Vergleich der Strahlensensitivität von Zellen aus oralen Plattenepithelkarzinomen und gesunder Mundschleimhaut

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1 Aus der Strahlenklinik der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Direktor: Prof. Dr. R. Fietkau Vergleich der Strahlensensitivität von Zellen aus oralen Plattenepithelkarzinomen und gesunder Mundschleimhaut Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg vorgelegt von Judith Bäumler aus Bamberg

2 Gedruckt mit Erlaubnis der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Dekan: Referent: Korreferent: Prof. Dr. J. Schüttler PD Dr. L. Distel Prof. Dr. R. Fietkau Tag der mündlichen Prüfung: 07. Juli 2010

3 Learn from yesterday, live for today, hope for tomorrow. The important thing is not to stop questioning. Albert Einstein

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6 1 Zusammenfassung Hintergrund und Ziele Methoden Ergebnisse und Beobachtungen Praktische Schlussfolgerungen Summary Background and aims Methods Results and observations Conclusion Einleitung Histon H2ax Pml NBs Protein p Material und Methoden Patienten Immunostaining Prinzip Zellvorbereitung Röntgenbestrahlung Fixierung und Permeabilisierung Fluoreszenzfärbung Apoptotische Zellen Auswertung...28

7 5 Ergebnisse H2ax Pml NBs Kolokalisation von γ-h2ax- und Pml-Foci p Apoptose Diskussion Literaturverzeichnis Abkürzungsverzeichnis Anhang Lösungen Danksagung Lebenslauf...50

8 1 1 Zusammenfassung 1.1 Hintergrund und Ziele Neben einer chirurgischen Intervention und der Chemotherapie stellt die Behandlung mit ionisierender Strahlung einen weiteren Hauptpfeiler in der gegenwärtigen Therapie des oralen Plattenepithelkarzinoms dar. Die Radiotherapie verursacht hochreaktive Sauerstoffmoleküle, die eine Vielzahl von DNA-Schäden hervorrufen. Als besonders gefährlich für das Zellüberleben sind hierbei die Doppelstrangbrüche anzusehen, da die Wahrscheinlichkeit ihrer Reparatur erheblich kleiner ist als bei anderen DNA-Schäden. Durch die hohe Vaskularisierung und die damit verbundene gute Sauerstoffversorgung wird das Tumorgewebe durch eine Bestrahlung stärker geschädigt als gesundes Gewebe. Außerdem weisen Tumorzellen in der Regel ein schlechteres Reparaturvermögen von DNA-DSBs auf als Normalgewebe. In dieser Arbeit wird nun der Frage nachgegangen, ob Gewebe aus oralen PLE-Karzinomen auf ionisierende Strahlung sensitiver reagiert als Gewebe aus gesunder Mundschleimhaut. Zudem wird untersucht, wie sich das Reparaturverhalten der Tumorzellen von demjenigen der Normalgewebszellen unterscheidet. 1.2 Methoden Untersucht wird die Verteilung von γ-h2ax-, Pml- und p53ser20-protein mittels Immunostaining an Zellen aus PLE-Karzinomen der Mundhöhle sowie an Zellen aus gesunder Mundschleimhaut. Hierzu wird jedem untersuchten Patienten ein Tumor- sowie ein Normalgewebspräparat entnommen. Mit Hilfe des Fluoreszenzmikroskops werden die Foci visualisiert und nachfolgend mittels Bildanalyseprogramm ausgewertet. Die Foci-Anzahl wird jeweils vor sowie nach einer Bestrahlung mit 2 Gy und 1- bzw. 24-stündiger Reparaturzeit ermittelt.

9 2 1.3 Ergebnisse und Beobachtungen Die Bestrahlung mit 2 Gy induziert sowohl im Tumor- als auch im Normalgewebe einen signifikanten Anstieg der γ-h2ax-foci-anzahl auf durchschnittlich 35,52 (Tumorgewebe) bzw. 32,40 (Normalgewebe) Foci pro Zelle. Nach 24-stündiger Reparaturzeit verbleiben in den Zellen aus oralen PLE-Karzinomen noch 22,08 Foci, während in den Normalgewebszellen ein Rückgang der Foci-Anzahl auf 10,63 beobachtet werden kann. Die Verteilung der Pml- sowie p53ser20-foci ergibt keine signifikanten Unterschiede zwischen Tumor- und Normalgewebe. Gleiches trifft in Bezug auf die Verteilung der apoptotischen Zellen zu, auch hier verhält sich das Tumorgewebe nicht eindeutig different im Vergleich zum Normalgewebe. 1.4 Praktische Schlussfolgerungen Somit lässt sich festhalten, dass Gewebe aus oralen PLE-Karzinomen auf eine Bestrahlung mit 2 Gy ebenso sensitiv reagiert wie Gewebe aus gesunder Mundschleimhaut. Das Tumorgewebe verfügt jedoch über ein signifikant geringeres Reparaturvermögen als das Normalgewebe, da nach 24-stündiger Reparaturzeit lediglich 47 % der entstandenen DSBs repariert werden, während das Normalgewebe in der Lage ist, 85 % der entstandenen Schäden zu beheben. Eine Mutation des p53-gens im Bereich der Ser20-Phosphorylierungsstelle kann anhand der Ergebnisse ausgeschlossen werden, nicht jedoch eine eventuelle Mutation in anderen Bereichen des Gens. Hinweise auf eine veränderte Pml-Expression lassen sich in Bezug auf das Tumorgewebe ebenso wenig finden wie eine abweichende Regulierung der Apoptose nach 24 h Reparaturzeit.

10 3 2 Summary 2.1 Background and aims In addition to surgical intervention and chemotherapy, treatment by ionizing radiation is one of the main methods used in the current therapy of oral squamous cell carcinoma. Radiotherapy causes highly reactive oxygen species that induce considerable DNA damage. Double-strand breaks are particularly dangerous as regards cell survival because the probability of their repair is considerably smaller than with other DNA damage. Due to high vascularization and the resulting high degree of oxygenation, tumor tissue is more strongly affected by radiation than healthy tissue. In addition, tumor cells tend to have a poorer capacity for the repair of DNA double-strand breaks than does normal tissue. In this dissertation we now consider the question as to whether tissue from oral squamous cell carcinoma reacts more sensitively to ionizing radiation than tissue from healthy oral mucosa. Moreover, it is determined in which way the repair behavior of the tumor cells differs from that of healthy oral mucosa cells. 2.2 Methods The dissertation explains the distribution of γ-h2ax, Pml and p53ser20 protein among oral squamous cell carcinoma cells and healthy oral mucosa cells using immunostaining. Oral squamous cell carcinoma tissue is collected from every patient studied, as well as tissue from healthy oral mucosa. The resulting foci are visualized and analyzed using a fluorescence microscope and an image analysis software. The foci numbers are determined in each case before and after irradiation with 2 Gy and repair times of 1 and 24 h.

11 4 2.3 Results and observations Irradiation with 2 Gy induces in both tumor and normal tissue a significant increase in the number of γ-h2ax foci, with averages of (tumor tissue) and (normal tissue) foci per cell. After 24 h of repair time, foci still remain in the cells of oral squamous cell carcinoma, whereas in cells of healthy oral mucosa a decline to foci is observed. The distribution of Pml and p53ser20 foci reveals no significant differences between tumor and normal tissue. The same is true in relation to the distribution of apoptotic cells, the behavior of the tumor tissue is also not clearly different in comparison to normal tissue. 2.4 Conclusion We observe that tissue from oral squamous cell carcinoma reacts to irradiation with 2 Gy as sensitively as tissue from healthy oral mucosa. The tumor tissue has however a significantly lower capacity for repair than normal tissue because it could repair within 24 h only 47 % of the resulting double-strand breaks, whereas the normal tissue is capable of repairing 85 % of the incurred damage. A mutation of the p53 gene in the Ser20-phosphorylation domain can be excluded from the results, but not a possible mutation in other areas of the gene. Evidence of a changed Pml expression and a different regulation of apoptosis after 24 h of repair time related to the tumor tissue are not found.

