Claudia E. Rübe. Department of Radiation Oncology Saarland University Homburg/Saar, Germany

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1 Claudia E. Rübe Department of Radiation Oncology Saarland University Homburg/Saar, Germany

2 LERNZIELE Physikalische Grundlagen: Strahlenqualitäten Linearer-Energie-Transfer Tiefendosiskurve Energiedosis/ Äquivalentdosis/ Effektive Dosis Biologische Grundlagen: DNA Schäden und deren Reparatur direkter und indirekter Strahleneffekt strahleninduzierter Zelltod Dosis-Effekt-Beziehung intrinsische Strahlenempfindlichkeit Strahlenempfindlichkeit Zellzyklus Sauerstoffeffekt Fraktionierung Linear-quadratisches Modell 4 R s der Strahlentherapie Strahlenwirkung auf Normalgewebe Eigene Forschung

3 Erste diagnostische Anwendung der Röntgenstrahlung Die Hand des Anatomen Geheimrat von Kölliker aufgenommen am von W.C. Röntgen in Würzburg

4 Erste therapeutische Anwendung der Röntgenstrahlung Leopold Freund

5 Physikalische Grundlagen: Strahlenqualitäten α-strahlung: Teilchenstrahlung: Helium-Atomkerne geringe Reichweite komplette Abschirmung möglich β-strahlung: Teilchenstrahlung: β - : Elektron wird emittiert Neutron geht in ein Proton über β + : Positron wird emittiert Proton geht in ein Neutron über begrenzte, d.h. nur geringe Reichweite komplette Abschirmung möglich γ-strahlung: Elektromagnetische Strahlung (Photonen) durchdringend, hohe Reichweite Abschwächung möglich, gleichzeitige Streuung

6 Linearer-Energie-Transfer (LET) Energiedeposition pro Wegstrecke

7 Linearer-Energie-Transfer (LET) räumliche Verteilung der Energiedeposition entlang der Teilchenbahn pro Weglängeneinheit deponierte Energie Strahlenart LET (kev/µm) Co-60-γ-Strahlen 0,22 2 MeV-Elektronen 0, kv-röntgenstrahlen 1,70 H-3-β-Strahlen 4,70 50 kv-röntgenstrahlen 6,30 5,3 MeV-α-Strahlen 43,00 entlang der Teilchenbahn ist der LET nicht konstant!

8 Tiefendosiskurve Energiedeposition von Photonen: hohe Dosis im Eintrittsbereich allmähliche Abschwächung Energiedeposition von Schwerionen: niedrige Dosis im Eintrittsbereich ausgeprägtes, scharfes Maximum am Ende der Reichweite (Bragg-Peak)

9 Bestrahlung am Linearbeschleuniger low-let Bestrahlung mit Photonen und Elektronen Metall-Blöcke Multi-Leaf-Kollimator individuell angefertigt Abschirmung des gesunden Gewebes durch die individuelle Formung des Strahlenfeld integriertes System elektr. gesteuerter Metall-Lamellen

10 Bestrahlung am Linearbeschleuniger Mehrfeldertechnik optimale Anpassung des Bestrahlungsvolumens an das Tumorvolumen Schonung des Normalgewebes Dosiseskalation im Tumorgewebe

11 Heidelberger Ionenstrahl-Therapiezentrum (HIT) Ionentherapie-Anlage mit Intensitätsmoduliertem Rasterscan-Verfahren: Bestrahlung mit Protonen und Schwerionen (Kohlenstoff, Sauerstoff und Helium) Bragg-Peak-Bestrahlung: Der Tumor wird höchstpräzise bestrahlt, und das umgebende gesunde Gewebe wird optimal geschont. ca. 10% der Krebspatienten leiden an Tumoren, die tief im Körper liegen, extrem widerstandsfähig gegenüber herkömmlicher Bestrahlung sind, von hoch strahlenempfindlichem gesunden Gewebe umschlossen werden (Sehnerv, Hirnstamm, Rückenmark oder Darm)

