf, die zuvor mit Antibiotika getränkt wurden und prüft die Kulturen nach der Inkubation auf Hemmhöfe um die Filterplättchen 42

43 Mikrobiologisches Praktikum - Wirksamkeit antimikrobieller Substanzen Kirby-Bauer- Methode Epsilometer-Test Links: Wirksamkeit von acht Antibiotika gegen das grampositive Bakterium Staphylococcus aureus Rechts: Wirksamkeit von acht Antibiotika gegen das grampositive Bakterium Staphylococcus epidermidis Optochin-Test Novobiocin-Test 43

44 Mikrobiologisches Praktikum - Wirksamkeit antimikrobieller Substanzen Kirby-Bauer- Methode Epsilometer-Test Optochin-Test Novobiocin-Test Epsilometer-Test (Etest) mit einem Teststreifen mit Ceftriaxon, der u.a. zur Wirksamkeitsprüfung bei Neisseria gonorrhoeae eingesetzt wird -> minimale Hemmkonzentration liegt in diesem Fall bei 1,5 µg/ml (Standardwert bei < 8 µg/ml -> Antibiotikum kann eingesetzt werden) MERKE für den Epsilometer-Test wird ein dünner kunststoffbeschichteter Streifen benutzt, auf dem ein exponentieller Antibiotikagradient angelegt wurde Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration ein Wert, der bei Vergleich mit Standard-Proben aussagt, ob der Organismus beim Einsatz eines bestimmten Medikaments resistent oder empfindlich reagiert Voraussetzung ist, dass die gesamte Agarfläche mit einem dichten Bakterienrasen bewachsen ist 44

45 Mikrobiologisches Praktikum - Wirksamkeit antimikrobieller Substanzen Kirby-Bauer- Methode Epsilometer-Test Optochin-Test Novobiocin-Test Optochin-Test: Die Empfindlichkeit gegen Optochin (= Ethylhydrocuprein) wird durch einen Agardiffusionstest mit einem Optochin-Testblättchen (OP 10 µg) geprüft -> Hemmhof mit einem Durchmesser >13 mm (links unten) spricht für Streptococcus pneumoniae, während andere vergrünend wachsende Streptokokken (rechts oben) eine Resistenz aufweisen MERKE Optochin ist ein Chiniderivat (kein Antibiotikum) aus der Rinde des Chinabaums und hemmt das Wachstum von Streptococcus pneumoniae, so dass sich dieser Keim aus der Gruppe der α-hämolysierenden Streptokokken (aerob, Katalase-negativ) identifizieren lässt Streptococcus viridans wird nicht im Wachstum gehemmt und ist unempfindlich gegen Optochin 45

46 Mikrobiologisches Praktikum - Wirksamkeit antimikrobieller Substanzen Kirby-Bauer- Methode Epsilometer-Test Optochin-Test Novobiocin-Test Bacitracin-Test Novobiocin-Test: Beimpfung einer von Koagulase-negativen Staphylokokken besiedelten Blut-Agar-Platte mit jeweils einem Novobiocin-Antibiotika-Plättchen oben: Hemmhofbildung -> Staphylococcus epidermidis ist sensitiv unten: keine Hemmhofbildung -> Staphylococcus saprophyticus ist resistent MERKE mittels der Novobiocin-Testung kann man innerhalb der Gattung der Koagulase-negativen Staphylokokken zwischen Staphylococcus epidermidis (! Plastikinfektionen) und Staphylococcus saprophyticus (Harnwegsinfektion) unterscheiden Novobiocin ist ein Aminocoumarin- Antibiotikum und potenter Inhibitor der bakteriellen DNA-Gyrase 46

47 Mikrobiologisches Praktikum - Wirksamkeit antimikrobieller Substanzen Kirby-Bauer- Methode Epsilometer-Test Optochin-Test Novobiocin-Test Bacitracin-Test: mit dem Bacitracin-Antibiotikum-Testplättchen lassen sich die ß-hämolysierenden Streptokokken genauer differenzieren: -> A-Streptokokken (Streptococcus pyogenes) sind sensibel -> Hemmhofbildung (siehe Bild) -> B-Streptokokken sind resistent Bacitracin-Test 47

48 Bacillus anthracis Bordetella pertussis Borrelia burgdorferi MIKROSKOPIE Gram-gefärbtes Präparat von Bacillus anthracis (ohne Sporenbildung) als Erreger des Milzbrands Campylobacter jejuni Clostridium botulinum Clostridium perfringens Clostridium tetani Escherichia coli Haemophilus influenzae Klebsiella pneumoniae Neisseria gonorrhoeae Pseudomonas aeruginosa Proteus mirabilis Salmonella typhi Serratia marcescens Shigella flexneri Staphylococcus aureus Streptococcus pneum. Vibrio cholerae 48

49 Bacillus anthracis Bordetella pertussis Borrelia burgdorferi MIKROSKOPIE Gram-gefärbtes Präparat von Bordetella pertussis als Erreger des Keuchhustens Campylobacter jejuni Clostridium botulinum Clostridium perfringens Clostridium tetani Escherichia coli Haemophilus influenzae Klebsiella pneumoniae Neisseria gonorrhoeae Pseudomonas aeruginosa Proteus mirabilis Salmonella typhi Serratia marcescens Shigella flexneri Staphylococcus aureus Streptococcus pneum. Vibrio cholerae 49

