Physikalisches Praktikum II. Mikroskop (MIK)

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1 Phyikaliche Praktikum II Mikrokop (MIK) Stichworte: Brechung- und Reflexiongeetz, Abbildunggeetze, Abbildungfehler, optiche Geräte, Lupe, Strahlenbegrenzung (Pupillen und Blenden), Beugung am Spalt und Gitter, Auflöungvermögen. Ziel de Veruch: Studium der optichen Eigenchaften de Mikrokop, Meungen mit dem Mikrokop. a) Betimmung der Geamtvergrößerung eine Mikrokop durch Vergleich von Bild- und Objektgröße. Meung de Abbildungmaßtabe für da Objektiv und Betimmung der Okularvergrößerung. b) Betimmung der Auflöunggrenze durch Meung der numerichen Apertur de Objektiv. c) Betimmung der Brechzahl von Probenplatten au Gla und Plexigla. LITERATUR: Hering-Martin-Stohrer: Phyik für Ingenieure; VDI Dobrinki, Krakau, Vogel: Phyik für Ingenieure,Teubner Bergmann, Schäfer: Experimentalphyik, Band III Optik; Walter de Gruyter Hecht: Optik; Addion-Weley 1 Grundlagen 1.1 Konventionelle Mikrokop Die Abbildung im Mikrokop erfolgt in zwei Stufen (iehe Skizze). Da Objektiv erzeugt in der Zwichenbildebene ein reelle, vergrößerte Bild y z ' de Objekte y. Da Okular entwirft ein virtuelle, vergrößerte Bild y' im Unendlichen. Der Beobachter betrachtet da Zwichenbild mit dem al Lupe wirkenden Okular. y a a a' _ f Ok. f ' Obj. t Objekt y _ F Obj. F' Obj. reelle Zwichenbild _ y' F z Ok. ' (-) F' Ok. Objektiv Okular Auge virtuelle Bild y' Abb.1: Abbildung und Vergrößerung bei einem konventionellen Mikrokop File: MIK_WS1314_BA.doc

2 MIK Seite 2/13 Ein Mikrokop beteht im Prinzip au einem Tubu, an deen Enden ich da Objektiv und da Okular befinden. Damit it der Abtand von Objektiv und Okular fet. Die Größe t (iehe Abb. 1a) heißt optiche Tubulänge. Die Scharftellung de Mikrokopbilde erfolgt durch Änderung de Abtande zwichen Objekt und Objektiv mit Hilfe eine Grob- und Feintriebe mit dem der Objekttich angehoben oder abgeenkt wird. Mikrokopvergrößerung M Da Mikrokop wirkt vergrößernd, da der Sehwinkel mit Intrument ' größer it al der Sehwinkel ohne Intrument, d.h. der Winkel unter dem man da Objekt ohne Mikrokop in der Entfernung a (= Bezugehweite) ehen würde. Die Vergrößerung ' eine optichen Intrument it allgemein definiert al da Verhältni: Sehwinkel mit Intrument ' tan ' ' (1) Sehwinkel ohne Intrument tan Nach Abb. 1 gilt: y' z Zwichenbildgröße (-) tan ' = f ' Ok Okularbrennweite (+) Der Sehwinkel ohne Intrument it per Definition auf die deutliche Sehweite oder Bezugehweite a = -250 mm fetgelegt. y tan a Gegentandgröße (+) - Bezugehweite (+) Damit wird die Vergrößerung ' M de Mikrokop: y' z / f ' Ok y' z a ' M ' Obj. ' Oku. (wobei ' Oku ' Lupe ) (2a) y / a y f ' Oku ' Obj it der Abbildungmaßtab de Objektive (-) Ok it die Vergrößerung de Okular (= Lupenvergrößerung) (+) Objektivbrennweite f' Obj. Die Objektivbrennweite wird au dem Abbildungmaßtab und der optichen Tubulänge t berechnet (iehe Abb.1a). ' a' a' f ' t Obj. Obj. wobei üblicherweie t = 160 mm a f ' Obj. f ' Obj.

