5.1. Humane adulte Knochenmarkszellen haben ein multipotentes Differenzierungspotential

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1 5. Diskussion Die Regeneration von Geweben in verschiedenen pathologischen Situationen ist ein wichtiges Ziel der modernen Medizin und könnte durch eine Zelltherapie mit körpereigenen Stammzellen erreicht werden. Durch die einfache Isolierung der mesenchymalen Stammzellen aus dem Knochenmark, und ihrer schnellen Replikation könnten diese Zellen ein guter Kandidat für eine Zelltherapie sein, durch die geschädigtes Gewebe regeneriert wird. Die Reparatur von Geweben unterliegt jedoch hohen Anforderungen, wie z.b. die Integration der HMSC in das geschädigte Gewebe, die Differenzierung der Zellen und die Expression gewebespezifischer Gene. Um die Frage zu beantworten, ob diese Zellen therapeutisch eingesetzt werden können, ist es wichtig das Verhalten der Zellen zu untersuchen. Durch in vivo-versuche sollte geklärt werden, ob die HMSC an der Regeneration des Muskelgewebes teilnehmen. Um den Mechanismus näher zu untersuchen, wurde ein in vitro-system etabliert, das der physiologischen Situation ähnelt Humane adulte Knochenmarkszellen haben ein multipotentes Differenzierungspotential Die Knochenmarkszellen wurden aus dem Hüftgelenkskopf verschiedener Patienten isoliert und nach 3-tägigem Präplatieren, um Fibroblasten zu entfernen, in GM-HMSC kultiviert. Pittenger et al. definierten Knochenmarkszellen, die in der Lage sind zu adipogenen, chondrogenen und osteogenen Zellen zu differenzieren, als multipotente mesenchymale Stammzellen (Pittenger et al., 1999). Um das Differenzierungspotential der isolierten und gereinigten Knochenmarkszellen zu erfassen, wurden sie mit verschiedenen Substanzen kultiviert. Nach 7-14 Tagen wurde die Differenzierung in 3 mesenchymale Gewebetypen durch histochemische Färbungen und per RT-PCR nachgewiesen. Bei der adipogenen Differenzierung wurden bis zu 90% Fettzellen erhalten, die durch Färbung der Lipidtröpfchen mit einer Oil-Red-Lösung identifiziert wurden. Die Expression von ap2, einem Fett-bindenden Protein, und Die osteogene Differenzierung wurde durch die Genexpression von Osteocalcin und einer von-kossa-färbung, die Kalziumdepositionen färbt, gezeigt. Die chondrogene Differenzierung wurde mittels einer Färbelösung, welche den Farbstoff Safranin-O enthält, dass an Bestandteile der extrazellulären Matrix, z.b. Hyaluronsäure bindet, und der Expression des Transkriptionsfaktors Sox9 und des Matrixproteins Aggrecan nachgewiesen. Die adulten Knochenmarkszellen konnten somit als multipotente Stammzellen bezeichnet werden. Allerdings zeigte sich in Kontroll-PCRs, dass die mesenchymalen Stammzellen nach 2-wöchiger Inkubation mit 2%FCS ebenfalls ap2, beziehungsweise Osteocalcin 62

2 anschalteten. Das zeigt, dass die HMSC auch nicht gerichtet, durch Zellkontakt und Herabsetzen des FCS und damit der Wachstumsfaktoren, differenzieren können. Überraschender Weise waren die Färbungen der Kontrollzellen negativ, was bedeutet, dass die Zellen nicht zu funktionalen Zellen enddifferenzierten. Eine mögliche Erklärung dieser spontanen Differenzierung könnte sein, dass diese Zellen schon determiniert waren und durch die Erniedrigung der Wachstumsfaktoren ihrer Determination durch die Expression spezifischer Differenzierungsgene folgten. Eine vollständige terminale Differenzierung konnte in diesem Zeitabschnitt nicht erreicht werden, was möglicherweise am Fehlen wichtiger Faktoren liegt, die für eine endterminale Differenzierung oder eine Verstärkung der Differenzierung nötig sind, wie Insulin (Klemm et al., 2001). Balsam et al., zeigten, dass determinierte Stammzellen auch in vivo zu einer nicht gewollten Differenzierung führen können. Sie stellten fest, dass hämatopoetische Stammzellen nach Injektion in geschädigtes Herzgewebe positiv für GR-1, einem Granulocyten-Marker waren. Eine unspezifische Differenzierung von Stammzellen könnte ein schwerwiegendes Problem bei der Stammzelltherapie sein. Eine mögliche Lösung dieses Problems wäre eventuell eine gerichtete in vitro-differenzierung nach Expansion der Zellen, bis zu einem Vorläuferstadium der Zellen, und eine anschließende Injektion der Zellen und Enddifferenzierung im Zielgewebe. Dabei könnte man die Zellen nach Oberflächenmarkern sortieren und undifferenzierte, eventuell aber schon determinierte Zellen aussortieren Teilnahme von HMSC an der Regeneration von Muskelzellen nach Kryoschädigung Um in dieser Arbeit einen möglichen therapeutischen Einsatz für mesenchymale Stammzellen bei der Regeneration von geschädigtem Muskelgewebe zu untersuchen und deren Mechanismus, wurden DiI-markierte Stammzellen in geschädigtes Muskelgewebe injiziert. Nach 14 Tagen wurde das Gewebe isoliert und die Kryoschnitte immunhistologisch untersucht. Es wurden vereinzelt DiI-positive Zellen entdeckt, die an Muskelzellen teilnahmen. Ihre Teilnahme wurde durch eine positive MF20-Färbung bestätigt. Es konnten aber auch Areale beobachtet werden, bei denen die Mehrheit der DiI-positiven HMSC in Zellgruppen angeordnet war, aber nicht die für die Muskelzellen charakteristische Querstreifung des Myosin-Aktin-Apparates aufwiesen. Eine MF20-Antikörper-Färbung zeigte, dass diese Zellen nicht MF20-positiv waren. Man konnte somit feststellen, dass diese Zellen nicht an der Muskelregeneration teilnahmen. Entweder sind die HMSC zu Bindegewebszellen differenziert, und haben eine eher auffüllende Funktion oder es handelt sich um abgestorbene Zellen, die noch nicht abgebaut und deren Reste noch nicht von Makrophagen entfernt wurden. Die Literatur beschreibt unterschiedliche Beobachtungen zur 63

