Analyse des zytotoxischen Effektes von geringen Konzentrationen beta-amyloid über den Neurotrophin Rezeptor p75

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1 Analyse des zytotoxischen Effektes von geringen Konzentrationen beta-amyloid über den Neurotrophin Rezeptor p75 Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften der Fakultät für Chemie der Ruhr-Universität Bochum vorgelegt von Nina Hambruch Bochum, Mai 2006

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3 When once you have tasted flight, you will always walk the earth with your eyes turned skyward; for there you have been and there you will always be" Leonardo da Vinci Für meine Eltern

4 Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit vom Juni 2003 bis Mai 2006 am Lehrstuhl Biochemie II, Molekulare Neurobiochemie in der Arbeitsgruppe von PD Dr. A. Blöchl angefertigt. Prüfungstermin: Prüfungskommision: Referent Koreferent Vorsitz PD. Dr A. Blöchl Prof. Dr. C. Herrmann Prof. Dr. R. Heumann

5 Danksagung Bei der Erstellung dieser Dissertation haben mir etliche Menschen hilfreich und unterstützend zur Seite gestanden. Ich will hier versuchen, mich zumindest bei den meisten davon zu bedanken. Herrn Prof. Dr. R. Heumann für die Bereitstellung des Arbeitspatzes und der Arbeitsmaterialien Frau PD Dr. A. Blöchl für die interessante Thematik dieser Arbeit und ihrer erstklassige Betreuung in allen Bereichen, die viel zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen hat. Es hat immer Spaß gemacht, an der interessanten Forschung, die Andrea in ihrer AG betreibt, mitzuwirken. Ihr Ideenreichtum und Ihre tiefe Einsicht in biochemischen Zusammenhänge werden für mich auch in Zukunft ein Leitfaden sein. Herrn Prof. C. Hermann für die Übernahme des Koreferates Bei meinen Kollegen und Mitstreitern vom Lehrstuhl BiochemieII, die ich während meiner Promotion kennen lernen durfte und die zum freundlichen Arbeitsklima beigetragen haben. Insbesondere bei Christian F. und Sabine L. für die vielen netten Gespräche und anregenden Diskussionen...und für das offene Ohr, wenn die Forschung mal ihre eigenen Gesetze hatte Bei meinen ehemaligen Kollegen Sabine, Jan, Guido und Eftychia die mit ihrer Kollegialität und Unterstützung ganz wesentlich zu einem ausgezeichneten Arbeitsklima beigetragen haben Bei Sabine Reiter aus der Analytischen Chemie für die schöne Zusammenarbeit und ihre unnachgiebigen Bemühungen, ihr Robotic System zur NO Messung mit meinen Zellen zu bestücken Bei dem EU Projekts CellSens für die finanzielle Unterstützung meiner Arbeit Bei meiner Schwester Eva für die unvergleichbare Hilfe in allen Lebens- und Forschungslagen sowie für ihre bedingungslose Unterstützung....und dafür, daß immer jemand da war, dem es genauso erging wie mir ^.^ Bei meinen Eltern für ihre Liebe, die ständige Unterstützung in jeder Hinsicht sowie ihre Geduld und ihre Verständnis, wenn ich am Ende eines anstrengenden Arbeitstages nicht mehr die beste Gesprächspartnerin war Bei meinen Freunden Anne, Daniela, Heiko, Miguel, Nicole, Susanne, Stefan, Tanja und Thorsten (fürs Korrekturlesen), die außerhalb der Arbeit immer für mich da waren

6 Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis Abkürzungen VI 1. Einleitung Die Alzheimersche Krankheit Diagnostik und Therapie Molekulare Mechanismen und Charakteristika Prozessierung des APP und Entstehung des beta-amyloids Beteiligte Sekretasen Neurotoxizität des beta-amyloid Der p75 Low Affinity Neurotrophin Rezeptor (p75) Signaltransduktion des p Pro- und anti-apoptotische Signalwege p75 abhängige Modulation kleiner monomerer GTPasen beta-amyloid induzierte Signaltransduktion des p Modulierte Signaltransduktion unter Beteiligung des p75 Rezeptors Rezeptor-vermittelte Endozytose Endozytose mittels Clathrin coated Vesikel Endozytose mittels Caveolae Endozytose des p75 Rezeptors Src Kinasen Expression der Src Kinasen Struktur der Src Kinasen Regulation von Src Kinasen Src Kinasen in der Signaltransduktion Zielsetzung Material und Methoden Materialien Chemikalien (allg.) Chemikalien (Zellkultur) Materialien der Molekularbiologie 39 I

7 Inhaltsverzeichnis Bakterienstämme Mikroorganismen Plasmide Enzyme Sekundäre Zellinien Antikörper Mutanten des p Verbrauchsmaterialien Geräte Lösungen Molekularbiologie Zellkultur Proteinbiochemie Immunohistochemie Methoden Molekularbiologische Arbeitsmethoden Mini Präparation mittels Phenol-Chloroform Extraktion Mini Präparation nach der boiling method Midi Präparation mittels handelsüblicher Kits UV-photometrische Bestimmung der Konzentration der DNA Spaltung der DNA mittels Resrtiktionsendonucleasen Agarosegelelektrophorese Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen Amplifikation von DNA-Fragmenten mittels PCR Fällung von DNA Ligation von DNA Fragmenten Herstellung CaCl 2 kompetenter Bakterien Transformation Zellbiologische Methoden sekundärer Zellkultur Auftauen und Einfrieren sekundärer Zellinien Kultivierung von RN22, PCNA, MDCKtetoff-p75 WT und MDCKtetoff-p75 Y337F Kultivierung von MC 192-Hybridomazellen Gelantine Beschichtung von Deckgläschen Herstellung des monoklonalen Antikörper MC II

8 Inhaltsverzeichnis Stimulation Crosslinking Proteinbiochemische Methoden Induktion von GST-Fusionsproteinen Herstellung von Vollysaten der GST-Fusionsproteine Aufreinigung von GST-Fusionsproteinen aus Vollysaten GST freie Aufreinigung von Fusionsproteinen aus Vollysaten Lyse sekundärer Zellen Proteinbestimmung Ras-Pulldown Kopplung Pulldown SDS-PAGE (SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese) Coomassie Proteinfärbung Silberfärbung Western Blot Immunodetektion Redetektion ( Strippen ) Dichtegradienten-Zentrifugation p75 ICD -Pulldown Immuopräzipitation In vitro Phosphorylierung Herstellung von aggregiertem beta-amyloid 1-42 (Susen et al, 2005) Aktivierung von Natriumvanadat zu Pervanadat oder Orthovanadat Herstellung von filamentösem Aktin (F Aktin) p75 ICD -Aktin Pulldown Dnase 1 Affinitätschromatographie Immunohistochemische Methoden Fixierung und Blockierung Färbung Messung von Stickstoffmonooxid (NO) Fluoreszenzmessung von NO in RN22 Zellen Elektroanalytische NO-Bestimmung 67 III

9 Inhaltsverzeichnis 3. Ergebnisse Untersuchung der Beteiligung von Tyrosinkinasen bei der durch beta-amyloid ausgelösten Signaltransduktion über den p75 Rezeptor Untersuchung zur Beteiligung der c-abl Kinase an der Phosphorylierung des p75 Rezeptors Analyse einer möglichen Beteiligung der Janus Kinasen an der Phosphorylierung des p75 mittels Analyse der Ras und MAPK Aktivität Rolle der Src Kinasen bei der Signaltransduktion des p p75 abhängige Ras Aktivierung kann durch PP2 blockiert werden MAPK (Erk1/Erk2) Aktivierung über den p75 Rezeptor wird durch PP2...abgeschwächt Kopräzipitation von Src Kinasen und p75 nach Kreuzvernetzung ( Crosslinking ) Src Kinasen abhängige Phosphorylierung des p75 Rezeptors nach beta-amyloid 1-42 Stimulation Invitrophosphorylierung des p75 durch aktive c-src Tyrosin 337 und nicht Tyrosin 366 ist ein Substrat von Src Kinasen Untersuchung zur Endozytose des p75 Rezeptors mittel Caveolae p75 ICD interagiert mit Caveolin Kolokalisation von p75 und Caveolin-1/Caveolae Analyse der stimulationsabhängigen Lokalisation mittels Dichtegradienten- Zentrifugation Analyse der stimulationsabhängigen Lokalisation mittels der konfokaler Mikrokopie Untersuchung zu einer möglichen Interaktion des p75 Rezeptors mit Aktin p75 und Aktin interagieren nicht im p75 ICD -Aktin Pulldown Assay DNase 1 Affinitätschromatographie NO Produktion nach beta-amyloid Stimulation 100 IV

10 Inhaltsverzeichnis 4. Diskussion Untersuchung der Beteiligung von Tyrosinkinasen bei der durch beta-amyloid 1-42 ausgelösten Signaltransduktion über den p75 Rezeptor c-abl ist nicht an der Phosphorylierung des p75 Rezeptors beteiligt Die Beteiligung der Janus Kinasen an der Phosphorylierung des p75 kann nicht nachgewiesen werden Src Kinasen sind an der Phosphorylierung des p75 Rezeptors beteiligt Src Kinasen sind an der Rezeptor-vermittelten Ras Aktivierung beteiligt Src Kinasen sind an der Rezeptor-vermittelten Aktivierung der MapK Erk1/Erk2 beteiligt Phosphorylierung des p75 durch Src Kinasen Endozytose der p75 Rezeptors p75 interagiert mit Caveolin Der p75 Rezeptor wird nach der Stimulation mit beta-amyloid in Caveolae aufgenommen Der p75 Rezeptor interagiert nicht mit Aktin Die Stimulation des p75 mit beta-amyloid führt in RN22 Zellen zur Bildung von NO Zusammenfassung Literaturverzeichnis Anhang 150 Kongressbeiträge 150 Lebenslauf 151 V

11 Inhaltsverzeichnis Abkürzungen AK Antikörper APS Ammoniumperperoxidisulfat ATP Adenosintriphosphat Bax Bcl-2 associated X Protein BDNF brain-derived neurotrophic factor bp Basenpaare BSA Rinderserumalbumin DD Death Domain cdna komplementäre DNA DMEM Dulbecco s modified Eagle s Serum DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonucleinsäure dntp desoxy-nucleosidtriphosphat DTT 1,4-Dithiothreitol DSP Dithiobis[succinimidylpropionat] E.coli Escherichia coli EDTA Ethylendiamin-N,N,N,N -tetraessigsäure EGTA Ethylenglykol bis(β-aminoethylether)-n,n,n,n tetraessigsäure ERK extracellular-signal regulated kinase FAP Fas-assoziierte Phosphatase FCS fötales Kälberserum g Erdbeschleunigung (9,81m/s 2 ) Grb2 growth factor receptor bound protein 2 GST Glutathion-S-Transferase GTP Guanosintriphosphat h Stunde HEPES 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]-ethansulfonsäure HRP Horseradish-Peroxidase JNK Jun N-terminale Kinase kda Kilodalton VI

12 Inhaltsverzeichnis LB Luria Berani LNTR low affinity neurotrophin rezeptor MAGE Melanoma antigene gene MAPK(K)(K) mitogen activated protein kinase (kinase) (kinase) MES Morpholinoethansulfonsäure MOPS γ-morpholinopropansulfonsäure MT Mikrotubuli MTOC Mikrotubuli organisation center NADE p75lntr-associated cell death executor NFκB nuclear factor κb NGF nerve growth factor NMR nuclear magnetic resonance NP 40 Nonylphenylpolyethylenglycol NRAGE Neurotrophin receptor-interacting MAGE homologue NRIF Neurotrohin receptor interacting factor NT-3, -4/5, -6 Neurotrophin-3, -4/5, -6 OD optische Dichte p75 p75 low affinity neurotrophin rezeptor PBS phosphat buffered saline PCR polymerase chain reaction PKA ProteinkinaseA PKC ProteinkinaseC PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid ptyr Phospho-Tyrosin RBD Ras binding domain RNA Ribonucleinsäure rpm rounds per minute RT Raumtemperatur SDS Natriumdodecylsulfat SDS-PAGE SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese SH-Domäne Src homologe Domäne Shc SH2-Domäne enthaltendes und α2-kollagen ähnliches Protein Sos son of sevenless Src sarcoma VII

13 Inhaltsverzeichnis TNF(R) TRAF TRE Tris Triton X-100 Trk U v/v V w/v tumor necrosis factor (receptor) TNFR-assoziierte Faktoren tetracyclin-resposive element Tris(hydroxylmethyl)-aminomethan Octophenyl-polyethylenglycolether tropomyosin related kinase Unit Volumen pro Volumen Volt Gewicht pro Volumen VIII

14 Einleitung 1 1. Einleitung 1.1 Die Alzheimersche Krankheit Die Alzheimersche Krankheit ist die häufigste Altersdemenz in Deutschland. Im Mittel werden in Deutschland Bürger geschätzt, die an der Alzheimerschen Krankheit leiden. Pro Jahr werden ca Neuerkrankte verzeichnet. Aus Studien in den Staaten geht hervor, dass 10% der über 65jährigen und 40% der über 85jährigen erkranken. Für die etwa 4 Millionen erkrankte Amerikaner entstehen ca. 61 Milliarden Dollar Kosten pro Jahr durch Arbeitsunfähigkeit, Arbeitsausfälle bei Familienangehörigen, die an der Pflege der Patienten beteiligt sind, Pflege in Heimen und Krankenhäusern und medizinischer Versorgung (Ross Koppel, Alzheimer's desease: The costs to U.S. Business in 2002; Alzheimers association 06/2002). Neben Herz-Kreislauf Erkrankungen und Behandlung von Krebs ist damit die Alzheimer'sche Krankheit der größte Kostenfaktor des Gesundheitswesens. Die demographische Entwicklung läßt vermuten, daß in den nächsten 20 Jahren der prozentuale Anteil von Alzheimer Patienten noch stark ansteigt. Die Erkrankung ist nicht nur mit zunehmender Gedächtnisschwäche verbunden, sondern auch mit einer starken Veränderung der Persönlichkeit des betroffenen Patienten. Diese Veränderungen sind eine schwere psychische Belastung für die Angehörige der Patienten, die häufig über lange Zeit auch die Pflege übernehmen. Dieses neurodegenerative Leiden wurde erstmals vom deutschen Neurologen und Psychiater Alois Alzheimer ( ) beschrieben. Als Assistenzarzt behandelte er im November 1901 die stark verwirrte und orientierungslose Auguste D. Er protokollierte ihren Krankheitsverlauf und untersuchte nach ihrem Tode am 8. April 1906 Schnitte ihres Gehirns. Dabei entdeckte er Proteinablagerungen, abgestorbene Nervenzellen und Faserbündel. Nach der Veröffentlichung seiner Ergebnisse 1907 in der Allgemeinen Zeitschrift für Psychiatrie, (Alzheimer, 1907) schlug sein früherer Lehrer Emil Kraeplin ( ) vor, die Krankheit nach Alzheimer zu benennen (Kraeplin, 1910). Aber erst im Dezember 1992 wurde ein weiterer Schritt zum Verstehen dieser Krankheit getan. Damals wurde das Material, das Alzheimer von seinem zweiten Patienten Johann F. (Alzheimer, 1911) gewonnen hatte, und seine Aufzeichnungen

15 Einleitung 2 im Archiv des Neuropathologischen Instituts der Universität München wieder gefunden. Mittels moderner Methoden wie der PCR und neuerer Erkenntnisse wurden die Daten erneut überprüft. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen und Bilder der Originalnotizen wurden 1997 von Graeber et al. (Graeber et al, 1997) veröffentlicht. In den Originalschnitten des cerebralen Kortex konnten amyloide Plaques gefunden werden, aber keine Neurofibrillen. Bis heute ist es gelungen, die Hintergründe und Risikofaktoren der Alzheimerschen Krankheit besser zu erforschen. Denn in der fast 100 jährige Geschichte der Erforschung der Krankheit wurden eine Menge deskriptiver und biochemischer Faktoren zusammengetragen, durch die ein relativ klares Bild eines progressiven Absterbens von Nervenzellen im Gehirn der Patienten entstanden ist. Die Krankheitsfälle werden eingeteilt nach frühem (< 60 Jahre) oder spätem (> 60 Jahre) Krankheitsbeginn und nach sporadischem oder familiärem Auftreten. Die Fälle mit frühem Krankheitsbeginn oder die familiär gehäuft auftretenden korrelieren häufig mit Mutationen in Genen, die an der Entstehung der Krankheit beteiligt sind. Hier spielen besonders Mutationen des Gens für das Amyloid-Vorläufer Protein (APP) und der Gene für die Preseniline-1 und 2 (PS-1, -2) eine Rolle. Die genannten genetischen Faktoren sind aber nur für einen kleinen Teil der auftretenden Fälle der Alzheimerschen Krankheit verantwortlich. Es spielen auch andere Risikofaktoren wie Umweltfaktoren, der Lebensstil, die medizinische Vorgeschichte und bisher unbekannte Faktoren eine Rolle Diagnostik und Therapie Trotz detaillierten Wissens über die charakteristischen Proteine ist bislang nicht genau geklärt, wodurch die krankhaften Veränderungen entstehen. Das Fehlen von Grundlagen zur Entstehung der Erkrankung verhindert aber, daß frühzeitig eine Behandlung einsetzen kann, um eine progressive Erkrankung zu verhindern. Kognitive Tests und bildgebende Untersuchungsverfahren geben aber Lebzeiten die Möglichkeit mit hoher Wahrscheinlichkeit die Krankheit festzustellen. Bildgebende Verfahren (Computertomographie, NMR-Spektroskopie, Positronen-Emissions- Spektroskopie (PET) und Single Photon Emission Computed Tomography (SPECT)) können strukturelle oder funktionelle Veränderungen des Gehirns darstellen. Einzeln lassen diese Methoden allerdings keine sichere Diagnose zu, da es auch bei

16 Einleitung 3 anderen Krankheiten zu oben genannten Veränderungen kommen kann. Um die Verläßlichkeit und Spezifität der Diagnose zu erhöhen, werden verschiedene Methoden miteinander kombiniert. Nachteilig bei allen Diagnosemethoden ist der Zeitpunkt der Diagnose, da die Krankheit erst im fortgeschrittenen Stadium diagnostiziert werden kann. Bisherige Behandlungsmethoden setzen so erst bei dem schon massiv geschädigten Gehirn an und können bestenfalls die Krankheit um wenige Jahre verzögern. Ein grundlegendes Verständnis der Krankheit und ihrer molekularen Hintergründe sind also sowohl für die Entwicklung von frühzeitig anwendbaren Diagnosemethoden, sowie für die von Therapeutika von großer Bedeutung Molekulare Mechanismen und Charakteristika Die hervorstehenden Symptome der Alzheimerschen Krankheit sind der Gedächtnisverlust und Persönlichkeitsveränderungen. Diese werden hervorgerufen durch massive synaptische Fehlfunktionen und dem fortschreitenden Absterben von Neuronen im Neokortex und basalen Vorderhirn. Molekular wird die Alzheimersche Krankheit durch zwei Formen von Ablagerungen charakterisiert. Die erste Form, die amyloiden Plaques, besteht zu einem großen Teil aus beta-amyloid, einem 4 kda großem Peptid, das durch Prozessierung des Amyloid-Vorläufer Proteins APP entsteht. Hierauf wird später noch genauer eingegangen. Beta-Amyloid existiert in einer löslichen, nicht aggregierten und in einer nicht löslichen, aggregierten (fibrillären) Form. Es ist sowohl außerhalb, als auch innerhalb der Zellen zu finden. Die zweite Form, die neurofibrillären Tangles (NFTs) oder paired helical filaments (PHFs), besteh aus hyperphosphoryliertem Tau. Tau ist ein Protein, das in Nervenzellen mit dem Zytoskelett (Mikrotubuli) interagiert, es stabilisiert und beim Transport von Nährstoffen und Signalmolekülen in der Nervenzelle mitwirkt. Durch alternatives Spleißen kommt es zur Expression von sechs unterschiedlichen Tau- Isoformen mit einem Molekulargewicht von 45 bis 65 kda (Goedert et al, 1989). Die kürzeste Isoform wird ausschließlich im fetalen Gewebe exprimiert, die anderen fünf kommen während der Entwicklung hinzu (Brion et al, 1993). Die Proteine besitzen drei bis vier Mikrotubuli-bindende Domänen mit bis zu 79 potentiellen Phosphorylierungsstellen. Tau bindet, Phosphorylierungs-abhängig an die

17 Einleitung 4 Mikrotubuli und stabilisiert sie. Es kann durch die Glykogen-Synthase-3α und β (GSK- 3α und β), die Mitogen-aktivierte Proteinkinase (Erk), die Cyclin-abhängige Kinase (cdk5), die Proteinkinase A (PKA), die Proteinkinase C (PKC), die Mikrotubuli- Affinitätsregulierende Kinase (MARK) und die Calcium/Calmodulin-abhängige Kinase (CaMK II) phosphoryliert werden. Eine vermehrte Phosphorylierung schwächt die Interaktion mit den Mikrotubuli ab, wobei die Dephosphorylierung (z. B. durch die Phosphatasen1, 2A, 2B (Calcineurin)) diese stärkt. Bei der Alzheimerschen Krankheit kommt es bereits im frühen Stadium zu einer vermehrten Phosphorylierung von Tau, wodurch dieses sich von den Mikrotubuli löst. Das freie hyperphosphorylierte Tau beginnt zu aggregieren und verliert damit seine stabilisierend Funktion (Review: Garcia and Cleveland, 2001; Imahori et al., 1998), was in der Konsequenz zum Absterben der betroffenen Zellen führt. Nach dem Zelltod verbleiben nur extrazelluläre NFTs, die als ghost tangles bezeichnet werden (Billingsley & Kincaid, 1997), (Mandelkow & Mandelkow, 1998), (Spillantini & Goedert, 1998). Die für die Alzheimersche Krankheit charakteristischen amyloiden Plaques können morphologisch unterschieden werden in diffuse, primitive, klassische und kompakte Plaques (Armstrong, 1998). In diffusen Plaques liegt das beta-amyloid nicht fibrillär vor und so wurden diese zunächst nicht mit neuronaler Degeneration in Verbindung gebracht. Im Gegensatz dazu enthalten die primitiven Plaques (Größe: 20 bis 60 µm, symmetrisch geformt) aggregiertes beta-amyloid (in β-faltblattstruktur). Des Weiteren bestehen sie aus dystrophen Neuriten, PHFs, phosphoryliertem Tau, konjugiertem und freiem Ubiquitin, Chromagranin A und Fragmenten des APPs. Die dritte morphologische Form der Plaques, die klassischen Plaques, haben einen zentralen Kern, der von einem Ring aus dystrophen Neuroten umgeben ist. Dieser Kern wird hauptsächlich aus beta-amyloid 1-42 gebildet, enthält aber auch Immunglobuline, Serum-Amyloid-P, α1-antichymotrypsin, Antitrypsin, Antithrombin III, Komplementfaktoren und Apolipoprotein ε. Im Unterschied zum Kern, ist im Ring kaum beta-amyloid vorhanden. Er besteht hauptsächlich aus Aggregaten von neuronalen Fortsätzen, Neurofilamenten und PHF. Die kompakten Plaques bestehen wie die klassischen Plaques aus einem amyloiden Kern (Größe 5 bis 15µm), ein umgebener Ring fehlt ihnen jedoch.