50 Bacillus anthracis Bordetella pertussis Borrelia burgdorferi MIKROSKOPIE Präparat des gramnegativen Spirochäten Borrelia burgdorferi Campylobacter jejuni Clostridium botulinum Clostridium perfringens Clostridium tetani Escherichia coli Haemophilus influenzae Klebsiella pneumoniae Neisseria gonorrhoeae Pseudomonas aeruginosa Proteus mirabilis Salmonella typhi Serratia marcescens Shigella flexneri Staphylococcus aureus Streptococcus pneum. Vibrio cholerae 50

51 Bacillus anthracis Bordetella pertussis Borrelia burgdorferi Ausstrichplatte mit speziellem Campylobacter-Agar und Wassertropfen-ähnlichen Kolonien Hinweis: zur Kultivierung müssen mikroaerophile Bedingungen geschaffen werden (Bio Bag) Campylobacter jejuni Clostridium botulinum Clostridium perfringens Clostridium tetani Escherichia coli Haemophilus influenzae Klebsiella pneumoniae Neisseria gonorrhoeae Pseudomonas aeruginosa Proteus mirabilis Salmonella typhi Serratia marcescens Shigella flexneri Staphylococcus aureus Streptococcus pneum. Vibrio cholerae 51

52 Bacillus anthracis Bordetella pertussis Borrelia burgdorferi Campylobacter jejuni MIKROSKOPIE Einfach gefärbtes Präparat von Clostridium botulinum mit ovalen Endosporen, die subterminal an einem Ende der grampositiven Stäbchen gebildet werden Clostridium botulinum Clostridium perfringens Clostridium tetani Escherichia coli Haemophilus influenzae Klebsiella pneumoniae Neisseria gonorrhoeae Pseudomonas aeruginosa Proteus mirabilis Salmonella typhi Serratia marcescens Shigella flexneri Staphylococcus aureus Streptococcus pneum. Vibrio cholerae 52

53 Bacillus anthracis Bordetella pertussis Borrelia burgdorferi Campylobacter jejuni MIKROSKOPIE Gram-gefärbtes Präparat von Clostridium perfringens mit abgerundeten Zellenden (ziegelsteinartig) Hinweis: Endosporen werden in Kultur nur selten gebildet Clostridium botulinum Clostridium perfringens Clostridium tetani Escherichia coli Haemophilus influenzae Klebsiella pneumoniae Neisseria gonorrhoeae Pseudomonas aeruginosa Proteus mirabilis Salmonella typhi Serratia marcescens Shigella flexneri Staphylococcus aureus Streptococcus pneum. Vibrio cholerae 53

54 Bacillus anthracis Bordetella pertussis Borrelia burgdorferi Campylobacter jejuni Links: Ausstrich von Clostridium perfringens als anaerob bebrüteter Kultur auf Schaedler-Agar -> Hinweis: man erkennt sehr gut den Hämolyse-Hof um die Kolonien Rechts: Wachstum von Clostridium perfringens auf der Eigelbplatte -> Lecithinase-Nachweis Clostridium botulinum Clostridium perfringens Clostridium tetani Escherichia coli Haemophilus influenzae Klebsiella pneumoniae Neisseria gonorrhoeae Pseudomonas aeruginosa Proteus mirabilis Salmonella typhi Serratia marcescens Shigella flexneri Staphylococcus aureus Streptococcus pneum. Vibrio cholerae 54

55 Bacillus anthracis Bordetella pertussis Borrelia burgdorferi MIKROSKOPIE Gram-gefärbtes Präparat von Clostridium tetani mit terminalen Endosporen Campylobacter jejuni Clostridium botulinum Clostridium perfringens Clostridium tetani Escherichia coli Haemophilus influenzae Klebsiella pneumoniae Neisseria gonorrhoeae Pseudomonas aeruginosa Proteus mirabilis Salmonella typhi Serratia marcescens Shigella flexneri Staphylococcus aureus Streptococcus pneum. Vibrio cholerae 55

56 Bacillus anthracis Bordetella pertussis Borrelia burgdorferi MIKROSKOPIE Präparat des gramnegativen Stäbchens Escherichia coli Campylobacter jejuni Clostridium botulinum Clostridium perfringens Clostridium tetani Escherichia coli Haemophilus influenzae Klebsiella pneumoniae Neisseria gonorrhoeae Neisseria meningitidis Pseudomonas aeruginosa Proteus mirabilis Salmonella typhi Serratia marcescens Shigella flexneri Staphylococcus aureus Streptococcus pneum. Vibrio cholerae 56

57 Bacillus anthracis Bordetella pertussis Borrelia burgdorferi Campylobacter jejuni Links: Endo-Agarplatte, die mit Escherichia coli beimpft wurde Mitte: Kligler-Agarröhrchen mit Escherichia coli Beimpfung (Glc +, Lac +, Gasbildung) Rechts: Citrat-Röhrchen mit Simmons-Agar und Grünfärbung, da Escherichia coli kein Citrat verwerten kann Clostridium botulinum Clostridium perfringens Clostridium tetani Escherichia coli Haemophilus influenzae Klebsiella pneumoniae Neisseria gonorrhoeae Neisseria meningitidis Pseudomonas aeruginosa Proteus mirabilis Salmonella typhi Serratia marcescens Shigella flexneri Staphylococcus aureus Streptococcus pneum. Vibrio cholerae 57

58 Bacillus anthracis Bordetella pertussis Borrelia burgdorferi Links oben: Winkle-Agar, der mit Escherichia coli beimpft wurde: Gelbfärbung weil Laktose-positiv Rechts unten: Ausstrich von Escherichia coli auf Nutrient-Agar Campylobacter jejuni Clostridium botulinum Clostridium perfringens Clostridium tetani Escherichia coli Haemophilus influenzae Klebsiella pneumoniae Neisseria gonorrhoeae Neisseria meningitidis Pseudomonas aeruginosa Proteus mirabilis Salmonella typhi Serratia marcescens Shigella flexneri Staphylococcus aureus Streptococcus pneum. Vibrio cholerae 58