3 Teilnahme von transplantierten adulten hämatopoetischen und mesenchymalen Stammzellen am Herzmuskelgewebe. In den meisten Experimenten wurde eine sehr geringe Teilnahme der MSC am Wirtsgewebe beobachtet, was durch die Ergebnisse meiner Analysen bestätigt werden kann. Jackson et al., zeigten, dass nur 0,02% der -Aktinin exprimieren (Jackson et al., 2001). Toma et al. stellten eine 0,44%-ige Teilnahme der injizierten humanen mesenchymalen Stammzellen fest (Toma et al., 2002). Eine annähernd so starke Teilnahme der Zellen am Myokard, wie Orlic et al. beobachteten, konnten bis heute nur wenige Untersuchungen, wie zum Beispiel von Balsam et al., bestätigen (Balsam et al., 2004). Allerdings exprimierten die transplantierten Zellen nicht herzmuskelspezifische Proteine, sondern den Granulozytenmarker GR-1 (Orlic et al., 2001; Balsam et al., 2004). Auffällig war ebenso, dass bei den meisten Transplantationsexperimenten nach 9-10 Tagen die Anzahl der detektierten transplantierten Zellen sank (Orlic et al., 2001; Nygren et al., 2004) und nach 20 Tagen verschwindend klein wurde (Balsam et al., 2004). Das bestätigen auch meine Untersuchungen, bei denen festgestellt werden konnte, dass einen Monat nach Transplantation kaum noch DiI-positive Zellen zu detektieren waren. Meine Untersuchungen und die neuen Ergebnisse anderer Wissenschaftler führen zu der Frage, ob die aus dem Knochenmark isolierten mesenchymale Stammzellen durch Transplantation in geschädigtes Skelettmuskel- bzw. Herzmuskelgewebe wirklich therapeutisch nutzbar sind. In den nächsten Experimenten wurde untersucht, ob die wenigen Zellen, die in der Peripherie der Muskelzelle zu detektieren waren, durch Transdifferenzierung am Muskelgewebe teilnahmen, oder mit den murinen Muskelzellen zu chimären Muskelfibrillen fusionierten Teilnahme von HMSC an der Bildung von Myotuben durch Fusion Um den Mechanismus der Partizipierung der HMSC zu untersuchen, wurde ein in-vitro- System entwickelt. Um die in vivo-situation in vitro nachzustellen, wurden Zellen der etablierten Myoblasten-abstammenden Zelllinie C2C12 genutzt. Es wurden Kokultivierungsversuche durchgeführt, bei denen HMSC mit C2C12-Zellen auf einer Zellkulturschale kultiviert wurden. Um die humanen mesenchymalen Stammzellen identifizieren zu können, wurden sie mit einem Adenovirus infiziert, der GFP exprimiert. Nach Differenzierung der C2C12-Zellen zu Myotuben, wurden grün fluoreszierende Myotuben-förmige Zellen beobachtet. Durch eine Antikörperfärbung gegen die schwere Kette von Myosin wurde das Vorhandensein von Muskelmarkern nachgewiesen. Es bestand nun die Möglichkeit, dass mehrere grün fluoresziernde humane Stammzellen durch sekretierende Faktoren der C2C12-Zellen zur Differenzierung induziert wurden und zu humanen Myotuben fusionierten, 64

4 oder dass die Stammzellen mit reifenden Myotuben, die von den C2C12-Zellen gebildet wurden, fusionierten. Um diese Fragestellung näher zu untersuchen, wurde ein Filtermembranassay entwickelt. Es wurden Polykarbonatmembranen mit verschiedenen Porendurchmessern gewählt. Bei den Filtermembranen mit dem geringsten Porendurchmesser (0,4µm), bei dem ein Kontakt der C2C12-Zellen zu den HMSC nicht möglich ist, konnten keine doppelt-positiven Zellen beobachtet werden. Bei den Filtermembranen mit den Porendurchmessern 3,0 und 8,0µm wurden hingegen doppelt positive Myotuben durch eine MF20-Färbung sichtbar gemacht. Dabei fiel auf, dass proportional zu der Porengröße die Anzahl der GFP-und MF20-positiven Myotuben stieg. Das bedeutet, dass ein Kontakt der HMSC zu den C2C12-abstammenden Myotuben notwendig ist, um eine positive Expression für den Muskelmarker Myosin-Heavy- Chain (MHC) zu zeigen. Um zu untersuchen, ob der Kontakt zu den Myotuben ausreicht, oder ob die HMSC mit den Mausmyotuben fusionieren, verwendete ich eine Untersuchungsmethode, die von Helen Blau entwickelt wurde (Blau et al., 1985). Sie stellte fest, dass bei Kernen humaner Zellen nach einer DAPI-Färbung, eine gleichmäßig gefärbte Kernoberfläche zu beobachten ist, hingegen bei Kernen von murinen Myoblasten die Nucleoli weiß erscheinen. Bei 1000-facher Vergrößerung ist es somit möglich die humanen Kerne von den gepunkteten murinen Kernen zu unterscheiden. Außerdem sind die humanen Kerne in der Regel doppelt bis dreifach so groß, wie die murinen Kerne der C2C12-Zellen, was eine Unterscheidung der verschieden abstammenden Kerne ebenfalls erleichterte. Es wurden alle GFP-und MF20-doppelt positiven Myotuben untersucht. Es konnte festgestellt werden, dass alle doppelt positiven Myotuben ein bis zwei humane Kerne enthielten und mindestens vier murine Kerne. Das läßt den Schluß zu, dass die von mir präparierten humanen multipotenten mesenchymalen Stammzellen durch Fusion an der Bildung von Myotuben teilnahmen. Des Weiteren wurde auch durch Kokultivierung von HMSC mit primären Myoblasten Fusionen festgestellt, von denen vereinzelt chimäre Myotuben 3 Tage nach Kokultivierung kontraktil waren, was bedeutet, dass einige der chimären Myotuben funktionell sind. Die Frage, ob die Stammzellen nach Transplantation fusionieren oder transdifferenzieren spaltete die Wissenschaftler in zwei Lager. In-vivo-Versuche, die von verschiedenen Gruppen durchgeführt wurden, zeigten verschiedene Beobachtungen. Frühere Untersuchungen, bei denen Knochenmarkszellen in geschädigtes Gewebe injiziert wurden, zeigten eine Teilnahme der Zellen unter anderem am Herzgewebe, (Orlic et al., 2001; Jackson et al., 2001). Dabei wurden oft transgene Marker zur Identifikation der injizierten Zellen genutzt, die im ganzen Tier exprimiert werden und nicht unter Kontrolle eines gewebsspezifischen Promotors stehen (Jackson et al., 2001; Orlic et al., 2001). Das bedeutet, dass die Knochenmarkszellen auch ebenso mit Kardiomyozyten und Endothelzellen der geschädigten Region zu Chimären hätten fusionieren können und 65