18 Einleitung Prozessierung des APP und Entstehung des beta-amyloids Beta-Amyloid entsteht durch Prozessierung des Amyloid-Precursor Proteins (APP). Dieses wurde erstmals 1987 von Kang (Kang et al, 1987) aus mrna kloniert und ist ein 695 Aminosäure langes transmembranes Glykoprotein vom Typ I (N-Terminus extrazellulär, C-Terminus intrazellulär) mit einem kalkulierten Molekulargewicht von 78,6kDa. Die verschieden Isoformen des APP haben eine Länge von 695 bis 770 Aminosäuren, wobei die Aminosäuren 625 bis 648 als potentielle Transmembrandomäne identifiziert wurden (Golde et al, 1990). Die Sequenz für das neurotoxische beta-amyloid liegt zwischen Aminosäure 597 und 638 und befindet sich somit teilweise im Transmembranbereich (Glenner & Wong, 1984). Das für APP codierende Gen ist auf Chromosom 21 beim Menschen lokalisiert (Kang et al, 1987). Dies führt dazu, daß ein Zusammenhang zwischen Trisomie 21 und Alzheimerscher Krankheit beobachtet werden kann. So sind Menschen mit Down-Syndrom in allen Fällen von der Alzheimerschen Krankheit betroffen. Hier scheint die zusätzliche Kopie des APP-Gens zu einer erhöhten beta-amyloid Synthese zuführen. Durch die größere Menge an beta-amyloid erhöht sich gleichzeitig die Wahrscheinlichkeit der Aggregation und somit auch die der Plaquebildung. Das Amyloid-Precursor Protein (APP) kann auf zwei unterschiedliche Arten prozessiert werden. Bei der α-sekretorischen Prozessierung kommt es nicht zu einer Bildung von beta-amyloid. Im Gegensatz dazu führt der β-sekretorische Weg zur Bildung von beta-amyloid und ist somit pathologisch bedeutend. Allgemein erfolgt die Prozessierung durch drei Proteasen, die α-, β- und γ-sekretase. In Abbildung 1.1 ist schematisch die α-sekretorische Prozessierung des APP dargestellt. Zunächst wird das APP von der α-sekretase geschnitten, wodurch das lösliche α APPs und das membrangebundene C83 (83 Aminosäuren = C83) Fragment entsteht. Das C83 Fragment wird nachfolgend durch die γ-sekretase in das lösliche p3 Fragment (3kDa) und das membrangebundene p7 Fragment (7kDa) gespalten.

19 Einleitung 6 α-apps APP p3 α-sekretase C83 p7 γ-sekretase Abbildung 1.1: Schematische Darstellung der α-sekretorischen Prozessierung von APP Das lösliche α APPs übernimmt in den Zellen verschiedene Funktionen wie zum Beispiel die Stimulierung von Zellproliferation, Verstärkung von Zelladhäsion und Inhibition von Serinproteasen (Saitoh et al., 1989; Schubert et al., 1989; Sinha et al., 1990; Chen und Yankner, 1991). Des Weiteren wirkt es neuroprotektiv bei verschiedenen Arten von zellulärem Streß. Dieser protektive Effekt kann teilweise auf die Stabilisierung der intrazellulären Calzium-Hömeostase in Neuronen zurückgeführt werden (Mattson et al., 1993; Schubert und Behl, 1993). Das ebenfalls freigesetzte Fragment P3 wird vermutlich schnell degradiert, und ist nicht in der Lage zu aggregieren (Näslund et al., 1994). Wird APP auf dem β-sekretorischen Weg prozessiert (Abbildung 1.2), wird zunächst durch die β-sekretase das lösliche Fragment β-apps freigesetzt. Das Fragment C99 verbleibt dabei in der Zellmembran (99 Aminosäuren/12kDa). Dieses Fragment wird innerhalb der Transmembranregion durch die γ-sekretase gespalten, wodurch das amyloidogene beta-amyloid 1-42 oder beta-amyloid 1-40 entsteht.

20 Einleitung 7 β-apps APP β-sekretase BACE C99 p7 beta-amyloid (40 o. 42aa) γ-sekretase Abbildung 1.2: Schematische Darstellung der β sekretorischen Prozessierung von APP Ein Teil des beta-amyloids wird von den Zellen sezerniert, wohingegen ein anderer innerhalb der Zellen verbleibt, wodurch zwei unterschiedliche Pools von Amyloid entstehen (Wilson et al., 1999) Beteiligte Sekretasen Da eine Ansammlung von beta-amyloid eine Plaquebildung begünstigt, wurde intensiv geforscht, um die Identität der Sekretasen zu enthüllen. Sie könnten mögliche Angriffpunkte für eine Therapie der Alzheimerschen Krankheit sein. So wäre es denkbar, den β-sekretorischen Weg zu inhibieren bzw. das Gleichgewicht der Prozessierung auf den α-sekretorischen Weg zu verschieben. Dadurch würde die Bildung des neurotoxischen beta-amyloids verhindert. Bis heute sind für alle Sekretasen viel versprechende Kandidaten, die alle Anforderungen erfüllen, identifiziert worden. Die α-sekretase schneidet das APP am C-terminalen Teil, zwischen Aminosäure Lysin-16 und Leucin-17 der beta-amyloid Sequenz (Esch et al, 1990). Diese Prozessierung findet vermutlich im Golgi-Apparat statt (Kuentzel et al, 1993), allerdings wurde auch schon α-sekretase Aktivität an der Plasmamembran beobachtet (Lammich et al, 1999). Bei der α-sekretase handelt es sich um eine Zink-

21 Einleitung 8 abhängige Metalloprotease (Parvathy et al, 1998). Ihre Aktivität kann durch Phorbolester (Buxbaum et al, 1990) oder M1 und M3 muskarinische Agonisten (Buxbaum et al.,1992; Nitsch et al., 1992) stimuliert werden. Zwei Proteasen, die APP schneiden wurden bereits identifiziert, TACE (Tumor Nekrosis Factor (TNF)-α converting enzyme bzw. ADAM-17) (Black et al, 1997; Moss et al, 1997) und ADAM-10 (Rosendahl et al, 1997), die beide zu der Familie der Adamalysin-Protease/Disintegrin-Metalloproteinasen gehören (Wolfsberg et al, 1995). Diese Proteasen sind nicht sequenzspezifisch, benötigen jedoch einen genauen Abstand zur Membran, um die Proteolyse durchzuführen. Die gleiche Beobachtung wurde auch für die α-sekretase gemacht (Sisodia et al.,1992). TACE ist eine 70kDa große, membrangebundene Zink-abhängige Endopeptidase (Typ I-Membranprotein). Zunächst wurde TACE 1997 von Black et al. und Moss et al. als wichtiges Enzym zur Freisetzung von TNF-α identifiziert (Black et al, 1997, Moss et al, 1997). Das als Pro-Protein exprimiertes TNF-α wird nach Spaltung durch TACE freigesetzt konnte die Expression von TACE in pyramidalen Neuronen des cerebralen Kortex und in granulären Zellen des Hippokampus nachgewiesen werden (Skovronsky et al, 2001). Hinweise für die α-sekretase Aktivität von TACE lieferten Buxbaum et al. (Buxbaum et al, 1998). Sie konnten zeigen, daß die katalytische Domäne der Protease in der Lage ist ein synthetisches Peptid, das die α-sekretase Schnittstelle des APPs enthält, zu schneiden. Die bereits erwähnte Phorbolester (PMA) abhängige Induktion der α-sekretase Aktivität wird durch TACE vermittelt. Wird die TACE Expression unterdrückt, hat die Stimulation mit PMA bzw. die Inhibition keinen Einfluß auf die Sekretase Aktivität. Neben dieser regulativen Aktivität scheint es somit auch eine konstitutive α-sekretase Aktivität zu geben. Einige Ergebnisse deuten darauf hin, daß ein weiteres Mitglied der ADAM Familie, ADAM-10, diese Aktivität besitzt. Sie scheint im Gegensatz zu der von Buxbaum et al. publizierten TACE sowohl für den regulativen als auch für den konstitutiven Weg verantwortlich zu sein (Lammich et al., 1999). Bei der Protease, die die β-sekretase Aktivität vermittelt, handelt es sich um eine Aspartatprotease namens BACE (Vassar et al, 1999, Sinha et al, 1999). BACE (betasite APP cleaving enzyme) ist ein Transmembranprotein vom Typ I, und besitzt vier N-Glykosylierungsstellen, deren Glykosylierung die β-sekretase Aktivität bestimmen (Charlwood et al, 2001). Wird die BACE Expression in neuronaler Kulturen durch sirna unterdrückt, reduziert sich der beta-amyloid Level deutlich (Kao, S.-C. et al.

22 Einleitung ). In BACE Knockout-Mäuse kann keine Produktion von beta-amyloid beobachtet werden. Die Mäuse weisen aber ansonsten einen normalen Phänotyp auf (Luo et al, 2001). Die γ-sekretorische Prozessierung des Fragments C99 bestimmt, ob beta-amyloid 1-40 oder beta-amyloid 1-42 gebildet wird. Da das längere beta-amyloid 1-42 leichter aggregiert und somit neurotoxischer ist als die kürzere Form, ist die Identifizierung der γ-sekretase wichtig, um die Entwicklung der Alzheimerschen Krankheit besser zu verstehen. Als erstes konnte gezeigt werden, daß es sich bei der γ-sekretase um eine Aspartatprotease handeln muß (Wolfe et al, 1999a). Des Weiteren konnte ein Zusammenhang zwischen den Presenilinen und APP Prozessierung hergestellt werden. Die Familie der Preseniline besteht aus zwei homologen Transmembranproteinen, die als Presenilin 1 (PS1) und Presenilin 2 (PS2) bezeichnet werden. Sie werden ubiquitär exprimiert (Levy-Lahad et al., 1995; Sherrington et al., 1995) und sind im Gehirn vorwiegend in Neuronen zu finden (Kovacs et al., 1996; Lee et al., 1996; Page et al., 1996). Mutationen der Preseniline führen zu einer frühen Form der Alzheimerschen Krankheit (Ausbruch zwischen dem 30. bis 60. Lebensjahr). Alle bisher untersuchten PS-Mutationen beeinflussen die Spaltung des C-terminalen Endes von beta-amyloid, so daß anstelle von beta- Amyloid 1-40 mehr beta-amyloid 1-42 entsteht (Duff et al., 1996; Scheuner et al.,1996; Borchelt et al., 1997; Tomita et al., 1997; Holcomb et al., 1998). Des Weiteren wurde in Neuronen von PS-1 defizienten Mäusen eine deutliche Reduzierung des γ- Sekretase Produktes (beta-amyloid) und die Akkumulation des Vorläuferpeptides C99 nachgewiesen (De Strooper et al., 1998; Naruse et al., 1998). Die verbleibende Aktivität stammt vermutlich von Presenilin 2, da Mäuse, bei denen PS1 und PS2 entfernt wurden, keine γ-sekretase Aktivität mehr aufweisen (Herreman et al, 2000). Diese Ergebnisse zeigen, daß die Preseniline für die Proteolyse des APP zu beta- Amyloid notwendig sind. Im weiteren Verlauf der Forschung häuften sich Hinweise für eine γ-sekretase Aktivität der Preseniline (Review Brunkan and Goate, 2005). Nach dem heutigen Wissenstand sind γ-sekretasen Komplexe aus vier verschieden Membranproteinen (Presenilin, Niscastrin, Aph-1 und Pen-2), die alle zum Erhalt der Aktivität notwendig sind (Kimberly et al, 2003). Dieser Komplex hat neben der APP Prozessierung noch weitere Aufgaben. So ist er unter anderem für die Proteolyse von Notch (Transmembranrezeptor, der besonders in der Entwicklung eine Rolle

23 Einleitung 10 spielt), ErbB4 (Rezeptor-Tyrosin-Kinase, die Differenzierung und Proliferation reguliert) und des p75 Rezeptors (s.u.) verantwortlich (Review Sisodia and St George-Hyslop, 2002) Neurotoxizität des beta-amyloid Das extrazelluläre beta-amyloid lagert sich bedingt durch eine Umlagerung von einer α-helix zu einer β-faltblatt-konformation zunächst zu Oligomeren zusammen. Daraus bilden sich im weiteren Verlauf der Aggregation Protofibrillen und schließlich fibrilläre Strukturen, die die Vorstufe der neuritischen Plaques sind (Lorenzo und Yankner, 1994). Welche beta-amyloid Aggregationszustände die größte neurotoxische Wirkung haben, ist bis heute noch nicht vollends aufgeklärt. Einerseits konnte früh gezeigt werden, daß fibrilläres beta-amyloid aus synthetischen beta- Amyloid Peptiden in Zellkultur neurotoxisch wirkt (Lorenzo und Yankner, 1994; Roher et al., 1996; Howlett et al., 1995). Bei diesen Experimenten wurden allerdings unphysiologisch hohe Konzentrationen eingesetzt. Andererseits häufen sich in letzter Zeit Hinweise darauf, daß nicht die Fibrillen, sondern die oligomeren beta-amyloid Komplexe das größte neurotoxische Potential haben. Diese amyloiden Sphären scheinen in sehr hohen Konzentrationen in der Lage zu sein, sich in die Zellmembranen einzulagern und Kanäle zu bilden. Damit stören sie das Calcium Gleichgewicht der Zellen und lösen Apoptose aus (Review Kagan et al 2002). In geringeren Konzentrationen wirken die Amyloid-Oligomere unter Beteiligung von Zelloberflächenproteinen neurotoxisch, was auf einen Rezeptor-vermittelten Signalweg hinweist (Lambert et al., 1998). Bis heute wurden verschiedene Rezeptoren entdeckt, die durch beta-amyloid induzierte Apoptose auslösen. So binden die Mikroglia Rezeptoren RAGE ( receptor for advanced glycation end products ) und Scavenger beta-amyloid und vermitteln dessen toxische Wirkung (Paresce et al., 1996; Yan et al., 1996). Apoptose durch beta-amyloid Oligomere kann auch über den p75 Rezeptor (s.u.) ausgelöst werden. In hohen Konzentrationen führt die Bindung von Amyloid an den Rezeptor zur Aktivierung von p38 und JNK. Nachfolgend kommt es zur Translokation von NFκB und zur Aktivierung von p53, welches Apoptose auslöst (Constantini et al 2005). Auch eine Beteiligung der Caspasen 8 und 3, sowie ein synergistischer Effekt durch die Cytokine TNFα Tumor Nekrosis Faktorα) und IL-1β wurde im Zusammenhang mit

24 Einleitung 11 dem durch p75 vermittelten Zelltod entdeckt (Perini et al 2002). Des Weiteren ist oligomers beta-amyloid in der Lage im Hippocampus auftretendes LTP (long term potentiation) zu blockieren und inhibiert die synaptische Plastizität (Review Walsh et al 2002). Eine indirekte Wirkung des beta-amyloids wird durch die Aktivierung von Mikroglia und Astrozyten vermittelt, die die amyloiden Plaques umgeben. Diese setzen Sauerstoff- und Stickstoffradikale, proteolytische Enzyme und Cytokine frei, woraufhin es zum Absterben der umliegenden Neuronen kommt. Aktivierte Mikroglia ist aber auch in der Lage beta-amyloid zu phagozitieren, baut es allerdings langsam und unvollständig ab (Paresce et al, 1997; Chung et al, 1999). 1.2 Der p75 Low Affinity Neurotrophin Rezeptor (p75) Neurotrophine sind kleine, meist dimere Moleküle, die sowohl pro- als auch antiapoptotische Auswirkungen auf Nervenzellen haben können. Zur Klasse der Neurotrophine zählen unter anderem der nerve growth factor (NGF), der brainderived neurotrophic factor (BDNF), Neurotrophin-3 (NT-3) und Neurotrophin-4/5 (NT-4/5). Während der Entwicklung regulieren sie neben der Differenzierung das Überleben und Absterben bestimmter Neuronen und sind an Aufbau und Verknüpfung neuronaler Netzwerke beteiligt. Im adulten Nervensystem erfüllen sie bei der Ausbildung und Modulation synaptischer Plastizität wichtige Aufgaben. Neurotrophine üben ihre Wirkung über ein duales Rezeptor-System aus, welches zum Einen aus den drei Tyrosinkinase gekoppelten Trk-Rezeptoren (TrkA, B und C), zum Anderen aus dem p75 Rezeptor, der keine intrinsische Kinaseaktivität aufweist, besteht. Der p75 Low Affinity Neurotrophin Rezeptor bindet alle Neurotrophine mit gleicher, niedriger Affinität (K D =10-9 ) (Meakin & Shooter, 1992), wohingegen die Trk- Rezeptoren spezifisch NGF, BDNF oder NT4/5 bzw. NT-3 binden. Außerdem bindet der p75 Rezeptor unter anderem RVG (Rabies Viruns Glycoprotein) (Langenevin et al., 2002), das Prionenprotein Fragment PrP (Della-Bianca et al., 2001) und beta-amyloid (Yaar et al., 1997). Die Signalwege, die über den p75 Rezeptor aktiviert werden, sind von vielen Variablen (Zellinie, Interaktionspartner etc.) abhängig. Sie

25 Einleitung 12 können sowohl pro-apoptotische, als auch anti-apoptotische Effekte auslösen (Review Hempstead, 2002; Chao, 2003). Strukturell gesehen ist der p75 ein O- und N-glykolysiertes TypI Transmembranprotein aus 425 Aminosäuren, und gehört zur Familie der Cytokine Rezeptoren des TypsIII. Der Rezeptor besitzt im extrazellulären Bereich vier Cysteinreiche Domänen (30-40As), von denen die ersten beiden zwei N- Glykolisierungsstellen enthalten. Als Mitglied der Cytokine Rezeptor Familie hat der p75 im intrazellulären Bereicht eine TypII Death Domain (DD), die der Death Domain anderer Mitglieder dieser Familie (Tumor Necrosis Faktor Rezeptor (TNFR) oder Fas) ähnelt (Chapman et al., 1995). Über Disulfidbrücken formen die extrazellulären, Cystein-reichen Domänen eine Immunoglobulin-ähnliche Struktur. Dieser Bereich wird als Ligandenbindungsdomäne bezeichnet. Daran schließt sich eine Serin/Threonin-reiche Region an, die so genannte Stark-Region (As ). Diese Domäne ist reich an O- Glykolisierungsstellen und hat Einfluß auf die Lokalisation des Rezeptors. Auf eine kurze Transmembrandomäne (As ) folgte der Juxtamembranbereich. Neben einer Palmitylierungsstelle (As 279), die bei der Ausrichtung des Rezeptors in der Membran eine Rolle spielt, wurde hier eine Chopper-Region (As ) identifiziert. Dieser 29As lange Bereich ist in der Lage, über Caspasen- und Calpain-Aktivierung den Zelltod auszulösen. Voraussetzung hierfür ist die Abspaltung der extrazellulären Domäne sowie die Membranverankerung über As 279. Weiterhin ist die Juxtamembrandomäne reich an Serinen und Threoninen und weist einen hohen Phosphorylierungsgrad auf (Coulson et al., 2000). Homolog zu den TNF-Rezeptoren besitzt der p75 eine der Death Domain (DD) homologe Domäne (As ) (Chapman, 1995). Diese globuläre Domäne besteht aus sechs α-helices, die in zwei Gruppen aus jeweils drei Helices angeordnet sind. Die beiden Gruppen stehen etwa senkrecht zueinander, wobei die Helices jeder Gruppe parallel ausgerichtet sind. In der entstehenden Struktur liegen der N- Terminus der ersten und der C-Terminus der sechsten Helix nahe beieinander (Liepinsh et al., 1997). Zu Beginn der ersten und zu Beginn der dritten Helix befindet sich jeweils ein Tyrosin (Y337 und Y366, siehe Abb. 1.3 ). Der Phosphorylierungszustand dieser Aminosäuren ist entscheidend für die p75 vermittelte GTPase Aktivierung (Blöchl et al., 2004).

26 Einleitung 13 Abbildung 1.3: Schematische Darstellung der Struktur der Death Domäne des p75 Rezeptors Des Weiteren liegt innerhalb der Helix 5 der Death Domain eine dem Mastoparan homologe Sequenz (Mastoparan-Site). Mastoparane können zum Einen G-Proteine binden und diese aktivieren (Chapman, 1995), zum Anderen interagieren sie mit kleinen monomeren GTPase der Rho Familie wie RhoA (Koch et al., 1991) oder Cdc42 (Daniel et al., 2002) und aktivieren diese. C-terminal weist der p75 ein SPV-Motiv auf. Dieses Motiv stellt ein Homolog zu den Bindungsmotiven der PDZ-Domänen dar und ist an der Unterdrückung des p75 vermittelten Zelltods beteiligt (Takahisa et al., 1999) Signaltransduktion des p75 Wie alle Cytokin Rezeptoren des TypsIII weist der p75 im zytoplasmatischen Bereich keine katalytische Domäne auf. Daher wurde zunächst angenommen, daß er keine eigene Signaltransduktion auslöst, sondern als Hilfsrezeptor für die Trk-Rezeptoren fungiert. So ist bekannt, daß der TrkA Rezeptor sowohl im dimeren homologen Komplex (Meakin & Shooter 1992), (Ibanez et al., 1994), als auch im Komplex mit p75 (Hempstead et al., 1989), (Barker & Shooter, 1994) hochaffine Bindungsstellen für NGF bilden kann.

27 Einleitung 14 Wenig später wurde jedoch klar, daß der p75 Rezeptor auch alleine Signale weiterleiten kann. Die resultierende Signaltransduktion ist spezifisch für die verschiedenen Liganden, obwohl ihre Affinität zum Rezeptor oft sehr ähnlich ist (Carter et al., 1992). Es zeigte sich, daß durch verschiedene Effektoren des Rezeptors eine Fülle von Signaltransduktionskaskaden ausgelöst werden kann. Ob die durch den p75 Rezeptor ausgelösten Signale pro- oder anti-apoptisch wirken, hängt von vielen Faktoren wie Zellart, Entwicklungsstadium oder verfügbaren Effektoren und Interaktionspartner ab. Weiterhin greift der Rezeptor in den Zellzyklus ein und ist an der Ausbildung von Axonen, Dentriten und der Synapsenfunktion beteiligt. In Abbildung 1.4 ist ein Überblick über bisher bekannte Proteine gegeben, die an der Signaltransduktion des Rezeptors beteiligt sind.

