1. Studien-gestützte HPV Tests mit Zulassung durch die amerikanische Lebensmittel- und Arzneimittelbehörde FDA

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1 Liste kommerzieller HPV- Tests 1. Studien-gestützte HPV Tests mit Zulassung durch die amerikanische Lebensmittel- und Arzneimittelbehörde FDA 1.1 Digene Hybrid Capture 2 High-Risk HPV DNA Test (Qiagen) Nachweis von: 13 Hochrisiko-HPV Typen (high-risk, HR): 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 und 5 Niedrigrisiko-HPV-Typen: 6, 11, 42, 43 und 44 (low-risk, LR) Der Test weist eine Infektion von o.g. Hochrisiko- bzw. Niedrigrisiko-HPV-Typen nach. Es findet keine Typisierung der einzelnen HPV-Typen statt. Signalamplifikation Durch die Hybridisierung mit synthetischen RNA-Sonden, die komplementär zu der Genomsequenz von 13 HR (high- risk, Hochrisiko)-HPV Typen und 5 LR (low- risk, Niedrigrisiko)-HPV- Typen sind können diese 18 Typen nachgewiesen werden. Dabei laufen die Reaktionen für die Hochrisiko-HPV-Typen und die Niedrigrisiko-HPV-Typen getrennt ab. Über die Bildung spezifischer DNA-RNA-Hybride und deren Bindung an immobilisierte Antikörper kann eine Reaktion dieser Hybride mit Anti-Hybrid- Antikörpern stattfinden Diese sind mit alkalischer Phosphatase markiert. Nach der Zugabe von Dioxetansubstrat kann die relative Lichtintensität des emittierenden Lichts gemessen werden. Diese relative Lichtintensität (relative light unit, RLU) ist proportional zur vorhandenen Ziel-DNA und stellt so ein semi-quantitatives Maß der Virusmenge dar. Der klinisch definierte Schwellenwert liegt bei (Anzahl Kopien je Reaktion) abhängig vom HPV Typ. Der empfohlene Schwellenwert der FDA (Food and Drug Administration) liegt bei 1 pg HPV DNA pro 1 ml Probe (bei HPV 16: Kopien), entsprechend einem Wert relativer Lichtintensität (RLU) von 1,0. Es können bei den Hochrisiko-Proben Kreuzreaktionen mit mind. 12 anderen HPV- Typen (u.a. den Niedrigrisikotypen HPV 6 und 42) stattfinden. Der Hybrid Capture 2 High-Risk HPV DNA Test ist seit März 2003 durch die FDA U.S (Food and Drug Administration) zugelassen. Der Digene Hybrid Capture 2 ist der am längsten in Routineuntersuchungen und in größter Stückzahl eingesetzte Test, der in außerordentlich vielen Querschnittsstudien sowie in kontrollierten randomisierten prospektiven Studien seine herausragende 1

2 Wertigkeit bewiesen hat (Arbyn et al.2006; Bulk et al.2007, Cuzick et al. 2006, Mayrand et al. 2007; Meijer et al. 2007, Ronco et al. 2006, Ronco et al. 2009). 1.2 Cervista HPV HR (Hologics) Nachweis von: Der Test weist eine Infektion von o.g. Hochrisiko-HPV-Typen nach. Es findet keine Typisierung der einzelnen HPV-Typen statt. Signalamplifikation Der Cervista HPV HR detektiert HPV DNA durch Bildung von DNA Triplex Strukturen. Diese unnatürliche Struktur, die nur bei HPV-positiven Patienten entstehen kann, wird von einem Spaltungsenzym erkannt. Das bewirkt die Ablösung der überlappenden Struktur (5 flap ). Es entstehen entsprechend der vorliegenden Menge HPV-DNA sogenannte DNA-Triplex-Strukturen und eine ebenfalls entsprechende Zahl dieser flaps. In einer zweiten, simultan verlaufenden, Reaktion generieren die abgelösten flaps mittels Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) ein fluoreszierendes Signal. Dieses Signal wird verstärkt. Zur genaueren Bestimmung, ob eine Infektion mit HPV16 und/oder 18 vorliegt kann der Cervista HPV 16/18 durchgeführt werden. Die analytische Sensitivität variiert zwischen Kopien je Reaktion, abhängig vom HPV Typ. Die Ergebnisse der 3 durchgeführten Reaktionen werden je durch einen Kontrollwert (Negativkontrolle) geteilt. Ein positives Ergebnis wird angezeigt, wenn entweder der Quotient des Höchst- und Tiefstwertes der 3 durchgeführten Reaktionen bei bzw. der Tiefstwert bei 1.93 liegt. Dabei handelt es sich um die klinisch relevante Schwelle zur Detektion von Gewebebefunden CIN 2. Eine Kreuzreaktion mit den HPV Typen 67 und 70 kann stattfinden. Cervista HPV HR sowie Cervista HPV16/18 sind seit März 2009 durch die FDA U.S (Food and Drug Administration) zugelassen. Bartholomew et al. 2011, Day et al. 2009, Einstein et al. 2010, Harvey et al. 2009, Johnson et al cobas system (Roche) 2

