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1 γ-h2ax Foci Induktion in Lymphocten des peripheren Bluts von Tumorpatienten: in vivo und in vitro Interaktion von Cisplatin mit Doppelstrangbruch-Signalen ionisierender Strahlen A. Sak, S. Grehl, M. Engelhard, A. Wierlemann, HP. Kaelberlah, P. Erichsen, C. Pöttgen, M. Groneberg, M. Stuschke Universitätsklinikum Essen, Strahlentherapie

2 Material und Methodik: Insgesamt wurden 28 Tumorpatienten mit intra-thorakalen-, Becken- und Kopf- Hals-Tumoren, die einer simultanen Radio-Chemotherapie mit Cisplatin unterzogen wurden, in die Studie einbezogen. Peripheres Blut wurde den Patienten vor Cisplatin-Gabe und verschiedene Zeiten nach Cisplatin (1h, 1-7 Tage) sowie jeweils vor und nach der täglichen Bestrahlungsfraktion entnommen. Für die in vitro Exposition von Lymphozyten mit Cisplatin und ionisierender Strahlung wurde peripheres Blut von Patienten, die weder Cisplatin noch Bestrahlung in den letzten Wochen erhalten haben, verwendet. Der Effekt von Cisplatin auf die Induktion von g-h2ax-foci nach Bestrahlung, als ein Maß für die Induktion von DSB, wurde gemessen. Zusätzlich wurde die Apoptoserate nach in vitro und in vivo Behandlung mit Cisplatin und in vitro Bestrahlung bestimmt.

3 Cisplatin reduziert die γ-h2ax Foci sowohl nach in vitro und in vivo Behandlung A B C Abbildung 1: Interaktion von Cisplatin und ioniserenden Strahlen auf die Induktion von γ-h2ax Foci. A: Induktion von γ-h2ax Foci 30 min nach Bestahlung als Maß für die Induktion von DSB. Lymphozyten wurden für 1 h mit Cisplatin behandelt, mit 1 Gy bestrahlt und 30 min später für die γ- H2AX Foci Bestimmung. Links oben: Lymphozyten mit g-h2ax Foci B: Lymphozyten wurden unterschiedliche Zeiten nach Behandlung der Patienten mit Cisplatin isoliert, in vitro mit 0 Gy, 0.1 Gy, 0.25 Gy, 0.5 Gy und 1 Gy bestrahlt und die Steilheit der Induktionskurven mit und ohne Cisplatin bestimmt. Blau: Patienten mit Cisplatin Monotherapie, Grün: Patienten mit Cisplatin-Navelbine Therapie, Rot: Patienten mit Cisplatin-Etoposid Therapie.

4 Cisplatin steigert additiv die Apoptose von Lymphozyten nach Bestrahlung A B C H2AX Apoptose Abbildung 2: Einfluss von Cisplatin auf die Apoptose nach Bestrahlung. A: Rückbildung von γ-h2ax Foci, als Maß für die DSB-Reparatur (grün), sowie apoptotische Zellen (rot). Rechts ist ein Ausschnitt mit apoptotischen Zellen. Apoptose wurde anhand starker Färbung mit γ-h2ax (grün) ermittelt. B: Die Lymphozyten von unbestrahlten Patienten wurden isoliert und in vitro für 1h mit Cisplatin behandelt, in vitro bestrahlt und die Apoptose 24 h nach Bestrahlung ermittelt. C: Lymphozyten wurden unterschiedliche Zeiten nach Behandlung der Patienten mit Cisplatin isoliert in vitro bestrahlt und 24h nach Bestrahlung die Apoptose bestimmt. Schwarze Dreiecke: 0 Gy, Rote Kästchen: 4 Gy, Schwarze Kästchen: 10 Gy. Apoptose wurde anhand starker gleichmäßiger Färbung mit H2AX (grün) ermittelt.

5 Zusammenfassung: Die Entwicklung des γ-h2ax Signals (Fociausprägung) tritt verzögert ein und hat ein Maximum bei etwa 30 min nach Bestrahlung. Danach nimmt es kontunierlich ab. Die Anzahl γ-h2ax Foci zeigt eine lineare Abhängigkeit von der Bestrahlungsdosis nach in vitro und auch von der mittleren in vivo Ganzkörperdosis. Behandlung von Patienten mit Cisplatin führte zu einer signifikanten Reduktion von Strahlen induzierten γ-h2ax Foci in Lymphozyten sowohl nach in vitro und nach in vivo Bestrahlung um etwa 35% (p<0.0001). Dieser Effekt von Cisplatin blieb bis zu 6 Tage nach Behandlung signifikant. Die Behandlung mit Cisplatin führte zu einer additiven Erhöhung der Apoptoserate von Lymphozyten. Die Konzentrationsabhängigkeit und die Dauer der Cisplatin-Wirkung spiegelten sich auch auf dem Apoptoseendpunkt wieder. Schlussfolgerung: Cisplatin führt zu lang andauernde Interaktion mit dem frühen Signalmechanismus der Induktion von γ-h2ax Foci nach Bestrahlung. Diese Interaktion ist aber nicht durch eine Änderung der tatsächlichen Induktion von DSB bedingt, noch hat Sie eine beeinträchtigte Wiederverknüpfung von DSB im Gelektrophorese-Test zur Folge. Die gestörte γ-h2ax Foci Bildung nach Cisplatin kann jedoch weitere durch Strahlen induzierte Signalmechanismen (homologe Rekombination, Zellzyklusblockade) beeinflussen, die in Tumorzellen eine wichtige Bedeutung für das Überleben nach Bestrahlung haben. Sak et al. 2009, Clin Cancer Res, 15,

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