12 Relative biologische Wirksamkeit (RBW) Die gleiche physikalische Strahlendosis kann bei verschiedenen Strahlenarten unterschiedliche biologische Wirksamkeit entfalten. unterschiedliche Wirksamkeit verschiedener Strahlenarten dimensionsloser Wichtungsfaktor Äquivalentdosis = Energiedosis Faktor 1J 1 Sv ( Sievert) = ( Joule) 1kg Maßeinheit: Wichtungsfaktor Strahlungsart 20 α-strahlung 1 β-strahlung 1 γ-strahlung 10 n-strahlung

13 Definition der Dosis Energiedosis Einheit: Gray (Gy) gibt die durch Strahlung auf das Gewebe übertragene Energie an Äquivalentdosis Einheit: Sievert (Sv) wichtet die Energiedosis anhand der biologischen Wirksamkeit der Strahlenart Effektive Dosis Einheit: Sievert (Sv) wichtet die Äquivalentdosis anhand der Strahlenempfindlichkeit des Gewebes

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15 Strahlenschaden: zeitlicher Verlauf

16 Biologische Grundlagen zeitlicher Verlauf des biologischen Strahlenschadens Sekunden Minuten Stunden Tage Wochen Monate Jahre Strahlen- Schaden Energiedeposition zelluläre Antwort DNA Reparatur verzög. Zellteilung Signaltransduktion Genexpression Zellfunktion/ Zellschicksal Zelltod Gewebeschädigung Früh- und Spätreaktionen Karzinogenese Die Stärke der frühen und späten Gewebsreaktionen hängt von den Eigenschaften der bestrahlten Gewebe ab, vor allem vom Zellumsatz und von der Anzahl der teilungsfähigen Stamm- und Vorläuferzellen. Genomische Instabilität Genetische Defekte

17 Zielstruktur der biologischen Strahlenwirkung Molekulare Ebene: Schäden an Molekülen Subzelluläre Ebene: Schäden an Zellorganellen Zelluläre Ebene: Zellzyklusänderungen, Zelltod, Zelltransformation (Krebs) Gewebe, Organe: Funktionsstörungen Organismus: Lebenszeitverkürzung, Tod Mutationen im Erbgut

18 Zielstruktur der biologischen Strahlenwirkung Zellkern ist Zielstruktur

19 Direkter und indirekter Strahleneffekt OH indirekter Effekt H O H e - E = h f Einfallende Strahlung Indirekter Effekt: DNA-Schaden durch strahleninduzierte Radikale 1 nm n Atomkern p + 3,4 nm direkter Effekt E = h f 0,34 nm e - n Atomkern p + Direkter Effekt: DNA-Schaden durch direkte Teilchen-Wechselwirkung

20 DNA Schäden nach Bestrahlung nach Bestrahlung mit nur 1 Gy 4000 DNA-Schäden pro Zelle: 3000 Basenschäden 1000 Einzelstrangbrüche, 40 Doppelstrangbrüche

21 DNA Doppelstrangbrüche: Auswirkung auf die Zelle Freie Radikale Replikationsvorgänge Ionisierende Strahlung Chemotherapeutika Chemikalien Antikörperbildung Meiose DSB Sensoren Effektoren Zelltod DSB-Reparatur Zellzyklusarrest

22 DNA Doppelstrangbruch Reparatur Homologe Rekombination -Matrizenvorlage: Schwesterchromatid -Fehlerfrei -späte S/G2-Phase Nicht Homologes End-Joining -End-zu-End Verknüpf. -Nicht fehlerfrei -G0/G1-Phase

23 Chromosomen-Aberrationen Fluoreszenzmikroskopie FISH-Analysen

24 Zelltod Apoptose Programmierter Selbstmord Zelle schrumpft veränderte Chromatinstruktur Zytoplasma und Kern werden fragmentiert (apoptotic bodies) Zelle wird phagozytiert Zelle verschwindet ohne Entzündung Nekrose schwere Schädigung durch externe Faktoren Zelle desintegriert Zelle schwillt an explodiert Membranen rupturieren Zytosol und Organellen Zellumgebung Entzündungsreaktion