28 Einleitung 15 Abbildung 1.4 Der p75 Rezeptor und seine direkten Effektoren Die Abbildung zeigt einige der intrazellulären Effektoren, die vom p75-rezeptor angesprochen werden und verschieden Signaltransduktionswege auslösen Pro- und anti-apoptotische Signalwege Die Ceramidbildung, in Abhängigkeit von NGF, war der als erstes entdeckte Signalweg des p75 Rezeptors. Durch NGF Stimulation kommt es zur Aktivierung der Sphingomyelinase (SMase), wodurch die Hydrolyse von Sphingomyelin zu Phosphatidylcholin und Ceramid katalysiert wird (Dobrowski et al., 1994), welches im Nervensystem als Second Messenger dient. Es wurde beobachtet, daß Ceramid einerseits protektive Wirkung auf hippokampalen Neuronen hat, andererseits zur Apoptose in neuronalen Kulturen führen kann. Für beide Effekte ist die Aktivität der

29 Einleitung 16 SMase notwendig. Brann et al. fanden 2002 eine Erklärung für diese gegensätzlichen Ergebnisse. Ist das Expressionslevel des p75 Rezeptors gering, entsteht nach Ligandenbindung wenig Ceramid. In dieser niedrigen Konzentration hat es protektive Eigenschaften und führt zum Auswachen von Neuriten. Erhöht sich die Expression des p75, zum Beispiel durch Alterung der Zellen, wird NGF-abhängig mehr Ceramid produziert. Diese höheren Konzentrationen führen zur Aktivierung der JNK (Jun-N-terminale-Kinase), die dann Apoptose auslöst (Brann et al., 1999; 2002). Ein weitere protektiver Effekt des Ceramid wurde von McCollum et al beobachtet. Nach NGF Stimulation wirkt es schützend in Bezug auf den durch UV-Strahlung ausgelösten Zelltod haben (McCollum et al., 2004). Eine Konzentrationsabhängigkeit wurde hier nicht untersucht. Neben Ceramid ist der Transkriptionsfaktor NF-κB ein zentraler Bestandteil der durch den p75 Rezeptor ausgelösten Signaltransduktion. Über die stimualtionsabhängige Aktivierung von NF-κB vermittelt der p75 anti-apoptotische Effekte, wohingegen eine Erniedrigung der Aktivität Apoptose fördert. Die unterschiedliche Wirkung des Rezeptors ist dabei auf verschieden Interaktionspartner zurück zuführen. So berichten Wang et al., daß p75 NGF-abhängig mit der p38 MAPK interagiert, was im weiteren Verlauf zur NF-κB Aktivierung führt (Wang et al., 2000). Ebenfalls protektive Effekte vermittelt IRAK (interleukin-1 receptor associated protein) zusammen mit TRAF6 (TNF receptor associated factors) und p62 (PKC interagierendes Protein) in PC12 Zellen. TRAF6 und IRAK assoziieren mit dem p75/ngf Komplex und vermittelt nach Interaktion mit p62 die NF-κB Aktivierung. Moduliert wird dies Aktivität durch die Verfügbarkeit von p62, welches zum Beispiel von TrkA gebunden und zurückgehalten werden kann. (Manidipudi et al., 2002). Das C-terminale SPV-Motiv des p75 könnte bei dieser Regulation ebenfalls eine Rolle spielen. Die FAP-1 (Fas-assoziierte Phosphatase-1) bindet dort über ihre PDZ- Domäne an den Rezeptor. Die Bindung führt zu einer Abschwächung der p75- induzuierten und TRAF6-vermittelten NF-κB Aktivierung. Ist diese Bindung an den Rezeptor nicht mehr möglich (zum Beispiel durch Mutation des SPV-Motives), kommt es zu einer Erhöhung der Apoptoserate (Irie et al., 1999). In Schwanomma Zellen erfolgt ebenfalls eine Regulation der Rezeptor-vermittelten NF-κB Aktivität, allerdings über einen anderen Mechanismus. Ist RIP2 (receptor interacting protein2) als Adapter für den Rezeptor zugänglich, resultiert die Bindung

30 Einleitung 17 von NGF in einer Aktivierung von NF-κB (Gentry et al., 2000; Khursigara et al., 2001), welche protektiv wirkt. Kürzlich wurde ein weiteres Adapterprotein des p75 entdeckt, welches eine ähnliche Bindestelle (in der DD des Rezeptors) wie RIP2 besitzt, und mit diesem um die Bindung an den Rezeptor konkurriert. Bex1 (brain expressed X-linked 1) ist ein kleines Adapterprotein, dessen Expression Zellzyklusabhängig oszilliert und während der Entwicklung eine Verteilung analog zum p75 aufweist. Es wird stimulationsabhängig aus dem Zellkern exportiert und zum Rezeptor rekrutiert. Ein hohes Expressionslevel führt so zur Erniedrigung der NF-κB Aktivität und in PC12 Zellen zur Verhinderung der NGF-induzieren Differenzierung. Wird die Expression von Bex1 unterdrückt, bedingt die Stimulation mit NGF ein Ansteigen der NF-κB Aktivität (möglicherweise durch Interaktion des Rezeptors mit RIP2) und die Differenzierung von PC12 Zellen. Durch seine oszillierende Expression hat Bex1 so die Fähigkeit, die Signaltransduktion des p75 abhängig von Zellzyklus zu modulieren (Vilar et al., 2006). Die Rezeptor-induzierte Modulation der NF-κB Aktivität kann außer über TRAF6 auch über TRAF2 und TRAF4 vermittelt werden. Der p75 interagiert mit TRAF4 und TRAF6 über die Juxtamembrandomäne, mit TRAF2 über seine DD. Die verschieden TRAFs haben unterschiedliche Effekte auf die Signalwege, wobei bei Interaktion mit TRAF6 neben dem oben beschriebenen protektiven Weg, auch einen proapoptotischen bedingen kann. Durch Ko-Expression von p75 und TRAF2 (interagiert vorwiegend mit dem monomeren p75) wird der Zelltod unabhängig von einer Stimulation verstärkt. TRAF4 interagiert nur mit dem dimeren Rezeptor und unterdrückt die NGF-induzierte Apoptose sowie die NF-κB Aktivierung (Ye et al., 1999; Khursigara et al., 1999). Die Rolle der Interaktion von TRAF6 und p75 wurde von Yeiser et al. in TRAF6-/- Mäusen untersucht. Sie konnten zeigen, daß TRAF6 notwendig für die p75 abhängigen Apoptose sympathischer Neuronen ist, bei der es zur Aktivierung von JNK kommt (Yeiser et al., 2004). Analog zur der Beteiligung von IRAK und p62 an dem protektiven Effekt von NGF, ist für diesen pro-apoptotischen Effekt die Beteiligung von NRIF entscheidend. Das Zinkfingerprotein NRIF (neurotrophin receptor interactin factor) wurde zunächst mit der Regulation des Zellzykluses und der Apoptose während der Entwicklung in Verbindung gebracht (Casademunt et al., 1999). Bis heute konnte gezeigt werden, daß es einen Komplex mit dem p75 Rezeptor und TRAF6 bilden kann, wobei wahrscheinlich TRAF6 über NRIF an den Rezeptor bindet. TRAF6 ist eine Ubiquitinligase und ubiquitiniliert nach

31 Einleitung 18 Ligandenbindung NRIF. Diese Modifikation ist für eine Translokation von NRIF in den Nukleus verantwortlich. Dort kann es als Regulator der Genexpression wirken und löst über Aktivierung von JNK den p75-vermittelten Zelltod aus (Linggi et al., 2005; Geetha et al., 2005). Durch die aktive JNK kommt es zur Phosphorylierung von c-jun, welches wiederum das Tumor Supressorprotein p53 aktiviert. Über die anschließende Aktivierung von Bad wird die Apoptose in sympathischen Neuronen ausgelöst (Bhakar et al., 2003). Neben der Modulation der NF-κB Aktivität kann die durch den p75 Rezeptor vermittelte Signaltransduktion auch zu anderen Ereignissen führen. So bindet ein weiteres Zinkfingerprotein, SC-1, an den ligandenfreien Rezeptor und wird bei dessen Stimulation mit NGF in den Zellkern transloziert. Dort ist es wahrscheinlich an der Kontrolle des Zellzyklus beteiligt (Chittka et al 1999). Der p75-associated cell death executor (NADE) und das neurotrophin receptorinteracting MAGE homologue Protein (NRAGE, MAGE = Melanoma antigene gene) beeinflussen durch ihre Interaktion mit dem Rezeptor die p75-induzierte Apoptose. NRAGE interagiert mit dem Rezeptor-Liganden Komplex, unterstützt damit die Apoptose und führt zum Zellzyklusarrest. Eine Überexpression von NRAGE verhindert in bestimmten Zellarten die Interaktion zwischen p75 und TrkA (Salehi et al., 2000). Auch NADE interagiert mit dem Rezeptor in seiner ligandengebundenen Form. Nach der Bindung an die Death Domain des p75 ist es in der Lage, eine NGFinduzierte Apoptose auszulösen. Dabei kommt es zu einer Aktivierung der Caspasen 2 und 3, sowie zur Fragmentierung der Kern-DNA (Mukai et al., 2000). Für die Induktion der Apoptose ist die Bildung eines p75-nade ε Komplexes notwendig. Das NADE-bindende Protein ε ist Teil vieler Signalkaskaden und spielt bei der Zellzyklusregulation eine Rolle (Kimura et al., 2000; Review Mukai et al., 2003). Der letzte Interaktionspartner, der in diesem Abschnitt genannt werden soll, ist Caveolin-1. Caveolin-1 ist die Hauptstrukturkomponente der Caveolae und wechselwirkt als solches mit einer Fülle von verschiedener Transmembranproteinen. Die Scaffolding Domäne1 des Caveolin-1 interagiert direkt mit dem intrazellularen Bereich p75 (Bilderback, 1997). Es wird angenommen, das Caveolin-1 an der Signaltransduktion und der Aufnahme des Rezeptors beteiligt ist (Bilderback et al., 1999).

32 Einleitung p75 abhängige Modulation kleiner monomerer GTPasen Neben der Regulation von pro- und anti-apoptotischen Vorgängen, hat der p75 noch weitere Funktionen. Über Modulation der Aktivität der kleinen monomeren GTPasen Ras und RhoA kann er Einfluß auf das Zytoskelett und die Zellform nehmen. Dabei ist die gegensätzliche Regulation der beiden GTPasen durch den Rezeptor entscheidet. Der p75 ist er in der Lage, RhoA nach Bindung von NGF zu deaktivieren. In seiner aktiven Form inhibiert RhoA das Auswachsen von Neuriten, seine Inaktivierung durch Stimulation des p75 führt zur Neuritenelongation und Axonverlängerung. Zwei verschieden Mechanismen wurden dazu bisher diskutiert. Zum Einen könnte der Rezeptor direkt mit aktivem RhoA interagieren und bei Ligandenbindung die Hydrolyse von GTP zu GDP katalysieren (Yamashita et al., 1999). Zum Anderen belegt eine neuere Arbeit, daß p75 mit Rho-GDI (Rho GDP dissociation inhibitor) interagiert. In diesem Model wird die Interaktion zwischen RhoA und Rho-GDI durch den unstimulierten p75 blockiert. RhoA ist somit aktiv. Bei Stimulation des Rezeptors wird Rho-GDI freigesetzt und kann RhoA binden und es inaktivieren (Yamashita et al., 2003). Beide Modelle gehen von einer Interaktion der DD des p75 mit RhoA bzw. Rho-GDI aus. Der stimulationsabhängige Phosphorylierungszustand der beiden Tyrosinreste in der DD des Rezeptors scheint diese Interaktionen zu regulieren (Blöchl et al. 2004). Im Gegensatz dazu wird Ras ligandenabhängig über den p75 Rezeptor aktiviert, was in Nervenzellen in Abwesenheit von TrkA zum Auswachen von Fortsätzen und der Formation von growth cones führt. Analog zu RhoA erfolgt die Interaktion von Ras mit den p75 über die Helix 5 der DD und ist vom Phosphorylierungszustand der beiden Tyrosine Y337 und Y366 innerhalb der DD abhängig. Interessant ist, daß der Rezeptor die Ras Aktivität sowohl inhibieren wie auch aktivieren kann. Der unstimulierte p75 bindet Ras-GTP (aktive Form) und konvertiert es zu Ras-GDP (inaktive Form), welches er bevorzugt bindet. Des Weiteren vollzieht der Rezeptor den Austausch von gebundenem Ras-GDP zu freiem Ras-GTP und erniedrigt somit den Level an Ras-GTP in der Zelle. Es konnte gezeigt werden, daß dies eine intrinsische Eigenschaft des p75 ist, und hierzu beide Tyrosine unphosphoryliert vorliegen müssen (Blöchl et al., 2004). Die lingandenabhängige Aktivierung von Ras verläuft, ähnlich der TrkA-induzierten Aktivierung (Review Chao 2003), unter

33 Einleitung 20 Beteiligung der Adapterproteine Shc, Grb2 und Sos. Auch hier spielen die Tyrosine die entscheidende Rolle. Mechanistisch ist die Phosphorylierung beider Reste nötig, um Ras zu aktivieren. Phosphotyrosin 366 ist verantwortlich für die Rekrutierung und Bindung oben genannter Adapterproteine und vermittelt so die Aktivierung von Ras. Die Phosphorylierung von Y337 beendet die Inaktivierung von Ras (s.o.) und ist notwendig, damit die Adapterproteine an den Rezeptor binden können (Blöchl et al., 2004). Ras wird also bei Ligandenbindung aktiviert, während RhoA simultan inaktiviert wird. Durch diesen wechselseitigen Mechanismus kann Neuritenwachstum abhängig vom p75 Rezeptor reguliert werden. Der unstimulierte Rezeptor aktiviert RhoA und inaktiviert Ras, wodurch das Neuritenwachtum und die Formation von growth cones inhibiert werden. Um Fortsätze zu bilden, muß nun zunächst die lokale Rigidität des Aktin-Zytoskeletts reduziert werden (Review Etienne-Manneville and Hall, 2002). Dies geschieht durch die Liganden-vermittelte Inaktivierung von RhoA. Die simultane Aktivierung von Ras führt anschließend über die Aktivierung der MapK Erk1 und Erk2 (Susen et al., 1999) zum Auswachsen von Fortsätzen (Blöchl et al., 2004). Ein weitere Signalkaskade die der Rezeptor über Ras aktiviert ist der PI3K (Phosphatidylinositol 3-Kinase)/Akt Signakweg (Roux et al., 2001). Aber auch Apoptose kann über kleine monomere GTPasen ausgelöst werden. So wird durch NGF Stimulation des p75 Rac aktiviert und löst durch Interaktion mit JNK1 und JNK3 Apoptose unter Beteiligung von c-jun und p53 aus. Die Aktivität von Rac und die ausgelöste Kaskade wird durch eine gleichzeitige TrkA-Aktivierung beeinflusst. Rac hat bei dem NGF-induzierten Zelltod also auch regulatorische Aufgaben (Harrington et al., 2002). Rac kann auch über Ras aktiviert werden. Ob dies bei der p75 Rezeptor-vermittelten Aktivierung der Fall ist, wurde bislang jedoch nicht geklärt beta-amyloid induzierte Signaltransduktion des p75 Neurotrophine spielen bei der Entstehung der Alzheimerschen Krankheit eine große Rolle. Sie regulieren die Transkription und Expression des APPs (insbesondere NGF, aber auch BDNF). Der p75 als niedrigaffiner Rezeptor für NGF vermittelt, neben den Trk-Rezeptoren, diese regulatorischen Eigenschaften der Neurotrophine. Gleichzeitig übt NGF einen Effekt auf die cholinergen Neuronen des Nucleus Basalis aus, die den

34 Einleitung 21 p75 Rezeptor exprimieren. Die Expression des p75 in diesen Neuronen bei Alzheimer Patienten ist Gegenstand intensiver Forschung. Da beta-amyloid neben den Neurotrophinen ein weiterer Ligand des p75 ist, ist die resultierende Signaltransduktion wichtig für die Entstehung bzw. für den Verlauf der Alzheimerschen Krankheit. Generell wird die Stimulation des p75 Rezeptors mit beta-amyloid mit einer Schädigung der Zellen oder der Apoptose in Verbindung gebracht (Rabizadeh et al., 1994; Yaar et al., 1997; Tsukamoto et al., 2003). Analog zu den NGF-vermittelten, neurotropischen Effekten ist die DD des p75 essentiell für diese, durch beta-amyloid induzierten, pro-apoptotische Signale (Perini et al., 2002). Costantini et al. konnten zeigen, daß einer dieser apoptotischen Signalwege zur Aktivierung von p38 MAPK und JNK sowie der nachfolgenden Translokation von NF-κB führt. In einem letzten Schritt wird p53 aktiviert, welches zum Zelltod führt (Costanini et al., 2005). Die Beteiligung ähnlicher Faktoren wurde von verschiedenen Gruppen berichtet. So unterstützt die Aktivierung der JNK (Yaar et al., 2002; Tsukamoto et al., 2003; Bhakar et al. 2003), der Caspase8 und/oder 3 (Perini et al., 2002) der p38 MapK (Savage et al.; 2002) und der MapK Erk1/Erk2 (Kuperstein et al., 2002) die beta-amyloid induzierte Apoptose. Die Aktivierung von Erk1/Erk2 ist in diesem Zusammenhang besonders interessant, da diese Kinasen in der Lage sind, Tau zu phosphorylieren. Wie schon oben erwähnt sind Aggregate aus hyperphosphoryliertem Tau ein Charakteristikum der Alzheimerschen Krankheit (Review Haddad 2004). Beta- Amyloid induzierte Aktivierung der MapK Erk1/Erk2 könnte an der Proliferation von Mikroglia (Tan et al., 2000) oder an entzündlichen Prozessen, die um die amyloiden Plaques bei Alzheimer auftreten, beteiligt sein (Pei et al., 2002). Neben Entzündungen erhöhen oxidativer Stress sowie Verletzungen der Neuronen die Expression des p75 und der p75/trk-rate zu Gunsten des p75. Diese negativen, p75 abhängigen Auswirkungen des beta-amyloid wurden beobachtet, wenn fibrilläres beta-amyloid in hohen Konzentrationen vorlag. Ähnlich hohe Konzentrationen von oligomerem beta-amyloid führen ebenfalls zum Absterben der Zellen, allerdings scheint dies unabhängig vom p75 reguliert zu werden. Die Expression des Rezeptors hat hier sogar einen neuroprotektiven Effekt, der PI3K abhängig zu sein scheint (Costantini et al., 2005). In geringen Konzentrationen (100x bis 1000x weniger) weist oligomeres beta- Amyloid neurotrophe Eigenschaften auf. So kommt es nach der Stimulation des p75,

35 Einleitung 22 analog zur NGF Stimulation, zur Phosphorylierung der intrazellulären Tyrosine und zur Aktivierung von Ras und Erk1/Erk2. Dies führt in cerebralen Neuronen zum Auswachen, Verzweigen oder Verlängern von Neuriten. Im Vergleich ist die neurotrophe Wirkung des NGF stärker ausgeprägt (Susen et al., 2005). Solche niedrigen Konzentrationen an beta-amyloid könnten im Anfangsstadium der Alzheimerschen Krankheit von den Plaques freigesetzt werden. Der auftretende Erinnerungsverlust wäre dann vielleicht eher auf eine veränderte neuronale Konnektivität als auf das Absterben von Neuronen zurückzuführen (Phinney et al., 1999) Modulierte Signaltransduktion unter Beteiligung des p75 Rezeptors Neben den verschiedenen intrazellulären Effektoren kann die Signaltransduktion des p75 auch durch Korezeptoren moduliert werden. So formt der Rezeptor zusammen mit Trk Rezeptoren hochaffine Bindestellen für NGF und wirkt anti-apoptotisch (s.o.). Während diese Interaktion schon lange bekannt ist, wurden kürzlich zwei weitere Korezeptoren des p75 entdeckt. Diese scheinen in bestimmten Situationen mit dem Rezeptor zu interagieren und so spezielle Strukturen der Signaltransduktion zu bilden. Bei Einem handelt es sich um NgR1 (Nogo-66 receptor 1) zusammen mit LINGO-1 (LRR and Ig domain-containing, Nogo receptor interaction protein). Bilden diese beiden einen Komplex mit dem p75, können Bestandteile des Myelins (MAG, Nogo, OMgp) gebunden werden. Dies resultiert in einer Modulation der Rho Aktivität und verhindert das Auswachsen von Neuriten (Wong et al., 2000; Mi et al., 2004). Auch Sortilin, ein Mitglied der Vps10p-domain Rezeptor Familie interagiert mit dem p75. Der entstandene Komplex bindet die Vorläufer von NGF und BDNF, Pro-NGF und Pro-BDNF, hochaffin und wirkt pro-apoptotisch (Nykjaer et al., 2004; Teng et al., 2005). Eine Modulation der Signaltransduktion könnte auch durch spezifische Prozessierung des p75 ausgelöst werden. Kanning et al. konnten 2003 zeigen, daß dies durch RIP (regulated intramembrane proteolysis) geschieht und dabei lösliche Fragment mit Signalkapazität entstehen (Kanning et al., 2003). Erst kürzlich wurde die erste physiologisch bedeutende Prozessierung des p75 Rezeptors publiziert. Bindet MAG an den p75/ngr1/lingo-1 Komplex, kommt es in cerebralen Neuronen

36 Einleitung 23 zur PKC-abhängigen, α- und β-sekretoischen Proteolyse des Rezeptors. Dies ist sowohl für die Aktivierung von Rho als auch für die Inhibition des Neuritenwachstums notwendig (Domeniconi et al., 2005). Abschließend läßt sich sagen, daß der p75 Rezeptor ein Fülle von verschiedenen Signalwegen auslösen kann, die sich positiv oder negativ auf die Zellen auswirken. Er scheint die Fähigkeit zu besitzen, durch Interaktion mit verschiedenen Proteinen diese unterschiedlichen Effekte zu balancieren und auf die jeweilige, aktuelle Situation in den Zellen abzustimmen. 1.3 Rezeptor-vermittelte Endozytose Es gibt zwei Hauptwege, über die spezifische Proteine durch Rezeptor-vermittelte Endozytose in die Zelle eingeschleust werden können. Nach der Bindung des Liganden an seinen Rezeptor, erfolgt in beiden Fällen die Abschnürung eines endozytotischen Vesikels von der Membran. Abbhängig von den, an der Membran des Vesikels assoziierten, Proteinen werden diese Vesikel als Clathrin coated Vesikel (ccv) oder als Caveolae bezeichnet Endozytose mittels Clathrin coated Vesikel Die meisten Zelloberflächenrezeptoren zur Vermittlung der Endozytose sind Transmembranglykoproteine. Viele dieser Rezeptoren sind in speziellen Regionen der Plasmamembran angeordnet, die als coated pits bezeichnet werden. Die Zytosolseite dieser Gruben ist mit einer dichten Hülle aus Clathrin, einem Protein, das ein Gitternetz um Membranvesikel bildet, versehen. Die Oberfläche einer typischen tierischen Zelle besteht zu etwa 2% als coated pits. Clathrin ist ein Trimer aus drei schwere und drei leichten Ketten. Diese (HL) 3 -Einheit (650kDa) hat eine dreibeinige Struktur, die auch als Triskelion bezeichnet wird. Gereinigte Trimere lagern sich spontan zu einer geschlossenen Hülle zusammen. Diese Polyeder bestehen aus Fünfecken und Sechsecken.