12 5 3 Einleitung Maligne Neoplasien stellen nach Herz- Kreislauferkrankungen die zweithäufigste Todesursache in Deutschland dar. Im Jahr 2004 umfasste die Zahl der jährlichen Krebsneuerkrankungen ca Fälle, wobei Männer etwas häufiger betroffen waren als Frauen. Mit Fällen rangieren die Neoplasien von Mundhöhle und Rachen bei den männlichen Patienten an 7. Stelle, bei weiblichen Patienten auf Platz 15 der Statistik (2 780 Neuerkrankungen/Jahr, basierend auf den Zahlen der Gesellschaft der epidemiologischen Krebsregister in Deutschland e. V. in Zusammenarbeit mit dem Robert-Koch-Institut in Berlin). PLE- Karzinome stellen mit über 90 % den größten Anteil der bösartigen Erkrankungen der Mundhöhle (Morse et al. 2007), wobei ein Großteil aus Präkanzerosen hervorgeht (Morse 2007; Scheifele et al. 1998). Ein Ansteigen der 5-Jahres-Überlebensrate konnte trotz intensiver Forschung in den letzten Jahren nicht festgestellt werden (Ota et al. 2008; Sudbo 2004), sie liegt gegenwärtig bei ca. 50 % (Kah et al. 2007; Sticht et al. 2008). Als Prädilektionsstellen sind der laterale Zungenrand, der Mundboden sowie die Zungenunterseite zu erwähnen. Die Entstehung eines PLE-Karzinoms ist multifaktoriell, wobei als wichtigste Risikofaktoren anhaltend erhöhter Tabak- u. Alkoholkonsum hervorzuheben sind (Campisi et al. 2009; Lagergren et al. 2000; Morse 2007). Obwohl Alkohol selbst nicht als Karzinogen anzusehen ist, besteht bei Menschen mit gleichzeitigem Alkohol- und Tabakabusus ein erhöhtes Risiko, an einem oralen PLE-Karzinom zu erkranken (Castellsague et al. 1999). Als Ursache hierfür ist die durch Alkoholabusus entstehende erhöhte Permeabilität der Mundschleimhaut gegenüber Karzinogenen des Tabaks anzusehen (vor allem tabakassoziierte Nitrosamine, polyzyklische Kohlenwasserstoffe). Tabak und Alkohol reagieren somit synergistisch (Morse 2007). Zudem besteht die Gefahr der Feldkanzerisierung, da alle oralen Epithelien, die dem Tabakrauch und dem Alkohol ausgesetzt sind, mit größerer Wahrscheinlichkeit eine Neoplasie entwickeln als

13 6 nicht-exponierte Epithelien (Martin et al. 2008). Desweiteren finden Risikofaktoren wie Mangelernährung (speziell Eisenmangel), Immundefizienz oder -suppression, ionisierende Strahlung, Tätigkeiten in der Holz- u. Nickelindustrie sowie eine Infektion mit Viren (Nachweis von HPV-DNA in ca. 20 % der PLE-Karzinome) in der Literatur Erwähnung. Der Verzehr von Obst und Gemüse reduziert hingegen das Risiko, an einem oralen PLE-Karzinom zu erkranken (King et al. 2007). Die Tumordiagnostik erfolgt mittels Anamnese, klinischer Untersuchung, bildgebender Verfahren sowie einer Biopsie. Zur Klassifizierung der Erkrankung wird das von Pierre Denoix entwickelte TNM-System angewendet, welches unter anderem Hilfe bei der Behandlungsplanung und einen Hinweis auf die Prognose gibt. Die prätherapeutische klinische Klassifikation (ctnm) ist hierbei von der posttherapeutischen histopathologischen Klassifikation (ptnm) abzugrenzen. Beurteilt wird die Größe des Primärtumors, der regionäre Lymphknotenstatus sowie das Vorliegen von Fernmetastasen: TX: keine Aussage über den Primärtumor möglich Tis: Carcinoma in situ T0: kein Hinweis auf einen Primärtumor T1: Tumor bis zu 2 cm im Größendurchmesser T2: Tumor zwischen 2 und 4 cm im Größendurchmesser T3: Tumor mehr als 4 cm im Größendurchmesser T4: jeder Tumor, unabhängig von der Tumorgröße, der Nachbarstrukturen infiltriert NX: Lymphknotenstatus kann nicht beurteilt werden N0: kein Hinweis auf regionäre LK-Metastasen N1: LK-Metastasen in einem regionären LK bis 3 cm Durchmesser auf der ipsilateralen Seite N2a: LK-Metastasen in einem regionären LK zwischen 3 und 6 cm im Durchmesser auf der ipsilateralen Seite

14 7 N2b: LK-Metastasen in mehreren regionären LK bis 6 cm Durchmesser auf der ipsilateralen Seite N2c: LK-Metastasen in einem oder mehreren regionären LK bis 6 cm Durchmesser auf der kontralateralen Seite oder bilateral N3: LK-Metastasen in einem oder mehreren regionären LK über 6 cm MX: das Vorliegen von Fernmetastasen kann nicht beurteilt werden M0: es liegen keine Fernmetastasen vor M1: Fernmetastasen liegen vor Mithilfe dieser Parameter erfolgt das sogenannte Tumorstaging, durch das eine Einstufung des Tumors in die jeweilige Kategorie erfolgt. Stadieneinteilung nach UICC: Stadium 0: Stadium Ia: Stadium Ib: Stadium IIa: Stadium IIb: Stadium IIIa: Stadium IIIb: Stadium IV: Tis N0 M0 T1 N0 M0 T2 N0 M0 T3 N0 M0 T4 N0 M0 Jedes T, N1, M0 Jedes T, N2, M0 Jedes T, jedes N, M1 Die Behandlung des PLE-Karzinoms stützt sich im Wesentlichen auf operative Maßnahmen, Strahlen- und Chemotherapie. Alternative Behandlungsoptionen wie die Immun- oder Gentherapie befinden sich derzeit erst im Initialstadium (Deshpande et al. 2008). Die Entscheidung über eine kurativ oder palliativ ausgerichtete Therapie sowie über die jeweiligen Behandlungsmaßnahmen wird maßgeblich von der Art des Tumors (Typing), der Ausbreitung (Staging) sowie dem Malignitätsgrad (Grading) bestimmt. Beim Tumorgrading werden insgesamt fünf Differenzierungsgrade unterschieden (GX-G4), wobei die Prognose

15 8 umso schlechter ausfällt, je entdifferenzierter der Tumor in Erscheinung tritt. In der Regel weisen PLE-Karzinome der Mundhöhle eine mäßige bis gute Differenzierung auf. Ziel des operativen Vorgehens ist eine sogenannte R0-Resektion (Resektion im Gesunden), zumeist in Verbindung mit einer kurativen bzw. prophylaktischen Neck dissection. Die Neck dissection wird in der Regel konservierend ausgeführt, da durch die größtmögliche Schonung der nichtlymphatischen Strukturen (N. accessorius, V. jugularis, M. sternocleidomastoideus) die Beeinträchtigungen für den Patienten möglichst gering gehalten werden können. Begleitend hierzu werden je nach individueller Behandlungsplanung radiotherapeutische bzw. radiochemotherapeutische Maßnahmen durchgeführt, die entweder neoadjuvant oder adjuvant erfolgen. Bei primär chirurgischer Intervention mit postoperativer Radiochemotherapie erfolgt eine Bestrahlung mit Gy sowie eine Chemotherapie, bestehend aus 5-FU 800mg/m² KOF und Cisplatin 20mg/m² KOF. Die auf diese Weise behandelten Patienten haben eine durchschnittliche 5-Jahres- Überlebensrate von 56 %. Bei fehlender Operationsmöglichkeit und definitiver Radiochemotherapie (50-72 Gy, 5-FU 800 mg/m², Cisplatin 20mg/m² KOF) beträgt die 3-Jahres-Überlebensrate nur 45,2 % (Kessler et al. 2008). Als Nebenwirkungen der Strahlentherapie sind unter anderem Mukositis, Xerostomie, Geschmacksverlust sowie die Osteoradionekrose bekannt (Samant et al. 2005). Nach Beendigung der Therapie erfolgt eine engmaschige Betreuung der Patienten im Rahmen der Tumornachsorge, die ein frühzeitiges Erkennen von etwaigen Tumorrezidiven und/oder Zweittumoren gewährleistet.

