Zur in vitro Bestimmung der Glutathion-S-Transferase p aus Serum, Plasma und Tumorgewebe
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- Charlotte Victoria Kramer
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1 ELISA Zur in vitro Bestimmung der Glutathion-S-Transferase p aus Serum, Plasma und Tumorgewebe For the in vitro determination of Glutathion-S-Transferase p in Serum, Plasma and tumor tissue extract Gültig ab/valid from Artikelnummer/Catalogue No.: K 7960 Packungsgröße/Package size: 96 Tests/96 determinations Lagerung/Storage: 2-8 C; Standard/Calibrator,1.Antikörper/1st Antibody 20 C Immundiagnostik AG, Wiesenstr. 4, D Bensheim Tel.: Fax: e.mail: Immundiagnostik@t-online.de 0
2 Inhaltsverzeichnis e Seite/Pag Table of content 2 1. VERWENDUNGSZWECK 3 2. EINLEITUNG 3 3. TESTPRINZIP 4 4. INHALT DER TESTPACKUNG 4 5. ERFORDERLICHE LABORGERÄTE UND HILFSMITTEL 6 6. VORBEREITUNG UND LAGERUNG DER REAGENZIEN 6 7. HINWEISE UND VORSICHTSMAßNAHMEN 7 8. PROBENVORBEREITUNG 8 9. TESTDURCHFÜHRUNG 9 HINWEISE 9 PIPETTIERSCHEMA ERGEBNISSE 11 MUSTEREICHKURVE EINSCHRÄNKUNGEN QUALITÄTSKONTROLLE TESTCHARAKTERISTIKA 12 PRÄZISION UND REPRODUZIERBARKEIT LITERATUR ALLGEMEINE HINWEISE ZUM TEST 14 1
3 Table of content Page 1. INTENDED USE SUMMARY AND EXPLANATION OF THE TEST PRINCIPLE OF THE TEST MATERIAL SUPPLIED MATERIAL REQUIRED BUT NOT SUPPLIED PREPARATION AND STORAGE OF REAGENTS PRECAUTIONS SPECIMEN COLLECTION AND PREPARATION ASSAY PROCEDURE 20 PROCEDURAL NOTES 20 TEST PROCEDURE RESULTS 22 TYPICAL CALIBRATION CURVE LIMITATIONS QUALITY CONTROL PERFORMANCE CHARACTERISTICS 23 PRECISION AND REPRODUCIBILITY LITERATUR GENERAL NOTES ON THE TEST AND TEST PROCEDURE 25 2
4 1. VERWENDUNGSZWECK Der hier beschriebene Assay ist für die Bestimmung von GST-pi aus Serum, Plasma und Tumorgewebe. Nur zur in vitro Diagnostik. 2. EINLEITUNG Glutathion-S-Transferasen (GST) sind eine Gruppe weit verbreiteter Enzyme in eukaryotischen Zellen. Man teilt heute in fünf Familien ein: Alpha, Mu, Pi, Teta und mikrosomale. Die Klassen unterscheiden sich in ihrem physikochemischen, immunologischen, enzymatischen und strukturellen Eigenschaften und sind in unterschiedlichen Genorten lokalisiert. Ihre Funktion im Zellmetabolismus ist die Kopplung elektrophiler Agenzien, zu denen auch die meisten Karzinogene gehören, mit Glutathion (GSH). Die GST-π sind die Hauptklasse in den Erythrozyten und einigen Leukozyten. Die GST-π sind Dimere mit einem Molekulargewicht von Da und einem Isoelektrischen Punkt von circa 4,7. In allen neoplastischen Geweben (fötal, maligne) konnten erhöhte Werte der GST detektiert werden. Besonders deutlich ist diese Erhöhung (2-3-fach) im Serum von Patienten mit post-operativen Rezidiven zu messen. Erhöhte Serumwerte findet man auch bei hämatologischen Erkrankungen (Hämolytische Anämie, sub-formen der Leukämie). Außerdem können GST-π Konzentrationen den multidrug-resistance-status eines Tumors anzeigen und die Relevanz der Chemotherapie klären. Indikationen: Tumormarker Multi-Drug-Resistance Potentieller Marker für die Quecksilberausschleusung Antioxidatives Enzym 3