59 Bacillus anthracis Bordetella pertussis Borrelia burgdorferi Campylobacter jejuni Clostridium botulinum Links: Ausstrich von Haemophilus influenzae auf Kochblut-Agar Rechts: Satellitenwachstum (= Ammenphänomen) von Haemophilus influenzae auf einer Blutagar-Platte: Blutagar-Platten enthalten, anders als Kochblutagar, vollständige Erythrozyten, die durch Staphylococcus aureus hämolytisch aufgeschlossen werden können und damit die darin enthaltenen Wachstumsfaktoren (Hämin und NAD) ins Medium gelangen, welche für Haemophilus influenzae essenziell sind -> daher wächst Haemophilus nur in direkter Nähe seiner "Amme" Clostridium perfringens Clostridium tetani Escherichia coli Haemophilus influenzae Klebsiella pneumoniae Neisseria gonorrhoeae Neisseria meningitidis Pseudomonas aeruginosa Proteus mirabilis Salmonella typhi Serratia marcescens Shigella flexneri Staphylococcus aureus Streptococcus pneum. Vibrio cholerae 59

60 Bacillus anthracis Bordetella pertussis Borrelia burgdorferi Campylobacter jejuni MIKROSKOPIE Gram-gefärbtes Präparat von Haemophilus influenzae Hinweis: Zellen sind häufig stäbchenförmig, es kommen aber auch abweichende Formen vor Clostridium botulinum Clostridium perfringens Clostridium tetani Escherichia coli Haemophilus influenzae Klebsiella pneumoniae Neisseria gonorrhoeae Neisseria meningitidis Pseudomonas aeruginosa Proteus mirabilis Salmonella typhi Serratia marcescens Shigella flexneri Staphylococcus aureus Streptococcus pneum. Vibrio cholerae 60

61 Bacillus anthracis Bordetella pertussis Borrelia burgdorferi Campylobacter jejuni Clostridium botulinum Clostridium perfringens Kultur von Klebsiella pneumoniae auf Blut-Agar (oben) mit großen, schleimigglänzenden Kolonien und auf der Winkle-Platte mit gelbem Farbumschlag (unten) MIKROSKOPIE Gram-gefärbtes Präparat von Klebsiella pneumoniae Clostridium tetani Escherichia coli Haemophilus influenzae Klebsiella pneumoniae Neisseria gonorrhoeae Neisseria meningitidis Pseudomonas aeruginosa Proteus mirabilis Salmonella typhi Serratia marcescens Shigella flexneri Staphylococcus aureus Streptococcus pneum. Vibrio cholerae 61

62 Bacillus anthracis Bordetella pertussis Borrelia burgdorferi Campylobacter jejuni Clostridium botulinum Kultur von Neisseria meningitidis auf Blut-Agar mit weißen, glänzenden Kolonien MIKROSKOPIE Gram-gefärbtes Präparat von Neisseria meningitidis Clostridium perfringens Clostridium tetani Escherichia coli Haemophilus influenzae Klebsiella pneumoniae Neisseria gonorrhoeae Neisseria meningitidis Pseudomonas aeruginosa Proteus mirabilis Salmonella typhi Serratia marcescens Shigella flexneri Staphylococcus aureus Streptococcus pneum. Vibrio cholerae 62

63 Bacillus anthracis Bordetella pertussis Borrelia burgdorferi Campylobacter jejuni Oben: Zuckersatz nach Lingelsheim zur Differenzierung von Neisseria meningitidis: Maltose-positive und Dextrose-positive Verstoffwechselung bewirkt einen Farbumschlag nach grün-blau, während der Saccharose-negative Metabolismus keine Farbänderung des Nährmediums bedingt Unten: Kochblutagar mit glänzenden, grau- bis cremefarbenen Kolonien von Neisseria meningitidis Clostridium botulinum Clostridium perfringens Clostridium tetani Escherichia coli Haemophilus influenzae Klebsiella pneumoniae Neisseria gonorrhoeae Neisseria meningitidis Pseudomonas aeruginosa Proteus mirabilis Salmonella typhi MIKROSKOPIE Gramnegative Diplokokken im mikroskopischen Präparat vom Liquor Serratia marcescens Shigella flexneri Staphylococcus aureus Streptococcus pneum. Vibrio cholerae 63

64 Bacillus anthracis Bordetella pertussis Borrelia burgdorferi Campylobacter jejuni Links: Ausstrich von Pseudomonas aeruginosa auf Winkle-Agar: Blaufärbung, weil Laktose-negativ Rechts: Ausstrich von Pseudomonas aeruginosa auf Blut-Agar mit großen, flachen und metallisch glänzenden Kolonien Clostridium botulinum Clostridium perfringens Clostridium tetani Escherichia coli Haemophilus influenzae Klebsiella pneumoniae Neisseria gonorrhoeae Neisseria meningitidis Pseudomonas aeruginosa Proteus mirabilis Salmonella typhi Serratia marcescens Shigella flexneri Staphylococcus aureus MIKROSKOPIE Gram-gefärbtes Präparat von Pseudom. aeruginosa EXKURS Oxidase-Test: Positiv, wenn Farbumschlag von weiß zu blau Streptococcus pneum. Vibrio cholerae 64