5 dadurch falsch positive Signale für gewebsspezifische Marker, wie -Aktinin für Herzmuskelzellen und Flt-1 für endotheliale Zellen zeigen können (Jackson et al., 2001). Weiterhin wurde in neueren Experimenten eine Teilnahme der Zellen am Myocardium durch Transdifferenzierung widerlegt (Balsam et al., 2004; Murry et al., 2004). Wenn man diese Untersuchungen betrachtet, ist eine Tendenz zu verzeichnen, die eine Transdifferenzierung von adulten Stammzellen und damit den therapeutischen Nutzen der Zellen bei dem heutigen Stand der Wissenschaft in Frage stellt HMSC halten ihre endogene Expression aufrecht und führen zur Reprogrammierung muriner Myotubenkerne Durch die in vitro-untersuchungen von Helen Blau, auf die im vorigen Kapitel kurz eingegangen wurde, konnte gezeigt werden, dass die in das Synzytium eintretenden fremden Zellen ihr genetisches Programm umstellen und muskelspezifische Marker exprimieren können (Blau et al., 1985). Spätere Untersuchungen zeigten Reprogrammierungen von mesenchymalen Stammzellen nach Fusionen mit embryonalen Stammzellen, wobei die adulten Zellen den embryonalen Faktor Okt4 exprimierten, was darauf hindeutet, das die mesenchymalen Stammzellen ihr genetisches Programm umstellen und den Phänotyp der Rezipienten-Zelle nachahmen (Ying et al., 2002; Terada et al., 2002). In den folgenden Exerimenten wurden die humanen Stammzellen auf eine mögliche Reprogrammierung per RT-PCR untersucht. Es wurde die Genexpression der muskelspezifischen Marker Myf3 und Myogenin analysiert. Es konnte keine myogene Expression der spezifischen humanen Muskelproteine Myf3 und Myogenin detektiert werden. Das bedeutet, dass diese Zellen nach Fusion zu den reifenden Myotuben nicht das Schicksal der myogenen Differenzierung in dem Zeitraum der Kokultivierung einschlagen. Ein nächster interessanter Aspekt war, in wiefern sich der Differenzierungsstatus der HMSC in der Myotube ändert, oder ob die Zellen weiterhin humane Proteine exprimieren. Dafür wurden Antikörper ausgewählt, die spezifisch humane Proteine detektieren und nicht mit Proteinen der Maus-Myoblasten bzw. Myotuben interagieren. Zum einen wurde ein Antikörper gegen das humane Vimentin genutzt. Vimentin-Filamente sind Intermediär- Filamente der Fibroblasten und Endothelzellen, die eine wichtige Rolle bei der Kontraktilität, Migration, Proliferation und der Verstärkung der Zelle spielen (Wang et al., 2002). Des Weiteren wurde eine RT-PCR zum Nachweis der Expression von Vimentin in humanen mesenchmyalen Stammzellen durchgeführt, die eine positive Vimentin-Expression zeigte. Ein weiterer spezifischer Antikörper, der an die -Untereinheit der Prolyl 4-Hydroxylase bindet, welche ein Schlüsselenzym bei der Collagensynthese darstellt (Coivunen et al., 2005), wurde verwendet, um die HMSC zu identifizieren. 66