5 3. TESTPRINZIP Dieser Enzyme-Immuno-Assay (EIA) dient zur quantitativen Bestimmung der humanen GST-π. In diesem EIA werden polyklonale Kaninchenantikörper gegen humanes GST-π eingesetzt. Das Testprinzip beruht auf einer Kompetitionsreaktion zwischen dem freien Antigen in der Probe oder Standard und dem an die Festphase gekoppeltem Antigen. Nach Ablauf zweier Inkubationsschritte, einer kalten Vorinkubation des Antikörpers mit der Probe bzw. den Standards und der Kompetitionsreaktion, erfolgt mittels eines peroxidase-markierten 2. Antikörpers und nachfolgender Substratumsetzung die Detektion. Als Substrat wird TMB eingesetzt. Die gebildete, chromogene Verbindung kann photometrisch bei 450 nm gemessen werden. 4. INHALT DER TESTPACKUNG Artikel Nr. Kit Komponenten Menge K 7960MTP Mikrotiterplatte, vorbeschichtet 96 K 7960WP ELISA Waschpufferkonzentrat 10x 1 x 100 ml K 7960AP Assaypuffer, gebrauchsfertig 1 x 11 ml K 7960A1 1. Antikörper (Kaninchen anti hgst-pi) 1 x 12 ml K 7960K K 7960ST POD Antikörper, (Esel anti Kaninchen, Peroxidase-markiert), gebrauchsfertig Standards, gebrauchsfertig (0; 9.4; 37.5; 150; 600 ng/ml) 1 x 11 ml 2 x 5 vials K 7960KO Kontrolle 2 vials K 7960TMB TMB Substrat (Tetramethylbenzidin), gebrauchsfertig 1 x 15 ml K 7960AC ELISA Stoplösung, gebrauchsfertig 1 x 7 ml 4
6 Auf Wunsch erhalten Sie bei Bedarf 1 weiteres Standardset kostenlos. Jedes weitere Standardset wird berechnet. 5
7 5. ERFORDERLICHE LABORGERÄTE UND HILFSMITTEL Destilliertes oder deionisiertes Wasser Präzisionspipetten und Pipettenspitzen für den Einmalgebrauch mit variablen Volumina von µl Mikrotiterplattenschüttler Multikanal- bzw. Multipipette Zentrifuge, 3000 x g Vortex-Mixer Laborübliche Glas- oder Plastikröhrchen (Einmalartikel) Mikrotiterplattenreader mit Filter 450 nm 6. VORBEREITUNG UND LAGERUNG DER REAGENZIEN Beim Mehrfachansatz der Platte ist bitte darauf zu achten, daß die Reagenzien wie in der Vorschrift beschrieben gelagert werden und nur die für den jeweiligen Ansatz benötigten Reagenzienmengen frisch angesetzt werden (z.b. Peroxidasemarkierter Antikörper ist in der größten Verdünnungsstufe nicht haltbar). Der Kit kann so bis zu 4 x je nach Probenaufkommen (Innerhalb des angegebenen Verfallsdatums) verwendet werden. Reagenzien mit einem Volumen kleiner 100 µl sollten vor Gebrauch kurz anzentrifugiert werden, um Volumenverluste zu vermeiden. Das Waschpufferkonzentrat muß vor Gebrauch 1:10 in aqua dest. verdünnt werden (50 ml Konzentrat ml aqua dest). Aufgrund der hohen Salzkonzentration in den Konzentraten kann es zu Kristallbildungen kommen. Die Kristalle lösen sich bei Raumtemperatur auf. Das Pufferkonzentrat kann bei 2-8 C bis zum angegebenen Haltbarkeitsdatum aufbewahrt werden. Die verdünnte Pufferlösung ist bei 2-8 C 1 Monat (in einem geschlossenen Gefäß) haltbar. Der 1. Antikörper wird bei -20 C gelagert. Er kann mehrmals (bis zu 4x) aufgetaut und wieder eingefroren werden und ist bis zum angegebenen Verfallsdatum (siehe Etikett) haltbar. 6
8 Die Standards werden bei -20 C gelagert. Sie können zweimal aufgetaut und wieder eingefroren werden und sind bis zum angegebenen Verfallsdatum (siehe Etikett) haltbar. Alle anderen Testreagenzien werden gebrauchsfertig in gelöster Form geliefert und sind bis zum angegebenen Verfalldatum (siehe Etikett der Testpackung) verwendbar. 7. HINWEISE UND VORSICHTSMAßNAHMEN Komponenten die auf Humanserum aufgebaut sind, sind auf HIV und Hepatitis B getestet und für negativ befundet worden. Jedoch sollten die Testkomponenten als Vorsichtsmaßnahme immer wie potentiell infektiöses Material behandelt werden. Die Stoplösung besteht aus H 2 SO 4. H 2 SO 4 ist eine starke Säure und muß auch im verdünnten Zustand mit Vorsicht behandelt werden. H 2 SO 4 verursacht bei Kontakt mit der Haut Verätzungen. Es sollte daher mit Schutzhandschuhen und Schutzbrille gearbeitet werden. Bei Kontakt mit der Säure muß die verätzte Stelle sofort mit viel Wasser gespült werden. Die Reagenzien dürfen nach Ablauf des Mindesthaltbarkeitsdatums nicht mehr verwendet werden. 7
