Teil 2: Was sind Stammzellen? Fusion einer HSZ mit einer Purkinjezelle

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1 Teil 2: Was sind Stammzellen? Fusion einer HSZ mit einer Purkinjezelle 1

2 Was erwartet Sie in dieser Vorlesung? (heute und in den kommenden Wochen) 1 - Einführung: Hype and Hope von SZ 2 - Definitionen, allg. Begriffe, Gewinnung, Kultivierung 3 - Embryonale SZ 4 - Adulte SZ: HSCs 5 - Adulte SZ: MSCs 8 - Tumor-SZ 11 - ips 6 - Signalvermittlung 7 - SZ-Nischen 9 - Pluripotenz 10 - Epigenetik 11 - Reprogrammierung Regenerative Medizin, Tissue Engineering Biomaterialien, Zell- und Gewebetransplantate Biologische und Gentherapien Verschiedene Gewebeund Organsysteme und assoziierte Erkrankungen: Bindegewebe Neuronale Gewebe Herz 2

3 Allgemeine Begriffe der Stammzellforschung Allgemeine Begriffe der Stammzellforschung: Definition SZ Potenzen (Entwicklungspotential) von Stammzellen: Omnipotenz/ Pluripotenz/ Multipotenz/ Oligopotenz usw. Plastizität/ Metaplasie/ Transdifferenzierung/ Re- und Dedifferenzierung Klassen oder Sorten von Stammzellen: embryonale SZ induzierte pluripotente SZ adulte SZ, fötale SZ Tumor-SZ 3

4 Definition Stammzelle eine einzelne (klonale) Zelle, die bei der Zellteilung sowohl eine Tochterzelle mit Stammzelleigenschaften (Selbsterneuerung) als auch eine Tochterzelle mit differenzierteren und somit eingeschränkteren Eigenschaften (Differenzierung/ Maturierung) erzeugt ( functional progeny ). In der Regel sind mindestens zwei differenzierte Zelltypen möglich. Stammzelle lebenslänglich Reprogrammierung (4 TF) Selbsterneuerung Self-renewal Differenzierung/ Maturierung 4

5 Einzelzellnachweis wenig stringent: Verdünnung Klonierungsringe deutlich stringenter: FACS Mikromanipulator Markierung z.b. durch Retroviren (Markergene) 5

6 Begriffe der Stammzellforschung Selbsterneuerung in vivo: mindestens eine Nachkommenzelle ist mit der Ausgangs- SZ identisch Selbsterneuerung/ Immortalität in Kultur: pluripotente SZ: theoretisch unlimitiert, schaffen mehr als 160 Verdopplungen ohne onkogene Transformation ( Telomere, Seneszenz) Adulte SZ und somatische Zellen: endliche Zahl von Zellteilungen (< 80) 6

7 Begriffe der Stammzellforschung Differenzierung := Erwerb von zelltyp-spezifischen morphologischen, phänotypischen UND funktionellen Eigenschaften 7

8 Wie werden Selbsterneuerung und Differenzierung gesteuert? Wieso oder wann unterscheiden sich Tochterzellen? 8

9 Symmetrische Zellteilung: Blastomere in Embryonalentwicklung (in vivo), pluripotente Stammzellen (ESZs, IPSCs) in Kultur: zwei identische Tochterzellen exponentielle Erhöhung der Zellzahl ZZ/ Masse zu erhöhen 9

10 Figure 23-8 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) selten/ langsam rasch/ große Zellmengen Begriffe für Stammzellen, um Einschränkungen der Entwicklungsfähigkeit zu beschreiben: Vorläuferzellen, Progenitorzellen, Precursorzellen, gewebespezifische SZ, stem-like cells, committed cells, transit cells 10

11 Asymmetrische Zellteilung: adulte SZ: Eine Progenitorzelle und eine sich differenzierende Tochterzelle mit symmetrischer Zellteilung 11

12 2 Mechanismen der asymmetrischen Zellteilung extrinsischer Mechanismus Umgebung beeinflußt Entwicklung Anzahl der Zellen kann der biologischen Nische rasch angepaßt werden Verbleib in SZ-Nische Erhöhung der SZ-Zahl/ Kompensation von SZ- Verlust möglich, wenn Nische frei ist! 12