65 Bacillus anthracis Bordetella pertussis Borrelia burgdorferi Campylobacter jejuni Links: Ausstrich von Proteus vulgaris auf Winkle-Agar -> Blaufärbung, da Laktose-negativ, kein Schwärmen auf Winkle-Agar Mitte: Kultur von Proteus mirabilis auf Blut-Agar ohne Kolonie-Bildung aufgrund der Beweglichkeit Rechts: Kligler-Röhrchen mit charakteristischer Färbung: Gelbfärbung -> Glucose-positiv, Schwarzfärbung -> H 2 S-Bildung Clostridium botulinum Clostridium perfringens Clostridium tetani Escherichia coli Haemophilus influenzae Klebsiella pneumoniae Neisseria gonorrhoeae Neisseria meningitidis Pseudomonas aeruginosa Proteus mirabilis Salmonella typhi Serratia marcescens Shigella flexneri MIKROSKOPIE Gram-gefärbtes Präparat von Proteus mirabilis Staphylococcus aureus Streptococcus pneum. Vibrio cholerae 65

66 Bacillus anthracis Bordetella pertussis Borrelia burgdorferi Campylobacter jejuni Clostridium botulinum Clostridium perfringens Clostridium tetani Escherichia coli Links: Salmonella-Shigella-Agar mit schwarzgefärbten Kolonien von Salmonella typhi Rechts: Kligler-Agar mit charakteristischer Färbung der Schichten MIKROSKOPIE Gram-gefärbtes Präparat von Salmonella typhi Haemophilus influenzae Klebsiella pneumoniae Neisseria gonorrhoeae Neisseria meningitidis Pseudomonas aeruginosa Proteus mirabilis Salmonella typhi Serratia marcescens Shigella flexneri Staphylococcus aureus Streptococcus pneum. Vibrio cholerae 66

67 Bacillus anthracis Bordetella pertussis Borrelia burgdorferi Campylobacter jejuni Clostridium botulinum Clostridium perfringens Clostridium tetani Escherichia coli Ausstrich von Serratia marcescens auf Nutrient-Agar mit konvexen, glatten, glänzenden, kleinen und roten Kolonien Hinweis: Rotfärbung der Kolonien durch Produktion des Prodigiosins MIKROSKOPIE Gram-gefärbtes Präparat von Serratia marcescens Haemophilus influenzae Klebsiella pneumoniae Neisseria gonorrhoeae Neisseria meningitidis Pseudomonas aeruginosa Proteus mirabilis Salmonella typhi Serratia marcescens Shigella flexneri Staphylococcus aureus Streptococcus pneum. Vibrio cholerae 67

68 Bacillus anthracis Bordetella pertussis Borrelia burgdorferi Campylobacter jejuni Clostridium botulinum Clostridium perfringens Clostridium tetani Escherichia coli Haemophilus influenzae Links: Blut-Agar mit Kultur von Shigella flexneri Rechts: Kligler-Agar mit charakteristischer Färbung bei Shigellen-Beimpfung Hinweis: anzüchtbar auch auf Leifson-Agar und Winkle-Agar (Blaufärbung) MIKROSKOPIE Gram-gefärbtes Präparat von Shigella dysenteriae Klebsiella pneumoniae Neisseria gonorrhoeae Neisseria meningitidis Pseudomonas aeruginosa Proteus mirabilis Salmonella typhi Serratia marcescens Shigella flexneri Staphylococcus aureus Streptococcus pneum. Vibrio cholerae 68

69 Bacillus anthracis Bordetella pertussis Borrelia burgdorferi Campylobacter jejuni Clostridium botulinum Clostridium perfringens Clostridium tetani Escherichia coli Oben: Kolonienwachstum von Staphylococcus aureus auf Blut-Agar Unten: MRSA-Platte zum Nachweis von ß-Lactam-Antibiotika-resistenten Stämmen, die in rosa-gefärbten Kolonien wachsen (Mechanismus: verändertes Penicillin-Bindeprotein) MIKROSKOPIE Gram-gefärbtes Präparat von Staphylococcus aureus Haemophilus influenzae Klebsiella pneumoniae Neisseria gonorrhoeae Pseudomonas aeruginosa Proteus mirabilis Salmonella typhi Serratia marcescens Shigella flexneri Staphylococcus aureus Streptococcus pneum. Vibrio cholerae 69

70 Bacillus anthracis Bordetella pertussis Borrelia burgdorferi Campylobacter jejuni Clostridium botulinum Clostridium perfringens Clostridium tetani Escherichia coli Links oben: Blut-Agar mit Kultur von Streptococcus pneumoniae (α-hämolyse) Rechts unten: Blut-Agar mit Kultur von Streptococcus pyogenes (ß-Hämolyse) MIKROSKOPIE Gram-gefärbtes Präparat von Streptococcus pneumoniae Haemophilus influenzae Klebsiella pneumoniae Neisseria gonorrhoeae Neisseria meningitidis Pseudomonas aeruginosa Proteus mirabilis Salmonella typhi Serratia marcescens Shigella flexneri Staphylococcus aureus Streptococcus pneum. Vibrio cholerae 70

71 Bacillus anthracis Bordetella pertussis Borrelia burgdorferi Übersicht Kochblutagar mit den drei verschiedenen Hämolyse-Formen der Streptokokken Campylobacter jejuni Clostridium botulinum Clostridium perfringens β-hämolyse: Streptococcus pyogenes Streptococcus agalacticae Clostridium tetani Escherichia coli Haemophilus influenzae Klebsiella pneumoniae Neisseria gonorrhoeae Neisseria meningitidis Pseudomonas aeruginosa Proteus mirabilis Salmonella typhi γ-hämolyse: Enterococcus faecalis Serratia marcescens Shigella flexneri Staphylococcus aureus α-hämolyse: Streptococcus pneumoniae Orale Streptokokken Streptococcus pneum. Vibrio cholerae 71