3 MIK Seite 3/ Mikrokop mit Unendlichoptik Da verwendete Mikrokop AXIOSTAR PLUS hat eine og. Unendlichoptik. Da Mikrokop beitzt einen Unendlich-Raum zwichen Objektiv und Okular, in dem die Strahlen parallel verlaufen. In dieem Unendlich-Raum können Eingriffe vorgenommen werden, die da Mikrokop ehr flexibel und aubaufähig machen. Bei der Fluorezenzmikrokopie wird zum Beipiel einfach eine Auflichtoptik in den Tubu eingechoben. Die Vergrößerung berechnet ich jedoch etwa ander, al bei der konventionellen Optik. z.b. Auflichtbeleuchtung Objektiv Tubuline Okular f Obj f Tub Objektiv = Kollimator Tubuline + Okular = Fernrohr Abb. 2: Abbildung und Vergrößerung bei einem Mikrokop mit Unendlichoptik Da Objektiv wirkt wie ein Kollimator, d.h. bildet nach Unendlich ab. Tubuline und Okular bilden zuammen ein Fernrohr. f ' ' M f ' Tubu Objektiv ' Okular f ' f ' Tubu Objektiv a a ' Okular ' Obj q ' Ok. (-) (2b) mit: a ' Obj Lupenvergrößerung de Objektiv (+) f ' Obj f ' Tubu q Tubufaktor q (+) a a ' Oku Lupenvergrößerung de Okular (+) f ' Oku Achtung: Im allgemeinen beginnt man die Scharftellung immer mit einem chwachen Objektiv bei einem großen Geichtfeld. Ert dann teigert man durch Objektivwechel (Drehen de Objektivrevolver) die Vergrößerung, bi da Präparat optimal erkennbar it. Beginnt man die Beobachtung mit einem mittleren oder tarken Objektiv (ab 40-fach), beteht die Gefahr, da da Objektiv auf da Objekt tößt und bechädigt wird.

4 MIK Seite 4/13 2 Veruchanordnung und Veruchdurchführung Abb. 3: Da verwendete Mikrokop Axiotar plu mit den wichtigten Bauteilen. 1 Okulare 10 Triebknopf für Kreuztichvertellung y 2 Binokularer Tubu 11 Leuchtfeldblende 3 Mikrokoptativ 12 Kondenorträger 4 Rändelchraube für Tubuarretierung 13 Aperturblendeneintellung 5 Beleuchtungtärkeregler 14 Kondenor 6 Ein-/Auchalter mit Kontrolllampe 15 Zentrierchraube für Kondenor 7 Fokuiertrieb Feinvertellung 16 Kreuztich mit Objekthalter 8 Fokuiertrieb Grobvertellung 17 Objektiv 9 Triebknopf für Kreuztichvertellung x 18 Objektivrevolver 5-fach Im Stativunterteil de Mikrokop befindet ich da Beleuchtungytem (Kondenor). Die Beleuchtung de Objekte wird mit zwei Blenden reguliert. Mit der Leuchtfeldblende (11) wird die Größe de augeleuchteten Bereich in der Objektebene reguliert, mit der Aperturblende (13) die Öffnung de Beleuchtungkegel (Köhlerche Beleuchtungprinzip). Die Helligkeit wird mit dem Lampentrom eingetellt.

5 MIK Seite 5/ Veruch 1: Durchlicht-Hellfeld nach KÖHLER eintellen Um bei voller Auleuchtung de Sehfelde die optimale Auflöung zu erhalten, müen Kondenor, Leuchtfeldblende und Aperturblende nach den Regeln de KÖHLERchen Beleuchtungprinzip eingetellt ein (iehe Anhang). Dabei wird der Lichtkegel der Beleuchtung dem Öffnungkegel de Objektiv angepat. Auf diee Weie wird die numeriche Apertur der Optik voll genutzt und "überflüige" Licht, da al törende Streulicht wirken kann, vermieden. Vorbereitung Zunächt wird der Objekttich (Kreuztich) mittel Grobtrieb oweit abgeenkt, bi zwichen Objekttich (Kreuztich) und Objektivrevolver genügend Platz it, um ein Präparat (Objektträgerplatte, Objektmikrometer uw.) einzubringen. Hellfeldpoition (H) an der Revolvercheibe eintellen. Ein kontratreiche Präparat (z.b. Objektträgerplatte mit Markierung) auf den Kreuztich legen und Bildhelligkeit mit dem Beleuchtungtärkeregler (1) am Mikrokoptativ eintellen. Abbe-Kondenor mit dem Kondenortrieb (3) an den oberen Anchlag fahren und Aperturblendenhebel (2) in Mittentellung bringen. Objektiv 10x mit dem Rändelring in den Strahlengang einchwenken. und Okulare durch Verdrehen der Augenline auf Nulltellung (Strichmarkierung) bringen. 1 Beleuchtungtärkeregler 2 Aperturblendenhebel 3 Kondenortrieb Abb. 4: Durchlicht-Hellfeld nach Köhler vorbereiten

