Methodentransfer in der HPLC
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- Valentin Fürst
- vor 5 Jahren
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1 Veronika R. Meyer Methoentransfer in er HPC Manche HPC-Analysen weren mit einem zu grossen Aufwan betrieben. «Aufwan» kann verschieenes beeuten: zu lange Analysenzeit, unnötig grosse Auflösung oer zu hoher Verbrauch an mobiler Phase. In iesen ällen könnte man ie Methoe optimieren. Manchmal stellen sich ie gleichen Probleme, wenn ie Analysen in einem aneren abor urchgeführt weren sollen, as nicht ie gleiche Auswahl an Säulen besitzt. Beim Methoentransfer sin einige physikalische Tatsachen zu beachten. Ohne ein bisschen Rechnen geht es nicht, aber mit en nachfolgenen Erläuterungen sollte ies nicht allzu schwierig sein. Dabei gibt es einfache un kompliziertere älle. Beginnen wir mit en einfachen. Kürzere Säule verwenen ür ie quantitative Analyse ist bei benachbarten Peaks eine Auflösung von minestens,3 notwenig, bei ungleich grossen Peaks allerings viel mehr. Ist nun aber ie Auflösung er zu quantifizierenen Peaks besser als nötig, so kann eine kürzere Säule (mit erselben stationären Phase un gleicher Packungsqualität) eingesetzt weren. Die Auflösung R ist proportional zur Wurzel er Trennstufenzahl N, un letztere ist proportional zur Säulenlänge c. Es gilt also: R c Beispiel: Die kritische Auflösung (as heisst, ie Auflösung es am schlechtesten aufgelösten Peakpaars von Interesse) beträgt aktuell 3,, sie kann aber ohne Probleme auf,0 gesenkt weren. Bisher wure eine Säule von 5 cm änge eingesetzt. R R c, c, R c,,0 5 c, cm 6 cm R 3, Man wir mit er viel kürzeren Säule Analysenzeit un ösungsmittel sparen. Seite von 7
2 Wir bei einer bestehenen HPC-Apparatur eine kürzere Säule verwenet, so sin ie externen Totvolumina kritisch zu beurteilen. Die Peaks weren nun in einem kleineren Volumen eluiert. alls ie Apparatur vorher en Ansprüchen an as Totvolumen nur knapp genügte, so ist mit er kürzeren Säule eine übermässige Verschlechterung er Trennstufenzahl zu beobachten. Die Volumina, welche hier eine Rolle spielen, betreffen ie Injektion, ie Verbinungskapillaren un ie Detektorzelle, bei Graiententrennungen auch as Verweilvolumen. Dünnere Säule verwenen Eine Säule mit 4,6 mm Innenurchmesser bietet keine Vorteile, sie ist aber übermässig urstig. Mit einer Anlage, ie keine speziell grossen Totvolumina aufweist (siehe oben), kann man ohne Verlust an Trennleistung, as heisst an Auflösung, auf ünnere Säulen umstellen. Damit ie Retentionszeiten gleich bleiben, muss er Volumenstrom er mobilen Phase reuziert weren, un zwar proportional zum Quarat er beteiligten Säulen-Innenurchmesser c : c Beispiel: Anstelle von 4,6-mm-Säulen sollen 3,0-mm-Säulen verwenet weren (as ist noch kein raiker Schritt). Der bisherige Volumenstrom beträgt, ml/min. c, c, c, 3,0, ml/ min 0,5 ml/min 4,6 c, Man spart fast 60 Prozent ösungmittel! Kleinere Korngrösse verwenen Wechselt man bei sonst gleich bleibenen Parametern zu einer Säule mit kleinerer Korngrösse, so steigen Trennstufenzahl un Druck. Die chromatographische Auflösung wir sich ein wenig veränern, weil man nun in Bezug auf ie van Deemter-Kurve an einer aneren Stelle steht. Man sollte en luss anpassen, amit man ie Vorteile er kleineren Korngrösse ausnützen kann: kleinere Korngrösse p beingt höheren luss weil nun ie Diffusionswege kürzer sin. Es gilt: p Beipiel: Anstelle von 5- m-packungen sollen in Zukunft solche von 3 m Korngrösse eingesetzt weren. Der Säulenhersteller garantiert abei gleich gute Packungsqualität. Bisher wure mit, ml/min gearbeitet. Seite von 7