72 Bacillus anthracis Bordetella pertussis Borrelia burgdorferi MIKROSKOPIE Einfach-gefärbtes Präparat von Vibrio cholerae mit gekrümmter Stäbchenform Campylobacter jejuni Clostridium botulinum Clostridium perfringens Clostridium tetani Escherichia coli Haemophilus influenzae Klebsiella pneumoniae Neisseria gonorrhoeae Neisseria meningitidis Pseudomonas aeruginosa Proteus mirabilis Salmonella typhi Serratia marcescens Shigella flexneri Staphylococcus aureus Streptococcus pneum. Vibrio cholerae 72

73 Chlamydia trachomatis Corynebacterium diph. Enterobacter cloacae Enterococcus faecalis MIKROSKOPIE Chlamydien treten als obligat intrazelluläre Bakterien in zwei Erscheinungsformen auf: -> die hier dargestellten Elementarkörperchen sind die eigentlich infektiöse Form und werden bei Tod der Wirtszelle freigesetzt, um die Verbreitung zu sichern -> die Initialkörperchen lassen sich von der Wirtszelle phagozytieren Gardnerella vaginalis Lactobacillus acidophilus Legionella pneumophila Listeria monocytogenes Mycobact. tuberculosis Treponema pallidum Yersinia pestis Pilze Candida albicans Aspergillus Pneumocystis jiroveci 73

74 Chlamydia trachomatis Corynebacterium diph. Enterobacter cloacae Spezies-Übersicht von drei Corynebakterien auf Blut-Agar Enterococcus faecalis Gardnerella vaginalis Lactobacillus acidophilus Legionella pneumophila Listeria monocytogenes Mycobact. tuberculosis Treponema pallidum Yersinia pestis Pilze Candida albicans Aspergillus Pneumocystis jiroveci 74

75 Chlamydia trachomatis Corynebacterium diph. Enterobacter cloacae Enterococcus faecalis Gardnerella vaginalis Zuckersatz nach Lingelsheim zur Differenzierung der Corynebacteria: Links: Dextroseplatte -> C. pseudodiphtheriticum ist Dextrose-negativ ohne Farbumschlag -> C. diphtheriae et xerosis sind Dextrose-positiv mit Blaufärbung des Zuckeragars Rechts: Saccharoseplatte -> C. pseudodiphtheriticum et diphtheriae sind Saccharose-negativ ohne Farbumschlag -> C. xerosis ist Saccharose-positiv mit Blaufärbung des Zuckeragars Lactobacillus acidophilus Legionella pneumophila Listeria monocytogenes Mycobact. tuberculosis Treponema pallidum Yersinia pestis Pilze Candida albicans Aspergillus Pneumocystis jiroveci 75

76 Chlamydia trachomatis Corynebacterium diph. Enterobacter cloacae Links: Schroer-Agar Rechts: Blut-Agar mit weiß-grauen Kolonien Enterococcus faecalis Gardnerella vaginalis Lactobacillus acidophilus Legionella pneumophila Listeria monocytogenes Mycobact. tuberculosis Treponema pallidum Yersinia pestis Pilze Candida albicans Aspergillus Pneumocystis jiroveci MIKROSKOPIE Corynebacterium diphtheriae als grampositive Stäbchen mit terminaler keulenförmiger Auftreibung nach Neisser- Färbung 76

77 Chlamydia trachomatis Corynebacterium diph. Enterobacter cloacae Enterococcus faecalis Gardnerella vaginalis Lactobacillus acidophilus MIKROSKOPIE Gram-gefärbtes Präparat vom Stäbchenbakterium Enterobacter cloacae Koloniewachstum von Enterobacter cloacae auf Tryptic Soy Broth (TSB)-Agar Legionella pneumophila Listeria monocytogenes Mycobact. tuberculosis Treponema pallidum Yersinia pestis Pilze Candida albicans Aspergillus Pneumocystis jiroveci 77

78 Chlamydia trachomatis Corynebacterium diph. Enterobacter cloacae Enterococcus faecalis Gardnerella vaginalis Lactobacillus acidophilus MIKROSKOPIE Gram-gefärbtes Präparat vom grampositiven Enterococcus faecalis Wachstum von Enterococcus faecalis in kleinen grauen Kolonien auf Blutagar Legionella pneumophila Listeria monocytogenes Mycobact. tuberculosis Treponema pallidum Yersinia pestis Pilze Candida albicans Aspergillus Pneumocystis jiroveci 78

79 Chlamydia trachomatis Corynebacterium diph. Enterobacter cloacae MIKROSKOPIE Oben: Scheidenabstrich bei bakterieller Vaginose: Plattenepithelzelle ist besiedelt mit kurzen stäbchenförmigen Bakterien Unten: Abstrich aus der Fossa navicularis beim Mann: Lactobacillus acidophilus gilt als probiotisches Bakterium Enterococcus faecalis Gardnerella vaginalis Lactobacillus acidophilus Legionella pneumophila Listeria monocytogenes Mycobact. tuberculosis Treponema pallidum Yersinia pestis Pilze Candida albicans Aspergillus Pneumocystis jiroveci 79

80 Chlamydia trachomatis Corynebacterium diph. Enterobacter cloacae Enterococcus faecalis Gardnerella vaginalis Lactobacillus acidophilus MIKROSKOPIE Legionellen sind schwach anfärbbare kurze bis filamentöse gramnegative Stäbchenbakterien Legionella pneumophila-kolonien auf BYCE-Agar (gepufferter Holzkohle-Hefe-Extrakt) Legionella pneumophila Listeria monocytogenes Mycobact. tuberculosis Treponema pallidum Yersinia pestis Pilze Candida albicans Aspergillus Pneumocystis jiroveci 80