16 9 3.1 Histon H2ax Das Histon H2ax, eine Variante des Histons H2a, nimmt in Säugerzellen eine wichtige Stellung bei der zellulären Antwort nach Auftreten von DSBs der DNA ein (Liu et al. 2008). DNA-DSBs sind äußerst gefährliche Läsionen mit schwerwiegenden Folgen bezüglich des Zellüberlebens und der Aufrechterhaltung der genomischen Stabilität (Kinner et al. 2008). Sie können einerseits durch exogene, DNA-schädigende Einflüsse wie z. B. ionisierende Strahlung hervorgerufen werden oder aber auch während des normalen zellulären Stoffwechsels oder der Lymphozytenentwicklung in Erscheinung treten (Zha et al. 2008). In Säugerzellen initiieren sie die Phosphorylierung von H2ax an Serin 139 des C-Terminus, es entsteht das sogenannte γ-h2ax (Kinner 2008). Wurde die Phosphorylierung nicht durch genotoxische Umwelteinflüsse hervorgerufen sondern findet in gesunden, unbehandelten Zellen statt, spricht man auch von intrinsischer oder programmierter H2ax-Phosphorylierung (Huang et al. 2006). Die Phosphorylierung von H2ax wird vermittelt durch Proteinkinasen der PIKK-Familie, genauer gesagt durch Atm, Atr bzw. DNA-Proteinkinasen (Zha 2008). Die Aktivierung der Einzelnen erfolgt hierbei durch unterschiedliche DNA-Schäden, so tritt beispielsweise Atm bei DSBs und Atr bei Schädigungen durch ultraviolettes Licht in Aktion (Zhao et al. 2008). Innerhalb weniger Minuten nach Auftreten einer DNA-Läsion werden mehrere tausend H2ax-Proteine phosphoryliert, wobei die Phosphorylierung in unmittelbarer Nähe des Schadens initiiert wird und sich nachfolgend radial ausbreitet. Somit finden sich γ-h2ax-proteine auch noch in bis zu einigen Megabasen Entfernung zum ursprünglichen Strangbruch (Rogakou et al. 1999). Gemeinsam mit Checkpoint- und Reparaturproteinen wie z. B. 53BP1, MDC1, BRCA1 und Rad51 bildet γ-h2ax Komplexe, die als nukleäre Foci bezeichnet werden.

17 10 Abbildung 1: Vereinfachte Darstellung der Nukleosomenstruktur in der Umgebung von DNA-DSBs (Carpenter, University Texas-Houston Medical School). Stellen die Foci eine zytologische Manifestation als Antwort auf ionisierende Strahlung dar, so findet der Terminus IR-induzierte Foci Anwendung in der Literatur (Takahashi et al. 2008). Ionisierende Strahlung verursacht reaktive Formen des Sauerstoffs, welche wiederum die DNA angreifen und zu Strangbrüchen führen (Pandita et al. 2009). Für die Reparatur von DSBs sind in diesem Fall sowohl Atm als auch DNA- Proteinkinasen verantwortlich, die zu einer Phosphorylierung von H2ax in der Umgebung des DSBs führen. Die Bedeutung der beiden Enzyme lässt sich auch daran erkennen, dass Atm- bzw. DNA-PK-defiziente Zellen auf ionisierende Strahlung hypersensitiv reagieren und zudem DNA-Reparatur-Defekte aufweisen (Bassing et al. 2002). γ-h2ax fungiert somit als Marker für die Strahlenempfindlichkeit einer Zelle. Durch die Entwicklung eines Antikörpers, der spezifisch an γ-h2ax bindet, ist

18 11 es nun möglich, diese nukleären Foci mit Hilfe von immunhistochemischen Methoden sichtbar zu machen und unter dem Fluoreszenzmikroskop zu betrachten (Huang 2006). Ein Großteil der DSBs wird innerhalb einiger Stunden repariert, die Anzahl der Foci reduziert sich somit ebenso (Yoshikawa et al. 2009). Während dieser Reparaturprozesse scheint γ-h2ax die Funktion eines Ankers wahrzunehmen, der für die Rekrutierung und korrekte sterische Anordnung der Reparaturkomplexe erforderlich ist. Außerdem hat γ-h2ax die Aufgabe, die Bruchenden zu fixieren und die Reparatur in Richtung der fehlerfreieren homologen Rekombination zu lenken. Durch die sogenannten Checkpointproteine vermittelt es zudem das Signal, dass eine potentiell letale Läsion vorhanden ist, die der Reparatur bedarf (Fernandez-Capetillo et al. 2003). Es existiert somit ein komplexes Protein-Netzwerk innerhalb der Zelle, das in der Lage ist, DNA- Schäden aufzuspüren, zu reparieren und gegebenenfalls die Apoptose einzuleiten, falls sich der Schaden als irreparabel erweist (Zha 2008). Die Bedeutung, die H2ax innerhalb der zellulären Struktur einnimmt lässt sich an Mäusen verdeutlichen, die eine H2ax-Defizienz aufweisen. Bei diesen ist eine genomische Instabilität und Strahlungsempfindlichkeit nachweisbar, außerdem sind sie wachstumsretardiert und immundefizient (Huang 2006). 3.2 Pml NBs Promyelocytic leukaemia nuclear bodies (Pml NBs) sind kugelförmige, subnukleäre Zellkompartimente, die auch unter einer Vielzahl von anderen Namen wie z. B. Kremer bodies oder Pml oncogenic domains bekannt sind (Borden 2002; Dundr et al. 2002). Studien deuten darauf hin, dass die Pml NBs u. a. an Transkription, Replikation und Reparatur der DNA, Tumorsuppression, Wachstumskontrolle, Apoptose und Seneszenz der Zelle beteiligt sind, wobei ihre genaue Funktion derzeit noch Gegenstand der Forschung ist (Dellaire et al. 2006; Matsuo et al.