6 Antikörper-Färbungen gegen humanes Vimentin und den myogenen Marker MF20 zeigten chimäre Myotuben, die das humane Protein Vimentin enthielten. Entgegen der Vermutung, dass humane Proteine der fusionierten HMSC relativ schnell abgebaut werden, zeigten die Untersuchungen, dass nach 5-6 Tagen immer noch Vimentin nachzuweisen war. Aus technischen Gründen wurde bei weiteren Färbungen ein Antikörper verwendet, der an das Kern-lokalisierte myogene Protein Myogenin bindet. Myogenin, ein Transkriptionsfaktor, der eine wichtige Rolle in der Muskeldeterminierung spielt, wird in Myoblasten exprimiert, die anschließend aus dem Zellzyklus austreten und zu Myozyten differenzieren, um terminal zu Myotuben zu fusionieren (Charge et al., 2004; Andres et al., 1996). Antikörper-Färbungen gegen die humane Prolyl 4-Hydroxylase oder humanes Vimentin und Myogenin zeigten chimäre Myotuben, die sowohl positiv für Myogenin als auch für die humanen Fibroblasten- Marker waren. Jedoch war in einigen Fällen zu beobachten, dass in einem Teil der Myotube, in dem der humane Antikörper positiv detektiert wurde, einige Kerne negativ für Myogenin waren. In dem Teil hingegen, in dem die humane Prolyl 4-Hydroxylase, bzw. humanes Vimentin nicht nachgewiesen werden konnte, waren alle Kerne positiv für Myogenin. Die Myogenin-negativ gefärbten Kerne deuteten auf eine partielle Reprogrammierung der chimären Myotube hin. Interessanterweise zeigten Konieczny et al. durch Kokultivierungs- Experimente von Myozyten mit proliferierenden Myoblasten, dass regulatorische Faktoren der undifferenzierten Zellen, in seinem Fall, der Myoblasten, die Expression von Myosin der differenzierten Zelle (Myozyte) dominieren und für die Extinktion des muskelspezifischen Proteins verantwortlich sind (Konieczny et al., 1983). Das würde bedeuten, dass die fusionierte HMSC in der chimären Myotube Faktoren exprimiert, die zu einer Unterdrückung der Myogenin-Expression der murinen Kerne führt. Wenn man bedenkt, dass eine Stammzelle daran interessiert ist, ihr undifferenziertes Stadium aufrechtzuerhalten, ist es nicht undenkbar, das eben diese Faktoren, die für den Selbsterhalt der Stammzelle verantwortlich sind, auch eine Rolle bei der Ausschaltung der Myogenin-Expression eine Rolle spielen könnten. Diese Beobachtungen stehen im Gegensatz zu den Erkenntnissen von Blau et al., die eine Anschaltung von myogenen Faktoren der fusionierten humanen Amniozyten beobachtete (Blau et al., 1983). Die unterschiedlichen Beobachtungen könnten durch die unterschiedlich verwendeten Zelltypen begründet sein. Helen Blau verwendete humane Amniozyten, die in ihren Experimenten nicht auf ein mögliches Stammzellpotential untersucht wurden. Eine mögliche Erklärung wäre, dass die Amniozyten weiter differenziert waren und keine Faktoren exprimierten, die inhibierend auf die Expression der muskelspezifischen Gene der Myotube wirkten. Denn Konieczny et al., zeigten in Kontrollexperimenten, bei denen er sowohl differenzierte Hühnchen- als auch Ratten- Myozyten verwendete, dass kein Abfall der muskelspezifischen Genexpression zu verzeichnen war (Konieczny et al., 1983). Die Frage ist, welche Faktoren für die Inhibition 67

7 der Myogenin-Expression der murinen Kerne verantwortlich sind. Dafür könnte es verschiedene Erklärungen geben. Eine Möglichkeit wäre, dass Proteine der humanen mesenchymalen Stammzelle zu einer Reprogrammierung, in Form einer Dedifferenzierung im Areal der dazu fusionierten Stammzelle führen. So konnte in C2C12-Zellenabstammenden Myotuben, in denen MSX1 (muscle segment homeobox-protein1), ein Inhibitor der Myogenese, ektopisch überexprimiert wurde, eine erniedrigte Expression der Muskelproteine, wie MyoD, Myogenin und MRF4 festgestellt werden. Die vielkernigen Myotuben entwickelten sich entweder zu kleineren Myotuben oder zu proliferierenden einkernigen Myoblasten zurück (Odelberg et al., 2000). Eine Dedifferenzierung der chimären Myotuben zu wenigkernigen Myotuben oder einkernigen Myoblasten konnte in meinen Kokultivierungsexperimenten jedoch nicht beobachtet werden. Eine andere Theorie wäre, dass die Genexpression von Myogenin still gelegt wurde, auch Silencing genannt. Verantwortlich für eine Stilllegung der Expression spezifischer Gene sind zum Beispiel DNA-Methyltransferasen und Deazethylasen. Sie haben eine wichtige Aufgabe beim Chromatin-Struktur-Remodeling. Chromatin-Struktur-Remodeling bedeutet die Modulation der Genexpression durch Inhibition oder Promotion der DNA-methylierung undazethylierung (Cerny et al., 2004). Die DNA-Methyltransferasen übertragen Methylreste auf das Cytosin von CpG-Dinucleotiden, die sich in Promotorregionenen als sogenannte CpG- Inseln befinden. Die CpG-reichen DNA-Abschnitte werden durch Methylierung für die Anlagerung von Transkriptionsfaktoren blockiert und verhindern dadurch die Transkription spezifischer Gene (Boyes and Bird 1991). Weiterhin führt eine Deazethylierung von Histonen durch Histondeazethylasen zu einer stärkeren Kondensierung der DNA, was eine Transkription spezifischer Abschnitte verhindert und zu einem Stilllegen von Genen führt (Fry und Peterson, 2001). Im Gegensatz dazu werden durch Azethylierung der Histone bestimmte DNA-Abschnitte aufgelockert und gewebsspezififische Gene transkribiert. Es könnten somit Deazethylasen und DNA-Methyltransferasen der humanen fusionierten Stammzelle für eine Deazethylierung der Histone, bzw. für eine Methylierung der Promotorsequenz bestimmter DNA-Abschnitte einzelner muriner Kerne verantwortlich sein. Allerdings bleibt unklar, warum nicht murine Azethylasen und Methylasen die humane Stammzelle nach Fusion reprogrammierten und eine myogene Expression förderten. Eine mögliche Erklärung dafür könnte die kurze Inkubationszeit der Myotuben sein. Die in vitro- Differenzierung der C2C12-Zellen muß 5-6 Tage nach Beginn des Mediumwechsels beendet werden, da die Myotuben sonst apoptotisch werden. Es könnte sehr gut möglich sein, dass die HMSC in der ersten Zeit nach ihrer Fusion zu der Myotube noch eine bestimmte Zeit ihr Programm aufrecht erhalten und die Reprogrammierung und myogene Expression erst später, außerhalb meines Beobachtungszeitraumes einsetzt. Die "Resistenz" der Umprogrammierung der humanen Stammzellen kann man nicht abschließend klären. Dazu 68