81 Chlamydia trachomatis Corynebacterium diph. Enterobacter cloacae Enterococcus faecalis Gardnerella vaginalis Lactobacillus acidophilus Legionella pneumophila MIKROSKOPIE Gram-gefärbtes Präparat von Listeria monocytogenes mit Stäbchenform Oben: Listerienwachstum auf Blutagar Mitte: PALCAM-Selektivagar mit typischer Schwarzfärbung Unten: Lanitexin-Säure-Spezial-Agar -> Listerien-spezifisch Listeria monocytogenes Mycobact. tuberculosis Treponema pallidum Yersinia pestis Pilze Candida albicans Aspergillus Pneumocystis jiroveci 81

82 Chlamydia trachomatis Corynebacterium diph. Enterobacter cloacae Enterococcus faecalis Gardnerella vaginalis Lactobacillus acidophilus Legionella pneumophila Listeria monocytogenes Mycobact. tuberculosis MIKROSKOPIE Ziehl-Neelsen-Färbung als Säurefestigkeitsfärbung zur Darstellung der rötlichen gefärbten säurefesten Stäbchen auf blauem Hintergrund Löwenstein-Jensen-Nährmedium mit Glycerol (C-Quelle) und PACT (Selektivsupplement aus Polymyxin B, Amphotericin B, Carbenicillin und Trimethoprim) zur Isolierung von Mycobacterium tuberculosis; Malachitgrün zur Hemmung der Begleitflora Treponema pallidum Yersinia pestis Pilze Candida albicans Aspergillus Pneumocystis jiroveci Kulturen haben trocken-krümliges, blumenkohlartiges Aussehen 82

83 Chlamydia trachomatis Corynebacterium diph. Enterobacter cloacae Enterococcus faecalis Gardnerella vaginalis Lactobacillus acidophilus Legionella pneumophila Listeria monocytogenes Mycobact. tuberculosis Treponema pallidum Yersinia pestis MIKROSKOPIE Treponema pallidum ist in vitro nicht kultivierbar, so dass ein direkter Erregernachweis nur mikroskopisch im Dunkelfeld möglich ist -> man erkennt dünne Schraubenbakterien mit Windungen EXKURS FTA-Abs-Test: Fluoreszenz-Treponema-Antikörper-Absorbens-Test als Antigene abgetötete Treponemen, die auf einen Objektträger aufgebracht sind diese werden mit Patientenserum überschichtet, wobei darin vorhandene Antikörper die Treponemen binden im zweiten Schritt wird der Objektträger mit einem fluoreszenzmarkierten Antikörper gegen humane Antikörper inkubiert bei positivem Testausfall grün leuchtende Antikörper-beladene Treponemen Pilze Aspergillus Candida albicans Mucor Pneumocystis jiroveci 83

84 Chlamydia trachomatis Corynebacterium diph. Enterobacter cloacae Enterococcus faecalis Gardnerella vaginalis Lactobacillus acidophilus Legionella pneumophila Listeria monocytogenes EXKURS TPPA-Test (= Treponema-pallidum-Partikel-Agglutination): mikrobiologischer Schnelltest zum Screening von Antikörpern gegen Treponema pallidum da nicht das Bakterium selbst, sondern nur die Antikörper gegen Treponema pallidum im Blutserum nachgewiesen werden, spricht man von einem indirekten Erregernachweis Patientenserum wird mit einem Absorptionsmedium verdünnt und daraufhin mittels Pipette in die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte gegeben -> in eine Reihe wird nun zum Serum ein Test-Kit aus Gelatinepartikelträger gegeben, die mit gereinigtem pathogenem Treponema pallidum (Nichols-Stamm) sensibilisiert wurden, in eine weitere Reihe ein Kit aus "nichtsensibilisierten" Gelatinepartikel bei Vorhandensein von Antikörpern gegen Treponema pallidum im Patientenserum agglutinieren die Gelatine-Partikel zu einer sichtbaren Verklumpung -> agglutinierte Partikel gleichmäßig über den ganzen Boden der Vertiefung verteilt ist der Patient gesund und sein Blut frei von Antikörpern gegen Treponema pallidum, so kommt es nicht zu einer Verklumpung, statt dessen setzen sich die Partikel einfach als Sediment am Grund ab -> Knopfform in der Mitte der Schale konzentriert Mycobact. tuberculosis Treponema pallidum Yersinia pestis Pilze Kontrolle: positiv bis 1:320 Negativkontrolle: knopfförmiges Sediment Aspergillus Candida albicans Mucor Pneumocystis jiroveci Patient 1: TPPA-positiv bis Titer von 1:320 Patient 2: TPPA-negativ -> keine Treponema-Infektion 84

85 Chlamydia trachomatis Corynebacterium diph. Enterobacter cloacae Enterococcus faecalis Gardnerella vaginalis Lactobacillus acidophilus Legionella pneumophila Listeria monocytogenes Mycobact. tuberculosis Treponema pallidum MIKROSKOPIE Gram-gefärbtes Präparat von Yersinia pestis mit Stäbchenform Oben: Eisen-Zweizucker-Agar nach Kligler (KIA-Agar) zeigt bei Yersinia pestis keinen Farbumschlag Unten: Selektiver Yersinienagar mit zarten, dunkelroten Kolonien und hellem Hof Yersinia pestis Pilze Aspergillus Candida albicans Mucor Pneumocystis jiroveci 85