3 Nachweis von: Typisierung von HPV 16 und 18 Realtime-PCR Das cobas system besteht aus zwei Komponenten: der cobas x 480-Einheit für die vollautomatisierte Nukleinsäure-Aufarbeitung mit PCR-Ansatz und dem Echtzeit PCR Analysesystem cobas z 480. Mittels Amplifikation der Ziel-DNA durch Anwendung einer Realtime-PCR und Nukleinsäurenhybridisierung können in einem einzigen Schritt oben genannte HR-HPV-Typen nachgewiesen werden. Eine Realtime- PCR kann die Zahl der Amplifikationsschritte während der Synthese erfassen und deshalb einen quantitativen Nachweis liefern. Über Fluoreszenz-Marker wird anwesende HPV-DNA oben genannter 14 Hochrisiko-Typen angezeigt. Dabei gibt es einen Farbstoff für die Typen 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 und. HPV 16 und 18 werden mit gesonderten Farbstoffen angezeigt. Dieses Zweikomponentensystem läuft größtenteils automatisiert ab, wodurch unter anderem das Kontaminationsrisiko deutlich gesenkt wird. Es besteht die Möglichkeit eine Probe wahlweise auf HR-HPV und/oder HPV16, 18 zu testen. Der Schwellenwert ist für die Test-Positivität an die klinische Wertigkeit angepasst und mit dem des Hybrid Capture 2 vergleichbar. Der analytische Schwellenwert liegt jedoch, je nach HPV-Typ, bei Kopien/ml. Es können Kreuzreaktionen mit 22 anderen HPV- Typen sowie 83 Mikroorganismen ausgeschlossen werden. Das cobas system ist seit April 2011 durch die FDA U.S (Food and Drug Administration) zugelassen. Castle et al. 2009, Castle et al. 2011, Heidemann et al 2011, Stoler et al 2011 Dieser Test erfüllt die Kriterien der Guidelines nach Meijer et al (Heidemann et al. 2011) und eignet sich damit zum HPV-Primärscreening. 1.4 APTIMA HPV (gen-probe) Nachweis von E6/7 mrna Nachweis & Genotypisierung von: 3