13 Drosophila-Ovar: Keimlinien (GSC)- und somatische (SSC) SZ kontaktieren Nischenzellen niche cell GSC niche cell SSC Li, L. und Xie, T.: Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 21, S (2005) 13

14 2 Mechanismen der asymmetrischen Zellteilung intrinsischer Mechanismus polaritätvermittelnde Faktoren (z. B. Numb) segregating determinants Determinante wird nur an eine Tochterzelle weitergegeben Schon bei der Geburt der Zelle festgelegt SZ-Zahl bleibt konstant/ SZ-Verlust irreparabel! 14

15 Asymmetrische Zellteilung: Satellitenzellen (Muskel-SZ) V. Shinin, B. Gayraud-Morel, D. Gomès and S. Tajbakhsh. Nat. Cell Biol. 8: , Immunzytochemie: e-tubulin-färbung des perizentriolären Materials unterscheidet zwischen Mutter- und Tochterzentrosomen. Numb wird in die Mutterzelle verteilt (intensiveres e-tubulin). Ki67: Marker für proliferierende Zellen (Zellzyklus)!!! 15

16 Asymmetrische Teilung von Gliom-(Krebs)-SZ steigt mit dem Entzug von Wachstumsfaktoren Zellinie Antikörper gegen CD133 16

17 Fate through Fat : Lipidstoffwechsel reguliert die Art der SZ-Teilung bei HSZ Ito K et al.: A PML-PPAR-d pathway for fatty acid oxidation regulates hematopoietic stem cell maintenance. Nature Medicine 18/9: (2012) PML: promyelocytic leukemia tumor suppressor gene PPAR-δ: peroxisome proliferator-activated receptor δ (ein Transkriptionsfaktor) FAO: fatty-acid oxidation 17

18 Fate through Fat : Lipidstoffwechsel reguliert die Art der SZ-Teilung bei HSZ Legende: Immunphänotypisierungstest 18

19 In Abwesenheit von PPAR-d sinkt die Zahl der asymmetrischen Teilungen; die Zahl der differenzierenden SZ erhöht sich Empty Cre 19

20 In Abwesenheit von PML sinkt die Zahl der asymmetrischen Teilungen; die Zahl der differenzierenden SZ erhöht sich 20

21 GW (stimuliert PPAR-d) erhöht, Etomoxir (inhibiert FAO) erniedrigt die Zahl der asymmetrischen Zellteilungen 21

22 Fate through Fat : Lipidstoffwechsel reguliert die Art der SZ-Teilung bei HSZ (Mäuse) Bone marrow transplantation PML: promyelocytic leukemia PPAR- δ: peroxisome proliferator-activated receptor δ FAO: fatty-acid oxidation 22

23 Die polarisierte Expression von Myosin IIB (MIIB) fördert die asymmetrische Zellteilung von humanen HSCs Shin JW et al.: Contractile Forces Sustain and Polarize Hematopoiesis from Stem and Progenitor Cells. Cell Stem Cell14: (2014) 23

24 Strategien zur Erhaltung des Gleichgewichtes zwischen Stammzellen und differenzierten Zellen Je nach Bedarf können sich Stammzellen symmetrisch oder asymmetrisch teilen. Während der (Embryonal)Entwicklung expandieren symmetrische Zellteilungen den Stammzellpool. Pluriotente SZ (ESZ, ipsz) teilen sich symmetrisch. Adult/ postnatal: Symmetrische Teilungen regenerieren Stammzellen ( SD ) (Expansion des Stammzellpools) oder bringen differenzierte Zellen hervor ( SC ). Asymmetrische Teilungen generieren auch differenzierte Tochterzellen (Konstanthaltung des Stammzellpools). Eine de novo-bildung von Stammzellen (Lepra) findet im adulten Organismus normalerweise nicht statt. 24