9 8. PROBENVORBEREITUNG Plasma und Serum Plasma oder Serum: Venöses Blut in Plasma- oder Serumröhrchen abnehmen (kein Heparin-Röhrchen verwenden), mischen und nach Minuten 10 Minuten bei 1800 x g zentrifugieren. Das entstehende Serum bzw. Plasma bis zur Messung bei - 20 C tiefgefroren lagern. Es dürfen kein hämolytischen Proben verwendet werden. Gewebe Gewebe nach Entnahme homogenisieren (z.b. mit einem Dismembrator: 1500 rpm, 5 min.) und in Phosphatpuffer aufnehmen. 1 Stunde bei x g zentrifugieren und Überstand (cytosolische Fraktion) bei -20 C lagern. Der Proteingehalt der cytosolischen Fraktion wird nach Lowry et al. oder mit dem BCA Protein Assay [Pierce] bestimmt. Alternativ kann das Gewebematerial nach der Homogenisierung in Phosphatpuffer mit 1% Triton X100 aufgenommen werden. Nach kräftigem Schütteln für mindestens 2 Stunden wird das Lysat bei x g für 10 Minuten zentrifugiert. Nach der Proteinbestimmung wird der Überstand im EIA eingesetzt. 8
10 9. TESTDURCHFÜHRUNG Hinweise Reagenzien der Testpackung dürfen nicht mit anderen Chargen gemischt werden. Qualitätskontrollen sollten immer mitgemessen werden. Inkubationszeit, Temperatur und Pipettiervolumen sind vom Hersteller festgelegt. Jegliche Abweichung der Testvorschrift, die nicht mit dem Hersteller koordiniert wurde, kann zu fehlerhaften Ergebnissen führen. Immundiagnostik übernimmt keine Haftung. Der Assay ist immer, nach der im Kit beigefügten Arbeitsanleitung abzuarbeiten. Pipettierschema Die vorbeschichtete Mikrotiterplatte vor Gebrauch 5x mit je 250 µl Waschpuffer waschen. Mikrotiterplatte nach dem letzten Waschgang auf Saugpapier ausschlagen. Die Bestimmungen sind in der Mikrotiterplatte in Doppelwerten durchzuführen µl Standards, Patientenproben oder Gewebe (aufgearbeitet) und 25 µl Assaypuffer in ein Teströhrchen geben µl 1.Antikörper pro Röhrchen pipettieren h bei 4 8 C inkubieren µl des vorinkubierten Ansatzes gut vortexen (mischen) und in die entsprechenden Vertiefungen pipettieren h bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubieren. 6. Den Inhalt der Platte verwerfen und 5 x mit je 250 µl Waschpuffer waschen. Mikrotiterplatte nach dem letzten Waschgang auf Saugpapier ausschlagen µl Konjugat (POX-markiert) pro Vertiefung pipettieren min bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubieren. 9
11 9. Den Inhalt der Platte verwerfen und 5 x mit je 250 µl Waschpuffer waschen. Mikrotiterplatte nach dem letzten Waschgang auf Saugpapier ausschlagen µl TMB-Substrat pro Vertiefung pipettieren Minuten (entsprechend der Farbdifferenzierung) bei Raumtemperatur inkubieren µl Stoplösung pro Vertiefung pipettieren. 13.Die Extinktion wird sofort im Mikrotiterplattenphotometer bei 450 nm gegen die Referenzwellenlänge 620 nm (oder 690 nm) gemessen. Sollte die Extinktion des höchsten Standards den Meßbereich des Photometers übersteigen, sollte sofort bei 405 nm gegen 620 nm (690 nm) gemessen werden. 10
12 10. ERGEBNISSE Zur Auswertung des Testes empfehlen wir die 4-Parameter-Funktion. Alternativ kann auch eine Punkt-zu-Punkt-Auswertung oder eine gewichtete Spline-Funktion gewählt werden. Vor jeder automatischen Auswertung sollte stets eine Kontrolle der Doppelwerte auf Plausibilität ( Ausreißerkontrolle ) durchgeführt werden; falls dies nicht durch das verwendete Programm erfolgt, sollte diese der Operator durchführen. Mustereichkurve Konzentration [ng/ml] B/B0 [%] Die hier aufgeführten Ergebnisse sind ein Beispiel für eine Standardkurve. Sie dürfen nicht für die Auswertung des Assays verwendet werden. 11