25 Zelltod nach einer Bestrahlung Klonogener Zelltod Verlust der unbegrenzten Teilungsfähigkeit Mitosetod Chromosomenschäden führen dazu, dass nach mehreren Mitosen eine Teilung nicht mehr vollendet werden kann Interphasetod ein frühes Apoptoseprogramm führt dazu, dass die Zellen bereits vor der Mitose sterben Differenzierung aus klonogenen Zellen entstehen terminale Funktionszellen, die keine Kolonien mehr bilden

26 Intrinsischen Strahlenempfindlichkeit Dosis-Effekt-Kurve Zellüberleben in Abhängigkeit von der Bestrahlungsdosis

27 Intrinsische Strahlenempfindlichkeit Überlebensfraktion Dosis [Gy] Glioblastom HNO-Tumor Bronchial-Ca. Mamma-Ca. Glioblastom mit Reparaturdefizienz

28 Intrinsische Strahlenempfindlichkeit Seminom Gy Leukämie Nephroblastom Gy Morbus Hodgkin Non-Hodgkin-Lymphom Neuroblastom Medulloblastom Gy Ewing-Sarkom Mikroskop. Befall: PEC, Adeno-Ca Mamma-Karzinom Makroskop. Befall: Gy PEC, Adeno-Ca Mammakarzinom Prostatakarzinom Weichteilsarkom (mikroskop.) Gliobastom > 70 Gy Knochensarkom Weichteilsarkom (makroskop.) Dosis [Gy] Tumoren sind unterschiedlich strahlenempfindlich! Glioblastom mit Reparaturdefekt Glioblastom HNO-Tumor Bronchial-Ca Mamma-Ca

29 Strahlenempfindlichkeit - Tumorgröße Tumorkontrolldosis mit zunehmendem Tumorvolumen werden höhere Strahlendosen benötigt Tumorvolumen

30 Strahlenempfindlichkeit - Zellzyklus G 0 : Ruhephase (bzgl. Teilung!) Metaphasen Kontrollpunkt G 1 : Ergänzung der Zellorganellen Reparatur geschädigter DNA Ausübung spezifischer Funktionen S: Verdoppelung der DNA G 2 : Synthese des mitotischen Apparats Kontrollpunkte(Checkpoints): G 1 /S: Sind die Umweltbedingungen für die Teilung günstig? Ist die DNAintakt? G 2 : Ist die DNAVerdoppelung vollständig? Ist die DNAintakt? Metaphase: Sind alle Chromosomen in der Äquatorialplatte? Sind alle Chromatiden mit einem Pol verbunden?

31 Strahlenempfindlichkeit - Zellzyklus Strahlenempfindlichkeit einer Zelle ist abhängig von der Zellzyklusphase! Zellen in der M- und G2-Phase besonders strahlenempfindlich

32 Strahlenempfindlichkeit - Sauerstoffeffekt Strahlenempfindlichkeit einer Zelle ist abhängig vom Sauerstoffgehalt!

33 Strahlenempfindlichkeit - Tumoroxygenierung Klinische Konsequenz: Sauerstoffversorgung Im Tumor verbessern! bei Tumoranämie: HB-Wert anheben

34 Strahlenempfindlichkeit - Fraktionierung Fraktionierte Bestrahlung Schonung des Normalgewebe

35 Strahlenempfindlichkeit - Fraktionierung Bestrahlung mit Einzeldosen

36 Strahlenempfindlichkeit - Fraktionierung Fraktionierte Bestrahlung

37 Linear-Quadratisches Modell Das linearquadratische Modell ist eine Formel, mit der die biologische Wirkung von unterschiedlich fraktionierten Strahlendosen verglichen werden kann.