19 ; McNally et al. 2008; Reineke et al. 2009b). In den meisten gesunden und neoplastischen Geweben sind Pml NBs enthalten (Matsuo 2008), für gewöhnlich in einer Anzahl von pro Kern und einer durchschnittlichen Größe von 0,2-1,0 µm (Borden 2002; Dundr and Misteli 2002). Ein Ansteigen der Kernkörperchen lässt sich beispielsweise in der S-Phase der Zelle, nach DNA-Schädigung oder einer Behandlung mit Interferon nachweisen (Dellaire 2006; Hodges et al. 1998). Das Pml-Protein, welches durch alternatives Spleißen am C-terminalen Exon in mehreren Isoformen vorliegt, ist essentiell für die Formierung von Pml-NBs. Darüberhinaus existieren mind. 50 weitere Proteine wie z. B. SP100, SUMO, p53, CBP und Daxx, die mit diesen Kernkörperchen assoziiert sein können. Es konnte nachgewiesen werden, dass einige von ihnen in der Lage sind, direkt an Pml zu binden, viele jedoch durch Interaktion mit einem anderen Bestandteil des NBs rekrutiert werden (Moran et al. 2009). Aufgrund der unterschiedlichen Zusammensetzung der NBs stellte man die These auf, dass sie in der Zelle nur eine Speicherfunktion einnehmen und selbst nicht aktiv sind (Borden 2002). Pml NBs sind innerhalb des Nukleoplasmas mobil, wobei der Großteil räumlich begrenzte, langsame Bewegungen ausführt und nur 12 % in der Lage sind, sich energieabhängig schneller fortzubewegen; 25 % der NBs sind gänzlich immobil (Muratani et al. 2002). Es existiert weiterhin eine lösliche Form des Pml-Proteins in Nukleo- und Zytoplasma, welche sich allerdings durch die zu geringe Konzentration nicht mit Antikörpern detektieren lässt (Kiesslich et al. 2002). Wichtigste Proteindomäne des Pml-Proteins ist das sog. RBCC- Motiv in der N-terminalen Hälfte, welches zu den Cystein-reichen Zink- Binde-Motiven gehört und in allen Isoformen enthalten ist. Es bestheht aus einer RING-Domäne, zwei B-Boxen und einer Coiled-Coil-Domäne und vermittelt unter anderem die Interaktion von Pml mit anderen Proteinen (Moran 2009). Wie bereits oben erwähnt wird den Pml NBs auch eine Rolle bei der DNA-Reparatur zugeschrieben. So erfolgt nach dem Auftreten eines DNA-Schadens eine Koakkumulation von p53, CBP und HIPK2 in den Pml NBs, welche einen Beitrag zur geregelten

20 13 Phosphorylierung (durch HIPK2) und Acetylierung (durch CBP) von p53 leistet. Weiterhin spielt Pml wahrscheinlich auch eine Rolle bei der Übermittlung von DNA-Schäden. Unklar ist jedoch, ob diese Modifikationen von Pml und Pml NBs für das Fortschreiten der DNA- Reparatur entscheidend sind oder ob sie nur eine Konsequenz der anhaltenden Reparaturmaßnahmen darstellen. Mit Hilfe von Fibroblasten- Zelllinien konnte des Weiteren nachgewiesen werden, dass die Anzahl der Kernkörperchen nach Induktion von DSBs zunimmt. Nach DSB- Induktion wurde zudem festgestellt, dass sich der Zeitpunkt der größten Anzahl an Pml NBs mit jenem der höchsten H2ax-Phosphorylierung deckt (Dellaire 2006). Das Pml-Gen ist zum Überleben nicht essentiell (Borden et al. 2002). Pml- Knock out -Mäuse sind lebensfähig und fruchtbar, allerdings anfälliger für virale Infektionen und neoplastische Ereignisse (Wang et al. 1998). In Tumorzelllinien von z. B. Adeno-, Brust- oder Lungenkarzinomen findet sich eine reduzierte Expression des Pml-Proteins, eine Tatsache, die auf die tumorsuppressive Wirkung von Pml hinweist (Moran 2009). Eine Erkrankung, die ebenfalls mit Pml NBs assoziiert wird, ist die Akute Promyelozytische Leukämie (APL). Ursache der Erkrankung ist eine Fusion der Gene Pml und RARalpha. Bei Patienten, die an APL erkrankt sind, konnte eine Zerstörung der Kernkörperchen in den Promyelozyten festgestellt werden, die Proteine der NBs finden sich dispers im Zellkern verteilt. Ein weiterer Hinweis darauf, dass die Integrität der Pml NB-Struktur für die Gesunderhaltung der Zelle von Bedeutung ist (Kiesslich 2002). 3.3 Protein p53 Das Tumorsuppressor-Protein p53, benannt nach seinem Molekulargewicht von 53 kda (Darnton 1998), ist ein nukleär lokalisierter Transkriptionsfaktor (Ruiz et al. 2008), welcher als ein zentrales Protein der Zellzykluskontrolle anzusehen ist. Zu den vielen Zielgenen von p53

21 14 zählen unter anderem Gene, die bei der Reparatur von DNA-Schäden, der Regulierung der Apoptose oder der Anti-Angiogenese eine Rolle spielen (Zhao 2008). In genomisch unauffälligen Zellen liegt p53 in inaktiver Form, das heißt gebunden an eine E3-Ubiquitin-Ligase vor (Carter et al. 2008; Lukashchuk et al. 2007; Ruiz 2008). Von allen E3- Ubiquitin-Ligasen wurde bisher MDM-2 am besten untersucht (Almazov et al. 2007; Chumakov 2007). Sie interagiert hierbei mit der N-terminalen Domäne des Proteins und inhibiert somit seine Funktion als Transkriptionsfaktor (Adams et al. 2006; Lukashchuk and Vousden 2007). Erfolgt jedoch eine Schädigung der DNA, wird p53 durch Phosphorylierung (u.a. durch Atm, DNA-Pks oder Chk2) in den aktiven Zustand überführt, wobei sich der Konformitätszustand von p53 ändert und MDM-2 abdiffundiert (Zhao 2008). In der Zelle erfolgt somit eine Stabilisierung und Akkummulation des Proteins (Adams and Carpenter 2006). Abbildung 2: DNA-Schäden führen zu einer Aktivierung von Proteinkinasen der PIKK-Familie (Atm, DNA-PK und Atr). Diese aktivieren wiederum die Checkpointkinasen (CHK1 und CHK2) und p53. Aktiviertes p53 vereinigt die Ergebnisse des Signalnetzwerkes und ist für das weitere Schicksal der Zelle verantwortlich (Rodier et al. 2007). Nachfolgend existieren für die normale Säugerzelle vier Optionen, den entstandenen Schaden zu reparieren und damit die Integrität des

22 15 Genoms sicherzustellen (Rodier 2007; Zhang et al. 2009). Zuerst erfolgt in allen Fällen eine Arretierung des Zellzyklus, um somit die Proliferation einer genomisch entarteten Zelle zu verhindern und selbiger Zeit für eine entsprechende Reparatur einzuräumen (Darnton 1998). Dieser Zellzyklus-Stop ist assoziiert mit verschiedenen Transkriptionsfaktoren wie z. B. dem Protein p21, welches nach DNA- Schädigung und nachfolgender Akkumulation von p53 vermehrt synthetisiert wird (Darnton 1998). p21 bindet die CDK2 und CDK4 und hemmt somit die Phosphorylierung ihrer Substrate, so z. B. des Rb105. Der Rb105-E2F-DP1-Komplex bleibt dadurch intakt und die Zelle wird so an einem Eintreten in die S-Phase gehindert (Chumakov 2007). Im günstigsten Falle handelt es sich um einen Schaden von eher geringem Ausmaß, der von der Zelle angemessen behoben werden kann. Die Arretierung des Zellzyklus wird nach erfolgreicher Reparatur durch ein Abfallen des p53-spiegels wieder aufgehoben, die Zelle ist somit wieder zur Proliferation befähigt. Handelt es sich jedoch um einen schwerwiegenden DNA-Schaden der sich nachfolgend als irreparabel herausstellt, so wird entweder der programmierte Zelltod, die sogenannte Apoptose, oder die zelluläre Seneszenz eingeleitet (Zhang 2009). Hierbei ist es unter anderem von Bedeutung, von welcher Gewebeart die betroffenen Zellen abstammen. So leiten Zellen mit lymphoider Abstammung nach schwerwiegendem DNA-Schaden für gewöhnlich die Apoptose ein, während sich Stromazellen der Seneszenz unterziehen (Rodier 2007). Die Proliferation von Zellen mit geschädigtem Erbgut wird somit entweder durch das Absterben der Zelle oder im Falle der Seneszenz durch einen dauerhaften Wachstumsstop verhindert. Im für den Organismus ungünstigsten Fall erlangt eine Zelle mit irreparablem DNA-Schaden wieder die Fähigkeit zur Proliferation. Es besteht bei einer Zellteilung somit das Risiko einer erhöhten Mutationsfrequenz, ein Szenario, welches die Entstehung von Krebs begünstigen kann (Rodier 2007).