86 Chlamydia trachomatis Corynebacterium diph. Enterobacter cloacae Enterococcus faecalis Gardnerella vaginalis Lactobacillus acidophilus Legionella pneumophila Listeria monocytogenes Mycobact. tuberculosis MIKROSKOPIE Lactophenol-Baumwollblau-Färbung: Sichtbar sind zwei Hyphen mit Vesikel und Phialidenreihe, die Konidien sind abgerissen und liegen verstreut im Präparat Oben: Kultur von Aspergillus fumigatus Unten: Kultur von Aspergillus niger mit schwarzen Sporen Treponema pallidum Yersinia pestis Pilze Aspergillus Candida albicans Mucor Pneumocystis jiroveci 86

87 Chlamydia trachomatis Corynebacterium diph. Enterobacter cloacae Enterococcus faecalis Gardnerella vaginalis Lactobacillus acidophilus Legionella pneumophila Listeria monocytogenes MIKROSKOPIE Sprosspilze der Gattung Candida lassen sich aus Abstrichen von Haut und Schleimhaut mikroskopisch im Nativpräparat nachweisen und kommen entweder in der Blastosporenform oder in der filamentösen Form vor Candida albicans entwickelt auf Blut-Agar (oben) und Sabouraud-Agar (unten) charakteristische cremefarbene, porzellanartige Kolonien Mycobact. tuberculosis Treponema pallidum Yersinia pestis filamentöse Form Pilze Aspergillus Candida albicans Blastosporenform Mucor Pneumocystis jiroveci 87

88 Chlamydia trachomatis Corynebacterium diph. Enterobacter cloacae Unterschiedliches Koloniewachstum verschiedener Candida-Spezies auf Sabouraud-Agar Enterococcus faecalis Gardnerella vaginalis Lactobacillus acidophilus Legionella pneumophila Listeria monocytogenes Mycobact. tuberculosis Treponema pallidum Yersinia pestis Pilze Aspergillus Candida albicans Mucor Pneumocystis jiroveci 88

89 Chlamydia trachomatis Corynebacterium diph. Enterobacter cloacae Enterococcus faecalis Gardnerella vaginalis Lactobacillus acidophilus Legionella pneumophila Listeria monocytogenes Mycobact. tuberculosis MIKROSKOPIE Lactophenol-Baumwollblau-Färbung: Darstellung eines Vertreters der Pilz-Ordnung Mucorales mit Hyphen, an deren Ausläufern sich prominente Sporangien befinden Flauschige Kolonie mit einem stark ausgeprägten Luftmyzel Treponema pallidum Yersinia pestis Pilze Aspergillus Candida albicans Mucor Pneumocystis jiroveci 89

90 Chlamydia trachomatis Corynebacterium diph. Enterobacter cloacae Enterococcus faecalis Gardnerella vaginalis Lactobacillus acidophilus Legionella pneumophila Listeria monocytogenes Mycobact. tuberculosis MIKROSKOPIE Zysten von Pneumocystis jiroveci mit 6 bis 8 Sporen im Inneren EXKURS da sich Pneumocystis nicht kultivieren lässt, dient zur diagnostischen Absicherung der Immunfluoreszenznachweis in der BAL mit der Calcofluor-White-Färbung (oben) unten: typischer Röntgen-Thorax bei der interstitiellen Pneumocystis-Pneumonie Treponema pallidum Yersinia pestis Pilze Aspergillus Candida albicans Mucor Pneumocystis jiroveci 90

91 Protozoen Entamoeba histolytica Giardia lamblia MIKROSKOPIE Invasive Amöbiasis wird durch den mikroskopischen Direktnachweis von Magnaformen im Stuhl diagnostiziert Leishmania Plasmodia Toxoplasma gondii Trichomonas vaginalis Trypanosoma Zyste (b) Helminthen Ascarididae Oxyuridae Schistosomatidae Strongyloides stercoralis Magnaform (a) Trichuridae 91

92 Protozoen Entamoeba histolytica Giardia lamblia MIKROSKOPIE im nativen Duodenalsekret lassen sich die begeißelten Trophozoiten leicht mikroskopisch an ihren zappeligen Bewegungen identifizieren meist wird jedoch im Stuhl nach dem Vorhandensein von Zysten gescreent Leishmania Plasmodia Toxoplasma gondii Trichomonas vaginalis Trypanosoma Zyste (b) Helminthen Ascarididae Oxyuridae Schistosomatidae Strongyloides stercoralis Trichuridae Trophozoit im Duodenalsekret (a) 92

93 Protozoen Entamoeba histolytica Giardia lamblia MIKROSKOPIE Links unten: Amastigote Form innerhalb von Gewebsmakrophagen Rechts oben: Promastigote Form in der Dermis nach Stich der Phlebotomus-Mücke Leishmania Plasmodia Toxoplasma gondii Trichomonas vaginalis Trypanosoma Helminthen Ascarididae Promastigote Oxyuridae Schistosomatidae Strongyloides stercoralis Trichuridae Amastigote 93

94 Protozoen Entamoeba histolytica Giardia lamblia Leishmania Plasmodia MIKROSKOPIE Links unten: Giemsa-gefärbter Blutausstrich mit vielen Erythrozyten im Sichtfeld, wo von einer (->) zwei Siegelringe enthält -> typisch für Plasmodium falciparum Rechts oben: Dicker Tropfen -> Erythrozyten sind durch osmotischen Schock lysiert und man erkennt einen Lymphozyten und einen Merozoit (->) von Plasmodium vivax Toxoplasma gondii Trichomonas vaginalis Trypanosoma Helminthen Ascarididae Oxyuridae Schistosomatidae Strongyloides stercoralis Trichuridae 94