13 11. EINSCHRÄNKUNGEN Proben mit einer GST-pi Konzentration größer dem größten Standard sollten im entsprechenden Puffer verdünnt und nochmals im Assay eingesetzt werden. 12. QUALITÄTSKONTROLLE Wir empfehlen die Kontrollen oder Plasma/Serum Pools, bei jedem Testansatz mitzumessen. Die Ergebnisse der Kontrollen müssen auf Richtigkeit überprüft werden. Liegen eine oder mehrere Kontrollen außerhalb des angegebenen Bereiches kann Immundiagnostik die Richtigkeit der Proben nicht gewährleisten. 13. TESTCHARAKTERISTIKA Präzision und Reproduzierbarkeit Intra-Assay-Variation Die Reproduzierbarkeit von zwei Proben innerhalb einer Meßserie wurde geprüft. Eine Probe wurde 10 mal in einem GST-pi ELISA von einer Person angesetzt. Intra-Assay VK n= 10 Probe GST-pi Mittelwert [ng/ml] Intra-Assay Vk [%]
14 Inter-Assay-Variation Es wird die Reproduzierbarkeit von einer Proben an unterschiedlichen Tagen geprüft. Eine Probe wurden an verschiedenen Tagen und verschiedenen Personen im GST-pi ELISA gemessen. Inter-Assay VK n= 10 Probe GST-pi Mittelwert [ng/ml] Inter-Assay Vk [%] LITERATUR 1. Sundberg et al. Nephron 1994; 66: Hayes, Pickett, Mantle, Proceedings of 3 rd International GST Conference, Edinburgh, Scotland Sundberg et al. Nephron 1994; 67:
15 15. ALLGEMEINE HINWEISE ZUM TEST Dieser Kit wurde nach der IVD Richtlinie 98/79/EG hergestellt und in den Verkehr gebracht. Falls für die Herstellung der Testkomponenten Humanseren verwendet wurde, sind diese auf HIV und Hepatitis B getestet und für negativ befundet worden. Jedoch sollten die Testkomponenten als Vorsichtsmaßnahme immer wie potentiell infektiöses Material behandelt werden. Die Testkomponenten enthalten zum Schutz vor bakteriellen Kontaminationen Natriumazid oder Thimerosal. Natriumazid/Thimerosal sind giftig. Substrate für enzymatische Farbreaktionen sind als giftig und karzinogen beschrieben. Jeder Kontakt mit der Haut oder der Schleimhaut ist zu vermeiden. Alle im Test enthaltenen Reagenzien dürfen ausschließlich zu wissenschaftlichen Zwecken oder, wenn vermerkt, zur in vitro Diagnostik eingesetzt werden. Die Reagenzien dürfen nach Ablauf des auf der Verpackung angegebenen Datums nicht mehr verwendet werden. Einzelkomponenten verschiedener Chargen dürfen nicht gemischt oder ausgetauscht werden. Für die Qualitätskontrolle sind die, für medizinische Laboratorien erstellten Richtlinien zu beachten. Die charakteristischen Testdaten wie Inkubationszeiten, Inkubationstemperaturen und Pipettiervolumina der verschiedenen Komponenten wurden firmenintern festgelegt. Nicht mit dem Hersteller abgesprochene Veränderungen in der Testdurchführung können die Resultate beeinflussen. Die Firma Immundiagnostik übernimmt für die hierdurch entstandenen Schäden und Folgeschäden keine Haftung. Bei Gewährleistungsansprüchen ist das beanstandete Material mit schriftlicher Erklärung innerhalb von 14 Tagen zum Hersteller- der Immundiagnostik zurück zu senden _GST-pi.DOC 14
16 Arbeitsanleitung/Manual ELISA Zur in vitro Bestimmung der Glutathion-S-Transferase π aus Serum, Plasma und Tumorgewebe For the in vitro determination of Glutathion-S-Transferase π in Serum, Plasma and tumor tissue extract Gültig ab/valid from Artikelnummer/Catalogue No.: K 7960 Packungsgröße/Package size: 96 Tests/96 determinations Lagerung/Storage: 2-8 C; Standard/Calibrator, 1. Antikörper/1st Antibody -20 C 0 15