6 MIK Seite 6/13 Bild- und Leuchtfeldblende eintellen Am binokularen Tubu (6) zunächt in da rechte (fete) Okular blicken und mit dem Fokuiertrieb (1) auf da Präparat fokuieren. Danach, wenn notwendig, die Bildchärfe für da andere Auge durch Verdrehen der Augenline de Okular nachtellen. Leuchtfeldblende (2) o weit chließen, da ie im Sehfeld (auch uncharf) ichtbar wird (A). Kondenor mit Kondenortrieb (eitlich link - verdeckt in Abb. 5) in der Höhe o weit vertellen, bi der Leuchtfeldblendenrand hinreichend charf ercheint (B). Leuchtfeldblende mit beiden Zentrierchrauben (4) de Kondenor zentrieren (C) und anchließend o weit öffnen, bi der Blendenrand aureichend weit au dem Sehfeld verchwindet (D). Aperturblende eintellen Ein Okular au dem Tubututzen heraunehmen und mit bloßem Auge in den Stutzen hineinchauen. Aperturblende mit Hebel (3) auf ca. 2/3... 4/5 de Durchmeer der Objektivautrittpupille eintellen (E). Diee Aperturblendeneintellung bietet in den meiten Anwendungfällen den beten Kontrat bei fat voller Auflöung und damit für da menchliche Auge den güntigten Kompromi. Okular wieder in den Tubututzen einetzen Hinwei: Mit jedem Objektivwechel verändern ich Sehfeldgröße und Objektivapertur, o da für optimale Ergebnie Leuchtfeld- und Aperturblendeneintellungen erneut vorzunehmen ind. 1 Fokuiertrieb 2 Leuchtfeldblende 3 Aperturblendeneintellung 4 Zentrierchrauben für Kondenor 5 Rändelring - Objektivrevolver 6 Binokulartubu Abb. 5: Durchlicht-Hellfeld nach Köhler eintellen

7 MIK Seite 7/13 Mikrokopie mit Videokamera Da Mikrokop am Praktikumplatz it mit einem binokularen Phototubu augerütet auf den mit Hilfe eine C-Mount-Adapter eine CCD-Kamera montiert werden kann. 1 Tubuline 2 Zwichenbild 3 Okular / Fotookular 5 Augenline / Kameraobjektiv 6 Netzhaut / Bildebene Abb. 6: Fototubu mit Strahlengang Zur Betrachtung de Mikrokopbilde über die Kamera mu die am Tubu angebrachte Schubtange heraugezogen werden. Die Kamera kann von einem PC au geteuert werden. Zum Betrachten der Bilder auf dem PC-Monitor oder zur Dokumentation mu da Programm IC Capture 2.2 getartet werden.