8 wären weitere Untersuchungen erforderlich. Außerdem müsste durch in vivo- Untersuchungen geklärt werden, ob es sich lediglich um einen Zellkultur-Artefakt handelt, oder ob die fehlende Umprogrammierung der HMSC nach Transplantation von Stammzellen in den lebenden Organismus, bei der Teilnahme durch Fusion ebenfalls Relevanz hat und zu bedenken ist. Zusammenfassend kann man sagen, dass die humanen mesenchymalen Stammzellen durch Fusion an der Myotubenbildung in vitro teilnehmen. Es konnte keine Expression der myogenen Marker, wie MyoD und Myogenin festgestellt werden. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die fusionierten HMSC die Expression der humanen Proteine weiter aufrechterhalten und die myogene Expression einiger muriner Kerne im Bereich der fusionierten HMSC unterdrücken. Diese Beobachtungen lassen den Schluss zu, dass humane mesenchymale Stammzellen in diesem Stadium der Untersuchungen noch nicht generell geeignet sind, um therapeutisch eingesetzt zu werden. Die spontane ungerichtete Differenzierung einiger Zellen, die niedrige Teilnahme der Stammzellen bei der Regeneration des Muskelgewebes bei den in vivo Versuchen, die fehlende Transdifferenzierung zu myogenen Zellen und die Resistenz der Umprogrammierung der Zelle nach der Fusion mit reifenden Myotuben stellen große Barrieren und Gefahren dar, um diese Zellen für eine Muskelreperatur nach Verletzungen von Muskelgeweben oder zur Muskelregenration, zum Beispiel bei Patienten mit Duchene Muskeldystrophie einzusetzen Regulation der Fusionsprozesse In weiteren Experimenten wurde untersucht, welche Prozesse und Faktoren bei der Fusion zwischen den beiden unterschiedlich abstammenden Zelltypen und der Bildung von chimären Myotuben eine Rolle spielen. Es sind verschiedene Faktoren bekannt, die einen Einfluß auf die Fusion von Myoblasten zu reifen Myotuben ausüben, unter anderem das Zytokin IL-4. IL-4 wurde durch frühere Untersuchungen als Zytokin bekannt, dass eine wichtige Rolle bei inflammatorischen Immunantworten spielt. Es ist zusammen mit IL-13 für die IgE-Synthese während der allergischen Entzündungsreaktion verantwortlich und wird von Mastzellen, Basophilen, T- Zellen und B-Zellen produziert (Shirakawa et al., 2000). Durch die Bindung von IL-4 an seinen Rezeptor wird weiterhin die VCAM-Expression auf endothelialen Zellen induziert, was für die Wanderung der Eosinophielen durch das Endothel zum Entzündungsort eine wichtige Rolle spielt (Shakoory et al., 2004). Durch Stimmulierung der Expression des Chemokins Eotaxin, wird außerdem die Migration durch chemotaktische Anlockung gefördert. Spätere Untersuchungen ergaben, dass IL-4 für die Fusion von Myozyten bei der Myotuben- Reifung bedeutend ist (Horsley et al., 2003). Die Expression von IL-4 wird durch die 69

9 nucleären Faktoren von aktivierten T-Zellen (NFATC2) kontrolliert, die in reifenden Myotuben aktiv sind. IL-4 bindet an den IL-4-Rezeptor von Myoblasten und löst einen Signalweg aus, der die Myoblasten veranlasst mit der reifenden Myotube zu verschmelzen (siehe Abb.31). Untersuchungen von NFATC2-Null-Mutanten ergaben, dass die Myotuben wesentlich schmaler sind und weniger Kerne pro Myotube aufweisen (Horsley et al., 2003). Des Weiteren wurde bei NFATC3-Knock-out Mäusen eine Erniedrigung der Muskelzellgröße beobachtet (Kegley et al., 2001). Die transkriptionelle Kontrolle von IL-4 durch NFATC3 ist bisher nur von T-Zellen bekannt (Rengarajan et al., 2002). Myoblasten Reifende Myotube Reife Myotube NFATc2 IL-4 IL-4 IL-4-R Abb.31: In Anlehnung an Horsley et al., 2003, Myotuben-Reifung: In der ersten Phase fusionieren Myoblasten zu einer reifenden Myotube. In der reifenden Myotube wird NFAT als Transkriptionsfaktor aktiv und verstärkt eine IL-4-Transkription und Expression. Das IL-4 bindet an den IL-4-Rezeptor einer Myoblasten-Zelle und löst einen Signalweg aus, der Myoblasten veranlasst mit der Myotube zu verschmelzen. Um zu untersuchen, ob IL-4 auch ein potentieller Faktor ist, der zur Erhöhung der Fusion zwischen HMSC und den reifenden Myotuben beiträgt, wurden verschiedene Kokultivierungsexperimente mit C2C12-Zellen und HMSC durchgeführt. Da bisher unbekannt war, ob mesenchymale Stammzellen den IL-4-Rezeptor exprimieren, wurde die Expression des Rezeptors der HMSC durch RT-PCR und immunhistochemische Färbung untersucht. Es werden zwei Interleukin-4-Rezeptoren beschrieben, der TypI-IL-4-Rezeptor und der TypII- IL-4-Rezeptor. Der TypI-Rezeptor wird vorzugsweise von hämatopoetischen Zellen exprimiert und besteht aus der Il- -Untereinheit und der IL-4-yc-Einheit. An diesen bindet ausschließlich Il-4. Der TypII-Rezeptor wird auf hämatopoetischen und nichthämatopoetischen Zellen z.b. Fibroblasten exprimiert und war deshalb von besonderem Interesse bei den folgenden Untersuchungen. Er besteht aus der IL-4- -Untereinheit und der IL- -Untereinheit (siehe Abb. 27), wodurch eine Bindung von Il-4 und Il-13 möglich ist (Chatila et al., 2004). Durch die Bindung von Interleukin 4 an die IL-4- -Untereinheit wird die Januskinase-1 aktiviert, die wiederum verschiedene Signaltransduktionen auslöst. Zum einen werden verschiedene Proteinkinasen aktiviert, wie PDK1/2, Akt und p70s6-kinase, 70