25 Immortal Strand Hypothesis Experimenteller Nachweis Satellitenzellen (Muskel-SZ) wurden 4 d mit BrdU markiert: Pulse Danach erfolgte ein Chase : 24 h ohne BrdU (5-Bromo-2-deoxyuridine). Am Ende der Zellteilung besitzt lediglich eine Tochterzelle das gesamte BrdU!!! Derartige asymmetrische Zellteilungen werden ausschließlich bei SZ beobachtet! Vorteil: keine Anhäufung von schädlichen Mutationen V. Shinin, B. Gayraud-Morel, D. Gomès and S. Tajbakhsh Nat. Cell Biol. 8: ,

26 Immortal Strand Hypothesis Kajstura J et al.: Tracking Chromatid Segregation. Circ. Res. 111, S (2012) 26

27 Können sich alle oder nur ein Teil der Satellitenzellen unter Beibehaltung der Ausgangs-DNA ( template DNA strand segregation ) teilen? Sind alle Chromosomen an diesem Prozeß beteiligt? Welches sind die biologischen Eigenschaften dieser Zellen? 27

28 Pax7 Immortal Strand Hypothesis Rocheteau, P. et al.: A Subpopulation of Adult Skeletal Muscle Stem Cells... Cell 148, S (2012) Transgene Mäuse: Pax7 ist ein wichtiger Faktor in Muskel-SZ. Der Pax7-Promotor kontrolliert die GFP- Expression und weist Muskel-SZ nach. 28

29 Immortal Strand Hypothesis (A) Scheme of BrdU injections during perinatal growth. (B) Quantification by immunofluorescence of LRCs. Histogram represents percentage of cells retaining BrdU in each subpopulation; n = 4 mice, 300 cells each. 29

30 Immortal Strand Hypothesis nur in Pax7-nGFP Hi -Zellen Immuncytochemie mit AKs gegen BrdU bzw. EdU 30

31 Zellen mit EdU wurden zu Beginn des Experiments generiert und sind somit älter Zellen ohne EdU wurden später (mit BrdU) generiert und sind somit jünger Sind die Stammzelleigenschaften identisch oder repräsentieren Zellen mit älterer DNA mehr den ursprünglichen SZ-Pool? Untersuchung von Pax7-nGFP HI und - LO -Populationen 31

32 Die Muskel-SZ mit den Ausgangs-DNA- Strängen behalten ihre SZ-Eigenschaften Alle Zellen sind differenziert (Myogenin-positiv) (F and G) Representative images of EdU (green) and Myogenin (red) immunostain-ings at T2 in Pax7-nGFPHi (F) and Pax7-nGFPLo (G) subpopulations. Insets in (F) show EdU-negative/Myogenin-positive (in die Differenzierung gegangen: rechts) cell (arrows) and EdU-positive/Myogenin-negative (Stammzellen geblieben: Mitte) cells (mutually exclusive). Insets in (G) show cells double positive for these markers. 32

33 Immortal Strand Hypothesis In intestinalen SZ zufällige Teilung! Schepers AG et al.: Lgr5 intestinal stem cells have high telomerase activity and randomly segregate their chromosomes. EMBO J. 30: S (2011) Yadlapalli S. and Yamashita Y.M.: DNA asymmetry in stem cells immortal or mortal? J Cell Sci. 126: (2013) Balken: 10 µm 33

34 Immortal Strand Hypothesis: Ein Mechanismus durch 5-Hydroxymethylcytosin Huh, Y.H, Cohen J., Sherley JL: Higher 5-hydroxymethylcytosine identifies immortal DNA strand chromosomes in asymmetrically self-renewing distributed stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 111, S (2013) 5 % 22 % 17 % 40 % 13 % 40% Chromosomal patterns of 5mC (5-methylcytosine) and 5hmC (5-hydroxymethylcytosine) content in mouse hair follicle SCs sister pair (SPr) cytochalasin D-arrested binucleated cells (CD) (Interphase-Zellkerne) mitotic cells (M) 34