37 Einleitung 24 Einige Rezeptoren assoziieren in coated pits, unabhängig davon, ob sie einen Liganden gebunden haben. Andere sammeln sich erst nach der Bindung ihrer entsprechenden Liganden dort. Die Rezeptor-vermittelte Endozytose beginnt mit der Einstülpung eines coated pit. Clathrin formt ein Gitterwerk um das coated pit und löst es unter Bildung eines umhüllten Vesikels (Clathrin coated Vesikel) von der Plasmamembran ab. Die Auswahl der zur Endozytose bestimmten Moleküle wird durch Adapterproteine getroffen. Diese Adapter bestehen aus zwei Adaptinuntereinheiten und zwei weiteren Proteinen. Sie interagieren während der Polymerisation der Triskelionmoleküle mit diesen und erkennen gleichzeitig welcher Transmembranrezeptor in dem Clathrinkäfig befördert werden soll. Im weiteren Verlauf der Endozytose wird die Clathrinhülle durch ATP-getriebene uncoating enzymes abgebaut und der Vesikel fusioniert mit einem Endosom. Der Weg bis zum Endosom ist allen Proteinen, die einer Endozytose unterliegen, gemeinsam. Die Schicksale der aufgenommenen Proteine und Rezeptoren divergieren dann. So können sie zur Membran zurückgeleitet werden oder in Proteosomen/Lysosomen abgebaut werden. Alternativ kann auch ein retrograder Transport zum Bestimmungsort des Liganden und/oder Rezeptors stattfinden (Biochemie, Stryer) Endozytose mittels Caveolae Eine weitere Möglichkeit zur Aufnahme von Proteinen sind Caveolae. Diese 1950 entdeckten Strukturen wurden zunächst als Einbuchtungen oder Höhlen (lat.: cave ) in der Plasmamembran beschrieben. Nach weiteren Untersuchungen wurde der Begriff Caveolae auch auf Vesikel und Vesikelhaufen (Grape-like Cluster oder Rosetten), sowie auf deren fusionierte Formen wie Röhren oder transzelluläre Kanäle ausgeweitet (Yamada, 1955, Simionescu et al., 1975, Scherer et al., 1994). Allen gemein ist die Zusammensetzung ihrer Membran. Traditionell wird die Plasmamembran als fluid mosaic (Singer and Nicolson, 1972) bezeichnet. Dies beschreibt einen Zustand, indem man sich die Membran wie eine Flüssigkeit vorstellen kann. Die Lipide können lateral fast frei diffundieren, so daß eine ungeordnete Phase entsteht. Zusätzlich können in der Membran aber auch relativ geordnete Bereiche vorliegen, die wie Inseln auf in der Lipiddoppelschicht

38 Einleitung 25 schwimmen. Diese Bereiche, die als lipid rafts bezeichnet werden, sind besonders reich an Cholesterol und Sphingolipiden. Auch die Membran der Caveolae, die in den lipid rafts entstehen, ist reich an diesen Steroiden und Fetten. Caveolae werden daher als eine spezielle Form der lipid rafts angesehen (Simons et al., 2000). Ein weiterer charakteristischer Bestandteil dieser Vesikel sind die Proteine der Caveolin- Gen Familie (Caveolin-1 bis Caveolin-3). Erst ihre Integration in lipid rafts, von der zytoplasmatischen Seite her, führt zur Entstehung der Caveolae. Daher werden sie auch als Markerproteine der Caveolae bezeichnet (Rothberg et al., 1992). Die 22kDa großen Membranproteine lagern sich zu Oligomeren zusammen und bilden das Netzwerk der Caveolae. Welche der drei Proteine in der Membran der Vesikel vorkommen, ist abhängig von Zelltyp. Caveolin-1 ist jedoch am häufigsten in den Caveolae zu finden. Caveolae/lipid rafts übernehmen in der Zelle verschiedene Aufgaben. Sie sind sowohl am vesikulären Transport, als auch an der Regulation des Cholesterolgehalts der Membranen und Zellen beteiligt. In Caveolae kann ebenso wie in Clathrin coated Vesikeln die Rezeptor-vermittelte Aufnahme von bestimmten Proteinen stattfinden. Dies wurde für die Aufnahme von Cholera- und Tetanus-Toxin, sowie für Albumin gezeigt (Montesano et al., 1982, Schnitzer et al., 1994). Wie genau die Transportroute für Caveolae innerhalb der Zelle aussieht, ist nicht bekannt. Hier scheinen, je nach aufgenommenen Proteinen, verschiedenste Wege wie der direkte Transport zu den Endosomen oder der retrograde Transport zu anderen Kompartimenten möglich (Razani et al., 2002). Der Mechanismus der Endozytose/Transcytose mittels Caveolae ist dem der Clathrin coated Vesikel sehr ähnlich. Für die Formation und die Einschnürung der Caveolae, sowie für das Andocken der Vesikel, werden die selben Komponenten benötigt wie bei den coated Vesikeln (z.bsp.: Dynamin, NSF, SNAP, VAMP, GTPasen). Diese sind in Caveolae anzutreffen und scheinen mit Caveolin-1 zu interagieren (Schnitzer et al., 1995, Predescu et al., 2001). Neben dem vesikulären Transport verschiedenster Moleküle spielen lipid rafts/caveolae auch in der Signaltransduktion eine wichtige Rolle. Die Komponenten der Signalwege können durch sie in räumliche Nähe zueinander gebracht oder vom Rest der Zelle getrennt werden. Deshalb werden die lipid rafts auch als dynamische Signal-Domänen bezeichnet, in denen wichtige Signalwege beginnen. Konsistent damit wurden neben den Proteinen der Caveolin-Gen Familie eine große Anzahl an

39 Einleitung 26 Signaltransduktionsmolekülen in lipid rafts entdeckt (Sargiacomo et al., 1993, Lisanti et al., 1994). Da Caveolae in diesen Membranregionen entstehen, enthalten sie neben Caveolin eine Auswahl von den in den lipid rafts vorkommenden Signalmolekülen. Zu ihnen zählen G-Protein gekoppelte Rezeptoren (z. Bsp.: β- adrenerger Rezeptor), Untereinheiten von heterotrimer G-Proteien und GTPasen wie H-Ras und RhoA. Auch Rezeptoren wie der EGF Rezeptor, TrkA und der p75 Rezeptor sowie Proteinkinasen (Src, Fyn, PKA) sind dort lokalisiert. Daneben befinden sich eine Vielzahl an Proteinadaptern, nuklearen Proteinen, Strukturproteinen und anderen Enzymen (Review Razani et al., 2002) in diesen Strukturen. Die Modulation des Signalwege erfolgt nicht allein über die räumliche Verteilung innerhalb der lipid rafts/caveolae. So konnte gezeigt werden, daß Caveolin-1 die GTP-Hydrolyse heterotrimer G-Proteine inhibiert (Li et al., 1995) und die Aktivität von H-Ras, Src, EGF-R und enos moduliert (Engelmann et al., 1998, Smart et al., 1999). Des Weiteren greift dieses Markerprotein negativ in antiapoptotische und proliferierende Signalwege ein. Ähnlich zu anderen Tumor- Supressoren kann Caveolin-1 die Signalweiterleitung des PDGF Rezeptors und des EGF Rezeptors unterbinden, und inhibiert weitere Komponenten dieser Signalwege wie die Ras-Erk Kaskade und Teile des PI-3-Kinase/Akt Signalwegs. Durch Caveolin- 1 Überexpression werden die Zellen sensitiv gegenüber Ceramid-vermittelten Zelltod, während eine Verringerung der Caveolin-1 Konzentration einen anti-apoptotischen Effekt hat. Der Vorläufer des Ceramids, Sphingomyelin, ist in großen Mengen in lipid rafts vorhanden. Auch das Ceramid generierende Enzym Sphingomyelinase ist in diesen Mirkodomänen lokalisiert. Es scheint, daß die Produktion von Ceramid und dessen Auswirkungen auf die Zelle durch die Lokalisation in lipid rafts und die Interaktion mit Caveolin-1 bedingt wird (Zundel et al., 2000, Liu et al., 2001). Sowohl Clathrin coated Vesikel, als auch Caveolae sind für die Aufnahme und den weiteren Transport von verschiedenen Molekülen zuständig. Beiden endozytotischen Vesikelarten ist gemein, daß sie die Vesikel entlang der Mikrotubuli transportieren. Mikrotubuli werden in den Zellen durch Addition von α- und β-tubulinmolekülen an bereits vorhandene Filamente oder Bildungszentren erzeugt. Die Initiationsorte des Mikrotubuluswachstums heißen Mikrotubulusorganisationzentren. Das α/β- Heterodimer des Tubulins weist GTPase-Aktivität auf. In seiner GTP-gebundenen

40 Einleitung 27 Form, kann es sich an ein bereits vorhandenes Filament anlagern. Nach der GTP- Hydrolyse fällt es vom Filament ab. Damit sich die Vesikel oder Organellen an den Mikrotubulin entlangbewegen können, sind Motorproteine nötig. So ist Kinesin für den anterograden und Dynein für den retrograden Transport zuständig. Beide Motorproteine weisen ATPase-Aktivität auf. Das zentrale Prinzip bei der Energieweitergabe (Bewegung) liegt dabei in einer Änderung der Affinität zwischen den Proteinen (MT/Dynein o. Kinesin/Vesikel o. Organell) während des ATP-ADP-Zuklus Endozytose des p75 Rezeptors Beide Typen des Neurotrophin Rezeptors, p75 und Trk, vermitteln die Aufnahme von Neurotrophinen. In Neuronen und Glia Zellen, die keinen Trk Rezeptor aufweisen, bewältigt diese Aufgabe der p75. Die Neurotrophine werden aufgenommen und Rezeptor-vermittelt transportiert (Curtis et al., 1995). In anderen Zellarten werden die Neurotrophine (NT) in einem p75-trk-nt Komplex internalisiert. Werden in einer Zelle Trk Rezeptoren und p75 exprimiert, zeigt sich, daß die verschiedenen NT verschiedene Rezeptoren favorisieren. So wird NGF in diesen Zellen vorwiegend über den TrkA, BDNF und NT-4 vorwiegen über den p75 aufgenommen (Curtis et al., 1995, Kramer et al., 1999). Die Bindung an die Rezeptoren ermöglicht den Neurotrophinen über Rezeptor-vermittelte Endozytose in die Zelle zu gelangen. Es konnte gezeigt werden, daß dabei sowohl Clathrin coated Vesikel, als auch Caveolae eine Rolle spielen (Grimes et al., 1996, Bilderback et al., 1999). Caveolae scheinen neben dem Transport auch die Signaltransduktion der Neurotrophin-Rezeptoren zu beeinflussen. Es ist bekannt, daß die Dimerisierung und Signaltransduktion dieser Rezeptoren durch die Lipidzusammensetztung der Membran in ihrem Umfeld bestimmt wird. Sowohl TrkA, als auch p75 sind in Caveolin-reichen Membransektionen (Caveolae) in hoher Konzentration vorhanden. Caveolin-1 interagiert direkt mit p75 und wird nach dessen Stimulation phosphoryliert (Blöchl, 2000). Auch die Phosphorylierung von TrkA wird durch Caveolin-1 reguliert (Huang et al., 1999). Wie schon in beschrieben, vermittelt der p75 Apoptose über die Bildung von Ceramid. Es konnte gezeigt werden, daß der p75 die Produktion von Ceramid in Caveolae stimuliert, währenddessen die Aktivierung des

41 Einleitung 28 TrkA-Signalweges diese hemmt. Caveolin-1 könnte hier als Vermittler zwischen diesen beiden Wegen dienen (Dobrowsky et al., 1995, Bilderback et al., 1997). Es werden nicht nur Liganden-Rezeptor-Komplexe retrograd transportiert, es erfolgt auch ein Liganden-unabhängig, konstitutiver Transport des p75 (Taniuchi & Johnson, 1985). Einmal internalisiert, gibt es für den Komplex sowie für den Rezeptor verschiedene Wege innerhalb der Zelle. Diese sind in Abbildung 1.5 schematisch dargestellt. Nach der Aufnahme in Clathrin coated Vesikel oder Caveolae kann ein Recycling an die Membran oder der sofortige Abbau in Proteosomen stattfinden. Alternativ erfolgt der retrograde Transport zum Zellsoma. Abbildung 1.5 Schematische Darstellung der Aufnahme und des weiteren Schicksals von Neurotrophinen und deren Rezeptoren (Dechant, 2001) Die Aufnahme erfolgt in Clathrin coated Vesikeln oder Caveolae. Die Internalisierung von NGF ist am genauesten erforscht. Zunächst wurde angenommen, daß in diesem Zusammenhang TrkA hauptsächlich an der Aufnahme beteiligt ist. Nach der Bindung von NGF an TrkA erfolgt die Einschnürung von Clathrin coated Vesikeln und der retragrade Transport. Dabei bleibt der TrkA-NGF- Komplex intakt und aktiv, und wird als signalling vesicle zum Bestimmungsort gebracht (Zhang et al., 2000). Durch weitere Untersuchungen konnte dargelegt werden, daß NGF in Abwesenheit des TrkA durch den p75 internalisiert und retrograd transportiert wird (Bartheld et al.,

42 Einleitung , Weible et al., 2001). Weitere Studien belegen, daß die Neurotrophine Rezeptor-vermittelt sowohl retrograd, als auch anterograd transportiert werden (Bartheld et al., 2001). So binden recycelte Neurotrophine während des axonalen Transportes an den p75. Der Rezeptor könnte daher im Golgi-System an der Sortierung der Faktoren (Transport, Recycling, Abbau) beteiligt sein (Bartheld & Butowt, 2000). Zusammenfassend scheint der p75 sowohl am retrograden/anterograden Transport, als auch an der Sortierung aufgenommener Neurotrophine beteiligt zu sein. Bronfman et al. konnten zeigen, daß der NGF/p75 Komplex in PC12 Zellen langsam in Clathrin coated Vesikeln aufgenommen werden kann. In den dabei entstehenden Endosomen ist der NGF/Rezeptor Komplex mit Interaktionspartnern, wie MAGE und NRAGE, assoziiert. Dies läßt darauf schließen, daß die Endosomen an der durch Neurotrophine ausgelösten Signaltransduktion beteiligt sind (Bronfman et al., 2003). Eine Internalisierung über Clathrin coated Vesikel schließt andere Endozytosewege jedoch nicht aus. So wird der EGFR (EGF Rezeptor) sowohl Clathrin-abhängig, als auch Clathrin-unabhängig über Caveolae aufgenommen. Der Endozytoseweg entscheidet hier über das Schicksal des Rezeptors. Wird er Clathrin-abhängig aufgenommen, besitzt er Signalkapazität, während eine Endozytose in Caveolae zur Degradation des EGFR führt. Die Regulation erfolgt dabei über ein Ubiquitin-Modifizierung des Rezeptors (Review Aguilar und Wendland 2005). Ebenso wie NGF könnte es sein, daß auch beta-amyloid Rezeptor-vermittelt über den p75 aufgenommen (Perini et al., 2002) und retrograd transportiert. Dies ist besonders in Bezug auf die Alzheimersche Krankheit interessant, die durch eine Agglomeration von beta-amyloid intra- und extrazellulär und dem Absterben von cholinergen Neuronen charakterisiert wird. Der p75 dient als Rezeptor für beta- Amyloid und fördert nach der Bindung die Apoptose über NFκB und JNK (Yaar et al., 1997, 2002). Zusammenfassend zeigen die Studien, daß der Transport des p75, möglicherweise im Verbund mit beta-amyloid oder dessen Vorläuferprotein, am Verlauf der Alzheimerschen Krankheit beteiligt sind (Refs. in Rabizadeh et al., 1994). Klinische Studien weisen darauf hin, daß die Beeinträchtigung des p75 vermittelten Transportes ein früher Schritt in der Entstehung der neurodegenerativen Krankheit ist (Salehi et al., 2000).

43 Einleitung Src Kinasen Src Kinasen sind Nicht-Rezeptor Tyrosinkinasen, die eine zentrale Rolle in vielen zellulären Prozessen wie Proliferation, Überleben, Zelladhäsion oder Vesikeltransport spielen. Da ihre Aktivierung wichtige Abläufe in der Zelle reguliert, sind strenge Kontrollmechanismen ihrer katalytischen Aktivität notwendig (Review: Parsons und Parsons 2004) Expression der Src Kinasen Die Familie der Src Kinasen besteht bislang aus neun Mitgliedern (Src, Blk, Fgr, Fyn, Hck, Lck, Lyn, Yes und Yrk), welche in unterschiedlichen Geweben exprimiert werden. Einige von ihnen werden ubiquitär, andere nur in bestimmten Zellarten produziert (Tabelle 1). Im Gehirn kommen zum Beispiel nur Src, Fyn, Yes und Lck vor. Der jeweilige Expressionslevel ist stark abhängig vom Zelltyp. So wird Src beinahe in allen Geweben exprimiert, wobei in Neuronen oder Thrombozyten 5 bis 200mal mehr Src produziert wird. Tabelle 1.: Expression der Src Kinasen Src Fyn Yes Yrk Lyn Hck Fgr Blk Lck Frk-Familie ubiquitär, Neuronen-spezifische Isoform ubiquitär, T-Zellen-spezifische Isoform ubiquitär ubiquitär Neuronen, B-Zellen, myeloische Zellen myeloischen Zellen B-Zellen, myeloischen Zellen B-Zellen T-Zellen, Neuronen, NK-Zellen Primäre Endothelzellen Diese Verteilung legt nahe, daß Zellen mehr als eine Src Kinase oder verschiedene Isoformen derselben Src Kinase exprimieren und so die Signaltransduktion

44 Einleitung 31 regulieren. Zusätzlich weisen die verschieden Mitglieder der Familie unterschiedliche zelluläre Lokalisationen auf. So ist Src in lipid rafts /Caveolea, Endosomen und fokalen Adhäsionspunkten zu finden, wohingegen Fgr und Frk im Nukleus detektiert werden können (Review Thomas und Brugge 1997). Welche der vier ubiquitär exprimierten Src Kinasen (Src, Fyn, Yes und Lck) in den jeweiligen Signalwegen wichtig sind, wurde bis heute meist nicht ermittelt. Zum Einen reagieren sie sehr ähnlich auf verfügbare Inhibitoren und Antikörper, zum Anderen haben sie teilweise redundante Funktionen in der Signaltransduktion. So wird im Weiteren nicht zwischen ihnen unterschieden, sonder der Terminus Src Kinasen verwendet Struktur der Src Kinasen Der strukturelle Aufbau ist innerhalb der Familie der Src Kinasen recht ähnlich (Abb.: 1.6). Jedes Mitglied besitzt einen N-Myristoyl-Terminus, an den sich eine SH4 Domäne und eine nicht-konservierte Domäne, die Unique region, anschließt. Diese Region ist die einzige, die wesentliche Unterschiede innerhalb der Familie aufweist. Die N-terminale Myristolierungsstelle dient als Membrananker und sorgt für eine Lokalisierung der Src Kinasen auf der zytosolischen Seite der Zellmembran. Auf die Unique region folgt eine SH3- ( Src-homology 3 ) Domäne, eine SH2- Domäne, die Tyrosin Kinase Domäne und ein kurzer C-terminaler Schwanz. SH2- und SH3-Domänen finden sich auch in einer Vielzahl anderer Signalmoleküle und stellen einen grundlegenden Mechanismus dar, Protein-Protein-Interaktionen zu vermitteln. Die SH2-Domäne erkennt und bindet phosphorylierte Tyrosinreste in einem spezifischen Kontext, während die SH3-Domäne an spezifische Sequenzen in Proteinen bindet, die Polyproline enthalten. Die Kinase Domäne besteht aus einer N- terminalen, einer C-terminalen und einer Aktivierungs-Schleife, in der sich die Autophosphorylierungsstelle (Tyr416) auf einer kurzen α-helix befindet. Diese Helix ist zwischen der N-terminalen und der C-terminalen Schleife eingebettet und ist für die Regulation der Aktivität wichtig.

45 Einleitung 32 Abbildung 1.6 Domänenstruktur der Src Kinasen Die funktionell charakteristischen Domänen der Src-Tyrosinkinase sind in linearer Anordnung gezeigt Regulation von Src Kinasen Da Src Kinasen eine essentielle Rolle in vielen Signaltransduktionswegen der Zelle spielen, ist ihre Regulation vielfältigen Mechanismen unterworfen (Hubbard et al., 1998, 2002). So gib es zwei wichtige, regulatorische Tyrosin- Phosphorylierungsstellen, Tyrosin 416 und Tyrosin 527 (Nummerierung für c-src). Findet eine Autophosphorylierung von Tyr416 statt, führt dies zur Aktivierung der Src Kinase. Eine Phosphorylierung des Tyr527 im C-terminalen Schwanz durch eine andere Kinase, führt dagegen zu einer Hemmung der Kinase-Aktivität. Mit Hilfe der Kristallstruktur von c-src (Williams et al., 1997; Xu et al., 1999; Xu et al., 1997) und Hck (Schindler et al., 1999; Sicheri et al., 1997) konnte gezeigt werden, daß die negative Regulation von Tyr527 durch eine intramolekulare Interaktion der SH2- Domäne mit dem Tyrosin-phosphorylierten C-terminalen Schwanz zustande kommt. Weiterhin wurde eine Interaktion der SH3-Domäne mit einer Polyprolin-Helix zwischen der Kinase Domäne und der SH2-Domäne gefunden. Dieser Bereich, auch SH2-Kinase Linker genannt, beinhaltet die für eine SH3-Bindung notwendige Polyprolin-Konsensussequenz. Der Linker wird von einem konservierten Leucin (Leu255) stabilisiert. Mutationen des Leu255 führen zu einer konstitutiven Aktivierung der Src Kinase (Gonfloni et al., 1999). Die oben genannten intramolekularen Interaktionen schaffen die strukturellen Vorraussetzungen für eine Regulation der Kinase Aktivität. Sie führen zu einer so genannten geschlossenen Konformation, welche die Bindung von ATP in das

46 Einleitung 33 katalytische Zentrum blockiert. Die Src Kinase ist damit inaktiv. Auch dient die Aktivierungsschleife in dieser geschlossenen Konformation wahrscheinlich nicht als Interface für die Bindung potentieller Substrate, wie ein Vergleich mit der Kristallstruktur der Tyrosin-Kinase-Domäne des Insulin-Rezeptors mit gebundenem Substrat (Hubbard, 1997) zeigt. Zur Aktivierung von Src Kinasen gibt es mehrere Möglichkeiten. Grundsätzlich muß es dabei gelingen, die Kinase von der geschlossenen und inaktiven in die offene und aktive Konformation zu überführen. Ein wichtiger Mechanismus besteht dabei in der Verdrängung der SH2-Domäne bzw. SH3-Domänen von ihren intramolekularen Interaktionspartnern. Die Affinität der jeweiligen Bindung ist durch die sie umgebene Sequenz nicht optimal. Andere Proteine, die Phosphotyrosinreste oder Polyprolinsequenzen aufweisen, können die SH2- bzw. SH3-Domäne der Src Kinasen mit höherer Affinität binden und so die geschlossene Konformation auflösen. Ein Beispiel hierfür ist der PDGF Rezeptor (platelet derived growth factor). Nach der Bindung von PDGF kommt es zur Dimerisierung und Autophosphorylierung des Rezeptors. An eines der so entstandenen phosphorylierten Tyrosine bindet die SH2-Domäne von Src mit hoher Affinität. Ist erst einmal die reprimierende Konformation der Src Kinasen aufgebrochen, erfolgt rasch die Autophosphorylierung von Tyr416, was die Rekonfigurierung der Aktivierungsschleife bedingt und zu einer vollständigen Aktivierung der Kinase führt. Ein weitere Möglichkeit, die geschlossene Konformation zu destabilisieren, besteht in der Dephosphorylierung des C-terminalen Tyrosinrestes (Tyr527) durch verschiedene Phosphatasen (z.b. PTP 1B) (Review Hubbard 1999). Der Inaktivierungs- und Aktivierung-Mechanismus ist in Abbildung 1.7 noch einmal dargestellt.

47 Einleitung 34 Abbildung 1.7 Aktivierungsmechanismen der Src Kinasen Links: Inaktive Src Kinase mit Phosphorylierung an Y527 Mitte: Mögliche Mechanismen, die bei der Aktivierung von Src Kinase eine Rolle spielen Rechts: Vollständig aktive Src Kinase Src Kinasen in der Signaltransduktion Src Kinasen sind an einer Vielzahl von Signalwegen in der Zelle beteiligt. Sie sind entscheidend für die Vermittlung von Immunantworten, T- und B-Zellen Entwicklung und Aktivierung sowie für die Signaltransduktion in blutbildenden Zellen. Darüber hinaus interagieren sie mit STATs (signal transducers and activators of transcription), (Rezeptor-Tyrosinkinasen (RTK), G-Protein gekoppelten Rezeptoren und greifen in die Regulation der Zelladhäsion und -migration ein (Review Parsons 2004). Obwohl die Rezeptoren, mit denen Src Kinasen wechselwirken, strukturell und funktional sehr unterschiedlich sind, können allgemeine Schlussfolgerungen gezogen werden. (a) Src Kinasen können direkt oder indirekt über eine Vielzahl von Mechanismen mit Rezeptoren interagieren. (b) Src Kinasen können durch Bindung eines Liganden an den Rezeptor aktiviert werden, wobei diese Aktivierung durch verschieden Mechanismen vermittelt werden kann.

48 Einleitung 35 (c) Src Kinasen werden nicht nur von Rezeptoren reguliert, sondern können auch die Funktionalität des Rezeptors regulieren. Src Kinasen dienen also sowohl als Effektoren, als auch als Regulatoren und ermöglichen durch ihre Vielseitigkeit die Abstimmung zwischen den verschieden Rezeptoren und Signalwegen (Review Thomas und Brugge 1997).

49 Einleitung Zielsetzung Bisherige Untersuchungen zeigen, daß der p75 Rezeptor eine Vielzahl von Effekten vermittelt, die sich anti- oder pro-apoptotisch auf die Zellen auswirken können. Insbesondere das zytotoxische Potential des Rezeptors ist immer wieder im Focus der Forschung, da es bei der Entwicklung und in einigen neuronalen Erkrankungen eine wichtige Rolle spielt (Review Schor 2005). Neben NGF ist auch beta-amyloid 1-42 in der Lage, zytotoxische Effekte über den p75 zu vermitteln. Beide Liganden haben allerdings auch trophe Wirkung und können Rezeptor-vermittelt Ras aktivieren (1.2.3). Welche der möglichen Signalwege angesprochen werden, scheint von der Zellart, den Interaktionspartnern und Liganden, sowie dem aktuellen Zustand der Zelle abzuhängen. Ob auch die Konzentration des beta-amyloids Einfluß auf die ausgelöste Signaltransduktion hat soll im Rahmen dieser Arbeit analysiert werden. So wurden die zytotoxischen Effekte bei Bindung an den p75 Rezeptor bisher hauptsächlich beobachtet, wenn hohe Konzentrationen (10 bis 50µM) von beta- Amyloid verwendet wurden (z.b. in Costantini et al., 2005). Der Rezeptor wird jedoch schon bei viel geringeren Konzentrationen (10 bis 40nM) voll aktiviert (Yaar et al., 1997). Es soll geklärt werden, ob diese geringen Konzentrationen, wie sie unter anderem wohl im frühen Stadium der Alzheimerschen Krankheit auftreten, ausreichen, um über den p75 zytotoxische Effekte zu vermitteln. Dazu werden die Signalwege untersucht, die nach der Stimulation des Rezeptors aktiviert werden. So soll der initiale Schritt, die Phosphorylierung des p75 durch Tyrosinkinasen, der gleichzeitig den Ras-MapK Weg startet, analysiert werden. Hierbei ist zu klären, welche Kinasen diese Aufgabe übernehmen und ob sich die durch beta-amyloid induzierte Ras Aktivierung mit der NGF abhängigen Aktivierung von Ras, die trophe Wirkung hat, vergleichen läßt. Des Weiteren soll eine mögliche Interaktion zwischen p75 und Aktin analysiert, sowie die Endozytose nach Stimulation mit beta-amyloid 1-42 untersucht werden. Bei der Aufnahme des Rezeptors soll die Beteiligung von Caveolae geklärt werden, da die intrazelluläre Ablagerung von internalisiertem beta-amyloid zytotoxisch wirken kann (Review Glabe 2001). Auch soll untersucht werden, ob beta-amyloid 1-42 durch Bindung an den Rezeptor die NO Produktion anregt, da Stickstoffmonooxid als proapoptotisches Signalmolekül fungieren kann.