38 Linear-Quadratisches Modell α/β ist umso höher, je weniger die Gewebe dem Fraktionierungseffekt unterliegen, d. h. je weniger die Gefahr von Spätschäden durch Fraktionierung der Gesamtdosis reduziert werden kann α/β = 2-4 für spätreagierende Normalgewebe (Lunge, Nieren) für frühreagierende Normalgewebe (Schleimhaut, Knochenmark)

39 4 R s der Strahlentherapie - Reparatur -wichtiger Moleküle, bzw. Erholung (Recovery) von Zellen / Geweben von subletalen Strahlenschäden - Repopulierung -Proliferation klonogener Tumorzellen in Therapiepausen - Reoxygenierung -von Tumoren (Sauerstoffeffekt Anämie behandeln, Rauchen unterlassen) - Redistribution -nach Bestrahlung partielle Synchronisation der Zellzyklusverteilung, mit zunehmender Zeit verteilen sich die Zellen wieder auf alle Phasen des Zellzyklus (Recruitment: Einschleusung ruhender Zellen aus der G0-Phase in den Zellzyklus) Effektivität einer fraktionierten Strahlentherapie

40 Strahlenwirkung auf Normalgewebe Tumorkontrollrate Komplikationen therapeutische Breite

41 Dosis-Effekt-Kurven therapeutische Breite Bei 50% Risiko der Schädigung des gesunden Gewebes: Tumor 1 kann zu 75% mittels Strahlentherapie geheilt werden, Tumor 2 lediglich zu 25% strahlenresistenter Tumor

42 Strahlenwirkung auf Normalgewebe Frühreaktion 90 Tage hoch gering groß Hierarchische Organisation Normalgewebe Zellumsatz intrazelluläre Erholung Repopulationsfähigkeit Gewebetyp Spätreaktion > 90 Tage niedrig groß keine / gering Flexible Organisation

43 Strahlenwirkung auf Normalgewebe Stammmzellen Selbsterneuerung Vorläuferzellen Proliferation Funktionszellen hierarchische Organisation Früh-reagierende Organgewebe: Dünndarm, hämatopoetische System, Haut/ Schleimhaut, Gonaden (Testis, Ovar)

44 Hämatopoetisches System bei großen Bestrahlungsfeldern bei Radio-/Chemotherapie Lymphozytopenie Granulozytopenie Thrombopenie Anämie

45 Testis: Spermatogonien Schwellendosis: 100 mgy 1,5 2 Gy Sterilität DNA Repair (Amst) Feb 7;10(2):159-68

46 Strahlenwirkung auf Normalgewebe ausgereifte Funktionszellen flexible Organisation wenige Stamm-/Vorläuferzellen im Hypocampus Gehirn Hypocampus-sparende Radiotherapie Spät-reagierende Organgewebe

47 Strahlenwirkung auf Normalgewebe Fokale Radionekrose T1-MRT: RF links temporal T2-MRT: perifokales Ödem

48 Strahlenwirkung auf Normalgewebe Diffuse Leukenzephalopathie 5 Monate (a) bzw. 9 Monate (b) nach Ganzhirnbestrahlung mit 40 Gy

49 Strahlenwirkung auf Normalgewebe

50 Strahlenwirkung auf Normalgewebe Skelett Nephroblastom postoperative Radiatio mit 40 Gy Dosisverteilung

51 zum Nachlesen Autor: Thomas Herrmann Taschenbuch: 228 Seiten Verlag: Elsevier GmbH; Auflage: 4 (2. März 2006) Sprache: Deutsch ISBN-10: ISBN-13:

52 Eigene Forschung

53 DNA double strand breaks (DSBs) diagnostic procedures therapeutic procedures DSB detection methods radiation exposure 1 mgy γh2ax 10 mgy 100 mgy FISH 1 Gy 10 Gy PFGE 100 Gy 53

54 Induction and repair of radiation-induced DSBs in-vivo Dose distribution Linear accelerator (6MV photons) whole-body irradiation of repair-deficient and repair-proficient mice: 10 mgy - 10 Gy blood / tissue isolation: 0.1h 72h post-irradiation Light Microscopy Immunohistochemistry Immunofluorescence Transmission Electron Microscopy FACS analysis visualization of DNA damage foci in blood lymphocytes and normal tissues 54