95 Protozoen Entamoeba histolytica MERKE Giardia lamblia Leishmania Plasmodia Toxoplasma gondii Trichomonas vaginalis Trypanosoma Helminthen Ascarididae Oxyuridae Schistosomatidae Strongyloides stercoralis Trichuridae 95

96 Protozoen Entamoeba histolytica Giardia lamblia Leishmania Plasmodia EXKURS Malaria-Schnelltest: qualitativer Schnelltest für den hochspezifischen und hochsensitiven P. falciparum-antigen-nachweis im Blut benötigt werden EDTA-Kapillarblut oder venöses EDTA-Blut Testergebnis in nur 15 Minuten mit integrierter Kontrolle Toxoplasma gondii Trichomonas vaginalis Trypanosoma Kontrolle positiv Kontrolle positiv T1 positiv Helminthen Ascarididae Oxyuridae Schistosomatidae Strongyloides stercoralis Trichuridae Diagnose: Plasmodium falciparum 96

97 Protozoen Entamoeba histolytica Giardia lamblia MIKROSKOPIE Links unten: Immunfluoreszenztest (IFT) zur Darstellung der Tachyzoiten -> IgM-Nachweis spricht für eine akute Infektion Rechts oben: Giemsafärbung zum direkten Nachweis der Tachyzoiten Leishmania Plasmodia Toxoplasma gondii Trichomonas vaginalis Trypanosoma Helminthen Ascarididae Oxyuridae Schistosomatidae Strongyloides stercoralis Trichuridae 97

98 Protozoen Entamoeba histolytica MIKROSKOPIE Vaginalabstrich mit Trichomonas vaginalis Giardia lamblia Leishmania Plasmodia Toxoplasma gondii Trichomonas vaginalis Trypanosoma Helminthen Ascarididae Oxyuridae Schistosomatidae Strongyloides stercoralis 1 Flagella 2 undulierende Membran 3 Kinetosom 4 Zellkern 5 Achsenstab Trichuridae 98

99 Protozoen Entamoeba histolytica Giardia lamblia Leishmania MIKROSKOPIE Trypomastigote Trypanosoma brucei im Blutausstrich mit charakteristischer am Zellkörper entlang ziehender Geißel Plasmodia Toxoplasma gondii Trichomonas vaginalis Trypanosoma Helminthen Ascarididae Oxyuridae Schistosomatidae Strongyloides stercoralis Trichuridae 99

100 Protozoen MERKE Entamoeba histolytica Giardia lamblia Leishmania Plasmodia Toxoplasma gondii Trichomonas vaginalis Trypanosoma Helminthen Ascaris lumbricoides Oxyuridae Schistosomatidae Strongyloides stercoralis Trichuridae 100

101 Protozoen Entamoeba histolytica Giardia lamblia Leishmania MIKROSKOPIE Diagnostik beruht hauptsächlich auf dem Nachweis der Wurmeier im Stuhl: dickschaliges, höckeriges, zitronenförmiges Aussehen durch Stuhl leicht bräunliche Anfärbung Plasmodia Toxoplasma gondii Trichomonas vaginalis Trypanosoma Helminthen Ascaris lumbricoides Oxyuridae Schistosomatidae Strongyloides stercoralis Trichuridae 101

102 Protozoen Entamoeba histolytica Giardia lamblia Leishmania MIKROSKOPIE Diagnostik der Wahl ist ein Abklatsch von der Perianalhaut auf den Objektträger Eier zeigen folgendes Aussehen: längsoval und dünnschalig Plasmodia Toxoplasma gondii Trichomonas vaginalis Trypanosoma Helminthen Ascaris lumbricoides Oxyuridae Schistosomatidae Strongyloides stercoralis Trichuridae 102

103 Protozoen Entamoeba histolytica Giardia lamblia Leishmania MIKROSKOPIE Schistosoma haematobium mit Nachweis der charakteristischen Eier in Urin oder Biopsaten bis 50 x 170 µm groß großer endständiger Sporn Plasmodia Toxoplasma gondii Trichomonas vaginalis Trypanosoma Helminthen Ascaris lumbricoides Oxyuridae Schistosomatidae Strongyloides stercoralis Trichuridae 103

104 Protozoen Entamoeba histolytica Giardia lamblia MIKROSKOPIE Schistosoma mansoni mit Nachweis der charakteristischen Eier im Stuhl großer, seitlicher Sporn Leishmania Plasmodia Toxoplasma gondii Trichomonas vaginalis Trypanosoma Helminthen Ascaris lumbricoides Oxyuridae Schistosomatidae Strongyloides stercoralis Trichuridae 104

105 Protozoen Entamoeba histolytica Giardia lamblia Leishmania MIKROSKOPIE Diagnose erfolgt durch den mikroskopischen Direktnachweis der Larven im Stuhl oder auch Bronchialsekret, Sputum, Aszites Larven sind 0,5 mm groß und stark beweglich Strongyloides-Eier sind sehr selten zu finden Plasmodia Toxoplasma gondii Trichomonas vaginalis Trypanosoma Helminthen Ascaris lumbricoides Oxyuridae Schistosomatidae Strongyloides stercoralis Trichuridae 105

106 Protozoen Entamoeba histolytica Giardia lamblia Leishmania MIKROSKOPIE Diagnose wird durch einen Einachweis im Stuhl gestellt Unverwechselbare Morphologie der Eier: zitronenförmige Gestalt bipolar aufgelagerte Schleimpfröpfe Plasmodia Toxoplasma gondii Trichomonas vaginalis Trypanosoma Helminthen Ascaris lumbricoides Oxyuridae Schistosomatidae Strongyloides stercoralis Trichuridae 106