50 Einleitung 37 Als Modell standen PCNA Zellen (Fibroblasten) und RN22 Zellen (Schwannoma Zellen) zur Verfügung. Beide Zellinie sind bezüglich der Signaltransduktion des p75 schon gut analysiert und wurden deshalb für diese Untersuchungen herangezogen. RN22 Zellen exprimieren den p75 endogen, während die PCNA Zellen stabil mit dem Rezeptor unter Kontrolle eines CMV Promotors transfiziert worden sind. Keine der beiden Zellininen zeigt eine Expression des TrkA Rezeptors.

51 Material und Methoden 38 2 Material und Methoden 2.1 Materialien Chemikalien (allg.) Acrylamid/Bisacrylamid (30:0,8) Roth Bromphenolblau Serva BSA Sigma CNBr aktivierte Sepharose 4B Sigma c-src, aktiv Biosource DMSO Fluka Dnase 1 Sigma EDTA Merck EGTA Sigma ECL Lösungen BioRad Glutathion Sepharose Amersham Pharmacia DAF-FM Diacetat Molecular Probes Magermilchpulver Merck Marker (SDS-PAGE) Fermentas MES, MOPS Biomol Moviol Calbiochem NP40 Fluka Ponceau S Fluka Prolong antifade Molecular Probes Protease Inhibitoren Sigma SDS Sigma TEMED Fluka Triton X-100 Fluka Tween 20 Fluka Alle weiteren, nicht speziell benannten Chemikalien wurden von den Firmen JT Barker, Roche, Riedel de Haen und Fluka bezogen Chemikalien (Zellkultur) β-2.5s mngf Alamone Labs

52 Material und Methoden 39 beta-amyloid 1-40/1-42 PP2 PP3 AG490 DSP DMEM Doxycyclin Foetales Kälberserum L-Glutamin Hygromycin Komponenten für B18(-/-) Penicillin/Streptomycin RPMI Poly-D-L-Ornithin Puromycin Trypsin Calbiochem Calbiochem Calbiochem Calbiochem Pierce PAA Roth PAA Gibco BRL Gibco BRL Sigma PAA PAA Sigma Sigma PAA Materialien der Molekularbiologie Bakterienstämme Es wurden folgende E.coli-Stämme verwendet: Stamm Genotyp Nova Blue enda1, hsdr17 (rk 12+ mk 12- ) supe44, thi-1, reca1, rgyra96, rela1, lac F'[proAB, laci qzm15, Tn10 (Tet)] (DE3-?cIst857, ind1, Sam7, nin5, lacuv5-t7 gene 1) BL21 Rosetta (Chloramphinicol F -, ompt hsds B (r - B m - B ) gal dcm lacy1 prare 2 (Cm R ) resistent) Zur Ampilfikation von Plasmid DNA wurde der Nova Blue Stamm verwendet. Die BL21 Stämme wurden zur Überexpression von Proteinen genutzt.

53 Material und Methoden Plasmide pgex-2t-p75 ICD Prokaryotischer Expressionsverktor (Amersham pgex-2t-p75 Y337F Bioscience), dient zur Überexpression der intra- pgex-2t-p75 Y366F zellulären Domäne des p75 (ICD) mit einem C- pgex-2t-p75 FF terminalen GST-Tag Enzyme Alle verwendeten Restriktionsendonucleasen sowie die Ligase und das Klenow- Enzym wurden von der Firma New England Biolabs bezogen. Desweiteren wurden RNaseA und DnaseA von der Firma Sigma und die Deep-Vent- Polymerase von der Firma New England Biolabs bezogen Sekundäre Zellinien Als sekundäre Zellen standen MDCKtetoff Zellen (transfiziert mit p75 WT oder p75 Y337F ), PCNA Zellen und RN22 Zellen zur Verfügung. Bei den MDCKtetoff Zellen (Madin Darby Canine Kidney typii, Clontech)handelt es sich um NierenepithelZellen des Cocker-Spaniels. Sie sind mit puhd15-1 und psvneo stabil transfiziert und besitzen eine Puromycinresistenz sowie eine G418- Resistenz. Die PCNA Zellen stammen von LTK - Zellen ab, die stabil mit einer für den p75lntr kodierenden cdna transfiziert wurden. PCNA Zellen exprimieren den p75lntr, aber nicht den TrkA-Rezeptor. Die RN22 Zellen (SChwannoma Zellen der Ratte) stammen ursprünglich von einem Tumor, der durch Ethylnitrosourea in einer BD-IX-Ratte induziert wurde. RN22 Zellen exprimieren den p75 Rezeptor endogen und Zellzyklus abhängig. Sie zeigen keine Expression von TrkA.

54 Material und Methoden Antikörper Anti-Maus-Alexa Fluor 546 1:2000 Anti-Kaninchen-Alexa Fluor 488 1:2000 Anti-Phosphotyrosin, py100 1:1000 Anti-pMapK (Thr202/Tyr204) Klon E10 1:2000 Anti-total MapK 1:20000 Anti-pan-Src 1:500 Anti-Caveolin-1 1:500 Anti-p75MC192 1:1000 Anti-p75(H-92) 1:500 Anti-p75 Serum 1: Anti-pa-Ras (Ab3) 1:500 Anti-Maus-POD 1:20000 Anti-Kanninchen-POD 1:15000 Molecular Probes Molecular Probes Cell Signaling Technologie Cell Signaling Technologie Sigma Santa Cruz Santa Cruz Boehringer Mannheim Santa Cruz Calbiochem Dianova Dianova Mutanten des p75lntr Intracelluläre Domäne des p75 (ICD) Aminosäure des p75 mit und ohne GST- Funsionsanteil Mutante der ICD: p75 Y377F Aminosäure des p75, wobei Tyrosin 337 zu Phenylalanin mutiert ist

55 Material und Methoden 42 Mutante der ICD: p75 Y366F Aminosäure des p75, wobei Tyrosin 366 zu Phenylalanin mutiert ist Mutante der ICD: p75 FF Aminosäure des p75, wobei Tyrosin 337 und Tyrosin 366 zu Phenylalanin mutiert sind Verbrauchsmaterial ECL-Hyperfilm Amersham Pharmacia Glasdeckgläser/Objekträger Menzel-Gläser/Assistant Kulturgefäße TPP und Nunc Filterpapier/Nitrocellulose Membranen Schleicher&Schüll Mikrptiterplatten Nunc und Sarstedt Plastikwaren Nunc, Sarstedt, Eppendorf, Greiner Sterilfilter Sarstedt Geräte CO 2 -Brutschränke, Schüttler ELISA-Reader Easy Reader 400AT Konfokales Fluoreszenzmikroskop Fluoreszenzmikroskop Mini-PROTEAN-Slab Cell Apparatur Photometer/Spektrometer Rotoren SpeedVac Sterilwerkbank Thermoschüttler Vortex Mischer Zentrifugen Heraeus SLT-Labinstruments Leika Olympus BioRad ShimadzuUV1202/Pharmacia Sorvall, Kendro, Beckmann, Heraeus Bachhofer Vacuum Concentrator BioGEAR Hood, The Baker Company Eppendorf Bender&Hobein AG Heraeus, Kendro, DuPont, Eppendorf 2.2 Lösungen Molekularbiologie DNA-Phenol Phenol mit TE gesättigt, ph 7,9 DNA-Probenpuffer (5x) 100mM EDTA 20%(w/v) Ficoll 400

56 Material und Methoden 43 0,025% (w/v) Bromphenolblau 0,025% (w/v) Xylencyanol LB-Medium (Resistenzmarker) LB-Platten (Resistenzmarker) SOC Medium Lösung 1 Lösung 2 10g/l Pepton 5g/l Hefeextrakt 10g/l NaCl (Amp:100mg/l, Chloramp: 20mg/l) 10g/l Pepton 5g/l Hefeextrakt 10g/l NaCl 15g/l Agar (Amp:100mg/l, Chloramp: 20mg/l) 2% Pepton 0,5% Hefeextrakt 10mM NaCl 2,5mM KCl 10mM MgCl 2 20mM MgSO 4 20mM Glukose 10mM EDTA 50mM Glucose 25mM Tris-HCL ph 8 0,2M NaOH 1% (w/v) SDS Lösung 3 3M Kaliumacetat, ph 4,8 RF1 100mM RbCl 50mM MnCl 2 30mM Kaliumacetat 10mM CaCl 2 15% (v/v) Glycerin ph 5,8 RF2 10mM MOPS ph 6,8 10mM RbCl 75mM CaCl 2 15% (v/v) Glycerin STET 100mM NaCl 10mM Tris-HCl ph 8 1mM EDTA 5% (v/v) Triton X-100 TE 10mM Tris-HCl ph 7,9 1mM EDTA

57 Material und Methoden 44 TEB 20mM EDTA 89mM Tris-Borat ph 8 90mM Borsäure Zellkultur B18 (-/-) 2µg/ml L-Alanin 0,1µg/ml Biotin 2µg/ml Carnitin 10µM Ethanolamin 15µg/ml D(+)Glucose 441µg/ml L-Glutamin 7,76µg/ml L-Prolin 16,1µg/ml Putrescin 25µg/ml Natriumpyruvat 100U/ml Penicillin 100µg/ml Streptomycin 0,016µg/ml Natrium Selenit 0,34µg/ml Vitamin B12 0,194µg/ml Zinksulfat 1µg/ml Linolsäure 1µg/ml Linolische Säure 0,0063µg/ml Progesteron 0,1µg/ml all trans-retinol 0,1µg/ml Retinylacetat 1µg/ml DL-α-Tcopherol 1µg/ml DL-α-Tocopherolacetat 2,5mg/ml BSA 4µg/ml Insulin 5µg/ml Transferrin 0,002µg/ml Triodo-I-Thyronin (T3) in DMEM PBS 8,1mM Na 2 HPO 4 138mM Nacl 2,7mM KCl 1,47mM KH 2 PO 4 PCNA Kulturmedium PEM DMEM (10% Carbonat) 6% (v/v) FKS (hitzeinaktiviert) 2mM L-Glutamin 100U/ml Penicillin 100µg/ml Streptomycin PBS + 500mM EDTA

58 Material und Methoden Proteinbiochemie Aktin Puffer 5mM Tris-HCl, ph 8,0 0,2mM CaCl2 0,2mM Li-ATP Aktin-Poly Puffer 5mM Tris-HCl, ph 8,0 500mM KCl 20mM MgCl2 50mM Li-ATP Blotpuffer 1xTG 20% (v/v) Ethanol 0,05% SDS Boehringer-Lysepuffer 50mM Tris-HCl ph 7,4 150mM NaCl 40mm NaF 5mM EDTA 5mM EGTA 1mM Na 3 VO 4 ph 10 1% (v/v) Nonidet 0,1% (w/v) Natriumdesoxycholat 0,1% (w/v) SDS 1mM PMSF Coomassie Färbelösung 40% Ethanol 10% Essigsäure 0,1% Coomassie Brilliant Blue R250 Coomassie Entfärber 40% Ethanol 10% Essigsäure Fish-Puffer 50mM Tris-HCl ph 7,6 100mM NaCl 2mM MgCl 2 10% (v/v) Glycerein 1% (v/v) Nonidet NP40 SDS-4xProbenpuffer 250mM Tris-HCl ph 7,6 (reduzierend) 8% (w/v) SDS 40% (w/v) Glycerin 0,04% (w/v) Pyronin Y (70µM β-mercaptoethanol)

59 Material und Methoden 46 lower Tris 1,5m Tris-HCl ph 6,8 0,4% (w/v) SDS upper Tris 500mM Tris-HCl ph 6,8 0,4% (w/v) SDS Kathoden Puffer 0,1M Tris ph 8,25 (Schägger PAGE) 0,1M Tricine 0,1% SDS Anoden Puffer 0,2M Tris ph 8,9 (Schägger PAGE) 3x Gelpuffer 3M Tris ph 8,25 (Schägger PAGE) 0,3% SDS GST-Puffer 100mM NaCl 50mM Tris ph 7,4 2mM MgCl 2 1mM DTT 100µM PMSF EP 100nM HEPES ph 7,6 40mM Gluthation 1mM DTT Ponceau S-Lösung SDS-Page Puffer 0,2% (w/v) Ponceau S 3% (w/v) Trichloressigsäure 3% (w/v) Sulfosalicylsäure 1xTG 0,1% (w/v) SDS Stripping Puffer 25mM Glycin ph 2 1% (w/v) SDS TBS (T) 25mm Tris-HCl ph 7,4 150mm NaCl (0,05% (v/v) Tween 20) Hochsalz Puffer 500mM LiCl 100mM Tris ph 7,4 Tiefsalz Puffer 10mM Tris ph 7,4 TG 25mM Tris 192mM Glycin

60 Material und Methoden 47 Src-Puffer 20mM Tris ph 7,4 10mM MgCl 2 5mM MnCl 2 1mM DTT 1mMEGTA 500µM Pervanadat 100µM ATP Meßpuffer 145mM NaCl 10mM Glukose 10mM HEPES 4mM KCl 2mM MgCl 2 3mM CaCl 2 240mg/l Arginin Immunohistochemie Blockierlösung Fixierlösung 10% (w/v) Sucrose 0,5% (w/v) Nonidet P40 5% Magermilch 100mM Glycin 5% (w/v) Paraformaldehyd 1% (w/v) Sucrose

61 Material und Methoden Methoden Molekularbiologische Arbeitsmethoden Mini Präparation mittels Phenol-Chloroform Extraktion Die Bakterien wurden auf eine LB-Agarplatte mit entsprechendem Resistenzmarker ausgestrichen. Ausgehend von einer Einzelkolonie wurde am nächsten Tag eine 5 ml Vorkultur über Nacht bei 37 C angezogen. 1,5ml der Bakterienlösung wurden abzentrifugiert (1,5min bei rpm in der Tischzentrifuge) und das Pellet in 100µl Lösung 1 resuspendiert. Anschließend wurden 200µl Lösung 2 hinzugefügt, umgeschwenkt und die Probe bei RT 5min inkubiert. Danach wurden 150µl Lösung 3 zugesetzt, gut gemischt und für mind. 5 min auf Eis belassen. Um die ausgefallenen Proteine zu entfernen, wurde für 15min bei 4 C und 14000rpm zentrifugiert und der Überstand in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Die zu extrahierende Lösung wurde mit 500µl Phenol versetzt und gründlich durchgemischt (30s Vortex). Zur Phasentrennung erfolgte eine 2 minütige Zentrifugation bei 14000rpm. Der Überstand wurde abgenommen und mit 500µl Chloroform (zur Entfernung des Phenols) versetzt, erneut gevortext und zentrifugiert. Nach Abnahme der wäßrigen Phase wurde diese erneut mit Chloroform extrahiert und zur Fällung der DNA mit 1ml eiskaltem Ethanol (100%) versetzt. Die Lösung wurde für 20min bei 20 C belassen und anschließend für 15min bei 14000rpm und 4 C in der Tischzentrifuge pelletiert. Das Pellet wurde einmal mit 70%Ethanol gewaschen und getrocknet. Es wurde in 20µl TE-Puffer, der mit RNaseA versetzt worden war (0,5µg/µl 0,25fach TE), aufgenommen Mini Präparation nach der boiling method Diese Methode wurde durchgeführt, wenn eine schnelle Untersuchung der Bakterien nötig war, und die erhaltene DNA nur zur Restriktionsanalyse verwendet werden sollte. Die Anzucht der Bakterien erfolgte analog zu der oben genannten Methode. 1,5ml der erhaltenen Bakteriensuspension wurden pelletiert und in 400µl STET resuspendiert. Anschließend wurde für 1min auf 100 C erhitzt. Nach der darauf folgenden Zentrifugation (14000rpm, 15min) wurde der Überstand in ein neues Reaktionsgefäß überführt und zur Präzipitation mit 400µl Isopropanol oder 1ml Ethanol versetzt. Die Präzipitation erfolgte beim Isopropanol 10min bei RT, beim

62 Material und Methoden 49 Ethanol mind. 20min bei -20 C. Um die DNA zu pellet ieren, wurde 10min zentrifugiert (14000rpm, 4 C). Das Pellet wurde mit 70% Ethanol g ewaschen und in 60µl-100µl 0,25fachTE (mit RNaseA 0,5µg/µl) aufgenommen Midi-Präparation mittels handelsüblichen Kits Wenn sehr reine Plasmid-DNA, zum Beispiel zur Sequenzierung oder Transfektion von Zellinien, benötig wurde, wurde diese mittels eines handelsüblichen Kits (Bsp.: Qiagen Maxi Kit zur Plasmidisolation) isoliert. Dabei wurde nach den vom Hersteller gegeben Anweisungen verfahren UV-photometrische Bestimmung der Konzentration der aufgereinigten DNA Die aufgereinigte DNA wurde 1:100 in Wasser verdünnt. Zur Konzentrationsbestimmung wurde die optische Dichte (OD) bei 260nm gemessen. Bei doppelsträngiger DNA entspricht OD 260 =1 einer Konzentration von 40µg/ml. Die Reinheit der DNA ergibt sich aus dem Quotienten OD 260 /OD 280, der bei reiner DNA- Lösung bei 1,8 liegt Spaltung der DNA mittels Restriktionsendonucleasen Die Restriktion wurde zur Analyse der DNA aus einer Mini- oder Midi-Präparation, wie auch zur Gewinnung von DNA-Fragmenten die in einer späteren Ligation benötigt wurden, durchgeführt. Die Restriktion erfolgte in einem Reaktionsansatz von 10µl (Kontrollrestriktion) bis zu 50µl (präp. Restriktion). Der DNA wurden Restriktionsendonukleasen (vom Hersteller empfohlene Konzentration), 10fach Konzentrat des Reaktionspuffers und Wasser zugefügt. Die Restriktion erfolgte meist bei 37 C f ür ca. 1h. Andere Inkubationszeiten und Inkubationstemperaturen waren enzymabhängig und vom Hersteller angegeben. Die geeignete Menge des Restriktionsenzyms, das eine gewisse Menge DNA in einer Stunde schneidet, leitet sich von der DNA des λ-phagen als Referenz ab und wird folgendermaßen ermittelt: Units Größe λ-phagen DNA (48.5kbp) Schnittstellen DNA = x µg DNA/h Größe der zu restringierenden DNA Schnittstellen λ-phagen DNA

63 Material und Methoden Agarosegelelektrophorese Zur Analyse von DNA wurde diese elektrophoretisch auftrennt. Dies erfolgte je nach Größe der aufzutrennenden Fragmente in 1-2%igen horizontalen Agarosegelen. Die entsprechende Menge Agarose wurde zuvor in TEB Puffer gegeben und unter Erhitzen gelöst. Mit dieser Lösung wurden die Agarosegele gegossen und nach dem Erkalten mit TEB Puffer übergossen. Zur Färbung der DNA wurden die Gele nach dem Lauf in ein Ethidiumbromid-Färbebad gegeben (15-25min). Ethidiumbromid färbt als interkalierender Farbstoff die DNA an, so daß sie im UV-Licht sichtbar wird. Die Proben wurden mit DNA-Probenpuffer gemischt und in die Taschen gegeben. Die Auftrennung erfolgte bei 70V. Als DNA-Größenstandard wurde meist λ-dna, restringiert mit den Endonukleasen HindIII und EcoRI, eingesetzt. (Banden bei 21226, 5148, 4973, 4268, 3520, 2027, 1904, 1584, 1375, 947, 831, 564 und 125bp) Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen Zur Isolation der DNA wurden die unter UV-Licht sichtbaren Fragmente mit einem Skalpell herausgeschnitten und in Reaktionsgefäße (1,5ml) überführt. Die Extraktion der DNA aus dem Gel Stück erfolgte mittels handelsüblicher Kits. Es wurde entsprechend der Vorschrift des Herstellers verfahren und die DNA mit Wasser eluiert Amplifikation von DNA-Fragmenten mittels PCR Zur Erzeugung von DNA Fragmenten wurde die Polymerasekettenreaktion (PCR) durchgeführt. Als Templet zur Amplifikation wurde ein vorhandener Vektor verwendet, der die gewünschte Sequenz bereits enthielt. 10 ng der Template-DNA wurden mit je 2,5 nm der jeweiligen Primer, 0,25 µm dntp und 2 Einheiten Deep Vent Polymerase gemischt. Die Amplifikation erfolgte in einem Eppendorf-Thermocycler Personal. Die Temperaturen wurden abhängig von den Schmelztemperaturen der verwendeten Primer gewählt. Die amplifizierte DNA wurde auf einem Agarosegel aufgetrennt und untersucht.

64 Material und Methoden Fällung von DNA Um zwischen verschieden Schritten während der Klonierung den Verlust der DNA möglichst gering zu halten, wurde diese mittels Ethanol und Salz gefällt. Hierzu wurde die jeweilige Probe auf ein Volumen von 100µl mit Wasser aufgefüllt und mit 7µl 5M NaCl und 500µl Ethanol versetzt. Die Präzipitation erfolgte für 20min bei 20 C. Um die DNA zu sedimentieren wurde anschli eßend in einer Tischzentrifuge 15min bei 14000rpm und 4 C zentrifugiert. Das Pelle t wurde getrocknet und in einer kleinen Menge Wasser aufgenommen Ligation von DNA Fragmenten Der Ligationsansatz enthielt in einem Endvolumen von 20µl 2µl 10fach Ligase Puffer, 0,5µl T4-DNA-Ligase, 2µl restringierte Vektor-DNA und 2µl Insert (bei Blunt-End Ligation 4µl). Zur Ligation wurden die Ansätze bei RT für drei Stunden oder über Nacht bei 14 C aufbewahrt. Zur Lagerung der DNA wurde die Ligase durch Hitze (15 min, 65 C) inaktiviert Herstellung CaCl 2 kompetenter Bakterien Es wurden kompetente Zellen der Stämme Nova Blue und BL21 rosetta hergestellt. Die Bakterien wurden auf eine LB-Agarplatte (NovaBlue) bzw. eine LB- Chloramphenikol-Agarplatte ausgestrichen. Ausgehend von einer Einzelkolonie wurde am nächsten Tag eine 5 ml Vorkultur über Nacht bei 37 C angezogen. Mit dieser Vorkultur wurde die Hauptkultur (200ml, LB-Medium) bis auf eine OD 590nm von 0,15 angeimpft und bei 37 C bis zu einer OD von 0,5-0,6 inkubiert. Die Bakterien wurden bei 2000g und 4 C für 10min sedimentiert, de r Überstand verworfen und das Pellet in 1/3 des Volumens der Hauptkultur RF1 resuspendiert. Die Suspension wurde für 30min auf Eis belassen, und anschließend wie oben zentrifugiert. Das Pellet wurde in 1/12,5 des Anfangsvolumens RF2 aufgenommen und für weitere 15min auf Eis gestellt. Abschließend wurde die Bakteriensuspension aliquotiert und in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Die Lagerung erfolgte bei 80 C.