23 16 Aufgrund seiner essentiellen Funktion zur Erhaltung der genomischen Integrität bezeichnet man p53 auch als Wächter des Genoms (Bauer et al. 2006; Darnton 1998; Rodier 2007). Eine Mutation von p53 findet sich in ca % aller menschlichen Tumoren (Adams and Carpenter 2006; Darnton 1998; Lukashchuk and Vousden 2007; Riley et al. 2007), wobei das defekte Protein nicht die Ursache der Erkrankung ist, sondern das Unvermögen des Körpers, gegen eine Zellentartung frühzeitig vorzugehen und somit die Entstehung eines Tumors zu verhindern. p53 ist das Gen, welches in menschlichen Tumoren am häufigsten eine Mutation aufweist (Pietsch et al. 2008). Bestrahlungs- u. Chemotherapie bei Patienten mit mutiertem p53 zeigen weniger Wirkung, da die so entstehenden genomgeschädigten Zellen nicht mehr mit Hilfe des p53-pathways und der Apoptose eliminiert werden können (Ferrari et al. 2009). Intention dieser Arbeit ist die Untersuchung der Strahlenempfindlichkeit von Zellen aus oralen PLE-Karzinomen und gesunder Mundschleimhaut. Es wird der Frage nachgegangen, wie viele DSBs nach einer Bestrahlung mit 2 Gy in den Zellen auftreten. Außerdem ist es Ziel herauszufinden, ob das Reparaturvermögen der Tumorzellen ebenso effizient wie jenes der Normalgewebszellen ist. Als Marker für die DSBs und somit als Maß für die Strahlenempfindllichkeit dient in den Versuchen γ-h2ax. Desweiteren wird die Verteilung von Pml- und p53ser20-protein sowie der Anteil der apoptotischen Zellen untersucht.

24 17 4 Material und Methoden 4.1 Patienten n Alter (Jahren) Mittelwert 63 (45-80) Geschlecht männlich 13 weiblich 7 Tumorlokalisation Mundboden anterior 6 OK 1 Oropharynx 1 UK 7 Unterlippe 1 Wange 2 Zunge 2 Primärtumor T1 6 T2 6 T3 1 T4 7 LK-Status N0 4 N1 6 N2 10 Fernmetastasen M0 20 Differenzierung G1 3 G2 14 G3 3

25 Immunostaining Prinzip Das Immunostaining stellt eine Methode dar, mit welcher bestimmte Kernproteine unter Zuhilfenahme von Antikörpern sichtbar gemacht werden können. In dieser Arbeit kommt die indirekte Methode der Immunfluoreszenz zur Anwendung, d. h. es wird zuerst ein sogenannter Primärantikörper verwendet, der aus einer bestimmten Tierart gewonnen wird und gegen das zu untersuchende Protein (Epitop) gerichtet ist. Dieser Antikörper soll sich durch eine möglichst hohe Affinität und Spezifität auszeichnen und keine Reaktionen mit anderen Epitopen zeigen. Im zweiten Schritt wird nun der Sekundärantikörper aufgetragen, welcher mit einem Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt ist und gegen den Primärantikörper gerichtet ist. Erst hierdurch können die durch den Primärantikörper markierten Proteine als Foci unter dem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht werden Zellvorbereitung Die Versuche wurden in Zusammenarbeit mit der Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgischen Klinik in Erlangen durchgeführt, wobei Zellen aus Gewebeproben von PLE-Karzinomen der Mundhöhle und gesunder Schleimhaut untersucht wurden. Hierzu wurde jedem Patienten ein Tumor- sowie ein Normalgewebspräparat entnommen, wobei letzteres aus unmittelbarerer Umgebung zum PLE-Karzinom stammte. Nach Zerkleinerung des Gewebes mittels Skalpell und anschließender Überführung in gentlemacs C-Tubes erfolgte die Zugabe von 5 ml Enzymlösung bestehend aus 1xPBS, Collagenase 0,1 %, Trypsin 0,1 % sowie Hyaluronidase 0,2 %. Um eine Einzelzell-Suspension zu erhalten wurden die C-Tubes nun auf den gentlemacs Dissociator aufgesteckt und der Dis-

26 19 soziationsvorgang gestartet. Daraufhin erfolgte eine 15-minütige Inkubation auf dem Rüttler im Brutschrank bei 37 C (5 % CO 2 ). Die Suspension wurde anschließend für 8 Min. bei 170 g zentrifugiert und der hierduch entstehende Überstand in ein Zentrifugenröhrchen pipettiert. Zu den verbliebenen Gewebestückchen in den C-Tubes wurde 2 ml Medium gegeben und erneut der Dissoziationsvorgang gestartet. Nach abermaligem Zentrifugieren für 8 Min. bei 170 g wurde der Überstand ebenfalls in das Zentrifugenröhrchen abpipettiert. Die somit erhaltene Zellsuspension wurde in der Zentrifuge in Zellpellet und Überstand aufgetrennt, wobei letzterer verworfen wurde und das Zellpellet mit 1,5 ml Medium (Dulbeccos-Mem: 3,7 g/l NaHCO3, 4,5 g/l D-Glucose, Na-Pyruvate, L-Glutamine, Phenol red, 10 % FKS, 1 % Penicillin, 1 % Streptomycin) resuspendiert wurde. Anschließend erfolgte ein Verteilen der Suspension auf drei Zentrifugenröhrchen, die der Reparaturzeit entsprechend beschriftet wurden Röntgenbestrahlung Bestrahlt wurden die Zellen, mit Ausnahme der Kontrollen, mit einer Isovolt Titan Röntgenröhre (120 kv; General Electrics, Ahrensburg, Deutschland) mit 2 mm Aluminium-Filter, wobei die Dosis 2 Gy betrug. Nach dieser Strahlenbehandlung wurden die Zellen für 1 h bzw. 24 h zurück in den Brutschrank gestellt. Die Kontrollproben konnten sofort mit Hilfe der Cytofuge (Cytospin 2, Fa. Shandon) bei Umdrehungen pro Minute auf StarFrost-Objektträger aufzentrifugiert werden, die restlichen Proben nach entsprechender Reparaturzeit. Der Zentrifugiervorgang dauerte jeweils 10 Min., wobei pro Objektträger 100 µl Suspension mit ca Zellen verwendet wurden.

27 Fixierung und Permeabilisierung Zur Fixation der Zellen und Permeabilisierung der Zellmembranen wurde eine 4%-ige Formaldehyd-Lösung mit 0,1% TritonX-100 zu den Objektträgern gegossen und die Küvette für 15 Min. unter den Abzug gestellt. Nach Abdekantieren der Fixierlösung erfolgte ein dreimaliger Waschvorgang mit 1xTBS-Lösung für jeweils 5 Min. auf dem Rüttler. Zu den gewaschenen Objektträgern wurde nun ein Blockierpuffer gegossen, der über Nacht oder länger in der Küvette verblieb Fluoreszenzfärbung Nachdem der Blockierpuffer aus der Küvette entfernt wurde schloss sich ein erneuter dreimaliger Waschvorgang mit 1xTBS-Lösung auf dem Rüttler an. Die Objektträger wurden nun auf Papiertücher gelegt und vorsichtig getrocknet. Jetzt erfolgte das Auftragen der Primärantikörper, welche in einer zuvor ausgetesteten Konzentration mit 1 % BSA in 1xTBS-Lösung angesetzt wurden. Pro Objektträger kamen 10 µl der Primärantikörperlösung zum Einsatz, die jeweils mit einem Coverslip bedeckt wurden. Hierbei konnten jeweils zwei verschiedene Antikörper gleichzeitig aufgetragen werden, jedoch nur, wenn die Antikörper nicht von derselben Tierart gewonnen wurden.