35 Begriffe der Stammzellforschung: Die Potenz von Stammzellen (Entwicklungs-/ Differenzierungsfähigkeit) 35

36 Begriffe der Stammzellforschung: Totipotenz/ Omnipotenz omni, toti: lateinisch zu allem fähig unbegrenzte Entwicklungsfähigkeit in alle oder die meisten spezialisierten Zelltypen einschl. Plazenta/ embryonale Gewebe Es muß sich ein gesamtes, lebensfähiges Individuum bilden können. Befruchtete Eizelle bzw. Zygote (Vorkerne verschmolzen) Blastomere bis zum Morula-Stadium The morula stage is reached when about 12 to 16 cells are present. This morula may contain 30 cells or more. 1. perivitelline space 2. zona pellucida 36

37 Begriffe der Stammzellforschung: Pluripotenz pluripotent: Zellen aller 3 Keimblätter, aber nicht in extraembryonales Gewebe und somit kein Individuum Ur-Keimzellen ( EGCs); abgeleitete Tumore = Teratocarcinome Blastocyste/ Blastula (transientes Stadium, Präimplantation): innere Zellen innere Zellmasse (ICM) ( Fötus) äußere Zellen Trophectoderm/ extraembryonales Ektoderm ( Plazenta, fötale Membranen) EG-, ES-, EC-Zellen, ips-zellen ( künstlich ; nur in vitro existent) späte embryonale Stadien/ Nabelschnurblut: USSCs u.a.? im adulten Organismus: MAPCs, MIAMI, SKPs? Blastocoel 0,1 0,2 mm 1. cavity within blastocyst 2. zona pellucida 1. zona pellucida 2. blastocyst cavity 3. inner cell mass 37

38 Begriffe der Stammzellforschung: Multipotenz multipotent: begrenzte Anzahl von spezialisierten Zelltypen nur eines Keimblattes HCS, NSCs, MSCs, also die meisten adulten SZ (sofern nicht oligopotent, s. folgende Folie) 38

39 Begriffe der Stammzellforschung: Oligo- und Unipotenz unmittelbare Vorläufer für bestimmte Gewebe (gewebespez. Progenitorzellen): oligopotent: z. B. gastrointestinale Stammzellen (Mukuszellen = goblet cells, Absorptive Zellen = Enterozyten, Neuroendokrine- und Paneth-Zellen) bipotent: Ovarstromazelle ( Granulosa- und Thecazellen) 39

40 unbegrenzt Nachweis Morphologie: der Pluripotenz Funktion: Zellderivate aller 3 Keimblätter - in vitro - Teratom in vivo* - Chimärenbildung - Keimbahntransmission molekular: TFs, Oberflächenantigene, Telomerase, epigenet. Zustand * Implantation unter die Hodenkapsel von SCID-Mäusen: Teratombildung und Zellen aller 3 Keimblätter = Test human, weitere Tests nicht möglich Injektion in Blastozyste und Implantation in scheinschwangere Ammenmaus: Integration in alle Gewebe (Chimären) und die Keimbahn = Test murin 40

41 Was ist mit Plastizität? 41

42 Plastizität, Transdifferenzierung usw. Vierbuchen, T. und Wernig, M.: Direct lineage conversions. Nature Biotechnology 29/10, S (2011) a d c b Various modes of induced cell fate changes. (a) Dedifferentiation: reversion to a less differentiated state. Example: ips cell reprogramming. (b) Transdetermination: conversion between two closely related progenitor cells that share a direct common progenitor. (c) Transdifferentiation: direct fate switch between two distinct cell types. Example: conversion of exocrine to endocrine pancreatic cells. (d) Directly induced differentiation: directly induce a more differentiated cell type without passing through the corresponding intermediate progenitor state. MyoD1 expression in human ES cells generates multinucleated myotubes. 42

43 Experiment: KEINE Transdifferenzierung von HSCs HSCs tragen lediglich zur Blutzellbildung bei Chimäre Blutzellen KEIN Nachweis in Gehirn, Niere, Darm, Leber, Muskel.!!! Blau, HM et al., Cell 105, S (2001) 43