17 1. INTENDED USE The Immundiagnostik Assay is intended for the quantitative determination of GST-p in serum and tumor tissue extract. For in vitro diagnostic use only. 2. SUMMARY AND EXPLANATION OF THE TEST Glutathion-S-transferases (GST) are a group of enzymes, which are involved in detoxification processes. The GSTs are divided in 5 subgroups: Alpha, Mu, Pi, Teta and microsomal. The classes differ in their physicochemical, immunological, enzymatic and structural properties. Their function in cellular metabolism is the coupling of electrophile compounds, for example most of the carcinogenes, to Glutathion (GSH). The GST Pi is the main group in erythrocytes and in some leucocytes, moreover they are found in most tissues except liver. The GST Pi are dimeric molecules with a molecular weight of Da and an isoelectric point of about 4,7. High GST Pi levels were found in all neoplastic tissue (fetal, maligne) and in serum of patients with postoperative recidives. Increased serum levels were also found in haematological diseases (haemolytic anaemia and sub-groups of leukemia). Moreover GST Pi concentrations give informations about the multi-drug-resistance-status of tumours. 3. PRINCIPLE OF THE TEST This Enzyme-Immuno Assay (EIA) allows the quantitative determination of human GST Pi. GST Pi is first coated to the surface of the microtiter plates. After a blocking step and a preincubation of calibrators and samples with a polyclonal rabbit antibody the GST-pi in the controls and samples compete with the GST-pi on the plate for the antibody binding. After a washing step the detection of the bound rabbit antibody is performed by a peroxidase labeled goat anti rabbit antibody (POD-antibody). The amount of converted substrate (TMB) is indirectly proportional to the amount of antigen in the sample and can be determined photometrically at 450 nm. 16
18 4. Material supplied Catalogue No Kit Components Quantity K 7960MTP one holder with precoated strips 96 K 7960WP ELISA wash buffer concentrate 10x 100 ml K 7960AP Assay buffer, ready-to-use 11 ml K 7960A1 K 7960K K 7960ST 1 st Antibody (rabbit anti hgst-pi),ready-touse POD antibody, (goat anti rabbit, Peroxidase-labelled), ready-to-use Calibrators, ready-to-use (0; 9.4; 37.5; 150; 600 ng/ml) 12 ml 11 ml 2 x 5 vials K 7960KO control 2 vials K 7960TMB TMB substrate (Tetramethylbenzidine) 1 x 15 ml K 7960AC ELISA stop solution, ready-to-use 1 x 7 ml On demand we will send you 1 calibrator set free of charge. Any further calibrator sets will be charged. 5. MATERIAL REQUIRED BUT NOT SUPPLIED Deionized water Precision pipettors calibrated to deliver µl A multi-channel dispenser or repeating dispenser Centrifuge capable of 3000 x g Vortex-Mixer Microplate reader 450 nm 17
19 6. PREPARATION AND STORAGE OF REAGENTS To run the assay more than one time, please make sure that the reagents are carefully stored as mentioned. Prepare just the appropriate amount necessary for the assay. The ELISA wash buffer concentrate should be diluted with Aqua dest. 1:10 before use (add 450 ml A. dest. to 50 ml concentrate). Crystals could occur due to high salt concentration. The crystals have to be resuspended before dilution of the buffer solutions using a water bath (37 C). The buffer concentrates are stable at 2-8 C until the expiry date stated on the label. Diluted solutions could be stored at 2-8 C for 1 month. The standards have to be stored at 20 C. It is possible to thaw and freeze the standard maximum, 2 times. The standards are stable at 20 C until the expiry date stated on the label. The 1. antibody (rabbit anti-gst π) has to be stored at 20 C. It is possible to thaw and freeze the antibody maximum, 4 times. The antibody is stable at 20 C until the expiry date stated on the label. All other test reagents are ready for use. The test reagents are stable up to the date of expiry (see label of test package) when stored at 2 8 C. 18