28 21 Tabelle 1: Primärantikörper für Immunostaining Antikörper Hersteller Konz. Anti-H2ax Ser139 (mouse) Upstate, New York, U.S.A. Anti-Pml (rabbit) Upstate, New York, U.S.A Anti-p53Ser20 (rabbit) Cell Signaling, Danvers, Ma, U.S.A. 1:1500 1:50 1:50 Zur Inkubation der Primärantikörper wurden die Objektträger über Nacht in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur aufbewahrt. Die Coverslips wurden anschließend von den Objektträgern entfernt und letztere abermals dreimal mit 1xTBS-Lösung für je 5 Min. auf dem Rüttler gewaschen. Nach anschließendem Trocknen konnte nun der mit Fluoreszenzfarbstoff-gekoppelte Sekundärantikörper aufgetragen werden, der analog zum Primärantikörper je nach ausgetesteter Konzentration mit 1 % BSA in 1xTBS-Lösung angesetzt wurde. Es wurden wiederum 10 µl Flüssigkeit pro Objektträger aufgetragen und mit einem Coverslip bedeckt. Tabelle 2: Sekundärantikörper (fluoreszierend) für Immunostaining Antikörper Hersteller Konz. Alexa Fluor 488 goat antimouse Alexa Fluor 555 donkey antirabbit Molecular Probes, Göttingen, Deutschland Molecular Probes, Göttingen, Deutschland 1:200 1:500

29 22 Bei zwei verschiedenen gleichzeitig aufgetragenen Primärantikörpern war zu beachten, jeweils einen Sekundärantikörper mit grünem Farbstoff gegen den einen und einen Sekundärantikörper mit rotem Fluoreszenzfarbstoff gegen den anderen der beiden Primärantikörper zu verwenden. Nach 3,5 h Inkubation in der feuchten Kammer und anschließendem dreimaligem Waschen mit 1xTBS-Lösung erfolgte jetzt die Gegenfärbung mit DAPI, welches den Zellkern unter dem Fluoreszenzmikroskop blau erscheinen lässt. Jeder Objektträger wurde mit 20 µl Flüssigkeit beschickt und für 1 Min. mit einem Coverslip bedeckt. Nach Entfernung derselbigen wurden die Objektträger mehrmals in destilliertem Wasser geschwenkt und unter Alufolie zum Trocknen aufgestellt. Das Eindecken erfolgte mit 20 µl Vectashield (Linaris GmbH, Wertheim, Deutschland), welches auf die Objektträger pipettiert und mit Deckgläsern abgedeckt wurde. DAPI Pml Merged Abbildung 3: Beispiel für Immunostaining mit PLE-Karzinom-Zellen. Der Zellkern erscheint durch ein Anfärben mit DAPI unter dem Fluoreszenzmikroskop blau, die Pml-NBs durch eine Färbung mit anti-pml rot. Das Zytoskelett der Zelle wurde mit anti-α-tubulin grün angefärbt. Gut erkennbar ist die Verschiebung der Kern- Plasma-Relation zugunsten des Zellkerns.

30 Apoptotische Zellen Abbildung 4: Bildanalyseprogramm Biomas: Im Vordergrund ist der Zellkern einer apoptotischen Zelle abgebildet, welcher fast vollständig mit γ-h2ax-protein ausgefüllt ist. Eine Zelle, deren Kern fast vollständig mit γ-h2ax-protein ausgefüllt war, wurde als apoptotische Zelle definiert. Dies wurde durch die Tatsache begründet, dass in jenen Zellen die Schäden an der DNA so komplex und schwerwiegend waren, dass eine Reparatur nicht mehr möglich war und daraufhin die Einleitung der Apoptose erfolgte. Abschließend wurde bestimmt, wie groß der Prozentsatz der Apoptosezellen gemessen an der vorher bestimmten Gesamtzellzahl war.

31 Auswertung Die Auswertung der Versuche erfolgte mit einem Fluoreszenzmikroskop sowie dem Bildanalyseprogramm Biomas. Biomas-Software, Version 4.5 1/2008, PD Dr. med. L. Distel, Erlangen, Deutschland Mit Hilfe des Fluoreszenzmikroskops wurden zuerst drei Bilder aufgenommen: zwei Bilder mit den rot bzw. grün angefärbten Proteinen sowie ein Bild des mit DAPI blau gefärbten Zellkerns. Das Programm Biomas selektierte und umrandete die Zellkerne und legte somit deren genaue Lage fest. Es erfolgte eine Fusion des blauen und roten Bildes sowie eine Überprüfung der korrekten Lage beider Bilder, welche gegebenenfalls korrigiert wurde. Analog wurde mit dem roten Bild im Vergleich zum grünen Bild verfahren. Nun erfolgte das Markieren der Foci durch das Programm, wobei nicht erkannte Foci manuell hinzugefügt bzw. zu viel markierte Foci wieder entfernt wurden. Nach Bestätigung der Eingabe wurden folgende Daten für beide Proteine in eine Excel- Tabelle übertragen: - Anzahl der Foci - Kolokalisation der Proteine - Fläche der Foci (µm²) - Durchschnittliche Helligkeit der Foci (Luminance in Graustufen) - Maximale Helligkeit (Luminance in Graustufen) - Fläche der Kerne (µm²) - Helligkeit der Kerne (Luminance in Graustufen)

32 25 Abbildung 5: Darstellung der Auswertung mit Hilfe des Bildanalyseprogramms Biomas. Im Vordergrund ist eine Normalgewebszelle abgebildet, deren p53ser20-foci rot markiert sind.

33 26 5 Ergebnisse Ziel der nachfolgenden Arbeit war es aufzuzeigen, ob und inwiefern sich die Anzahl der DSBs nach Bestrahlung und entsprechender Reparaturzeit in Tumorzellen und humanen Keratinozyten unterscheidet. Desweiteren wurde die Interaktion zwischen γ-h2ax- und Pml-Protein sowie die Verteilung der apoptotischen Zellen untersucht. Außerdem wurde mit Hilfe des Proteins p53 der Frage nachgegangen, wie die Reparatur der DNA-DSBs in Tumorzellen und Keratinozyten reguliert wird. 5.1 H2ax Phosphoryliertes H2ax (γ-h2ax) dient als Marker von DNA-DSBs im Zellkern, wobei die Phosphorylierung nach Bestrahlung durch Atm an Ser139 am C-Terminus erfolgt. Mit Hilfe immunhistochemischer Methoden werden die DNA-DSBs als γ-h2ax-foci unter dem Fluoreszenzmikroskop sichtbar, wodurch nun auf die Anzahl der DSBs im Zellkern geschlossen werden kann. Deshalb wurde die Induktion von γ-h2ax-foci nach 1 h und 24 h im Immunostaining betrachtet, sowohl bei Tumorzellen als auch bei gesunden Schleimhautzellen. Die Anzahl der Foci in den unbestrahlten Kontrollen war im Tumor- und im Normalgewebe mit 6,72 bzw. 6,55 Foci nahezu identisch (p=0,702), es konnte somit kein Unterschied in der Anzahl der spontan autretenden DSBs in den verschiedenen Geweben festgestellt werden. Betrachtete man die Foci-Anzahl nach Bestrahlung und einstündiger Reparaturzeit, so war ein signifikanter Anstieg in beiden Geweben zu verzeichnen, wobei in Tumorzellen der Wert mit durchschnittlich 35,52 Foci pro Zelle (p<0,001) noch etwas höher ausfiel als im Normalgewebe (N: 32,40 Foci/Zelle; p<0,001). Nach Bestrahlung der Gewebeproben mit 2 Gy und anschließender 24-stündiger Reparaturzeit war zwischen Tumor- und Normalgewebe ein deutlicher Unterschied erkennbar, da

