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1 Forum Chancen der Landwirtschaft im Bereich regenerativer Medizin Status Quo, Perspektiven, Geschäftsmodelle Nifa Hannover, 12. November 2008 (Agrar-) ) wissenschaftliche Perspektiven der regenerativen Medizin Neue Entwicklungen in der Biologie Somatisches Klonen und transgene Tiere Embryonale und adulte Stammzellen Prof. Dr. Heiner Niemann Institut für Nutztiergenetik (FLI) Mariensee, Neustadt, Germany Was ist regenerative Medizin? Definition: Entwicklung und Anwendung innovativer medizinischer Therapien unter Nutzung von Biomaterialien, Zellen und Organen. Ziel: Wiederherstellung der Gewebefunktion, Unterstützung der Regeneration kranker oder verletzter Organe. Charakteristikum: Interdisziplinär: Forschung aus Allgemeinmedizin, Chirurgie, Intensiv-, Transplantationsmedizin, Entwicklungsbiologie, Molekularbiologie; Grundlagen- und anwendungsorientiert, Arbeitsmethoden aus: Zellbiologie, Biotechnologie, Medizintechnik, Molekularbiologie, Ingenieurswesen, u.a.

2 Der Adler und Prometheus: Erste Hinweise für f Regenerative Medizin Ein neues Zeitalter der Biologie: Genomsequenzierung,, somatisches Klonen und embryonale Stammzellen 2004: Erste Versionen des Rinder- und Geflügelgenoms 2006: Hund, Biene 2007: Pferd 2009: Schwein (erwartet) Dolly RIP 1998 Nature 426, 2003

3 Hauptfaktoren der epigenetischen Modulation der Genepression: DNA-Methylierung und Histon-Modifikationen Weitere epigenetische Mechanismen: Telomerenlänge X-Chromosom-Inaktivierung Me Me Me Me Hauptkomponenten des epigenetischen Codes DNA Methylierung Methylgruppen an DNA-Basen unterdrücken Genaktivität Gesamtheit der epigenetischen Mechanismen: Epigenom Histon Histonende Histonmodifikation Verschiedene Moleküle können an die Proteinenden binden. Dies verändert die DNA-Aktivität. Chromosom Qiu, Nature 441, , 2006 Dolly, das erste geklonte Säugetier markiert den Beginn einer neue Aera in der biologischen Forschung Dolly RIP

4 Ableitung humaner embryonaler Stammzellen aus Embryonen im Blastozystenstadium 1998 Aktueller Stand der Genomsequenzierung 2004: Rind, Gefügel 2006: Hund, Biene 2007: Pferd 2009: Schwein (erwartet) Nature 426, 2003

5 Somatisches Klonen beim Rind KT 7d. IVC ET Enukleierte Oozyte Rekonstruierter Embryo Schlüpfende KT-Blastozyste Geklonte Rinder in Mariensee aus adulten (links) und fetalen (rechts) Fibroblasten Die zweite Generation geklonter Rinder Somatisches Klonen beim Schwein I: In vitro Reifung und Enukleation von Oozyten Porcine Cumulus Oocyten Komplee aus Schlachthofovarien Porcine COC nach 42 Std IVM Mikrochirurgische Entfernung dermetaphase II Platte (Licht und Fuoreszenzmikroskopie)

6 Gewinnung fetaler und adulter Fibroblasten für somatischen Kerntransfer Growing fibroblasts Tissue eplant Somatisches Klonen beim Schwein II: Transfer der Spenderzelle in enukleierte in vitro gereifte Oozyten Schweinefetus am Tag 25 pc und auswachsende Fibroblasten Aufsaugen der Spenderzelle (Fibroblast) Transfer der Spenderzelle - + Fusion von Spenderzelle und Cytoplast Status 15 min. nach Fusion Schlüpfende Blastozyste nach 7 Tagen Kultur

7 Aktueller Entwicklungsstand des somatischen Kerntransfers Spezies % lebensfähige Geschätzte Anzahl Nachkommen geklonter Tiere Rind <4000 Schaf 8 <400 Ziege 3 <600 Schwein 2-5 <800 Katze ~1 ~10 Maus < 2 >250 Kaninchen < 2 <10 Maultier <1 3 Pferd <1 ~10 Ratte 1 3 Hund 1 4 Wolf 1 2 Weltweite Schätzung, Mai 2008 Effizienz des somatischen Kerntransfers bei Verwendung präovulatorischer peripubertaler Sauen als Empfänger und transgenen Spenderzellen Anzahl Transfers 14 Anzahl der KT- Komplee 2243 Fusion (%) 1951 (87.0%) Transf. Embryonen 1736 ( = 124) Trächtig Tag 25 (%) 11/11 (78.6%) Abferkelung (%) 11 (100%) Geb. Ferkel (Effiz. %) 56 (3.2%)

8 Epigenetische Reprogrammierung der Gen- epression bei geklonten Embryonen Housekeeping Genes Tissue specific genes In vivo embryo Developmentally immportant genes Pluri-/Totipotency related genes Cloned embryo IVP embryo Somatic cell Anwendungsperspektiven des somatischen Kerntransfers (=Klonen) Reproduktives Klonen Genetisch identische Mehrlinge Transgene Tiere (Transfektion, homolog. Rekombination) Krankheitsmodelle Erhaltung genetischer Resourcen Tierzucht (Milch, Fleisch, etc.) Therapeutisches Klonen ES Zellen Gerichtete Differenzierung Regenerative Zellen und Gewebe (homolog, heterolog) Tissue Engineering Biomedizin Grundlagenforschung Toti- und Pluripotenz Reprogrammierung De-Differenzierung Re-Differenzierung Alterung Tumorbildung Telomerenbiologie Viele andere Gebiete