10 welche die Proliferation der Zelle unterstützen (Kelly-Welch et al., 2003). Zum anderen wird der Transkriptionsfaktor STAT6 durch Phosphorylierung rekrutiert. Das aktivierte STAT6 dimerisiert mit einem zweiten phosphorylierten STAT6, wandert als Dimer in den Kern und bindet an eine spezifische Promotor-Region (Abb. 32), um die Transkription spezifischer Gene, z.b. Eotaxin zu regulieren (Hou et al., 1994; Akiho et al., 2002; Takamura et al., 2004). Auf diese Weise könnte die Transkription von Zielgenen aktiviert werden, die für eine verstärkte Fusion der HMSC zu den Myotuben verantwortlich ist. Durch RT-PCR konnte eine Expression der IL-4-R-Untereinheiten IL-4-R- -13-R- der HMSC nachgewiesen werden. Die Expression des IL-4-Rezeptors konnte durch eine immunhistochemische Färbung mittels eines IL-4-R-Ak bestätigt werden. Die Expression des Rezeptors war je nach Präparation unterschiedlich. Ungefähr 1-6% der HMSC exprimierten den IL-4-R. Eine Abnahme der IL-4-R-Expression konnte mit Erhöhung der Passagen verzeichnet werden. Die Abnahme des IL-4-R korrelierte mit der Abnahme der Fusionsfähigkeit der Zellen. Eine Erklärung könnte sein, dass im Laufe der in vitro- Kultivierung immer mehr Zellen differenzieren und ihren Stammzellcharakter verlieren und dabei ebenso ihre Fähigkeit verlieren zu fusionieren. IL-4-R IL-13R 1 Jak1 Y STAT 6 Y Y P P STAT 6- Dimer P P STAT 6- Dimer Genexpression Abb.32: Übersicht über den IL-4-Signalweg durch Aktivierung von STAT 6 (in Anlehnung an Kelly-Welch et al., 2003) 71

11 Um den Einfluß von IL-4 auf die Fusionsrate zu untersuchen, wurde das Zytokin in einer Konzentration von 5 ng/ml zugegeben. Das Ergebnis zeigte nach Zugabe von IL-4 einen erheblichen Anstieg der Fusionsrate der HMSC. Die Statistische Auswertung ergab, dass die Fusion der HMSC mit den reifenden Myotuben um den Faktor 2,5-3 erhöht wurde. Eine Erhöhung der Interleukin-4-Konzentration führte zu keiner weiteren Erhöhung der Fusionsrate. Es wurden verschiedene Konzentrationen eines Rezeptor-Antikörpers eingesetzt, um eine Abnahme der Rekrutierung der HMSC zu chimären Myotuben zu erreichen. Beim Einsetzen des Rezeptor-Ak in den Konzentrationen 5ng/ml und 50ng/ml konnte eine Erniedrigung der Fusionsrate beobachtet werden. Bei einer Konzentration von 50 ng/ml des IL-4R-Ak wurde die Fusionsrate über 50% gegenüber der Kontrolle erniedrigt. Dieses zeigte deutlich, das IL- 4 durch die Bindung an seinen Rezeptor die Fusion durch Aktivierung von Zielgenen fördert Mesenchymale Stammzellen nehmen durch eine NFAT/IL-4- vermittelte Fusion an der Muskelbildung teil Wie in dem vorherigen Abschnitt beschrieben, wird die IL-4-Expression von den Transkriptionsfaktoren NFATC2 und NFATC3 reguliert. Ob dieser Signalweg auch für die Fusion von mesenchymalen Stammzellen zu Myotuben verantwortlich ist, wurde durch invivo-experimente näher untersucht. Es wurde ein in vivo-system genutzt, bei dem adulte murine Knochenmarkszellen (MASC-multipotent adult stem cells) aus MLC1/3-LacZtransgenen Mäusen isoliert wurden (Kelly et al., 1995). Das LacZ-Gen steht unter transkriptioneller Kontrolle eines MLC (myosin-light-chain)-promotors. Eine LacZ-Färbung von Embryonen 10,5d und 13,5d zeigte positive Zellen im Dermomyotom und in der Randzone des Herzgewebes. Die MASC wurden in Wt-Blastozysten und in Blastozysten von NFATC2-Mutanten und NFATC2/C3-Doppelmutanten implantiert. In den Wildtyp-Mäusen konnte mittels von LacZ-Färbungen der Embryonen des Embryonalstadiums 10,5d LacZpositive Zellen im Dermomyotom, aber nicht im Herz festgestellt werden. Das heißt, dass die implantierten Zellen im Herzen den MLC-Promotor nicht anschalteten. Bei den NFATC2-oder NFATC2/C3-Doppelmutanten wurden kaum (NFATC2-KO-Chimäre), bzw. keine LacZpositiven Zellen (NFATC2/C3-KO-Chimäre) detektiert. Eine PCR mit spezifischen Primern zum Nachweis des LacZ-Gens, zeigte jedoch, dass MASC der MLC1/3-LacZ-transgenen Mäuse in verschiedenen Geweben nachzuweisen waren. Das bedeutet, dass die MASC im Muskelgewebe zwar anwesend sind, aber weder zu Muskelzellen differenzieren, noch durch Fusion an der Bildung von Muskelzellen teilnahmen. Dieses in vivo-experiment veranschaulichte, dass MASC zur Entwicklung der Skelettmuskulatur durch eine NFATC2/C3/IL-4-vermittelte Zellfusion und nicht durch Transdifferenzierung beitragen. An 72