34 27 die γ-h2ax-foci-anzahl im Tumorgewebe mehr als doppelt so hoch ausfiel wie bei gesunder Schleimhaut (p<0,001). Bei letzterer betrug die durchschnittliche Foci-Anzahl 10,63, wohingegen im Tumorgewebe ein Wert von 22,08 ermittelt wurde (Abb. 6/7). Es konnte somit festgestellt werden, dass in den untersuchten Tumorzellen nach 24 h weit weniger DNA-DSBs repariert wurden als in den Zellen der gesunden Mundschleimhaut. Abbildung 6: Immunostaining mit Tumor- und Normalgewebszellen. Anzahl der γ-h2ax-foci nach Bestrahlung mit 2 Gy im zeitlichen Verlauf. Dargestellt sind sowohl die Einzelwerte aller untersuchten Patienten als auch die Mittelwerte. * Besonders hervorzuheben ist der signifikante Unterschied nach Bestrahlung mit 2 Gy und 24-stündiger Reparaturzeit zwischen Tumor- und Normalgewebe (p<0,001).

35 28 DAPI H2ax Merged Kontrolle 2 Gy/1h 2 Gy/24h Abbildung 7: Immunostaining mit humanen Keratinozyten. Färbung mit DAPI und anti-γ-h2ax. Darstellung der γ-h2ax-foci pro Zelle nach einer Bestrahlung mit 2 Gy im zeitlichen Verlauf. 5.2 Pml NBs Neben den γ-h2ax-foci wurde des Weiteren die Verteilung der Pml NBs nach Bestrahlung mit 2 Gy im zeitlichen Verlauf betrachtet sowie die Kolokalisation beider Proteine. Pml NBs sind in nahezu allen gesunden und neoplastischen Geweben enthalten und an einer Vielzahl von Prozessen innerhalb der Zelle beteiligt, unter anderem auch an Reparaturprozessen der DNA. Betrachtete man nun die Anzahl der Pml-NBs in den unbestrahlten Kontrollproben, so war zwischen Tumorund Normalgewebe kein signifikanter Unterschied festzustellen. Die

36 29 durchschnittliche Foci-Anzahl im Tumorgewebe betrug 8,11, während im Normalgewebe 7,92 Foci pro Zelle ermittelt wurden (p=0,112). Nach Bestrahlung und einstündiger Reparaturzeit verdoppelte sich die Anzahl der Foci bei den Tumor- sowie Normalgewebszellen auf 15,55 (Tumorzellen) bzw. 16,75 (gesunde Schleimhautzellen), eine signifikante Differenz zwischen Tumor- und Normalgewebe war hierbei ebenso nicht zu beobachten (p=0,554). Im weiteren Verlauf nahm die Zahl der Pml-Foci wieder ab und erreichte in beiden Geweben wieder den Ausgangswert der Kontrollproben bzw. lag leicht darunter (T: 6,22 Foci/Zelle; N: 7,07 Foci/Zelle; Abb. 8/9). Ein signifikanter Unterschied lag hier zwischen Tumor- und Normalgewebe ebenfalls nicht vor (p=0,549). Abbildung 8: Immunostaining mit Tumorzellen und Zellen aus gesunder Mundschleimhaut. Anzahl der Pml NBs nach Bestrahlung mit 2 Gy im zeitlichen Verlauf.

37 30 DAPI Pml Merged Kontrolle 2 Gy/1h 2 Gy/24h Abbildung 9: Immunostaining mit humanen Keratinozyten. Färbung mit DAPI und anti-pml, Darstellung der Foci-Anzahl im zeitlichen Verlauf. 5.3 Kolokalisation von γ-h2ax- und Pml-Foci Eine nennenswerte Kolokalisation von γ-h2ax- und Pml-Foci war bei keinem der untersuchten Patienten zu beobachten, weder bei Zellen aus PLE-Karzinomen noch bei Zellen der gesunden Mundschleimhaut (Abb. 10). Lediglich nach Bestrahlung und einstündiger Reparaturzeit stieg die Kolokalisation in beiden Gewebearten an, was jedoch durch die große Anzahl der γ-h2ax-foci eher auf ein zufälliges Übereinanderliegen hindeutete.

38 31 DAPI Pml Merged Abbildung 10: Immunostaining mit humanen Keratinozyten. Färbung mit DAPI, anti-γ-h2ax und anti-pml. Darstellung der γ-h2ax- (grün) und Pml-Foci (rot) sowie deren Kolokalisation nach Bestrahlung und 24-stündiger Reparaturzeit. 5.4 p53 Neben γ-h2ax und Pml NBs wurde außerdem die Verteilung von p53ser20-foci untersucht. p53 ist ein wichtiger Tumorsuppressor, der unter anderem auch eine entscheidende Rolle bei der Reparatur von DNA-Schäden spielt. So erfolgt nach genotoxischem Stress, wie z. B. einer Bestrahlung der Zellen, eine Phosphorylierung durch Atm an Ser20, wodurch p53 stabilisiert wird und im Zellkern akkumuliert. Dies war sowohl im Tumor- als auch im Normalgewebe zu erkennen, da die Anzahl der p53ser20-foci nach Bestrahlung mit 2 Gy und einstündiger Reparaturzeit auf 17,60 (Tumorzellen) bzw. 15,82 (Zellen aus gesundem Gewebe) anstieg. Somit war in beiden Geweben ein signifikanter Anstieg der Foci-Anzahl im Vergleich zu den Kontrollen zu verzeichnen (T: p=0,019; N: p=0,029). Diese Werte nahmen im weiteren Verlauf wieder ab, womit sich nach 24 h Reparaturzeit in den Tumorzellen noch eine durchschnittliche Anzahl von 8,89 und in den gesunden Schleimhautzellen ein Wert von 10,12 ergab (Abb. 11/12).

39 32 Abbildung 11: Immunostaining mit Tumorzellen und Zellen aus gesunder Mundschleimhaut. Anzahl der p53ser20-foci nach Bestrahlung mit 2 Gy im zeitlichen Verlauf.

40 33 DAPI p53ser20 Merged Kontrolle 2 Gy/1h 2 Gy/24h Abbildung 12: Immunostaining mit humanen Keratinozyten. Färbung mit DAPI und anti-p53ser20. Darstellung der p53ser20-foci pro Zelle nach einer Bestrahlung mit 2 Gy im zeitlichen Verlauf. 5.5 Apoptose Abschließend wurde untersucht, wie groß der Anteil apoptotischer Zellen an den insgesamt ausgewerteten Zellen war. Mit durchschnittlich 1,03 % (T) bzw. 3,02 % (N) fiel der Anteil der apoptotischen Zellen in den Kontrollproben beider Gewebe gering aus, die Differenz war hierbei nicht signifikant (p=0,188). Betrachtete man den Anteil nach Bestrahlung und einer Stunde Reparaturzeit, so stieg im Fall der Tumorzellen der Wert leicht an bzw. fiel bei den Zellen der gesunden Schleimhaut geringfügig ab (T: 3,21 %; N: 2,73 %). Ein signifi-

41 34 kanter Anstieg im Vergleich zu den Kontrollproben war in beiden Geweben erst nach 24-stündiger Reparaturzeit erkennbar, der Anteil der apoptotischen Zellen lag hier bei 8,5 % bzw. 9,9 % (T: p<0,001; N: p=0,007; Abb. 13). Abbildung 13: Zahl der apoptotischen Zellen nach Bestrahlung mit 2 Gy und entsprechender Reparaturzeit in %.