65 Material und Methoden Transformation Zu 100µl-200µl Bakteriensuspension (kompetent nach ) wurde die entsprechende Menge DNA (bis zu maximal 1/10 des Volumens der Bakteriensuspension) gegeben, und anschließend für 30min auf Eis inkubiert. Einem Hitzeschock bei 42 C für 50s folgte eine weitere In kubation auf Eis für ca. 2min. Nach der Zugabe von 1ml SOC-Medium wurden die Zellen für 20-40min bei 37 C gehalten um die Resistenz auszubilden. Danach wurde die Suspension für 2min bei 3000rpm in einer Eppendorf Tischzentrifuge zentrifugiert. Ein Großteil des Überstandes wurde verworfen. Von der verbliebenen Suspension wurden 100µl- 200µl auf LB-Agarplatten mit dem entsprechenden Resistenzmarker ausgestrichen. Die Inkubation erfolgte über Nacht bei 37 C Zellbiologische Methoden sekundärer Zellkultur Auftauen und Einfrieren sekundärer Zellinien Um sekundäre Zellinien über längere Zeit zu lagern, wurde dem Kulturmedium 7-10% (v/v) DMSO zugesetzt. In diesem Medium wurden die Zellen aufgenommen und in Kryo-Röhrchen gefüllt. Um langsames Einfrieren zu gewährleisten wurden die Zellen über Nacht in Styropor verpackt und bei 80 C eingefroren. Zur endgültigen Lagerung wurden die Zellen in flüssigen Stickstoff (-196 C) gegeben. Um die Zellen erneut zu kultivieren, wurde das entsprechende Kryo-Röhrchen schnell aufgetaut, und die Zellsuspension in 10ml kaltem Kulturmedium aufgenommen und zentrifugiert (5min, 900rpm). Das Zellpellet wurde in Kulturmedium überführt und über Nacht kultiviert. Am nächsten Tag wurde das Medium gewechselt um eventuell verbliebenes DMSO zu entfernen Kultivierung von RN22, PCNA, MDCKtetoff-p75 WT und MDCKtetoffp75 Y337F Zellen PCNA Zellen und MDCKtetoff Zellen wurden in DMEM Kulturmedium bei 37 C und 10% CO 2 Atmosphäre, RN22 Zellen in RPMI Kulturmedium bei 37 C und 5% CO 2 Atmosphäre gezogen. Dem Kulturmedium der MDCKtetoff Zellen wurde zusätzlich Puromycin (1µg/ml), Hygromycin (250µg/µl) und Doxycylin (1µg/µl) zugefügt. Durch die Zugabe des Doxycylins wurde die Expression der transfizierten p75 Konstrukte unterdrückt. Die verwendeten stabilen MDCKtetoff Zellinien waren

66 Material und Methoden 53 MDCK p75wt (exprimieren Wildtyp p75) und MDCK Y337F (exprimieren eine p75 Mutante, bei der Tyrosin 337 gegen Phenylalanin ausgetauscht wurde). Konfluente Zellen wurden zur Passagierung zunächst mit PBS gewaschen und durch eine Inkubation (ca.5min, 37 C) mit einer Trypsinlösung (Trypsin/PE M: 1/1) von der Kulturschale abgelöst. Bei den RN22 Zellen wurde auf die Zugabe von Trypsin verzichtet. Die gelösten Zellen wurden in 5ml Kulturmedium aufgenommen und sedimentiert (5min, 900rpm). Das Pellet wurden in Kulturmedium resuspendiert und die Zellsuspension in einer Verdünnung von 1:10 in eine neue Kulturflasche gegeben. Dort wurden die Zellen wiederum bis zur Konfluenz kultiviert. Für Experimente wurden die PCNA, MDCK oder RN22 Zellen in Kulturschalen oder auf Deckgläschen (mit Gelantine beschichtet) ausgesät und für mind. zwei Tage kultiviert. Für Experimente mit den verschiedenen MDCKtetoff Zellen wurde am Tag zuvor das Medium gegen serumfreies B18-/- Medium ausgetauscht. So konnte die für die p75 Konstrukte kodierende cdna, welche im ptre2hyg-vektor unter der Kontrolle eines Tetracyclin-Responsives-Elements steht, abgelesen werden Kultivierung von MC 192-Hybridomazellen Die MC192-Hybridomazellen wurden in DMEM Kulturmedium bei 37 C und 10% CO 2 Atmosphäre kultiviert. Zur Passagierung wurden die Zellen durch leichtes Klopfen vom Boden der Kulturflasche abgelöst. Nach dem Sedimentieren der Zellen wurden diese zur weiteren Kultivierung in einer Verdünnung von 1:2 in neue Kulturflaschen gegeben Gelantine Beschichtung von Deckgläschen Zwecks besserer Haftung der verschieden Zellen bei der Immunohistochemie erfolgte die Kultivierung auf gelantinebeschichteten Deckgläschen. Hierzu wurden die Deckgläschen zunächst sterilisiert und anschließend in einer strerilen Gelantine-Lösung (0,1% in Wasser) für mindestens 15min bei RT inkubiert. Die Lösung wurde abgenommen und die Deckgläschen zum Trocknen aufgestellt.

67 Material und Methoden Herstellung des monoklonalen Antikörper MC192 Um aus dem Überstand der Hybridomazellen ( ) MC192 Antikörper zu isolieren, mußte das Kulturmedium der Zellen frei von Serum und BSA sein. Hierzu wurden die Zellen nach der Sedimentierung mehrmals mit DMEM gewaschen und anschließend für mindestens drei Tage mit einer Mischung aus DMEM:B18-/- ohne BSA (1:1) kultiviert. Da die Hybridomazellen ohne FCS-Zusatz nicht überlebensfähig sind, starben sie während der Inkubation mit DMEM ab. Am Ende der Kultivierung (Großteil der Zellen waren abgestorben) wurden die Überstände der Zellen geerntet. Um den Überstand von Zellen und Zelldebris zu befreien, wurde für 10 Minuten bei 3000g zentrifugiert und der Überstand zur Aufbewahrung (bei 4 C) mit Natriumazid (0,02%) versetzt. Waren 500ml Überstand gesammelt, wurde der enthaltene Antikörper durch Ammoniumsulfatfällung isoliert. Hierzu rührte man die Lösung bei 4 C und fügte zum Fällen der Proteine langsam Ammoniumsulfat bis zu einer Endkonzentration von 25% innerhalb 1 h hinzu. Danach wurde 1 h weitergerührt. Das Präzipitat wurde durch Zentrifugation bei 10000rpm in einem GSA-Rotor für 15 Minuten abgetrennt. Zur vollständigen Fällung wurde erneut Ammoniumsulfat bis zu einer Endkonzentration von 50% zugefügt und für 1 h gerührt. Durch Zentrifugation (s. o.) wurde das Präzipitat abgetrennt. Die beiden Präzipitate wurden jeweils in PBS resuspendiert und gegen PBS dialysiert. Die Reinheit des isolierten Antikörpers wurde mittels SDS-PAGE analysiert Stimulation Sekundäre Zellen wurden zwei bis drei Tage nach der Aussaat (70-80% Konfluenz) für die Stimulation verwendet. Das Kulturmedium wurde zuvor durch B18-/- Medium, welches bei 37 C und 10%CO 2 -Atmosphäre vorinkubiert wurde, ersetzt. Die Zellen wurden mit diesem Medium von 4h bis zu 24h (MDCKtetoff Zellen) inkubiert. Wurden Inhibitoren verwendet, wurden diese nach dem Ablauf dieser Zeit für 20min-30min hinzugefügt und die Zellen weiterhin bei 37 C inkubiert. Die ve rwendeten Inhibitoren sowie deren Konzentration sind in den Ergebnissen aufgeführt. Das stimulierende Agens wurde anschließend dem serumfreien Medium zugefügt (NGF: 100ng/ml, aggregiertes β-amyloid 1-42 : 25nM) und die Zellen wurden für die jeweiligen Stimulationszeiten im Brutschrank inkubiert. Nach Beendigung der Stimulation wurden die Kulturschalen sofort auf Eis gestellt, und die Zellen mit kaltem PBS zweimal gewaschen. Schloß sich das Experiment direkt an, wurden die Zellen sofort lysiert ( ) oder für die Histochemie fixiert

68 Material und Methoden 55 ( ). Erfolgte es zu einem späteren Zeitpunkt, konnten die Zellen (nach Abnahme des PBS) bei -80 C eingefroren werden Crosslinking Um schwache, entfernte oder zeitlich begrenzte Interaktionen zwischen verschieden Proteinen zu untersuchen, wurde ein chemisches Crosslinking durchgeführt. Hierzu wurde DSP (Dithiobis[succinimidylpropionat]) verwendet. Dieser Crosslinker reagiert mit primären Aminogruppen und ist membranpermeabel, so daß er für intrazelluläre Verknüpfung genutzt werden kann. Nach der Stimulation ( ) wurden die Zellen mit kaltem PBS gewaschen und anschließend für 30min in Crosslinking-Lösung (2mM DSP, 500µM Pervanadat in PBS) bei RT geschüttelt. Um unreagiertes DSP zu entfernen, wurden die Schalen nachfolgend mehrmals mit kaltem PBS gewaschen und vor der sich anschließenden Immunopräzipitation mit BLP lysiert ( ) Proteinbiochemische Methoden Induktion von GST-Fusionsproteinen Zur Überexpression von Fusionsproteinen wurde das pgex Expressionssystem verwendet. Bei diesem System wird das Zielprotein unter der Kontrolle eines tac Promotors (mit IPTG induzierbar) als Fusionsprotein mit Glutathione S-Transferase (GST, 26kDa) exprimiert. Nach der Reinigung über Glutathione-Sepharose kann das Zielprotein durch Thrombinverdau vom GST getrennt werden. Die kodierenden Sequenzen von der Ras-binding domain von Raf (RBD), der intrazellulären Domäne vom p75 (p75 ICD ) sowie Mutationen dieser Domäne (p75 Y337F, p75 Y366F und p75 FF ) wurden in den pgex-2t Vektor kloniert und zur Expression in BL21-rossetta Zellen transformiert. Transformanten des Fusionskonstruktes wurden als Kultur in 50ml LB-Medium unter selektiven Bedingungen (Ampicillin 100µg/ml, Chloramphenicol 34mg/ml) bei 37 C über Nacht angezogen. Nach Bestimmung der optischen Dichte (OD) bei 600nm wurde eine 400ml Hauptkultur auf einen OD-Wert von 0,15 angeimpft und bei 37 C inkubiert. Bei einer OD 600nm von 0,4 bis 0,6 wurde mit 250µM IPTG für 4h induziert. Es wurden Proben vor und nach der Induktion genommen. Anschließend wurden die Zellen geerntet (GS3 Rotor, 5000rpm, 4 C, 15min) un d bei -80 C aufbewahrt.

69 Material und Methoden Herstellung von Vollysaten der GST-Fusionsproteine Die in erhaltenen Pellets wurden in 20ml kaltem GST-Puffer (100mM NaCl, 50mM Tris, 2mM MgCl 2, 2mM DTT, 100µM PMSF, ph 7,4) resuspendiert. Der Aufschluß der Zellen erfolgte mittels eines Mikrofluidizers (zweimal durchlaufen lassen). Um Zellreste abzutrennen wurde 1h bei 10000g und 4 C im HB4 Rotor zentrifugiert. Der resultierende Überstand (Vollysat) wurde aliquotiert und nach dem Einfrieren im flüssigen Stickstoff bei -80 C gelage rt Aufreinigung von GST-Fusionsproteinen aus Volllysaten Zur Aufreinigung von GST-Fusionsproteinen wurde GSH-Sepharose verwendet. 10ml des Volllysates ( ) wurden mit 1,5ml GSH-Sepharose in GST-Puffer bei 4 C für 1h inkubiert. Die beladene Sepharose wurde anschließend dreimal mit GST- Puffer, zweimal mit Hochsalz-Puffer und zweimal mit Tiefsalz-Puffer gewachsen. Zur Elution der Fusionsproteine wurde die sedimentierte Sepharose mit 1ml EP (1mM DTT, 100mM HEPES, 40mM Gluthation, ph 7,6) je 500µl Sepharosevolumen für 1h bei 4 C gerollert. Nach einer erneuten Zentrifugati on (15000g, 2min, 4 C) wurde der Überstand mittels Anionenaustauschchromatographie weiter aufgereinigt. Hierzu wurde eine MonoQ Säule an eine FPLF Anlage angeschlossen und mit 25mM HEPES, ph7,6 äquilibriert (Flußrate: 1ml/min).Nach Aufgabe der Probe wurde zur Elution ein steigender Gradient von Null bis 2M NaCl verwendet. Es wurden Fraktionen mit je 500µl gesammelt und die Leitfähigkeit und die Absorption bei 280 nm gemessen.. Die Fraktionen, die einen hohen Proteingehalt aufweisen, wurden auf ihren Gehalt an GST-Fusionsprotein hin analysiert GST freie Aufreinigung von Fusionsproteinen aus Volllysaten Um reines Protein zu erhalten erfolgt in einem weiteren Schritt eine Affinitätsaufreinigung. Hierzu wurden 5ml des erhaltenen Lysats ( ) mit 500µl GSH-Sepharose bei 4 C für 1h in GST-Puffer inkubier t. Anschließend wurde fünfmal mit 10ml Puffer (20mM Tris ph7.4, 10mM MgCl 2 ) gewaschen und die sedimentierte, beladene Sepharose in 500µl Puffer aufgenommen. Der Thrombinverdau (20Units) erfolgte über Nacht bei 4 C. Die Suspension wurde a bzentrifugiert und der Überstand zur weiteren Verarbeitung auf Eis gelagert. Das Pellet wurde mit dem gleichen Volumen an Puffer aufgeschwemmt und erneut abzentrifugiert. Auch dieser Überstand wurde auf Eis gelagert.

70 Material und Methoden 57 Um das im Überstand enthaltene Thrombin abzutrennen wurde eine Gelfiltration durchgeführt. Hierzu wurde der Überstand mit DTT versetzt (1mM) und auf eine Superdex75HR Säule gegeben. Als Laufpuffer (entgast) wurden 20mM Tris ph7.4, 10mM MgCl 2 und 1mM DTT verwendet. Die Flußgeschwindigkeit betrug 0,5ml/min, das Fraktionsvolumen 1,5ml. Durch UV-Analyse wurden die proteinhaltigen Fraktionen ausgewählt, und mittels SDS-PAGE analysiert Lyse sekundärer Zellen Die nach der Stimulation mit PBS gewaschenen Zellen wurden zur Lyse mit Boehringer-Lysepuffer (BLP) oder mit Fishpuffer (für den Ras-Pulldown oder p75 ICD - Pulldown) versetzt. Beiden Puffer wurden zuvor 1mM PMSF, 500µM Pervanadat und 1mM Orthovanadat zugefügt. Für die 6cm Schälchen wurden 400µl Puffer verwendet, für die 3,5cm Schälchen 90µl Puffer. Nach kurzer Inkubation auf Eis wurden die Zellen mit einem Gummischaber gelöst und in ein Reaktionsgefäß überführt. Um Zelldebris zu entfernten wurde bei 14000rpm und 4 C für 15min zentrifugiert. Der Übers tand (Lysat) wurde in ein neues Reaktionsgefäß gegeben und zur weiteren Verwendung aufbewahrt (-20 C) Proteinbestimmung Da es für Stimulationsstudien wichtig war, die gleichen Mengen an Protein einzusetzen, wurde die Proteinkonzentration der Lysate bestimmt. Zur Bestimmung wurde der DC-Protein Assay Kit der Firma BioRad verwendet. In eine 96Well Mikrotiterplatte wurden als Standard 0, 2, 3,4 und 5µl einer BSA- Lösung (2mg/ml) und je 2µl der Lysate gegeben. Weiterhin wurden zu jeder Probe 20µl A (1000µl Lösung A + 25µl Lösung S) und 200µl Lösung B pipettiert. Nach einer Inkubation von 5min bei RT wurden die Proben bei 620nm im ELISA-Reader ausgelesen. Mit Hilfe der Standardwerte konnte so die jeweilige Proteinkonzentration ermittelt werden. War im Zellysat kein Detergenz enthalten, wurde der Proteingehalt nach der Bradfort Methode bestimmt. Hierzu wurde in eine 96Well Platte als Standart 0, 2, 3, 4 und 5µl einer BSA-Lösung (0,2mg/ml) gegeben. Von der zu bestimmenden Proteinlösung konnten bis zu 10µl eingesetzt werden. Nach dem Zufügen von 200µl Bradford Reagenz (5fach: 50% Phosphorsäure, 25% Ethanol, 0,05% Coomassie G250) wurde für 5min bei RT inkubiert und anschließend bei 596nm im ELISA-Reader detektiert.

71 Material und Methoden Ras-Pulldown Die Ras-binding domain von Raf (RBD) bindet spezifisch Ras in seiner GTP Form (aktives Ras). Als Fusionsprotein an GST gekoppelt ist es somit möglich, aktives Ras aus Zellysaten durch den Einsatz von Glutathion-Sepharose (bindet GST) zu isolieren Kopplung Zur Vorbereitung erfolgt die Kopplung von RBD-GST an die Glutathion-Sepharose. Hierzu wurden je Ansatz 10µl Vollysat nach (RBD-GST überexprimierende Bakterien) und 10µl Glutathion-Sepharose in minimal 600µl Fishpuffer gemischt und unter Rotation für 90min bei 4 C inkubiert. Nach der Kopplung von RBD-GST an die GSH-Sepharose wurde die beladene Sepaharose viermal mit 900µl Fishpuffer gewaschen. Während des Waschens wurde bei 9500g zentrifugiert, um die Sepharose zu sedimentieren und den Überstand entfernen zu können. Es wurden nur gekühlte Lösungen verwendet. Die gewaschene Sepharose wurde in 100µl Fishpuffer je Ansatz aufgenommen (RBD-Sepharose) Pulldown Die Zellen (Stimulation gemäß ) wurden wie in beschrieben lysiert und ihr Proteingehalt bestimmt. Je 800µg Protein wurden mit 100µl der RBD-Sepharose versetzt und unter Rotation für 25min bei 4 C inkub iert. Nach dieser Zeit wurde die Sepharose viermal mit Fishpuffer gewaschen, anschließend in 15µl SDS-2xProbenpuffer aufgenommen und für 10min auf 95 C erhitzt. Nach einer Zentrifugation (5min, 14000rpm) wurde der Überstand auf ein 12%iges SDS-Polyacryamidgel gegeben, nachfolgend auf eine Nitrocellulosemembran transferiert und weiter verarbeitet SDS-PAGE (SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese) Für die elektrophoretische Auftrennung von Proteinen unter denaturierenden Bedingungen wurden diskontinuierliche SDS-Polyacrylamidgele nach Laemmli (Laemmli et al., 1970) oder, falls die relevanten Proteine kleiner als 20kDa waren,

72 Material und Methoden 59 nach Schagger (Schagger et al., 1987) verwendet. Hierzu wurden Polyacryamidgele in einer Mini-Protean-Slab Cell Apparatur (BioRad) gegossen. Zunächst wurde ein Trenngel (12% oder 15%) gegossen und mit Isopropanol überschichtet. Nach der Polymerisation wurde das Isopropanol abgegossen und die Kammer mit Whatman-Papier getrocknet. Das 5%ige Sammelgel wurde auf das Trenngel gegossen und ein Teflonkamm eingesetzt. Nach dem Auspolymerisieren des Sammelgels und Entfernen des Kamms wurde das Gel mit den Proben und einem entsprechenden Größenstandard (Marker) beladen. Zur Probenvorbereitung wurden gleiche Proteinmengen mit 4x-SDS-Probenpuffer verdünnt und für 5min auf 95 C erhitzt. Nach einer kurzen Zentrifugation konn ten die Proben auf das Gel gebracht werden. Sollte eine Detektion des p75 über den MC192 Antikörper durchgeführt werden, wurde Probenpuffer ohne reduzierendes Agens verwendet. Die Elektrophorese erfolgte bis zum Einlaufen der Proben in das Trenngel bei 100V, danach bei 150V bis 200V. Je nach aufgetragener Probe wurde sie beim Erreichen des Gelendes oder nach einer bestimmten Auslaufzeit gestoppt Coomassie Proteinfärbung Um die Proteine unspezifisch im Gel anzufärben, wurde das Gel nach der Elektrophorese in Coomassie Färbelösung gegeben und bis zum Kochen erhitzt. Anschließen wurde bei RT für 30min geschüttelt. Zum Entfärben wurde das Gel in Coomassie-Entfärber gelegt und mindestens 30min geschüttelt. Die Lösung wurde mehrfach gewechselt um ein besseres Ergebnis zu erhalten Silberfärbung Eine sensitivere Methode zur unspezifischen Färbung von Proteinen ist die Silberfärbung. Hierbei war darauf zu achten, daß nur bidest. Wasser verwendet und das Gel nicht berührt wurde. Nach der Elektrophorese wurde das Gel für 5min mit Wasser gewaschen und anschließend zur Fixierung für 30min in 50% Ethanol/10% Essigsäure inkubiert. Nach dreimaligem Waschen (je 10min in Wasser) wurde es für 1min mit 0.02% (w/v) Na 2 S 2 O 3 inkubiert und danach nochmals zweimal gewaschen (je 1min mit Wasser). Zur Anfärbung der Proteine wurde das Gel für 30min in einer 0.1%igen (w/v) AgNO 3 - Lösung im Dunkeln inkubiert. Die Entwicklung erfolgte nach zweimaligem Waschen (je 1min mit Wasser) mit Entwicklerlösung (2% (w/v)na 2 CO 3 mit 30 µl 37% (v/v) Formaldehyd je 100 ml). Die Reaktion wurde mit 1%iger (v/v) Essigsäure abgestoppt.

73 Material und Methoden Western Blot Zur Immunodetektion erfolgte der Transfer von Proteinen auf Nitrozellulosemembran (Porengröße: 0,45 µm und 0,2µm) unter Verwendung einer Mini-Transblot-Zelle / Nass-Blot (Biorad Laboratories GmbH, München) oder einer Semidry-Anlage (Roth). Nach der Elektrophorese wurden Gel und Nitrocellulose für 10min im Blotpuffer äquilibriert. Anschließend wurde das Gel luftblasenfrei auf die Nitrozellulose gegeben, mit Whatmanpapier und einem Fiberpad von beiden Seiten bedeckt und, unter Berücksichtigung der Polung, fest in der Transblot-Zelle installiert. Die Blotdauer betrug 2h bei 100 V oder 16h bei 25V. In beiden Fällen wurde ein Kühlaggregat zur Kühlung in den Behälter eingesetzt und bei Bedarf gewechselt. Wurde die Semidry-Anlage verwendet, betrug die Dauer 1,5h bis 2h bei 70mA pro Gel. Nach dem Transfer wurde die Nitrozellulose zunächst mit PonceauS-Lösung angefärbt und mit Wasser gewaschen bis die Proteinbanden gut zu erkennen waren. Die Markerbanden wurden eingezeichnet und die Membran mit TBS-T vollständig entfärbt Immunodetektion Je nach verwendetem Erstantikörper wurde die Membran mit verschiedenen Blockierungs-Lösungen für 1h inkubiert (norm.: 5% Magermilch in TBS-T, bei Detektion mit Phosphotyrosin Antikörper mit 5% Blockierungs-Lösung von Amersham Bioscience in TBS-T). Der erste Antikörper (geeignete Verdünnung in TBS) wurde nach kurzem Waschen mit TBS zur Nitrozellulose gegeben und inkubiert (1h bei RT bis zu 16h bei 4 C). Nach erneutem Waschen (mind. 30min in TBS-T) wurde der Zweitantikörper (geeignete Verdünnung in TBS) auf die Membran gegeben, und es erfolgte eine weitere Inkubation für 1h bei RT. Zur Immundetektion wurden Zweitantikörper verwendet, die mit der Meerrettich- Peroxidase gekoppelt sind. Unter Verwendung des ECL (enhanced chemiluminescence) Systems, welches die durch Spaltung des Diacylhydrazid Luminols entstehende Lichtemission ausnutzt, konnten die spezifischen Proteinbanden mit einem ECL-Film detektiert werden. Die Entwicklung wurde gemäß den Vorschriften des Herstellers durchgeführt.