12 dieser Stelle muß noch einmal erwähnt werden, dass oft Zellmarkierungen genutzt werden, die nicht unter transkriptioneller Kontrolle eines Gewebespezifischen Gen stehen, und es somit zu falsch positiven Ergebnissen führen können (Orlic et al., ; Wang et al., 2001; Davani et al., 2004). Wie in vorherigen Abschnitten beschrieben, zeigte sich in den in vitro- Experimenten keine Reprogrammierung und Expression myogener Faktoren. Wie schon im Diskussionsteil erklärt, ist die Wahrscheinlichkeit gegeben, dass die chimären Myotuben der in vitro-kultur zu kurz inkubiert wurden, um eine mögliche Reprogrammierung und Expression von myogenen Faktoren zu beobachten. Außerdem war nicht bei allen chimären Myotuben eindeutig ein Einfluß auf die murinen Kerne zu beobachten. Ein weiterer wichtiger Punkt sind die verschiedenen Systeme, in denen gearbeitet wurde. Die Stilllegung der murinen Kerne wurde in einem in vitro-system beobachtet, bei dem menschliche und murine Zellen kokultiviert wurden. Die in vivo-versuche wurden mit Mausstammzellen durchgeführt. Ergänzende Untersuchungen wären nötig, wie die Kokultivierung von humanen primären Myoblasten mit humanen mesenchymalen Stammzellen, um ein Zellkulturartefakt durch die von mir verwendeten unterschiedlichen Spezies auszuschließen. Des Weiteren haben die murinen Stammzellen die Embryonalentwicklung bis zum Tag 13,5 durchlebt. Faktoren die während der Embryonalentwicklung, aber nicht von den C2C12-Zellen nicht exprimiert werden, z.b. Sonic hedgehog, welches während der Embryonalentwicklung vom Notochord und der Neuralplatte exprimiert wird (Fan und Tessier-Lavigne, 1994) und Wnt-Proteine, z.b. Wnt1 und Wnt7a, welche die Expression von MyoD und Myf5 fördern (Wodarz und Nusse, 19998; Kengaku et al., 1998) könnten für das Aufheben der Reprogrammierungsblockade verantwortlich sein und zur Transdifferenzierung der MLC1/3LacZ-abstammenden mesenchymalen Stammzellen geführt haben Potentielle Zielgene von IL-4 Nach dieser Erkenntnis stellte sich die Frage, welche Zielgene durch IL-4 aktiviert werden, welche die Fusion der HMSC mit den Myotuben fördern. Ein wichtiges Protein, das bei der Fusion zwischen Myoblasten und Myotuben in der späten Phase der Myotubenreifung eine Rolle spielt, ist VCAM-1 (Vascular-Cell-Adhäsions-Molekül1). VCAM-1 ist ein Adhäsionsmolekül, das auf sekundären Myoblasten und sekundären Myotuben exprimiert -Integrin (VLA-4) interagiert. Es wurde beobachtet, dass die Interaktion von VLA-4 mit VCAM-1 das Aneinanderlagern der sekundären Myoblasten zu den Myotuben und damit die Fusion und Reifung zu vielkernigen Myotuben fördert (Rosen et al., 1992). In vivo konnte dieser Zusammenhang jedoch bis heute nicht bestätigt werden (Yang et al., 1996). Um die Problematik klären zu können, bedarf es weiterer Experimente. Fest steht, das VCAM-1 nicht nur auf Myoblasten, sondern auch auf cornealen Fibroblasten und 73

13 multipotenten Zellen, die aus dermalen Gewebe isoliert wurden, exprimiert wird (Kumagai et al., 2003; Chunmeng et al., 2004). Weiterhin konnte festgestellt werden, dass die Expression von VCAM-1 in Fibroblasten durch IL-4 erhöht wurde. Somit ist es vorstellbar, dass eine erhöhte Expression von VCAM auf den HMSC eine bessere Anlagerung an die Myotuben ermöglicht und somit die Fusion zu chimären Myotuben unterstützt. Um diese Hypothese zu unterstützen, bedarf es jedoch weiterer Untersuchungen. Ein weiteres mögliches Ziel-Gen des IL-4 ist das Chemokin Eotaxin. Es ist bekannt, das epitheliale Zellen des Lungenepithels Eotaxin nach IL-4-Induktion exprimieren (Heller et al., 2004). Eotaxin wirkt unter anderem als Chemoatraktant, der die Migration von Eosinophilen zum Entzündungsort fördert (Ponath et al., 1996). Weitere Untersuchungen zeigten eine IL- 4-induzierte STAT-6 vermittelte Eotaxin-Expression von dermalen Fibroblasten, die eine Erklärung für die erhöhte Migration von Eosinophilen in die Dermis bei einer inflammatorischen Immunantwort darstellen könnte (Heller et al., 2004 ). Es wäre durchaus möglich, dass nach Einwandern der HMSC in den Ort der Schädigung, eine durch IL-4- induzierte Expression des Eotaxins, eine Wanderung weiterer mesenchymaler Stammzellen oder Eosinophile zum geschädigten Gewebe fördert. Abschließend kann man sagen, das IL-4 die Fusion der HMSC mit reifenden Myotuben um den Faktor 3 fördert. Weiterhin konnte durch Injektionen aus MLC1/3LacZ-transgenen Mäusen isolierte MASC in Blastozysten von Wildtyp-, NFATC2-und NFATC2/C3-Knock-out Mäusen gezeigt werden, dass die Stammzellen durch eine NFAT/IL-4-vermittelte Signalkaskade gefördert wird Fusionsereignisse bei dermaler Fibroblasten und Vorhaut- Fibroblasten Die Dermis besteht aus einer heterogenen Zellpopulation, die sich aus Fibroblasten, dentritische Zellen und Leukozyten zusammensetzt. Dermale Fibroblasten haben eine wichtige regulatorische Aufgabe für die Physiologie der Haut. Sie bilden die extrazelluläre Matrix und kommunizieren miteinander und mit anderen Zelltypen. Zudem spielen sie eine wichtige Rolle bei der Wundheilung der Haut. Im gesunden Gewebe sind dermale Fibroblasten inaktiv, aber durch Schädigung der Haut kommt es zur Freisetzung von Zytokinen, die Fibroblasten aktivieren können. Die aktivierten Fibroblasten wandern in die verletzte Region, proliferieren und differenzieren schließlich zu Myofibroblasten, die sich durch die Expression kontraktiler Elemente auszeichnen (Gabbiani et al., 1976). Myofibroblasten produzieren eine provisorische Matrix, welche reich an Fibronectin und Hyaluronan ist und fördern die Wund-Kontraktion (Singer and Clark 1999). Später wurde erkannt, dass einige Zellen aus Fibroblastenkulturen ebenfalls, wie mesenchymale 74