4 Der Aptima HPV Test beinhaltet 3 Schritte, die nacheinander in einem Reaktionsgefäß ablaufen. Zuerst werden die Zielmoleküle (HPV-mRNA) vom Lysat getrennt, an Mikropartikel gebunden und hybridisieren mit komplementären Fänger- Oligomeren, die wiederum an magnetische Mikropartikel gebunden sind. Diese Hybride werden an die Wand des Reaktionsröhrchens gezogen. Dieser Schritt wird als target capture (TC) bezeichnet. Der zweite Schritt führt zur Vervielfältigung der Nukleinsäureproben. Die Transcription-Mediated Amplification (TMA) ermöglicht die Vervielfältigung sowohl von DNA- als auch von RNA-Proben. Die Reverse Transkriptase erzeugt dabei eine DNA-Kopie der Target-Sequenz. Die Kopie enthält eine Promotersequenz für die RNA-Polymerase, die im Anschluss mehrere Kopien des RNA-Amplikons vom Template der DNA-Kopie erzeugt. DIE TMA ist isothermal und das Amplifikationsprodukt eine RNA. Der dritte Schritt dient dem Nachweis des Amplikons. Mit Hilfe des Hybridization Protection Assay (HPA). Dabei wird eine, mit einem Acridiniumester markierte Sonde verwendet, die mit der komplementären Sequenz des Zielmoleküls hybridisiert. Über den Kontakt mit dem so genannten Detektions-Reagenz emittiert ein Lichtsignal, welches mit einem Luminometer gemessen werden kann. Die Messung erfolgt qualitativ. Als Einheiten werden relative Lichteinheiten (Relative Light Units, RLU) verwendet. Die analytische Sensitivität liegt bei Kopien je Reaktion abhängig vom HPV Typ. Der Schwellenwert für Testpositivität ist jedoch mit dem des HC2 Tests vergleichbar. Kreuzreaktionen mit Niedrigrisiko-HPV-Typen, Bakterien, Hefe und Pilzen finden nicht statt. Clad et al 2011, Monsonego et al 2011, Ratnam et al 2011 Der Aptima HPV Test ist seit Oktober 2011 durch die FDA U.S (Food and Drug Administration) zugelassen. 2. Studien-gestützte HPV Tests 2.1 Abbott RealTime HR HPV assay (Abbott) Nachweis von: Typisierung von HPV 16 und 18 Beim Abbott RealTime HR HPV assay erfolgt der Nachweis der o.g. HR-HPV-Typen ebenfalls über eine Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und liefert damit einen 4

5 quantitativen Nachweis. Eine interne Kontrolle wertet die Qualität der entnommenen Probe, die Qualität und Effizienz des DNA-Extraktionsprozesses und die Effizienz der Amplifikation aus. Der Schwellenwert wurde intern vom Hersteller auf eine Schwelle von 32 Zyklen festgelegt und ist damit mit dem des HC2 vergleichbar. Die analytische Sensitivität liegt bei Kopien je Reaktion abhängig vom HPV Typ. Es können Kreuzreaktionen mit 15 anderen HPV- Typen ausgeschlossen werden. Carozzi et al 2011, Cuzick et al 2010, Halfon et al 2010, Huang et al 2009, Kaliterna et al 2009, Poljak et al 2011, Tang et al 2009 Dieser Test zeigt in einer aktuellen Studie eine, dem Hybrid Capture vergleichbare Spezifität und Sensitivität (Poljak et al 2011). Damit erfüllt er die Kriterien der Guidelines von Meijer et al 2009 zur Eignung zum HPV Primärscreening. 2.2 Papillocheck genotyping assay (Greiner BioOne) Nachweis & Genotypisierung von: 24 HPV Typen: 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/45, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66,, 70, 73 und 82 Bei dem Papillocheck genotyping assay wird zur Analyse, der durch PCR amplifizierten Produkte, das reverse Hybridisierungsverfahren angewandt. Dieses Verfahren ermöglicht eine vollständige Genotypisierung für eine große Bandbreite von HPV Typen in einer einzelnen Analyse. Die, beim Papillocheck genotyping assay amplifizierten, E1- Fragmente des Virusgenoms bilden mit spezifischen DNA-Proben Hybride. Die DNA-Proben sind auf einem PapilloCheck Mikroarray Chip fixiert. Während der Hybridisierung findet auch die Fluoreszenzmarkierung statt. Nachdem der DNA-Chip gewaschen wurde kann das Fluoreszenzsignal mit dem CheckScanner (Greiner BioOne) sichtbar gemacht werden. Mit der dazugehörigen CheckReport Software (Greiner BioOne) kann die Analyse und Auswertung durchgeführt werden. Die Qualität der Einzelproben, sowie Ausführung und Effizienz der Hybridisierung werden durch integrierte Kontrollelemente geprüft. Die analytische Sensitivität liegt bei Kopien je Reaktion abhängig vom HPV Typ. Der Schwellenwert für Testpositivität ist zum HC2 vergleichbar (Schopp et al 2010). 5