42 35 6 Diskussion Neben chirurgischer Intervention und Chemotherapie stellt die Behandlung mit ionisierender Strahlung eine weitere Option im Therapiekonzept des oralen PLE-Karzinoms dar. Sie wird meist mit chemotherapeutischen Maßnahmen kombiniert eingesetzt, da Radiound Chemotherapie auf verschiedene Weise interagieren und somit ein effektiveres Vorgehen gegen den Tumor ermöglichen (van Heijl et al. 2008). So verhindert beispielsweise die Chemotherapie die Neubesiedlung der Tumorzellen nach erfolgter Bestrahlung oder verbessert durch Verkleinerung des Tumors die Reoxygenierung, welche wiederum förderlich für die Radiotherapie ist (van Heijl 2008). Die Anwendung ionisierender Strahlung zur Therapie von neoplastischen Ereignissen beruht darauf, dass sie in der Lage ist, direkte Schäden der DNA zu induzieren (Burdak-Rothkamm et al. 2009). Hierbei sind vor allem die DSBs von Bedeutung, da die Wahrscheinlichkeit ihrer Reparatur erheblich kleiner ist als bei anderen DNA-Schäden. Die Wirkung der Strahlentherapie beruht im Wesentlichen auf der Toxizität von reaktiven Sauerstoffmolekülen, die durch die Radiolyse von Wasser entstehen. Studien zeigen, dass durch ionisierende Strahlung geschädigte Zellen Signale an ihre ungeschädigten Nachbarzellen aussenden können, die in diesen ähnliche Effekte wie die Strahlung selbst hervorrufen. Dieses Phänomen wird auch als bystander effect bezeichnet (Rzeszowska-Wolny et al. 2009). Neoplastisches Gewebe wird auf Grund seiner guten Vaskularisierung und der damit verbundenen Versorgung mit Sauerstoff stärker geschädigt als gesundes Gewebe (Lee et al. 2008). Zudem weisen Tumorzellen in der Regel eine schlechtere Reparaturfähigkeit von DNA-Schäden auf als nicht-neoplastische Zellen (Bolderson et al. 2009). Ob Zellen aus oralen PLE-Karzinomen ebenfalls eine verminderte Reparaturfähigkeit von DNA-Schäden aufweisen und damit strahlenempfindlicher sind als Zellen aus der benachbarten, gesunden Schleimhaut, war das wesentliche Ziel dieser Arbeit. Um dieser Frage nachzugehen, wurde

43 36 die Anzahl von DNA-DSBs nach einer Bestrahlung mit 2 Gy im zeitlichen Verlauf ermittelt, jeweils in einem Tumor- sowie Normalgewebspräparat desselben Patienten. Ein sensitiver Marker für strahleninduzierte DNA-DSBs stellt γ-h2ax dar (Avondoglio et al. 2009). Nach Induktion von DSBs der DNA wird in Säugerzellen H2ax, eine Variante des Histons H2a, rasch an Ser139 phosphoryliert. Das entstehende γ-h2ax kann nun mit Hilfe von Antikörpern detektiert werden und dient somit als Indikator für die DNA-DSBs (Dickey et al. 2009). Nach einer Bestrahlung mit 2 Gy und 1-stündiger Reparaturzeit war in den Tumorzellen die γ-h2ax-foci-anzahl mit durchschnittlich 35,52 Foci nur geringfügig höher als bei den Zellen der gesunden Schleimhaut. Bei der Induktion von DSBs war zwischen Tumor- und Normalgewebe somit kein signifikanter Unterschied zu erkennen (p=0,433), das Tumorgewebe aus den oralen PLE-Karzinomen reagierte somit nicht wesentlich strahlenempfindlicher als das gesunde Gewebe. Betrachtet man nun die Foci-Anzahl nach 24 h Reparaturzeit, so lässt sich eine Aussage bezüglich der Reparaturfähigkeit beider Gewebe treffen. Hierbei war nun ein signifikanter Unterschied feststellbar, da im Tumorgewebe die Anzahl der verbliebenen DNA- DSBs wesentlich höher ausfiel als im gesunden Gewebe (p<0,001). Somit ist festzuhalten, dass die Tumorzellen innerhalb von 24 h lediglich 47 % der entstandenen DSBs reparieren konnten, während die gesunden Zellen in der Lage waren, 85 % der Schäden zu beheben. Das Reparaturvermögen der Zellen aus oralen PLE-Karzinomen ist somit als wesentlich geringer einzustufen als jenes von nichtneoplastischen Schleimhautzellen. Obwohl auch nach 24 h noch eine Reparatur von DNA-DSBs stattfindet, so ist es im Fall der Tumorzellen doch sehr unwahrscheinlich, dass die Anzahl der γ-h2ax-foci wieder bis auf den Wert der unbestrahlten Kontrollproben absinkt. Es ist nämlich zu vermuten, dass es sich bei den verbliebenen Defekten um komplizierte Läsionen handelt, da sie ja noch nicht repariert werden konnten. So ist davon auszugehen, dass sich viele DSBs als irreparabel erweisen, woraufhin die Zelle die Apoptose einleitet und abstirbt. Diese

44 37 Erkenntnis lässt darauf schließen, dass die ionisierende Strahlung eine sinnvolle therapeutische Maßnahme bei der Behandlung des oralen PLE-Karzinoms darstellt, da die Tumorzellen aufgrund ihres schlechteren Reparaturvermögens in größerem Maße zugrunde gehen als die Zellen der umgebenden gesunden Schleimhaut. Nun stellt sich die Frage, worauf diese verminderte Reparaturfähigkeit der Zellen des oralen PLE-Karzinoms zurückzuführen ist. Ein Faktor, der in dieser Fragestellung Aufschluss geben kann, ist das Protein p53, da dieses Protein eine zentrale Stellung in der DNA-Schadens-Antwort einnimmt. Die Aufhebung der p53-funktion ist außerdem eine der häufigsten molekularen Veränderungen im oralen PLE-Karzinom (Poeta et al. 2007). Es wurde in den Versuchen gezeigt, dass sich die Anzahl der p53ser20-foci nach Bestrahlung und einer Stunde Reparaturzeit in etwa verdoppelt und nach 24 h wieder auf den Wert der unbestrahlten Kontrollproben absinkt. Das Ansteigen der Foci-Anzahl resultiert dadurch, dass nach der Bestrahlung mit 2 Gy p53 durch Atm an Ser20 phosphoryliert wird und dadurch im Zellkern akkumuliert (Wang 2005). Signifikante Unterschiede bezüglich der p53ser20-foci-anzahl im Tumor- und Normalgewebe wurden weder in den Kontrollproben (p=0,943), noch nach Bestrahlung und 1- (p=0,711) bzw. 24-stündiger Reparaturzeit (p=0,764) beobachtet. Lediglich der Anstieg nach Bestrahlung und 1 h Reparaturzeit war in beiden Geweben als signifikant zu bezeichnen (T: p=0,019; N: p=0,029). Daraus lässt sich schlussfolgern, dass nach Einwirkung ionisierender Strahlung die Phosphorylierung von p53ser20 im Tumorgewebe somit ebenso wie im Normalgewebe erfolgt. Auch eine p53-defizienz kann bei den untersuchten Patienten ausgeschlossen werden, da in allen untersuchten Präparaten p53ser20-foci erkennbar waren. Trotz fast identischer Anzahl an p53-protein sind die Tumorzellen dennoch nicht in der Lage, die aufgetretenen DNA-Schäden ebenso effektiv zu reparieren wie die Zellen der gesunden Schleimhaut. So wäre es denkbar, dass die Ursache hierbei unter anderem in einer beschädigten p53-funktion zu suchen ist. Eine Mutation von p53 findet sich in vielen