20 7. PRECAUTIONS For in vitro diagnostic use only. Components contain human source material was tested and found to be non-reactive to HBsAg, anti-hiv-1/2, and anti-hcv. Since no method can offer complete assurance that hepatitis B virus, HIV-1/2, HCV or other infectious agents are absent, these reagents should be handled as if potentially infectious. Stop Solution consists of diluted Sulfuric acid. This is a strong acid. Although diluted, it still must be handled with care. It can cause burns and should be handled with gloves, eye protection, and appropriate protective clothing. Any spill should be wiped out immediately with copious quantities of water. Do not breath vapor and avoid inhalation. Reagents should not be used beyond the expiration date shown on kit label. 8. SPECIMEN COLLECTION AND PREPARATION Plasma or serum: Collect blood in plasma- or serum tubes (don t use heparin tubes), mix and incubate minutes at 2-8 C, then centrifuge 10 minutes at 1800xg. Store serum or plasma at -20 C. Caution - Don t use haemolytic serum or plasma - Tissue material has to be homogenised (e.g. mechanically with a dismembrator) and then resuspended in phosphate buffer. Then follows an ultra centrifugation step (1h at x g). The supernatant of this centrifugation step is the cytosolic fraction. Protein in the supernatant should be determined according to Lowry et al. or with BCA Protein Assay [Pierce]. Alternatively the tissue material can be resuspended after the homogenisation in phosphate buffer with 1% Triton X100. After mixing for at least 2 hours this tissue lysate has to be centrifuged at x g for 10 minutes. After determination of protein content the supernatant can be used for the EIA 19
21 9. ASSAY PROCEDURE Procedural notes Do not interchange different lot numbers of any kit component within the same assay. The quality control guidelines should be observed. Incubation time, incubation temperature and pipetting volumes of the different components are defined by the producer. Any variations of the test procedure, that are not coordinated with the producer, may influence the test results. Immundiagnostik can therefore not be held reliable for any damage resulting from this. Carry out the assay with the actual manual delivered with the kit. Test procedure The precoated microtiter plate is washed 5 x with 250 µl washing buffer. Carry out the tests in duplicate. 1. Pipette 25 µl standards/ patient samples and 25 µl Assay buffer into test tubes. 2. Add 200 µl of the 1 st antibody. 3. Incubate for 16h at 2-8 C 4. Shake the preincubated solution well and pipette 100 µl of the solution in each well. 5. Incubat for 4h at room temperature C, shaking on a horizontal mixer. 6. Decant the content of plate and wash the wells 5 x with 250 µl ELISA wash buffer 7. Pipette 100 µl peroxidase labelled antibody into each well. 8. Incubate for 45 min at room temperature, shaking on a horizontal mixer. 20