55 Induction and repair of radiation-induced DSBs in-vivo Confocal images of γh2ax immunfluorescence: 10 min after 1Gy Radiation-induced foci (RIF) in the nuclei of somatic cells of different tissues 55 Int J Radiat Oncol Biol Phys Nov 15;72(4):1180-7

56 Induction and repair of radiation-induced DSBs in-vivo brain lung SCID: DNA-PKcs mutated ATM: ATM mutated Balb/c: DNA-PKcs polymorphism C57BL/6: Ø heart intestine Identification of even slight DSB repair impairments caused by single polymorphisms 56 Clin Cancer Res Oct 15;14(20):

57 Induction and repair of radiation-induced DSBs in-vivo DSB repair measured in blood lymphocytes is valid for somatic cells in different complex organs 57 Clin Cancer Res Oct 15;14(20):

58 Childhood cancer treatment unexpected serious side effects after DNA-damaging radio-/chemotherapy genetic alterations in DNA damage response increased risk of severe treatment-related normal-tissue toxicities 58

59 Childhood cancer treatment Fanconi Anemia (FANC-L subtype) congenital anomalies: growth retardation, skeletal deformities, microcephaly, microphthalmia dystopy of the kidney, endocirne abnormalities relapsing squamous cell carcinomas glossectomy with bilateral neck dissection defective DSB repair excessive accumulation of heterochromatinassociated DSBs in rapidly cycling cells 59 PLoS One Mar 17;9(3):e91319

60 Nuclear organization of chromatin chromatin modifications at sites of DNA damage recruitment of repair factors DSB processing restoration of original chromatin configurations 60 Are DSBs in tissue-specific stem cells recognized and repaired by the same repair machinery and with similar efficiency?

61 Spermatogonial Stem Cells (SSCs) protecting the heritable genome: robust DNA repair mechanisms? Chromatin remodeling during spermatogenesis Structural rearrangements phosphorylation of H2AX DNA Repair (Amst) Feb 7;10(2):159-68

62 Spermatogonial Stem Cells (SSCs) γh2ax & PLZF spermatogonial stem cells: Ø γh2ax MDC1 & PLZF DNA damage in SSCs is mediated in the absence of the transducer complex γh2ax/mdc1 Ø MDC1 53BP1 & PLZF PLZF-pos. SSCs 53BP1 in seminiferous tubules of testis at 0.5 h after irradiation DNA Repair (Amst) Feb 7;10(2):159-68

63 Spermatogonial Stem Cells (SSCs) DSB repair kinetics after irradiation with 1 Gy significant higher levels of remaining RIF in SSCs and round spermatides impaired DSB repair capacity DNA Repair (Amst) Feb 7;10(2):159-68

64 Spermatogonial Stem Cells (SSCs) different expression of DSB repair proteins in spermatogenic cells, with no germ cell type possessing the complete set compromised DSB repair efficiency increased apoptosis rate increased radiosensitivity of spermatogonial stem cells DNA Repair (Amst) Feb 7;10(2):159-68

65 Transmission electron microscopy (TEM) combined with immunogold-labeling identification and localization of DNA repair proteins within the cell nuclei of tissue samples 10 nm Electron Microscopy Secondary antibodies: electron-dense gold particles of different size TEM micrographs of a cortical neuron: Nucleus with euchromatin (electron-lucent) and heterochromatin (electron-dense) 65 Resolution 0.1 nm

66 Transmission electron microscopy (TEM) Co-localisation of p53bp1 and γ-h2ax in heterochromatic regions Co-localisation of p53bp1 and MDC1 in heterochromatic regions Repair factors forming RIF (53BP1, γh2ax, MDC1) are allocated exclusively at heterochromatic DSBs 66 DNA Repair (Amst) Apr 3;10(4):427-37

67 Transmission electron microscopy (TEM) Assembly of 53BP1 clusters occurs exclusively at heterochromatin-associated DSBs, characterized by the histone modification H3K9me3 67 DNA Repair (Amst) Apr 3;10(4):427-37