14 Stammzellen in der Lage sind zu Adipocyten, Chondrozyten und Ostoblasten zu differenzieren (Sorisky et al., 1996; French et al., 2004; Rutherford et al., 2002). Durch eine Überexpression von MyoD in dermalen Fibroblasten konnte ebenso eine myogene Differenzierung beobachtet werden (Choi et al., 1990). Chaudhari et al., stellte fest, dass Fibroblasten zu spontan kontrahierenden Myotuben fusionieren (Chaudhari et al., 1989). Es wurde bis jetzt jedoch noch nicht untersucht, ob die Fusionsereignisse und das Differenzierungspotential der Fibroblasten und Stammzellen vergleichbar sind. Um zu untersuchen, ob ein Zusammenhang zwischen den Fusionsereignissen und der Differenzierungsfähigkeit besteht, wurden zusätzlich zu den HMSC, Fibroblasten verwendet, die aus unterschiedlichem Gewebe abstammen. Primäre dermale Fibroblasten, welche aus einer Biopsie gewonnen wurden, und Vorhaut-Zellen von der Firma ATCC wurden genutzt, um durch Kokultivierung mit C2C12-Zellen eine mögliche Fusion zu beobachten. Bei beiden Zelltypen konnte eine Fusionspotenz festgestellt werden. Auffällig war, dass weniger Zellen der primären dermalen Fibroblastenkultur und nur vereinzelt Vorhaut-Fibroblasten zu chimären Maus-Mensch-Myotuben fusionierten. Die erniedrigte Fusionsrate korrelierte ebenso mit der erniedrigten IL-4-R-Expression, was noch einmal die fördernde Funktion des IL-4-Rezeptors für die Fusion fibroblastidärer Zellen mit reifenden Myotuben unterstreicht. Weitere mögliche fusionsfördernde Faktoren könnten Adhäsionsmoleküle, wie VCAMs und NCAMs sein, die die Zell-Zell-Interaktion fördern. Da auch humane mesenchymale Stammzellen VCAMs bzw. NCAMs exprimieren (Majumdar et al., 2003), ist es vorstellbar, dass auch diese Oberflächenmoleküle für eine bessere Anlagerung an die reifende Myotube verantwortlich sind, in dem sie dort mit Oberflächenmolekülen, zum Beispiel dem ß1-Integrin (Schwander et al., 2003), der Myotube interagieren und so die Fusion fördern. Interessanterweise zeigte eine immunhistochemische Färbung mit einem Anti-Myogenin-und einem Anti-Fibroblasten-Antikörper, ebenfalls eine Reprogrammierung einiger muriner Kerne, in dem Teil der Myotuben, der eine stark positive Färbung für das humane Enzym zeigte. Durch Zugabe des Zytokins IL-4 konnte ebenso, wie bei den HMSC, eine Erhöhung der Fusionsrate beobachtet werden. Allerdings wurde festgestellt, dass bei den Vorhaut- Fibroblasten die Fusionen nach einigen Passagen deutlich abnahmen und selbst nach IL-4- Zugabe keine Bildung von chimären Myotuben mehr beobachtet werden konnte. Durch Differenzierungassays wurde weiterhin untersucht, wie hoch das Differenzierungspotential der dermalen Fibroblasten und der Vorhaut-Fibroblasten ist. Dazu wurden die Zellen mit adipogenen Faktoren inkubiert. Die Oil-Red-Färbung zeigte, dass die dermalen Fibroblasten gegenüber den HMSC ein vermindertes Differenzierungspotential besaßen. Nur 10% der dermalen Fibroblasten differenzierten zu Adipozyten. Bei den Vorhaut-Zellen differenzierten weniger als 1% zu Fettzellen. Wenn man nun die Ergebnisse zusammenfasst, fällt auf, dass ein proportionales Verhältnis zwischen der Fusionskompetenz und dem 75

15 Differenzierungspotential der verschiedenen Zellen, HMSC, dermale Fibroblasten und Vorhaut-Fibroblasten bestehen. Bei den HMSC, die sehr stark fusionierten, war auch eine sehr hohe Differenzierung zu beobachten, während bei den dermalen Fibroblasten das Fusionspotential, sowie das Differenzierungspotential stark abnahm. Die Vorhaut- Fibroblasten zeigten relativ selten sowohl Fusions-als auch Differenzierungsereignisse. Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass die Zellen, die in der Lage sind zu fusionieren auch eine Differenzierungspotenz besitzen, und es sich somit um Stammzellen bzw. Zellen mit Stammzelleigenschaften handeln. Da aber sehr viel weniger Zellen fusionierten (bis17 % der Gesamtzellzahl), als differenzierten (90% der HMSC differenzierten zu Fettzellen), handelt es sich dabei wahrscheinlich um eine Subpopulation der Stammzellen. Vor allem bei den Fibroblasten der primären Fibroblasten-Kultur ist es sehr gut denkbar, dass sich in der Kultur Stammzellen befinden. Die Haut ist ein Organ mit einer sehr hohen Regenerationsfähigkeit. Um die Hautregeneration zu gewährleisten sind Vorläuferzellen oder Stammzellen nötig. Dass einige der Zellen sowohl der dermalen Fibroblastenkultur, als auch der Vorhaut-Fibroblasten, sich in Fettzellen differenzieren ließen, zeigt, dass diese Zellen eine gewisse Plastizität besitzen. Da keine weiteren Differenzierungsassays (osteogene Differenzierung, chondrogene Differenzierung) durchgeführt wurden, kann man sagen, dass diese Zellen zumindestens unipotente Stammzellen sind, die eine Fähigkeit zur Fettdifferenzierung haben. Ob die Fähigkeit der Differenzierung zu bestimmten Zelltypen und die Fähigkeit zur Fusion Ausdruck einer spezifischen Eigenschaft von Stammzellen sind oder ob beide Fähigkeiten unabhängig voneinander als Ausdruck einer Stammzellprogrammierung lediglich mit diesem Zelltyp korrelieren, müssen weitergehende Untersuchungen klären. 76