22 9. Decant content of plate and wash the wells 5 x with 250 µl ELISA wash buffer 10. Pipette 100 µl substrate solution (TMB) into each well 11. Incubate minutes at room temperature until sufficient colour differences are visible. 12. Add 50 µl stop solution and mix shortly. 13. Determine absorption with an ELISA reader at 450 nm against 620 nm as reference. If no reference wavelength is available, read only at 450 nm. If the extinction of the highest standard exceeds the measurement range of the photometer, absorption must be measured immediately at 405 nm against 620 nm as reference. 21
23 10. RESULTS A calibration curve is constructed from the standards. Commercially available software can be used as well as graph paper. Results of the samples are read from this calibration curve. THE CALIBRATION CURVE IS NOT LINEAR, therefore a spline- or 4PL algorhythm is recommended. Typical calibration curve Concentration [ng/ml] B/B0 [%] The data is for demonstration only and cannot be used in place of data generations at the time of the assay. 22
24 11. LIMITATIONS Samples with GST-pi levels greater than the highest calibrator, should be diluted and re-assayed. 12. QUALITY CONTROL Immundiagnostik recommends commercial control samples for internal quality control. Control samples or serum pools should be analyzed with each run of calibrators and patient samples. Results, generated from the analysis of control samples, should be evaluated for acceptability using appropriate statistical methods. In assays in which one or more of the quality control sample values lie outside the acceptable limits, the results for the patient sample may not be valid. 13. PERFORMANCE CHARACTERISTICS Precision and reproducibility The precision (intra-assay variation) of the Immundiagnostik GST-pi ELISA test was calculated from 10 replicate determinations on each of the samples. Intra-Assay CV n= 10 Sample GST-pi Mean value [ng/ml] Intra-Assay CV [%]
25 The total precision (inter-assay variation) of the Immundiagnostik GSTpi ELISA test was calculated from data on 2 samples obtained in 10 different assays by three technicians on two different lots of reagents over a period of 3 months. Inter-Assay CV n= 10 Sample GST-pi Mean value [ng/ml] Inter-Assay CV [%] LITERATUR 4. Sundberg et al. Nephron 1994; 66: Hayes, Pickett, Mantle, Proceedings of 3 rd International GST Conference, Edinburgh, Scotland Sundberg et al. Nephron 1994; 67:
26 15. GENERAL NOTES ON THE TEST AND TEST PROCEDURE This assay was produced and put on the market according to the IVD guidelines of 98/79/EC. The test components which are made of human serum are tested for Australia antigen and HIV and found to be negative. However, since no test method can offer complete assurance that infectious agents are absent, these reagents should be handled as recommended for any potentially infectious human serum or blood specimen. The normal precautions for laboratory working should be observed. Reagents of the test package contain sodium azide as a bactericide. Contact with skin or mucous membranes has to be avoided. All reagents in the test package are to be used for in-vitro diagnostics only. The reagents should not be used after the date of expiry (see label on the test package). Single components with different lot numbers should not be mixed or exchanged. The guidelines for medical laboratories should be observed. Incubation time, incubation temperature and pipetting volumes of the different components are defined by the producer. Any variations of the test procedure, that are not coordinated with the producer, may influence the results of the test. Immundiagnostik can therefore not be held reliable for any damage resulting from this _GST-pi.DOC 25
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