68 DSB repair in euchromatin and heterochromatin pku70 clusters consisting of 2 beads in constant distance, reflecting the two Ku70 proteins bound to double-stranded DNA Are DSBs in euchromatic and heterochromatic compartments repaired with similar efficiency? Labeling pku70 permits reliable detection of DSBs in euchromatic and heterochromatic regions 68 DNA Repair (Amst) Apr 3;10(4):427-37

69 DSB repair in euchromatin and heterochromatin 53BP1 pku70 Induction: Dose-dependent induction of pku70 clusters in euchromatin & heterochromatin 53BP1 clusters exclusively in heterochromatin Repair: Euchromatin Heterochromatin While DSBs in euchromatin are promptly sensed and rejoined, DNA packaging in heterochromatin appears to retard DSB processing. PLoS One. 2012;7(5):e38165

70 Low-LET: ultrastructural characterization of DNA damage Nucleus Euchromatin Heterochromatin pku70 clusters with 4 or 6 beads in heterochromatin at late repair times = multiple DSBs in close proximity caused by radiationinduced damage of highly-compacted DNA 70 PLoS One. 2012;7(5):e38165

71 High-LET versus Low-LET radiation High-LET Radiation: heavy ions (carbon) GSI Helmholtzinstitut Darmstadt Radiation track 71

72 High-LET: Ultrastructural characterization of DNA damage b 5h post IR 0,12 µm 0,05 µm 0,05 µm 0,06 µm 0,27 µm 0,13 µm 0,07 µm 0,27 µm 0,05 µm 0,07 µm 0,74 µm 0,93 µm 0,07 µm 0,27 µm a 0,05 µm 0,06 µm 0,08 µm 0,05 µm 0,07 µm c 0,93 µm 0,06 µm 0,11 µm 0,17 µm 0,27 µm pku70 (10nm) / γh2ax (6nm) 0,07 µm 0,12 µm 0,14 µm 0,07 µm 0,58 µm 0,12 µm 0,08 µm 0,17 µm 1,38 µm 0,07 µm 0,07µm 0,44 µm 0,12 µm 0,89 µm 1,41 µm 0,10 µm 0,07 µm 1,46 µm 0,11 µm 0,84 µm 0,08 µm 0,73 µm 0,06 µm 0,12 µm 0,10 µm 0,58 µm 0,12 µm 0,07 µm 0,12 µm 1,14 µm 0,12 µm 0,60 µm 0,07 µm 0,61 µm 0,42 µm 1,48 µm 0,83 µm 0,07 µm 0,13 µm 0,07 µm 0,60 µm 1,42 µm 0,06 µm 0,06 µm 0,07 µm 1,17 µm 0,68 µm c 1,43 µm ,20 µm 0,10 µm 0,11 µm 0,06 µm 1,9 µm 0,07 µm 1,16 µm 0,24 µm 0,80 µm 2,8 µm 0,26 µm

73 High-LET: Ultrastructural characterization of DNA damage merge 5h pku70 53BP1 24h post IR pku70-dimers ( and, 10 nm): 53BP1-Beads (6 nm):

74 Vorteile des TEM extrem hohe Auflösung (Nanometer Bereich) Nachweis der verschiedenen Reparaturfaktoren am Bruchende auf Einzelmolekül-Ebene im Kontext des Chromatins Differenzierung zw. Eu- und Heterochromatin - durch die Elektronendichte (hell/ dunkel) - spezifische Histonmarker Nachweis der zentralen Reparaturproteine des NHEJ: pku70 als Marker für einen unreparierten DSB Nachweis von SSBs (pxrcc1)/ komplexen DNA Schäden Charakterisierung des DNA Schadensmuster Differenzierung zwischen unreparierten DSBs und bleibenden Chromatinveränderungen

75 strahlenbiologische Erkenntnisse

76 Prof. Dr. Claudia Rübe Klinik für Strahlentherapie und Radioonkologie Universität des Saarlandes Tel

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