74 Material und Methoden Redetektion ( Strippen ) Um eine bereits detektierte Nitrozellulose mit einem neuen Antikörper zu untersuchen wurde vor der zweiten Detektion gestrippt. Hierzu wurde die Membran für 30min bis zu 1h in Stripping-Puffer eingelegt. Anschließend wurde zweimal kurz mit Wasser gewaschen und anschließend dreimal 10min mit TBS-T. Nach einem 30minütigen Blockierungsschritt konnte erneut mit dem Erstantikörper inkubiert werden Dichtegradienten-Zentrifugation Um die Vesikel-Lokalisation des p75 zu untersuchen, wurde eine Dichtegradienten- Zentrifugation mit Sucrosegradienten durchgeführt. Bei dieser Methode trennen sich während der Zentrifugation die Kompartiemente und Bestandteile der Zellen entsprechend ihrer Dichte auf. Durch vesikelspezifische Proteinmarker kann die Verteilung in den erhaltenen Fraktionen analysiert werden. Hierzu wurden zunächst Zellen gemäß stimuliert. Zur Lyse wurden die Zellen in 500mM Natriumcarbonat ph11 abgeschabt. Zur weiteren Desintegration wurden die Proben mit Ultraschall behandelt (je 10 Stöße bei Output 3). Dies führte außerdem dazu, daß sich halboffene Vesikelstrukturen schlossen. Nach der Proteinbestimmung wurden 1,5mg Protein pro Gradient verwendet. Der Gradient wurde wie folgt aufgebaut: Als unterste Stufe wurde die Proteinprobe auf eine Sucrosekonzentration von 45% eingestellt. Darüber folgten Stufen mit 35%, 25% und 5% Sucrose. Die Lösungen wurden in einem 25mM MES Puffer ph6.5 (mit 150mM NaCl) angesetzt. Des Weiteren wurde allen Stufen noch Orthovanadat und PMSF als Protease Inhibitor beigegeben. Die Zentrifugation erfolgte in einem TH641 Rotor für 16h bis 20h bei 4 C und 35000rpm. Anschließend wurden von oben 1ml Fraktionen genommen und je 60µl per SDS-PAGE und Immunodetektion analysiert p75 ICD -Pulldown Um eine mögliche Interaktion von Caveolin und dem p75 Rezeptor zu untersuchen wurde ein Pulldown-Experiment durchgeführt. In einem ersten Schritt wurde Vollysat ( ) von Bakterien die p75 ICD-GST exprimierten mit GSH-Sepharose inkubiert (30min, 4 C). Je Probe wurden hierbei 5µl Vollysat und 15µl GSH-Sepharose

75 Material und Methoden 62 verwendet. Das Experiment wurde in mindestens 600µl Fishpuffer durchgeführt. Nach dem Waschen (6 mal mit Fishpuffer) wurde die GSH-Sepharose in 100µl Fishpuffer pro Probe aufgenommen und auf Eis gestellt. PCNA Zellen wurden nach stimuliert und in Fishpuffer lysiert. Nach der Konzentrationsbestimmung wurde je 1mg der Proben mit 100µl der gekoppelten GSH-Sepharose versetzt und für 1h bei 4 C gerollert. Darauffolgend wurde einmal mit Fishpuffer, zweimal mit Hochsalz-Puffer und zweimal mit Tiefsalz-Puffer gewaschen. Die nach Zentrifugation erhaltene, beladene Sepharose wurde mit 20µl 2fach Lämmlipuffer versetzt und für 5min bei 95 C erhitzt. Anschließend erfolgte die Analyse per SDS Page und Immunodetektion. Die Temperatur der hier verwendeten Puffer betrug 4 C. Des weiteren wurde zur Inhibiton von Phosphotasen und Proteasen allen Puffern 1mM Orthovanadat und 100µM PMSF zugefügt Immuopräzipitation Diese Methode wurde genutzt, um bestimmte Proteine zusammen mit interagierenden Proteinen aus dem Zelllysat aufzureinigen. Zur Präzipitation wurde je nach Experiment MC192 oder py100 Antikörper (2µg pro Probe) verwendet. Dieser wurde zusammen mit 800µg Protein und 50µg/ml Anti- Maus-Agarose in BLP (mit 500µM Pervanadat und 100µM PMSF) für 2h bis 4h bei 4 C gerollert. Wurde ein bereits an Agarose gekoppe lter py100 Anitkörper verwendet, erfolgte die Inkubation über Nacht bei 4 C. Das Präzipitat wurde durch Zentrifugation für 1 Minute bei 10000g sedimentiert. Zum Entfernen unspezifisch gebundener Proteine wurde die Probe zweimal mit Hochsalz- Puffer und zweimal mit Tiefsalz-Puffer gewaschen. Die an die GSH-Sepharose gebundenen Proteinen wurden durch Zugabe von 25 µl 2x Laemmli-Probenpuffer und 5-10minütigem Erhitzen bei 95 C abgelöst und na ch der Abtrennung der Agarose (Zentrifugation bei rpm für 5 Minuten) auf einer SDS-PAGE analysiert In vitro Phosphorylierung Um zu überprüfen, ob der p75 an seinen intrazellulären Tyrosinen durch die Src Kinase phosphoryliert werden kann, wurde eine In vitro Phosphorylierung durchgeführt. Gereinigtes p75 Protein (je 10µg der verschiedenen Mutanten) wurde mit activer c- Src Kinase (9*10-3 U) in Src-Puffer in einem Gesamtvolumen von 30µl bei 30 C für

76 Material und Methoden 63 30min inkubiert. Durch Zugabe von 4fach Lämmlipuffer wurde die Reaktion gestoppt. Je nach Größe der verwendeten Fragmente wurden die Proben über eine SDS- PAGE nach Laemmli oder nach Schägger und nachfolgender Immunodetektion analysiert Herstellung von aggregiertem beta-amyloid 1-42 (Susen et al, 2005) Da angenommen wird, daß die verschiedenen Aggregationsstufen von beta- Amyloid 1-42 verschieden Effekte auf Zellen haben können war es wichtig, die Aggregation des Amyloids zu überprüfen und im richtigen Moment abzustoppen. Hierzu wurde beta-amyloid 1-42 in einer Konzentration von 2mg/ml in 20% DMSO gelöst, für 10min im Ultraschallbad inkubiert und bei 14000g zentrifugiert um ungelöste oder bereits aggregierte Bestandteile zu entfernen. Der Überstand wurde aliquotiert und in flüssigem Stickstoff schockgefroren (Lagerung bei 80 C). Am Tage des Experiments wurde das beta-amyloid in PBS (ph 7,4) verdünnt (25µM), und unter vorsichtigem Schütteln bei 37 C für 4h inkubi ert. Hierdurch wurden Amyloid- Oligomere (bestehend aus max. 16 Monomeren) gebildet. Die Aggregation zu höher molekularen Formen konnte durch die kurze Aggregationszeit nicht stattfinden Aktivierung von Natriumvanadat zu Pervanadat oder Orthovanadat Um eine maximale Inhibition der Tyrosinphosphatasen zu erhalten, wurde Natriumvanadat vor Gebrauch aktiviert. Dabei konnte einerseits das stabilere Orthovanadat, andererseits das membrangängige Pervanadat gewonnen werden. Zur Herstellung des Orthovanadat wurde eine 200mM Natriumvanadat Lösung in Wasser angesetzt. Diese Lösung wurde mit NaOH oder HCl auf ph 10 eingestellt (Lösung wird gelb). Anschließend wurde die Lösung für ca. 10min gekocht, wobei sie sich wieder entfärbt. Nachdem die Lösung auf RT abgekühlt war, wurde erneut der ph auf 10 justiert und gekocht bis die Gelbfärbung verschwand. Dieses wurde so oft wiederholt bis die Lösung einen stabilen ph von 10 aufwies und sich nicht mehr gelblich färbte. Nach dem Aliquotieren konnte das Orthovanadat bei 80 C gelagert werden. Das potentere aber relativ instabile Pervanadat mußte vor jedem Experiment frisch angesetzt werden. Hierzu wurden 100mM Natriumvanadat in 20mM HEPES ph7,4 angesetzt. 100µl dieser Lösung wurden zusammen mit 400µl 20mM HEPES ph7,4 und 500µl 100mM H 2 O 2 (ebenfalls in 20mM HEPES ph7,4) für 5min bei RT inkubiert. Anschließend wurde 100µg/ml Catalase zugefügt, gut gemischt, für 2 bis 5min

77 Material und Methoden 64 inkubiert (bis Gasentwicklung nachläßt) und das entstandene Pervanadat 1:20 (500µM) eingesetzt Herstellung von filamentösem Aktin (F Aktin) Soll eine Interaktion eines Proteins mit G Aktin (globuläres Aktin)untersucht werden, muß dieses nur im entsprechenden Puffer aufgenommen werden. Da Aktin- Filamente sich aus G Aktin bilden, welches ATP abhängig zu einer engen Helix polymerisiert, muß dieses zunächst hergestellt werden um eine mögliche Interaktion mit p75 analysieren zu können. Hierzu wurde Nicht-Muskel-Aktin in einer Konzentration von 1µg/µl in Aktin-Puffer gelöst und anschließend 20min auf Eis inkubiert. Durch Addition von 1/10 Volumen Aktin-Poly-Puffer wurde die Polymerisation von G Aktin zu F Aktin induziert und für eine Stunde bei RT gerollert. Anschließen konnte es in einer Konzentration von 100ng bis 100µg für die versuche eingesetzt werden. Das Nicht-Muskel-Aktin sowie die Puffer wurden von Cytoskeleton bezogen p75 ICD -Aktin Pulldown Dieses in vitro Experiment wurde durchgeführt, um eine mögliche Interaktion vom p75 Rezeptor mit Aktin (G oder F) zu untersuchen. Zunächst wurden je Probe 20µg p75 ICD -GST ( ) und 10µl GSH-Sepharose in 200µl Interaktions-Puffer für 20min bei 4 C gerollert (Beladung der Sepharose). Anschli eßend wurden unterschiedliche Mengen (100ng bis 100µg) F oder G Aktin zugefügt und erneut für 1h langsam gerollert (4 C). Nach der Sedimentation der Sepharo se wurde diese dreimal mit Interaktions-Puffer gewaschen. Das Sediment wurde in 25µl 2x Laemmli- Probenpuffer aufgenommen und 5 bis 10min bei 95 C e rhitzt. Die Analyse der Proben erfolgte mittels SDS-PAGE und Western Blot Dnase 1 Affinitätschromatographie Eine weiteren Möglichkeit, Aktin-bindende Proteine zu untersuchen, ist die DNase Affinitätschromatographie. DNase 1 bindet Aktin mit einer sehr hohen Affinität (K d 1.9x10-9 ) und wurde so genutzt, um Aktin und interagierende Proteine aufzureinigen (Schafer et al. 1998, Kron et al, 1992)

78 Material und Methoden 65 Zur Herstellung der DNase 1 Affinitätsmatrix wurde CNBr aktivierte Sepharose 4B (Sigma) verwendet. 500mg der voraktivierten Sepharose wurden zum Quellen in 1mM HCl inkubiert (ca.10min) und anschließend über 15min mit 100ml 1mM HCl gewaschen. Die gequollene Sepharose wurde zur Bindung der Dnase mit 3ml Liganden-Bindungs-Puffer (10mg/ml DNase1 in 0,1M NaHCO 3, 500mM NaCl, ph 8,3) versetzt. Die Kopplung erfolgte anschließend über Nacht unter Rotation bei 4 C. Nachfolgend wurde die beladene Matrix mit 25ml Bindungs-Puffer (0,1M NaHCO 3, 500mM NaCl, ph 8,3) gewaschen, um überschüssigen Liganden zu entfernen. Das Blocken noch verbliebener, aktiver Gruppen fand durch eine Inkubation mit 0,1M Tris ph 8 für 2h bei RT statt. In einem letzten Schritt wurde die Matrix abwechselnd mit 0,1M Natriumacetat ph 4, 500mM NaCl und 0,1M Tris ph 8, 500mM NaCl (vier Zyklen) gewaschen. Zur Lagerung wurde die DNase 1 Affinitätsmatrix in PBS (1,5fache Volumen der Matrix) mit 0,05% NaN 3 bei 4 C gelagert. 50µl dieser Sepharose wurden je Probe im Experiment eingesetzt und zuvor mit Fishpuffer gewaschen. Stimulierte PCNA Zellen ( ) wurden in Fishpuffer lysiert (je Probe wurden 800µg Protein eingesetzt) und für 45min mit der DNase 1 Sepharose bei 4 C gerollert. Um unspezifisch gebund ene Proteine zu entfernen, wurde anschließend zweimal mit Fischpuffer und zweimal mit Tiefsalzpuffer gewaschen. Das Sediment wurde in 30µl 1x Harn-Probenpuffer (nichtreduzierender SDS Probenouffer mit 8M Harnstoff) aufgenommen und 5 bis 10min bei 95 C erhitzt. Die Analyse der Proben erfolgte mittels SDS-PAGE und Western Blot Immunohistochemische Methoden Fixierung und Blockierung Die nach der Stimulation mit PBS gewaschen Zellen wurden durch Zugabe von Fixierlösung auf den Deckgläschen fixiert. Nach einer Inkubation von 30min bei 4 C wurden die Zellen zweimal mit kaltem PBS gewaschen. Um eine spezifische Detektion zu erhalten, wurden die Zellen für ebenfalls 30min mit Blockierlösung behandelt (4 C) Färbung Nach Inkubation mit der Blockierlösung wurden die Deckgläser einmal mit TBS-T gewaschen und mit der Zellseite nach unten in einen Tropfen (20µl) Antikörperlösung (Erstantikörper) gelegt. Die Inkubation erfolgte für 1h bei RT oder über Nacht bei 4 C in einer feuchten Kammer. Danach wurden die Deckgläschen viermal mit TBS-T

79 Material und Methoden 66 gewaschen und mit der Zellseite in einen Tropfen Zweitantikörper gelegt. Die Inkubation erfolgte im Dunkeln für 1h bei RT, da der Zweitantikörper mit einem fluoreszierenden Farbstoff gekoppelt war, der auch bei Tageslicht bleichen kann. Nach dieser Zeit wurden die Zellen fünfmal mit TBS-T und einmal mit Wasser gewaschen. Um die Zellen auf einem Objektträger zu fixieren, wurden sie in Prolong Antifade TM (für konfokale Mikrokopie) oder Mowiol (mit 1% Propylgallat) eingebettet und über Nacht bei RT gelagert. Die Färbung wurde anschließend im Fluoreszenzlicht oder unter dem Lasermikroskop bei verschiedenen Vergrößerungen betrachtet und fotografiert Messung von Stickstoffmonooxid (NO) Die Quantifizierung von NO in biologischen Systemen ist aufgrund des Radikalcharakters des Moleküls und seiner geringen physiologischen Konzentration (nanomolar) schwierig.. NO ist sehr instabil und reagiert schnell mit Sauerstoff, Peroxiden oder Proteinen. Eine ideale Methode zur NO-Bestimmung in Zellen sollte das Molekül direkt und selektiv bis in den nanomolaren Bereich bei schneller Ansprechzeit detektieren können. Es wurden hier zwei verschiedene Verfahren verwendet, um die NO Freisetzung zu messen Fluoreszenzmessung von NO in RN22 Zellen Bei dieser Methode wurde die Freisetzung des NO in Echtzeit gemessen. RN22 Zellen wurden auf Gelantine-beschichteten Deckgläschen bis zu einer Konfluenz von 30% kultiviert. Nachdem die Zellen für 4h in B18-/- inkubiert wurden, wurden sie anschließen mit dem membrangängige Fluoreszenzfarbstoff DAF-FM Diacetat beladen (30min, 10ng/µl in Meßpuffer). Der Farbstoff wurde in der Zelle durch cytosolische Esterasen hydrolysiert und ist in diesem Zustand nur leicht fluoreszierend und nicht mehr membrangängig. Wird NO gebildet, reagiert es mit dem Farbstoff, was zu einer deutlichen Zunahme der Fluoreszenz führt (Abb.1).

80 Material und Methoden 67 DAF-FM Diacetat (nicht fluoreszierend, zellpermeabel) DAF-FM Benzotriazol (fluoreszierend) Abbildung 1 Reaktionsschema des DAF-FM Diacetat Nach dem Beladen wurden die Zellen vorsichtig mit Meßpuffer gewaschen um überflüssigen Farbstoff zu entfernen. Anschließend wurden die Zellen mit Meßpuffer überschichte und unter einem Fluoreszenzmikroskop (Zeiss Axiovert 35) platziert. Nach der Stimulation mit 25nM beta-amyloid 1-40 erfolgte die Messung der Fluoreszenzveränderung bei RT und einer Anregungswellenlänge von 488 nm. Bis zu einer Stimulationszeit von 5min wurde nach jeweils 30s eine Aufnahme gemacht. Danach wurde die Fluoreszenz alle 300s fotografiert. Die Intensität der Fluoreszenz zu verschiedenen Stimulationszeiten wurde analysiert und gegen die Zeit aufgetragen Elektroanalytische NO-Bestimmung Die NO Freisetzung von RN22 Zellen nach beta-amyloid Stimulation sollte auch elektroanalytisch gemessen werden. Dazu wurde im 96well Format eine differentialpulsamperometrischen Messungen im Kombi-SECM (Scanning electrochemical microscopy) angestrebt. Dieses Experiment wurde in einer Kooperation von Frau S. Reiter aus dem Lehrstuhl für Analytische Chemie der Ruhr- Universität-Bochum durchgeführt (Dissertation S. Reiter 2005).

81 Ergebnisse Ergebnisse 3.1 Untersuchung der Beteiligung von Tyrosinkinasen bei der durch Amyloid ausgelösten Signaltransduktion über den p75 Rezeptor Es ist bereits bekannt, daß der p75 Rezeptor nach Bindung von Amyloid oder NGF in einem ersten Schritt phosphoryliert wird. Diese Phosphorylierung findet an zwei Tyrosinresten (Y337 und Y366) innerhalb der Death Domain statt und ist für den Start der nachfolgenden Signalweiterleitung verantwortlich. So konnte gezeigt werden, daß die Phosphorylierung des p75, ausgelöst durch Stimulation mit NGF oder beta-amyloid 1-42, den Ras-Mapk Signalweg aktiviert und zum Auswachsen von Neuriten in neuronalen Kulturen führt (Susen et al., 2005). Dabei scheinen die beiden Tyrosinreste unterschiedliche Aufgaben zu übernehmen. So zeigten Untersuchungen in unserer Arbeitsgruppe, daß Y366 entscheidend an der Aktivierung von Ras beteiligt ist. Im phosphorylierten Zustand ist es für die Bindung der wichtigen Adapter Proteine (Shc, Grb2 und Sos) verantwortlich. Y337 scheint hingegen eher regulative Aufgabe zu besitzen und an der Inaktivierung von Ras beteiligt zu sein (Blöchl et al., 2004) Während es gelungen ist, den Signalweg bis zur Aktivierung der Erk Kinasen aufzudecken, liegen die Ereignisse, die zur Tyrosinphosphorylierung des p75 führen noch im Dunkeln. Bisher konnte nicht geklärt werden, welchem Mechanismus die Phosphorylierung folgt, und welche Tryrosinkinasen an diesem Vorgang beteiligt sind. Dies soll im Rahmen dieser Arbeit untersucht werden. Zunächst müssen verschiedene Kinasen überprüft werden, um einen möglichen Kandidaten auszumachen. Der p75 Rezeptor besitzt keine intrinische Kinase Aktivität und könnte somit sowohl von einer Rezeptor-Tyrosinkinase, als auch von einer Nicht- Rezeptor-Tyrosinkinase phosphoryliert werden. Der Focus wird hierbei auf Nicht- Rezeptor-Tyrosinkinasen gelegt, da diese für funktionelle Interaktionen mit p75 ähnlichen Rezeptoren bereits bekannt sind. So werden drei verschieden Kandidaten getestet (Janus Kinasen, c-abl und Src Kinasen) die, im Vergleich zu den vom p75 angesprochen Signalwegen, in ähnlichen Abläufen eine Rolle spielen.

82 Ergebnisse Untersuchung zur Beteiligung der c-abl Kinase an der Phosphorylierung des p75 c-abl (145kDa) ist eine Nicht-Rezetor-Tyrosinkinase, die in der Zelle weitverbreitet vorkommt (Kern, Zytoplasma, Mitrochondrien, und ER) und mit einer Vielzahl von Proteinen interagiert. Es konnte gezeigt werden, daß diese Kinasen an der Regulation des Zellzykluses, des Zellwachstums und der Differenzierung, sowie dem Überleben und der Antwort auf oxidativen Stress beteiligt sind. Außerdem interagieren sie mit Zytoskelettproteinen und haben so Einfluß auf die Zellmigration (Herna ndez et al., 2004). Auch konnte ihre Beteiligung an durch Wachstumsfaktoren ausgelösten Signalwegen gezeigt werden (Plattner et al. 2004). Da kein kommerzieller Inhibitor für c-abl vorhanden war, wird überprüft, ob eine Interaktion des p75 Rezeptor und c-abl nachzuweisen ist. Hierzu werden PCNA Zellen in Kulturschalen ausgesät und nach 3 Tagen für 4h in serumfreiem Medium kultiviert. Die Stimulation erfolgt über 0, 1, 2.5, 5 und 7.5min mit 25nM aggregiertem beta-amyloid Anschließend werden die Zellen lyisert und je 800µg für eine Immonupräzipitätion mit MC192 verwendet. Zur Kontrolle des c-abl Expressionslevels wird von den Lysaten je 15µg Protein verwendet. Nach dem Transfer auf Nitrocellulose Membran erfolgt die Detektion mittels eines c-abl spezifischen Antikörpers. Abbildung Blot zur Untersuchung der Beteiligung von c-abl and der Phosphorylierung des p75 Gezeigt ist der Blot einer 12%igen SDS-PAGE einer Immunopräzipitation (IP) mit dem p75 Antikörper MC192 als Köder. Die Detektion erfolgt mittels eines c-abl spezifischen Antikörpers. Die Zellen werden vor der Lyse für 0, 1, 2.5, 5 und 7.5min mit 25nM beta-amyloid stimuliert. In den erstes 5 Reihen sind die Lysatproben, in den letzten fünf Reihen die Proben der IP zu sehen. Die Abbildung zeigt das Ergebnis einer repräsentativen Immunopräzipitation. Gut zu erkennen ist die c-abl Bande bei ca. 145kDa in den Lysaten (ersten fünf

83 Ergebnisse 70 Reihen). Die Expression verändert sich nicht im Laufe der Stimulation. Bei den IP Proben (letzten fünf Reihen) ist keine Bande auf dieser Höhe zu erkennen. Somit konnte mittels IP keine Interaktion zwischen der c-abl Kinase und dem p75 Rezeptor gezeigt werden. Die Bande bei ca. 50kDa beruht auf der Detektion der schweren Antikörper-Kette. Die Analyse der p75 Detektion (Daten nicht gezeigt) ergab, daß bei der IP ausreichende Mengen p75 Rezeptor präzipitiert werden Analyse einer möglichen Beteiligung der Janus Kinasen an der Phosphorylierung des p75 mittels Analyse der Ras und MapK Aktivität Die Tyrosinkinasen der Januskinase Familie (JAK) spielen eine entscheidende Rolle bei der durch Cytokine ausgelösten Signaltransduktion. Cytokinrezeptoren weisen keine intrinsische Kinase Aktivität auf, sondern rekrutieren JAK Kinasen um die Signale weiterzuleiten (O Shea et al., 2002). Da auch der p75 Rezeptor keine intrazelluläre Kinase Aktivität besitzt, und zu den Cytokinrezeptoren zählt, wäre es denkbar, daß er in ähnlicher Weise mit den JAK Kinasen interagiert. Um dies zu überprüfen, wird eine Stimulationsstudie durchgeführt. Im Vorfeld wird bereits gezeigt, das die Stimulation des p75lntr mit 25nM beta-amyloid 1-42 oder 100ng/ml NGF zur Aktivierung der MapK (hauptsächlich über die RafK-Kaskade) führt (Susen et al., 1999). Da der erste Schritt dieser Kaskade, die Aktivierung von Ras von der Tyrosinphosphorylierung des p75 abhängig ist, sollte keine Ras Aktivierung und darauffolgend auch keine MapK Aktivitätsänderung bei dephosphoryliertem Rezeptor stattfinden. Um den Effekt der Inhibition der JAK Kinasen zu untersuchen, wird der kommerzielle Inhibitor AG490 (inhibiert JAK1, JAK2 und JAK3) verwendet. PCNA Zellen werden in Kulturschalen angezogen und 4h vor dem Experiment mit B18-/- Medium inkubiert. Vor der Stimulation werden sie entweder ohne Inhibitor oder mit 50µM AG490 für 30min behandelt. Anschließend erfolgt eine Stimulation mit 25nM beta-amyloid 1-42 über 0, 2 und 5min. Nach Lyse der Zellen wird ein Ras- Pulldown durchgeführt. Die Proben werden auf ein 12%iges reduziertes SDS-Gel gegeben und nachfolgend auf Nitrocellulosemembran transferiert. Die Detektion