6 Eine Kreuzreaktion von HPV 55 mit HPV 44 sowie von HPV 13 mit HPV 11 ist möglich. Dalstein et al 2010, Didelot et al 2011, Halfon et al 2010, Hesselink et al 2010, Jones et al 2009, Schopp et al 2010, Hesselink et al 2010 Dieser Test zeigt in aktuellen Studien eine zum validierten GP5+/GP6+ EIA Test vergleichbare Spezifität und Sensitivität (Jones et al 2009, Hesselink et al 2010). Damit erfüllt er teilweise die Kriterien der Guidelines von Meijer et al 2009 zur Eignung zum HPV Primärscreening. 3. Weitere kommerziell erhältliche HPV Tests 3.1. INNO-LiPA HPV Genotyping Extra (Innogenetics) Nachweis & Genotypisierung von: 28 HPV Typen: 6, 11, 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 40, 43, 44, 45, 51, 52, 53, 54, 56, 58, 59, 66,, 69, 70, 71, 73, 74, 82 Der Test INNO-LiPA HPV Genotyping Extra typisiert, über die Amplifikation von Teilen des L1-Abschnitts des HPV-Genoms mittels Polymerasekettenreaktion, 28 HPV Typen. Der L1-Abschnitt ist neben dem E1-Gen der am stärksten konservierte Abschnitt des HPV-Genoms. Bei INNO-LiPA HPV Genotyping Extra wird das SPF10- Primer-Set angewandt, das einen Abschnitt im L1-offenen Leserahmen amplifiziert (Kleter et al.1998). Zusätzlich sind dem Reagenzienmix Primer hinzugefügt, die die Qualität und Extraktion der Probe überprüfen. Die Zugabe von UNG (Uracil-N- Glykosylase) dient der Komtaminierungsprävention. Die analytische Sensitivität liegt bei Kopien je Reaktion abhängig vom HPV Typ. Es existiert kein Schwellenwert, so dass dieser Test eine sehr hohe Sensitivität aufweist. Deshalb sollte er nicht für die Routinediagnostik eingesetzt werden. Für Verifizierungsanalysen und zum Nachweis persistenter Infektionen sowie zur Aufklärung der Typ-spezifischen Prävalenz in Bevölkerungsgruppen wird dieser Test häufig einegesetzt. Es wurden bislang keine Kreuzreaktionen bei diesem Test beobachtet. Castle et al 2008, Fontaine et al 2007, Galan-Sanchez et al 2011, Hesselink et al 2008, Kocjan et al 2011, Safaeian et al 2007, van Hamont et al 2006) 3.2. Linear Array (Roche) 6

7 Nachweis & Genotypisierung von: 36 HPV Typen: 6, 11, 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 44, 45, 51-54, 56, 58, 59, 61, 62, 64, 66-73, 81-84, 89, sowie HPV-82 Der Linear Array weist oben genannte HPV-Typen mittels PCR-Amplifikation, sowohl eines Abschnitts der L1-Region, als auch einer Region des humanen β-globin Gens, mit den Primern PGM09/PGMY11 und PC04/GH20 nach. Anschließend findet die Genotypisierung der resultierenden Fragmente, mit einem Einzeltypisierungsstreifen, der mit 37 HPV-Typ- und 2 β-globin- spezifischen Oligonukleotid-Sonden beschichtet ist, statt. Die analytische Sensitivität liegt bei Kopien je Reaktion abhängig vom HPV Typ. Kreuzreaktionen mit anderen HPV Typen sowie 62 Mikroorganismen können ausgeschlossen werden. Castle et al 2008, Coutlée et al 2006, Halfon et al 2010, Liu et al 2010, Poljak et al. 2009, Schopp et al. 2010, Galan-Sanchez et al 2009, Jamison et al 2009, Stevens et al 2007, Waldstrom and Ornskov

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