9 Erstellung transgener Tiere mit Hilfe des somatischen Kerntransfers Transgene Zelle Transgenes Tier Zeitdauer der Produktion transgener Schweine durch Mikroinjektion oder somatischen Kerntransfer Tag Mikroinjektion Somatischer KT 0 Mikroinjektion der DNA in Zygoten Transfektion der Spenderzellen Somatisches Klonen Foundertiere Transgene Klonschweine Testen auf transgene Epression ~360 Paarung der Foundertiere 475 Geburt von F1-Tieren Testen der F1-Tiere auf transgene Epression Zeitgewinn: ~ 350 Tage

10 Warteliste und Anzahl der Nierentransplantationen in Deutschland Source: Deutsche Stiftung Organtransplantation 2005 Das Schwein als potentielle Spenderspezies für f humane Organe Domestizierte Species Hohe Fertilität, viele Tiere Anatomie, Physiologie nicht zu verschieden vom Menschen Haltung unter strikten hygienischen Konditionen möglich Genetische Veränderungen möglich I like pigs; dogs look up to us, cats look down to us, pigs treat us as equal. (Winston Churchill) Klinische Prüfung von Inselzellen vom Schwein zur Diabetes Behandlung läuft zur Zeit.

11 Endothel der normalen Schweinegefässe Genetisch verändertes Endothel der Schweinegefäße (α1,3gal-ko) preformed anti-gal-antibodies HAR hcd59 hcd55 hcd59 hcd55 hcd46 AVR hirudin htm TFPI A20 A1 HO-I HLA-E HLA-GHLA-E CXR HLA-G Fas-L Fas-L = αgal-epitopes = Membrane attack comple (MAC) = Thrombus = Natural Killer Cells Erste dreifach transgene (hcd59/hdaf/htm) Schweine, geb. 11. August 2005

12 Gene Pharming ATryn : das erste zugelassene rekombinante Medikament (humanes Antithrombin III) aus der Milchdrüse transgener Ziegen Indikation: Prophylaktische Behandlung genetisch bedingter Antithrombin Defizienz im Rahmen einer eines chirurgischen Eingriffs FRAMINGHAM, MA June 2, GTC Biotherapeutics, Inc. ("GTC", Nasdaq: GTCB) announced today that the Committee for Medicinal Products for Human Use (CHMP) of the European Medicines Agency (EMEA) has adopted a positive opinion on the market authorization application (MAA) for ATryn, GTC s recombinant form of human antithrombin.

13 Generierung differenzierter Zellen durch Reprogrammierung somatischer Zellen Ableitung embryonaler Stammzellen aus Embryonen im Blastozystenstadium 1998

14 Humane ES-Zell Kolonie Gezielte Differenzierung von ES-,, EG- und EC-Zellen

15 Einsatz von Stammzellen zur Generierung von regenerativen Zellen und Geweben Therapeutisches Klonen Enukleierte humane Eizelle Kerntransferembryo Bioptierte Zelle (z.b. Fibroblast) Blastozyste In vitro- Differenzierung Benötigte Zellen (z.b.herzmuskelzellen) Embryonale Stammzellen

16 Published Nature online ahead of press, June 7th, 2007 Erzeugung pluripotenter Stammzellen durch Überepression von 4 Schlüsselgenen Oct4 (PouSf1) So 2 c-myc KIf4 Somatische Körperzellen Induzierte pluripotente Stammzellen

17 Gewinnung von ips aus humanen Haarzellen Gadue and Cotsarelis; Nature Biotechnology 26, , 2008 Applikation adulter Stammzellen am Herzen

18 Die Notwendigkeit neuer Tiermodelle Jüngste Entwicklungen: Pluripotente Zellen, Reprogrammierung, ips In Vorbereitung: Modelle im Minischwein, Rhesusaffe, Weissbüschelaffe Umwälzungen in der Biologie Sequenzierung und Annotierung von Genomen Somatisches Klonen beim Säuger Epigenetische Plastizität von Zellen (Pluripotenz und De-Differenzierung) Neue Horizonte für f r die Nutztiergenetik und Biomedizin

19 REBIRTH*: : Aufbau eines Centers für f Regenerative Medizin mit internationaler Spitzenstellung Area A: Stammzell Biologie Klonen/Reprogrammierung Organogenese Proliferation und Alterung Blut Lunge Künstliche Organe Autologe Zellen und Gewebe Allogene Zellen und Gewebe Xenogene Zellen und Gewebe Tissue Engineering (Xenotransplantate) Herz Leber *DFG-Ezellenzcluster: MHH, Leibniz Univ., TiHo, HZI, MPI, ING-Mariensee Zusammenfassung und Schlussfolgerungen Das somatische Klonen erlaubt die Erstellung transgener Tiermodelle für die regenerative Medizin. Pharming ist bereits in der praktischen Anwendung. Die Erzeugung multi-transgener Schweine wird die Xenotransplantation bis zur präklinischen Prüfung voranbringen. Effektive Verfahren zur Reprogrammierung somatischer Zellen stehen zur Verfügung. Die Erstellung individual-spezifischer therapeutischer Zellen, entweder durch therapeutisches Klonen oder ips Verfahren ist möglich. Die Etablierung aussagekräftiger Tiermodelle ist von entscheidender Bedeutung für die Erweiterung der Grundlagenkenntnise und die Weiterentwicklung dieser Technologien bis zur klinischen Anwendungsreife. Die Entwicklung aussagekräftiger Grosstiermodelle für die regenerative Medizin ist eine viel versprechende Nische für wirtschaftliche Aktivitäten

20 Vielen Dank für f Ihre Aufmerksamkeit Lowry and Plath; Nature Biotechnology 26, , 2008

21 Lowry and Plath; Nature Biotechnology 26, , 2008

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