84 Ergebnisse 71 erfolgt mittels eines pan-ras Antikörpers. Zur Kontrolle des Gesamt-Ras Levels in den Zellen, werden je 15µg von den Lysaten nach SDS-PAGE und Blot mittels pan- Ras Antikörpers analysiert. Abbildung Repräsentativer Blot zur Untersuchung des Einflusses der Inhibiton der JAK Kinasen auf die ligandeninduzierte Ras Aktivierung PCNA Zellen werden mit 25nM beta-amyloid 1-42 für die angegebenen Zeiten stimuliert und wie angegeben zuvor mit (+) oder ohne (-) 50µM AG490 inkubiert. Das aktivierte Ras wird mittels RBD- GST als Köder präzipitiert (PD: RBD). Die Präzipitate (obere Blot Reihe) und die Lysate (untere Blot Reihe) werden mittels SDS-PAGE aufgetrennt. Die Detektion erfolgt nach dem Transfer auf Nitrocellulose durch einen pan-ras Antikörper. Abbildung zeigt den Einfluß der Inhibition der JAK Kinasen auf die durch beta-amyloid über den p75 ausgelöste Ras Aktivierung. Findet vor der Stimulation keine Inkubation mit dem Inhibitor statt, ist ein deutlicher Anstieg der Ras Aktivität nach 2min und auch nach 5min zu erkennen. Die Inhibition der JAK Kinasen durch AG490 ändert diesen Stimulationsverlauf nicht. Auch hier kann eine Erhöhung der Ras Aktivität nach 2 bzw. 5min Stimulation analog zu ersten Fall beobachtet werden. Die Analyse des Gesamt-Ras zeigt, das diese Effekte nicht auf unterschiedliche Proteinmengen zurückzuführen sind. Die Inhibition der JAK Kinasen hat demnach keinen Einfluß auf die ligandeninduzierte Ras Aktivierung über den p75 Rezeptor. Zur Vollständigkeit wird auch der nachfolgende Schritt im Ras Signalweg, die Aktivierung der MapK, untersucht. Für die quantitative Bestimmung der phosphorylierten Form der p42/p44 MapK (der aktiven Form) werden PCNA Zellen in Kulturschalen ausgesät und nach 3 Tagen für 4h in serumfreiem Medium kultiviert. Danach wird ein Teil der Zellen für 30min mit AG490 (50µM) inkubiert. Als Kontrolle werden Zellen ohne Zugabe von Inhibitor stimuliert. Die Stimulation erfolgt über 0,

85 Ergebnisse , 5, 7.5, 10 und 15min mit 25nM beta-amyloid Von den Lysaten werden je 15µg Protein nach elektrophoretrischer Trennung und Transfer auf Nitrozellulose mit einem phosphospezifischen MapK Antikörper analysiert. Um auszuschließen, daß eine Intensitätsänderung auf eine unterschiedliche Proteinmenge zurückzuführen ist, wird der Blot mit einem Tubulin-spezifischen Antikörper redetektiert. Abbildung Repräsentativer Blot zur Untersuchung des Einflußes von JAK Kinase Inhibitoren auf die MAPK-Phosphorylierung infolge einer beta Amyloid 1-42 Stimulation Gezeigt ist der Blot eines 12%igen SDS-Gels mit je 15µg Protein pro Tasche. Die Detektion erfolgt mittels eines Phospho-MAPK spezifischen Antikörpers. Die Zellen werden 30min vor der Lyse mit AG490 (JAK Inhibitor) behandelt und für 0, 2.5, 5, 7.5, 10 und 15min mit 25nM beta Amyloid 1-42 stimuliert.. In Abbildung ist die repräsentative Detektion der Phospho-MapK in stimulierten Zellen gezeigt. Gut zu erkennen sind die beiden Banden der Phospho- MapK p42 oder Erk2 (bei 42kDa) und p44 oder Erk1 (bei 44kDa). Allgemein ist zu sehen, daß die beiden Isoformen ein fast identisches Stimulationsverhalten zeigen. Die ersten sechs Proben zeigen den Stimulationsverlauf bei Zellen, die nicht mit dem einem Inhibitor behandelt wurden. Die Zunahme der phosphorylierten Spezies beginnt nach 2,5min und hat nach einer 10minütigen Stimulation ihren Höhepunkt erreicht. Danach ist ein Abfall des Signals zu beobachten. In den letzten sechs Reihen ist der Verlauf mit Zugabe von JAK Kinase Inhibitor zu sehen. Im Vergleich zur Stimulation ohne Inhibitor ist hier kein Unterschied zu erkennen. Da die Inhibition der Janus Kinasen keinen Einfluß auf die durch den p75 Rezeptor ausgelöste Aktivierung von Ras oder MapK zeigt, kann davon ausgegangen werden, daß die JAK Kinasen in der Phosphorylierung des Rezeptors keine Rolle spielen.

86 Ergebnisse Rolle der Src Kinasen bei der Signaltransduktion des p75 Einer der vielversprechendsten Kandidaten für die Phosphorylierung des p75 sind Mitglieder der Src Kinase Familie (Src Kinasen). Es konnte gezeigt werden, das diese Nicht-Rezeptor Tyrosinkinasen mit einer Vielzahl von Rezeptoren interagieren und zelluläre Prozesse wie Migration, Neuritenwachstum und Überleben modulieren können (Parsons et al., 2004). Des weiteren ist bekannt, daß Src Kinasen durch die Multimerisierung von Rezeptoren aktiviert werden können und diese Rezeptoren, sowie interagierend Proteine anschließend phosphorylieren (Bormann et al., 2004). Für den Tumor Necrosis Factor (TNF) Rezeptor, der zur selben Familie wie der p75 Rezeptor gehört, konnte bereits eine Interaktion mit Src Kinasen gezeigt werden (Narita et al., 2005) p75 abhängige Ras Aktivierung kann durch PP2 blockiert werden Die Tyrosinphosphorylierung des p75 Rezeptors ist notwendig, um nach Stimulation mit NGF oder beta-amyloid 1-42 eine Aktivierung des Ras-MapK Signalweges zu erhalten (Blöchel et al., 2004). Sollten Src Kinasen an dieser Phosphorylierung beteiligt sein, müßte diese p75-abhängige Ras Aktivierung durch den Src Kinase Inhibitor PP2 unterdrückt werden können. Dieser Inhibitor blockiert die Aktivität aller Src Kinasen, indem er mit ATP um die Bindung an die Kinase konkuriiert, und so das Übertragen einer Phosphogruppe auf ein Substrat verhindert. Die Untersuchungen werden wie die Vorherigen in PCNA Zellen durchgeführt. Diese werden vor der Stimulation mit unterschiedlichen Konzentrationen von PP2 Inhibitor oder dem inaktiven Analogon PP3 für 30min inkubiert. Anschließend erfolgt eine Stimulation mit 100ng/ml NGF oder 25nM beta-amyloid 1-42 über 0, 2 und 5min. Nach der Lyse der Zellen wird ein Ras-Pulldown durchgeführt. Die Proben werden auf ein 12%iges reduziertes SDS-Gel gegeben und nachfolgend auf Nitrocellulosemembran transferiert. Die Detektion erfolgt mittels eines pan-ras Antikörpers. Zur Kontrolle des Gesamt-Ras Levels in der Zellen, werden je 15µg von den Lysaten nach SDS-PAGE und Blot mittels pan-ras Antikörpers analysiert.

87 Ergebnisse 74 Abbildung Ras Aktivierung über den p75 kann durch PP2 inhibiert werden PCNA Zellen werden mit NGF (A, 100ng/ml) oder beta-amyloid 1-42 (B, 25nM) für die angegebenen Zeiten stimuliert und wie angegeben zuvor mit (+) oder ohne (-) PP2 oder PP3 behandelt. Das aktivierte Ras wird mittels RBD-GST als Köder präzipitiert (PD: RBD). Die Präzipitate (obere Blot Reihe) und die Lysate (untere Blot Reihe) werden mittels SDS-PAGE aufgetrennt. Die Detektion erfolgt nach dem Transfer auf Nitrocellulose durch einen pan-ras Antikörper. Die darüber angebrachten Histogramme zeigen die Mittelwerte (Fehlerbalken entsprechen SEM) von bis zu sechs (wie angegeben) densitometrisch ausgewerteten Experimenten (TINA) Der untere Teil der Abbildung zeigt repräsentative Blots durchgeführter Ras-Pulldown Experimente und den Einfluß der Inhibition von Src Kinasen auf die p75-abhängige Ras Aktivität. Deutlich ist zu erkennen, daß Ras nach einer Stimulation von 2min mit NGF (A) oder beta-amyloid 1-42 (B) aktiviert wird, und daß die Aktivität auch nach 5 minütiger Stimulation noch vorhanden ist. Die Gabe von 100nM PP2 vor einer Stimulation ist ausreichend, um diesen Stimulationseffekt (für NGF und beta-amyloid 1-42 ) zu unterbinden. Sowohl in A als auch in B ist kein deutlicher Anstieg in der Ras Aktivität zu erkennen. Wird die Konzentration des Inhibitors erhöht (500nM), verringert sich das Basallevel an aktivem Ras. Um zu zeigen, daß dieser Effekt des Src Kinase Inhibitors PP2 spezifisch ist, werden Zellen auch mit dem inaktiven Analogon PP3 (500nM) behandelt. Eine Inkubation hatte keinen Einfluß auf die Ras Aktivierung nach Stimulation des p75. Dies ist auch im Histogramm zu erkennen. Die darüberliegende graphische Darstellung der

88 Ergebnisse 75 Mittelwerte von mehreren verschieden Experimenten verdeutlich den Sachverhalt noch weiter. So steigt bei einer NGF Stimulation (A) die Ras Aktivität im Mittel um 120% (+/- 50%) bei 2min und um 150% (+/-70%) bei 5min an. Trotz der relativ großen Fehlerspanne ist dieser Anstieg signifikant. Werden die Zellen vor der Stimulation mit 100nM PP2 Inhibitor behandelt, fand nach 2min eine Aktivierung um 50% (+/-50%) und nach 5min um 100% (+/-80%) statt. Zusammen mit der Variabilität des Nullwertes sind dies keine signifikanten Änderungen der Ras Aktivität. Ähnliche Beobachtungen werden bei einer Gabe von 500nM PP2 gemacht. Außerdem wird hierbei der Basallevel an aktivem Ras im Durchschnitt um 70% gesenkt. Die Inkubation mit PP2 hat auch Auswirkungen auf die p75-abhängige Ras Aktivierung nach beta-amyloid 1-42 Stimulation (B). Ohne Inhibition der Src Kinasen steigt die Ras Aktivität nach 2 minütiger Stimulation um 120% (+/-50%) an. Nach 5min ist sie um 170% (+/-35%) angestiegen. Auch diese Steigerung ist signifikant. Eine Inkubation mit 100nM PP2 verändert diese Situation. Während der Basallevel vergleichbar ist, findet hier bei einer Stimulation von 2min oder 5min kein Anstieg (bei 2min Anstieg um 20% bei +/-20%) statt. Wird die Konzentration des Inhibitors auf 500nM erhöht, verringert sich die Basalaktivität analog zur NGF Stimulation um 70%. Hier kann keine stimulationsanhängige Aktivierung von Ras beobachtet werden. 100nM PP2 sind ausreichend, um die stimulationsabhängige Ras Aktivierung ausgelöst durch NGF oder beta-amyloid 1-42 zu inhibieren. Des Weiteren scheint der Basallevel an aktivem Ras von der Aktivität der Src Kinasen abzuhängen MapK (Erk1/Erk2) Aktivierung über den p75 Rezeptor wird durch PP2 abgeschwächt Da die p75 vermittelte Ras Aktivierung zu einer Aktivierung der MapK Erk1 und Erk2 führt (Susen et al., 1999), wird im Folgenden untersucht, ob dies auch mit der Aktivität der Src Kinasen korreliert werden kann. Zur Bestimmung der phosphorylierten (aktiven) Form der MapK Erk1/Erk2 werden PCNA Zellen in Kulturschalen ausgesät und nach 3 Tagen für 4h in serumfreiem Medium kultiviert. Danach wird ein Teil der Zellen für 30min mit verschiedenen Konzentrationen PP2 oder PP3 Inhibitor inkubiert. Als Kontrolle werden Zellen ohne Zugabe von Inhibitoren stimuliert. Die Stimulation erfolgt über 0, 5, 7.5 und 15min mit 25nM beta-amyloid 1-42 oder 100ng/ml NGF. Von den Lysaten werden je 15µg Protein

89 Ergebnisse 76 auf eine SDS-PAGE aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Nach dem Transfer auf Nitrocellulose Membran erfolgt die Detektion mittels eines Phospho- MapK (perk1/perk2) spezifischen Antikörpers. Um auszuschließen, daß eine Intensitätsänderung auf eine unterschiedliche Proteinmenge zurückzuführen ist, wird der Blot mit einem Antikörper gegen Erk1/Erk2 redetektiert. Abbildung Stimulationsabhängige Aktivierung von Erk1/Erk2 über den p75 Rezeptor kann durch PP2 inhibiert werden Gezeigt ist der Blot eines 12%igen SDS-Gels mit je 15µg Protein pro Tasche. PCNA Zellen werden mit NGF (100ng/ml) oder beta-amyloid 1-42 (25nM) für die angegebenen Zeiten stimuliert und wie angezeigt zuvor mit PP2 oder PP3 behandelt. Die Detektion erfolgt mittels eines Phospho-Erk1/2 spezifischen Antikörpers. Um die aufgetragenen Proteinmenge zu überprüfen, wird der Blot abschließend mit einem Erk1/2 Antikörper redetektiert. In Abbildung ist die repräsentative Detektion der MapK perk1 und perk2 in stimulierten Zellen gezeigt. Gut zu erkennen sind die beiden Banden der Kinasen perk2 (bei 42kDa) und perk1 (bei 44kDa) und der fast identische Stimulationsverlauf der beiden Isoformen. Im unstimulierten Zustand liegt meist nur Erk2 phosphoryliert vor. Wird der p75 mit NGF oder beta-amyloid 1-42 stimuliert, erfolgt eine Aktivierung von Erk1 und Erk2. Die Aktivität von beiden Isoformen erreicht nach 5min bei Amyloid Stimulation und nach 7min bei NGF Stimulation ihr Maximum. Wird über 15min stimuliert (NGF oder Amyloid), ist keine Aktivität von Erk1 oder Erk2 mehr vorhanden. Werden die Zellen zuvor mit PP2 Inhibitor behandelt, wird sowohl der Basallevel der Isoformen als auch die Aktivitätslevel erniedrigt. Es sind jedoch mindestens 500nM PP2 notwendig, um die Aktivierung der MapK Erk1/Erk2 durch Stimulation zu blockieren. Die Gabe von 500nM PP3 resultiert in einer Aktivierung analog zu der Stimulation ohne PP2. Durch die Detektion der Gesamtmengen an

90 Ergebnisse 77 Um diese Ergebnisse weiter zu verdeutlichen, werden mehrere unabhängige Stimulationsexperimente durchgeführt und densitometrisch ausgewertet. Das Ergebnis ist in Abbildung dargestellt. A Aa B Abbildung Graphische Darstellung der densitometrischen Auswertung der Phospho-MapK Detektion mit TINA Dargestellt sind die auf den Gesamtlevel an Erk1/2 und den Nullwert normierten Werte sowie der SEM (Anzahl wie angegeben) dieser Mittelwerte. Es handelt sich um eine Auftragung der relativen Zunahme der Signalintensität gegen die NGF-Stimulationszeit (A) oder die beta-amyloid-stimulationszeit (B) in Minuten. PCNA Zellen werden mit NGF (A, 100ng/ml) oder beta-amyloid 1-42 (B, 25nM) für die angegebenen Zeiten stimuliert und wie angegeben zuvor mit (+) oder ohne (-) PP2 behandelt. Die Detektion erfolgt mittels eines Phospho-Erk1/Erk2 spezifischen Antikörpers.

91 Ergebnisse 78 Auffallend ist, daß die Inhibition der Src Kinasen auf die durch NGF und die durch beta-amyloid 1-42 induzierte Aktivierung der MapK Erk1/Erk2 vergleichbare Effekte hat. Des weiteren sinkt das Level der Basalaktivität beider Isoformen mit zunehmender Konzentration an PP2 Inhibitor, und ist ab einer Konzentration von 1µM bis 50µM nicht mehr zu detektieren. Abbildung A zeigt den Stimulationsverlauf in PCNA Zellen. Infolge der NGF Stimulation steigen die Signale zunächst bis auf ein Maximum bei 5min an. Hierbei steigt die Aktivität von Erk2 auf das Doppelte, die von Erk1 auf das 8,5fache. Nach 15 minütiger Stimulation ist der Level der aktivierten MapK wieder auf den Anfangswert zurückgefallen. Eine Inkubation mit 100nM PP2 führt dazu, daß die Aktivität der Erk1 um das 3fache (+/-50%) und die von Erk2 um das 2,4 fache zunimmt. Nach 15min Stimulation ist der Level der anfänglichen Aktivität erreicht. Werden PP2 Konzentrationen von mehr als 500nM eingesetzt, kann die stimulationsabhängige Aktivierung von Erk1 und Erk2 über den p75 vollständig blockiert werden. Abbildung B zeigt die Erk1/Erk2 Aktivierung infolge einer beta-amyloid 1-42 Stimulation. Hier erreichen beide Isoformen die maximale Aktivität nach 7min, wobei die Aktivität von Erk2 um das Doppelte, die von Erk1 um das Vierfache ansteigt. Nach Inkubation mit 100nM PP2 verringert sich der Anstieg auf das 1,2fache bei Erk2 und das 1,7fache bei Erk1 (im Vergleich zum unbehandelten Nullwert) und die Streuung der Ergebnisse nimmt zu. Werden Zellen mit 500nM PP2 inkubiert, wiesen die Experimente eine hohe Variabilität auf (hoher SEM-Wert). Bei einigen Versuchen konnte so noch eine geringe stimulationsabhängige Aktivierung der MapK detektiert werde, wohingegen bei anderen keine Aktivierung zu finden war. Erst wenn Konzentrationen von 1µM und mehr verwendet werden, wird die p75 vermittelte Aktivierung der MapK Erk1/Erk2 vollständig blockiert. Nach Literaturangaben (lit Hanke, Gardner1996) wirken sich die hier eingesetzten, sehr hohen Inhibitor Konzentrationen, ausschließlich auf Src Kinasen aus Kopräzipitation von Src Kinasen und p75 nach Kreuzvernetzung ( Crosslinking ) Da die Inhibition der Src Kinasen auch die Signalweiterleitung über den p75 verhindert, liegt es nahe eine mögliche Interaktion zwischen dem p75 und Src

92 Ergebnisse 79 Kinasen zu untersuchen. Nur wenn die Kinasen in der zellulären Umgebung des Rezeptors anzutreffen sind, wäre es ihnen möglich, den Rezeptor nach Ligandenbindung zu phosphorylieren. Da bekannt ist, dass die Interaktion zwischen Src Kinasen und verschiedenen Rezeptoren oftmals transienten oder schwachen Charakter hat (Thomas et al., 1997), wurde vor der Immunopräzipitation ein intrazelluläres Crosslinking mit DSP (2mM) durchgeführt. DSP vernetzt primäre Aminogruppen chemisch und konserviert somit auch kurzzeitige Interaktionen zwischen Proteinen (Luttrell et al., 1999). Das Experiment wird in zwei verschieden Zelllinien durchgeführt. Während RN22 Zellen den p75 in geringem Maße zellzyklusabhängig endogen exprimieren, erfolgt die Expression in PCNA Zellen unter der Kontrolle eines CMV Promotors (hoher Expressionslevel). Dies könnte einen entscheidenden Einfluß auf die Signaltransduktion haben und es muß zunächst überprüft werden, ob die Zellinien ähnlich auf Stimulation reagieren. Der Vorteil der PCNA Zellen liegt im hohen Expressionslevel des p75. Bei der Stimulation auftretende Ereignisse können so einfacher untersucht werden, da sie öfter vorkommen. Auch ist der p75 kein Fremdkörper in diesen Zellen, da die Mutterzellinie ihn in geringen Mengen exprimiert. Weder RN22 noch PCNA Zellen exprimieren den TrkA Rezeptor. Dies ist wichtig, da dieser mit dem p75 interagieren und dessen Signaltransduktion verändern kann. So erhaltene Ergebnisse wären damit nicht eindeutig auf einen Rezeptortyp zurück zuführen. Die Zellinien werden für mehrere Tage in Schalen kultiviert und vor der Stimulation für 4h in B18-/- Medium angezogen. Die Stimulation erfolgt für 0, 2, 5, 7 und 15min mit 25nM beta-amyloid Anschließend werden die Zellen auf Eis gewaschen, unter vorsichtigem Schütteln für 30min mit 2mM DSP bei RT inkubiert und darauf folgend lysiert. Um zu überprüfen, ob eine Interaktion auch ohne Crosslinking zu erkennen ist, wird ein Teil der für 5min stimulierten Zellen nicht mit DSP behandelt. Nach der Lyse werden 800µg Protein je Probe für eine Immunopräzipitation mit dem p75 Antikörper MC192 als Köder genutzt. Nach der Elektrophorese und anschließendem Immunoblot wurde mit einem pan-src Antikörper detektiert. Um die Qualität der Immunopräzipitation zu überprüfen, wurde der Blot mit einem spezifischen p75 Antikörper redetekiert.

93 Ergebnisse 80 Abbildung Repräsentativer Blot einer Kopräzipitation von p75 und Src Kinasen nach chemischem Crosslinking mit DSP infolge einer beta-amyloid 1-42 Stimulation Gezeigt ist der Blot eines 15%igen SDS-Gels einer IP mit p75 Antikörper (MC192) als Köder und 800µg Protein. Stimuliert wird nach Crosslinking (+) mit 2mM DSP (30min, RT) in RN22 Zellen (A) und in PCNA Zellen (B) für 0, 2, 5, 7 und 15min mit 25nM beta-amyloid Außerdem erfolgt die IP von einem Teil der für 5min stimulierten Zellen ohne (-) vorheriges Crosslinking. Detektiert wird mit einem pan-src Antikörper und zur Kontrolle der IP mit einem p75 spezifischen Antikörper (Santa Cruz). Abbildung zeigt repräsentative Immunopräzipitationen in RN22 (A) und PCNA (B) Zellen. Der jeweils obere Teil zeigt die Detektion mit Src Antikörper, der untere die Redetektion mit p75 Antikörper. Sowohl in A als auch in B detektiert der Src Antikörper (erkennt alle Mitglieder der Src-Kinase Familie) mindestens zwei Banden im Bereich von 60kDa. In PCNA Zellen (B), die einen sehr viel p75 exprimieren, kann eine der Src Kinasen sowohl in der unstimulierten Probe, als auch in den stimulierten Proben detektiert werden. Sie scheint in diesen Zellen permanent mit dem Rezeptors assoziiert zu sein. Die Kopräzipitation der zweiten Kinase scheint kontinuierlich zuzunehmen. Des Weiteren können in PCNA Zellen auch ohne Crosslinking Src Kinasen mit dem p75 kopräzipitiert werden. RN22 Zellen (A) exprimieren den p75 Rezeptor endogen in einem geringen Level. In diesen Zellen konnten Src Kinasen erst nach einer Stimulation von mindestens 2 Minuten mit dem Rezeptor kopräzipitiert werden. Wird kein Crosslinking