3 p, p, p, 5, ml/ min,0 ml/min 3 p, Wie hoch ist nun er Druck? Da kommt es arauf an, ob wir ie Säulenlänge konstant lassen wollen oer aber ie Trennstufenzahl (bzw. ie Auflösung). Bei unveränerter änge er Säule, was eine höhere Trennstufenzahl zur olge hat, steigt er Druck p eutlich, enn es gelten ie beien Beziehungen: p p Beispiel: Mit er 5- m-phase betrug er Druck 80 bar. Nun wir eine gleich lange 3- m-säule verwenet. Der luss wir wie oben berechnet erhöht. p p p, p, p p, 5,0 80 p bar 370 bar 3, p, Es macht allerings nur ann Sinn, eine gleich lange Säule mit kleinerer Korngrösse einzusetzen, wenn ie Trennung vorher ungenügen war. Möchten wir ie Trennstufenzahl un amit auch ie Auflösung konstant hen, so können wir nun eine kürzere Säule einsetzen, enn es gilt: N N c p Beispiel: Wir wollen ie kritische Auflösung bei,0 belassen. Bisher wure ie Trennung mit einer cm langen Säule urchgeführt. Wenn ie Trennstufenzahl sowohl mit er 5- m- wie auch mit er 3- m-phase gleich hoch ist, so bleibt auch ie Auflösung unveränert: N N c, p, c, p, Seite 3 von 7
4 c, p, 3 c, cm 7 cm 5 p, Die e Säule ist um en aktor 3:5 = 0,6 kürzer. Damit ist auch er benötigte Druck nur noch 0,6 mal so hoch wie mit er Säule in Originallänge. Oben wure eine Druckerhöhung um as 4,6- fache berechnet (was 370 bar ergab); mit er kürzeren Säule, welche ie ursprüngliche Auflösung bietet, beträgt er Druck noch 370 0,6 bar = 0 bar. Eine Verkleinerung er Korngrösse wir immer mit einer beeutenen Druckerhöhung «bezahlt». Dies ist auch ann er all, wenn man ie lussrate nicht azu passen erhöht, wie man es en kürzeren Diffusionsstecken entsprechen tun sollte. Die Zusammenhänge stellen sich wie folgt ar: Pumpenruck ausnützen Dieses Szenario beeutet nun ie hohe Schule es Methoentransfers. Will man eine Trennung schneller urchführen, so kann man einfach ie lussrate erhöhen. Der Druck wir proportional ansteigen, wie man aus er täglichen Arbeit mit HPC bestens kennt. Damit verschenkt man (in er Regel) aber chromatographische Auflösung, weil man sich vom van Deemter-Optimum entfernt. Die Analysenzeit sinkt un ie benötigte Menge an mobiler Phase bleibt konstant. Um ie Auflösung unveränert auf ie en Beingungen transferieren un erst noch effizienter arbeiten zu können, sollte man gleichzeitig ie Korngrösse verkleinern, en luss erhöhen un eine kürzere Säule verwenen. Der Druck nimmt zu, ie Analysenzeit sinkt jeoch um en gleich grossen aktor un ie Trennung benötigt weniger mobile Phase. Die Strategie «kleinere Korngrösse, kürzere Säule» bietet emnach einen echten Mehrwert aus em zur Verfügung stehenen Druck, weil man an Eluent einspart. ür iese Art es Methoentransfers muss man mit er Wurzel er relativen Druckerhöhung DE rechnen: p DE p Die e Korngrösse erhält man mit: p, p, DE Damit ist er e Volumenstrom vorgegeben; wie oben erläutert beträgt er: p, p, DE Die änge er en Säule mit kleinerer Korngrösse erhält man analog wie ie e Korngrösse: Seite 4 von 7
5 c, c, DE un wenn er Säulenurchmesser unveränert bleibt, so gilt für ie Ersparnis an Eluentenvolumen V: V total, V total, c, c, DE In er Tabelle ist ein Beispiel mit einer Veroppelung es Drucks gezeigt ( DE = =,4). Die berechneten Zahlen wir man runen un sich im übrigen anach richten, welche Säulenimensionen un Korngrössen käuflich sin. Bei gleichzeitiger Änerung von Säulenlänge un Korngrösse gilt für as Druckverhältnis: p p p, p, c, c, Diese Beziehung gilt immer un unabhängig avon, ob man ie Trennung in Richtung Druckoptimierung veränert, wie beschrieben, oer ob man eine zufällige oer sogar unsinnige Veränerung von einem oer mehreren Parametern vornimmt. Will man zuem auch noch eine ünnere Säule einsetzen, so muss ie lussrate wie bereits erwähnt gleich nochmals verkleinert weren: c, c, Robustheit beachten Bei Optimierungen un Transfers ist er Robustheit gebührene Beachtung zu schenken. Eine Methoe ist robust, wenn sie auch bei kleinen Schwankungen er Beingungen (beispielsweise von Temperatur oer ph-wert) konstante Ergebnisse liefert. Wir etwa ie Auflösung bei er Methoenentwicklung auf en kleinstmöglichen Wert verkleinert, er noch vertretbar ist, so wir sich ie Trennung wegen er unvermeilichen Alterung er Säule über kürzere oer längere Zeit verschlechtern un ie Anforerungen nicht mehr erfüllen. Ein bisschen Reserve bei er Auflösung ist bei allen freigegebenen Methoen ringen zu empfehlen. Muss valiiert weren? Nach em Transfer einer vorgängig valiierten Methoe muss in er Regel nicht wieer valiiert weren. Es genügt, ass er Systemeignungstest erfüllt wir. Die Transferschritte un ie ahinter Seite 5 von 7
6 stehenen Überlegungen müssen zuem okumentiert un erklärt woren sein, amit er Transferprozess nachvollziehbar ist. Kalibrierkurven oer Responsefaktoren müssen selbstverstänlich bestimmt weren! Es wäre vollkommen falsch, sie einfach zu übernehmen wie es überhaupt falsch ist, quantitative Analysenserien ohne aktuell ermittelte Kalibrationen urchzuführen. Un ie stationäre Phase? Bei stationären Phasen mit genau gleichem Hanelsnamen kann man avon ausgehen, ass ihre chromatographischen Eigenschaften unabhängig von er Korngrösse sin. Man kann beim Wechsel von 5 m auf beispielsweise 3 m nahezu oer völlig ientische Trennungen erwarten. Das gilt nicht mehr, wenn ein aneres Material eingesetzt wir. Bereits eine Änerung er Porenweite wirkt sich im Chromatogramm aus. Ein aneres abrikat, selbst mit einem ähnlichen Namen wie «RP-8» kann ganz anere Eigenschaften aufweisen. Wenn man emnach mit er Selektivität er gewählten stationären Phase zufrieen ist, gibt es keinen Grun, eine anere Phase zu wählen. Dies würe nicht mehr als «Methoentransfer» bezeichnet. Vielmehr wäre as eine e Methoe, ie wieer valiiert weren müsste. Graiententrennungen Will man ie Säulenimensionen oer ie Korngrösse von Graiententrennungen änern, so ist je nach Situation em Graientenprofil Beachtung zu schenken. Vereinfacht gesagt sin ie rei besprochenen Szenarien zu unterscheien. Kürzere Säule: Die Analysenzeit ist jetzt auch kürzer un ie aufzeit es Graienten muss proportional angepasst weren. Dünnere Säule: Die aufzeit es Graienten bleibt unveränert, ie lussraten er beien Eluenten müssen zusammen em berechneten entsprechen. Kleinere Korngrösse: Wie argelegt sollte man gleichzeitig en luss erhöhen. Zuem ist as Szenario «kürzere Säule» attraktiv, as heisst as beschriebene Vorgehen «Pumpenruck ausnützen». Der Graient muss steiler gelegt weren, amit innerhalb es berechneten V total ie Enbeingungen erreicht sin. Bei Graiententrennungen spielen mehr Parameter eine Rolle als bei isokratischen Trennungen. Die untersuchten Proben sin komplexer zusammengesetzt (sonst wäre eine Graiententrennung nicht nötig). Es ist eshalb zu überlegen, ob bei einem erartigen Methoentransfer eine Neuvaliierung nötig ist oer ob man sich wirklich nur mit em Systemeignungstest zufrieen geben arf. Seite 6 von 7
7 Tabelle: Veränerung er Parameter, wenn er Druck veroppelt weren kann. Der Säulenurchmesser bleibt unveränert. Parameter ursprünglich simpel: oppelter luss Druck 00 bar 00 bar luss ml/min ml/min Zeitbearf 0 min 5 min Korngrösse 5 m 5 m Säulenlänge 5 cm 5 cm totales Volumen 0 ml 0 ml Auflösung nimmt ab raffiniert: Druck ausnützen 00 bar,4 ml/min 5 min 3,5 m cm 4 ml bleibt gleich Autorin: PD Dr. Veronika R. Meyer Empa St. Gallen Materials Science & Technology erchenfelstrasse St. Gallen Tel veronika.meyer@empa.ch Publikation: Veronika R. Meyer HPC an ultra HPC: Basic concepts in: Hanbook of Biological an Chemical Plant Analytical Methos, K. Hostettmann et al. es., Wiley, Chichester 04, pp Hinweis: Dieser Artikel wure bereits in er Zeitschrift SZ 0-08 veröffentlicht Seite 7 von 7
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