44 Nachweis der Plastizität Voraussetzung: kein Chimärismus liegt vor (Coexistenz von Zelltypen mit unterschiedlicher genetischer Ausstattung)? Analyse auf Einzelzellniveau überzeugende genetische Analysen nötig (Karyotyp; Epigenetik: Veränderungen (Transformation) durch in vitro-kultur/ Isolierung?) auch funktionelle Nachweise müssen erbracht werden (mehrere Methoden) ggf. Zellfusion als Ursache!? Reprogrammierung? gezielte Veränderung von somatischen Zellen, um einen anderen somatischen Zelltyp zu erhalten 44

45 Zellfusion: ein zentrales Phänomen der Biologie Membranfusion zentrales Phänomen der Biologie: Pathogene (Infektion von Wirtszellen) Organellen (sekretorischer Weg für Proteine) eukaryontische Zellen i. d. R. spezielle Bedingungen nötig: Zygoten-Bildung Organogenese bestimmter Gewebe wie Plazenta (Synzytiotrophoblasten), Knochen (Osteoklasten) und Muskelbildung (Fusion von Myoblasten zur Bildung multinukleärer Muskelzellen) mehrfache Chromosomensätze (> 2n) Experimentelle Zellfusion (z. B. Elektrofusion, Viren) wurde bereits seit 1970 eingesetzt, um immortalisierte Zelltypen zu generieren, monoklonale Antikörper zu produzieren und auch, um Genregulation zu untersuchen Und Zellfusionen wurden/ werden auch genutzt, um Zellen epigenetisch zu reprogrammieren und pluripotent zu machen 45

46 Zellfusion: ein zentrales Phänomen der Biologie 46

47 Das Knochenmark besteht aus einer heterogenen Population von Stamm-, Progenitor- und maturen Zellen, die zur Ausbildung hämatopoietischer, mesenchymaler und endothelialer Gewebe führen. Um zu untersuchen, ob hämatopoietische Stammzellen mit Purkinjeneuronen fusionieren können, wurden einzelne hämatopoietische Stammzellen genetisch mit GFP markiert und in letal bestrahlte Mäuse transplantiert. 47

48 Zellfusion: ein zentrales Phänomen der Biologie Zwei Mäuse zeigten seltene GFP + Purkinjeneurone, also eine Fusion von GFP-HSCs und Purkinjeneuronen. Laser-Scanning Confocal Imaging des Zerebellums einer Maus, die mit einer einzigen HSC transplantiert wurde. Pfeil zeigt auf das Axon. PCL: Purkinje- Zellschicht, ML: Molekularschicht. GCL: Granular Cell Layer (Körnerzellschicht). Rot: Calbindin (Kalziumbindendes Protein). 48

49 49

50 Heterokaryonen-Bildung wird durch bestimmte Entzündungen gesteigert Idiopathische ulzerative Dermatitis oder Experimentelle Autoimmun-Encephalitis BMT: bone marrow transplantation 50

51 Begriffe der Stammzellforschung: Klassen von Stammzellen 51

52 humane SZ embryonal fötal infantil adult Blastozyste ( 5 7 d) Genitalleiste (6 Wo.) Fehlgeburten (Fötalgewebe) Nabelschnurblut Wharton s Jelly Keimbahn Somatisch Embryonale SZ (embryonic stem cells) Embryonale Keimzellen (embryonic germ cells) Embryonale Karzinomzellen (embryonic carcinoma cells) fötale SZ (embryonic stem cells) Nabelschnur- Blut-SZ Nabelschnur- Matrix-SZ Spermatogonien Oogonien hämatopoetisch mesenchymal Leber Epidermis Neuronal Auge Darm Pankreas (Haut, Haare) Knochenmark Peripheres Blut K.M.-Stroma u. a. Gewebe induced pluripotent stem cells (ips) Tumor-SZ 52

53 Zusammenfassung Begriffsdefinitionen Allgemeine Begriffe der Stammzellforschung asymmetrische Zellteilung, immortaler DNA-Strang Definition SZ: klonal/ Selbsterneuerung/ Differenzierung Omnipotenz/ Pluripotenz/ Multipotenz/ Oligopotenz usw. Zellhierarchie von der SZ zur differenzierten Zelle? embryonale versus adulte SZ und ihr Entwicklungspotential Plastizität (Metaplasie)/ Transdifferenzierung/ Re- und Dedifferenzierung 53