8 MIK Seite 8/ Veruch 2: Betimmung der Vergrößerungeigenchaften de Mikrokop a) Mikrokopvergrößerung M Man beobachtet einmal durch da Mikrokop ein Objektmikrometer (Strichgitter mit bekannter Teilung: 2 mm = 200 Skt.) und gleichzeitig mit dem anderen Auge am Mikrokop vorbei einen Maßtab (Lineal). Der Maßtab liegt im Abtand L vom Auge entfernt auf einer Platte, die eitlich am Mikrokop angebracht it. Mit etwa Geduld und Übung können beide Bilder übereinander- bzw. nebeneinanderliegend wahrgenommen werden. Eine Strecke y auf dem Objektmikrometer überdeckt dann ein Stück der Länge B de Maßtabe. Für die Mikrokopvergrößerung ' M gilt dann: B y tan ' B a tan ' und tan =, ' M (3) L a tan y L Betimmen Sie die Mikrokopvergrößerung M für die drei vorhandenen Objektive und jeweil dem elben Okular. (Meunicherheiten mit Gaußcher Fehlerfortpflanzung betimmen!) b) Lupenvergrößerung Obj de Objektive Zur Betimmung von ' Obj mit man die Zwichenbildgröße y z ' eine bekannten Objekte (Objektmikrometer) au. Dazu tellt man da Mikrokop zunächt auf da Strichgitter de Objektmikrometer charf. Die Größe de Zwichenbilde kann dann mit Hilfe de Meokular vermeen werden. Im Meokular it dazu ein feter Strichmaßtab in der Zwichenbildebene eingebaut, mit dem durch Vergleich ' Obj betimmt werden kann. Au Objektgröße y und Zwichenbildgröße y z ' (Okulartrichmaßtab) erhält man den Abbildungmaßtab ' Obj und darau ' Obj zu: ' Obj. y' z (-) y (+) f f ' ' Tub Obj ) a a ' Obj q Betimmen Sie für die 3 vorhandenen Objektive jeweil die Lupenvergrößerung ' Obj Der Tubufaktor it auf dem Tubu aufgedruckt.. (Meßunicherheiten mit Gaußcher Fehlerfortpflanzung betimmen!) c) Okularvergrößerung Ok Berechnen Sie die Okularvergrößerung au der Geamtvergrößerung M und der Lupenvergrößerung de Objektiv ' Obj unter Verwendung von Gleichung 2b. (Meunicherheiten mit Gaußcher Fehlerfortpflanzung betimmen!) d) Objektivbrennweite f' Obj. Berechnen Sie die Brennweiten der drei vorhandenen Objektive. (Meunicherheiten angeben!)

9 MIK Seite 9/ Veruch 3: Betimmung der Auflöunggrenze Nach der Abbéchen Theorie de Auflöungvermögen, mu für ein kohärent (z.b. mit einem Laer) beleuchtete Objekt mindeten die 1. Beugungordnung in da Objektiv eintreten, damit überhaupt ein Bild de Objekte entteht. Je mehr Beugungordnungen in da Objektiv eintreten, um o chärfer wird da Bild, da ert alle Beugungordnungen zuammen die geamte Bildinformation geben. Da abzubildende Objekt oll im folgenden ein einfache Strichgitter ein. Wenn der Beugungwinkel für die 1.Ordnung it, dann gilt nach der Theorie der Beugung am Gitter für die kleintmögliche Gitterkontante d min : d min (5a) in Die Auflöunggrenze de Objektive it erreicht, wenn die 1. Beugungordnung gerade noch in den Öffnungkegel de Objektive fällt und entpricht dann dem Wert d min. Da ein Objekt im Mikrokop auch chräg beleuchtet wird oder auch elbt leuchtet (inkohärent), verkleinert ich der Wert für d min noch bi zu einem Faktor 2. Der Beugungwinkel kann dann doppelt o groß ein, wie der fete halbe Öffnungwinkel. Befindet ich weiter ein Medium zwichen Objekt und Objektiv, ergibt ich chließlich: 0 dmin (5b) 2nin Objektiv Objekttich H Markierung K Tichbewegung Abb.7: Anordnung zur Betimmung der numerichen Apertur mit: 0 = Vakuumlichtwellenlänge n = Brechzahl de Medium zwichen Objekt und Objektiv ( = 0 /n) 2 = Öffnungwinkel der vom Objektiv aufgenommenen Lichtbündel n in = NA Numeriche Apertur de Objektive (nach Abbé) Da Objektiv blendet kontruktionbedingt die höheren Beugungordnungen au, wodurch die in ihnen enthaltene Bildinformation verloren geht. Die Unchärfe wird allein durch dieen beugungbedingten Informationverlut veruracht, elbt wenn alle anderen Abbildungfehler behoben ind. Da Objektiv wirkt wie ein Tiefpafilter. Veruchdurchführung und Auwertung Die Auflöunggrenze de Mikrokop wird mit der numerichen Apertur NA = n in de Objektive berechnet. Der Winkel wird nach dem in Abb. 7 dargetellten Verfahren gemeen.

10 MIK Seite 10/13 Zunächt wird ein Plexiglaklotz der Höhe H = 10 mm auf die dünne Streucheibe mit der Linienmarkierung gelegt und auf eine obere Seite charf getellt. Dann entfernt man den Plexiglaklotz und ein Okular (alle Übrige nicht verändern!). An die Stelle de Okular wird eine kleine Lochblende eingeetzt. Für eine beere Auleuchtung kann der Kondenor mit dem Kondenortrieb abgeenkt und die Helligkeit nachgeregelt werden. Ein Stück glatte, weiße Papier unter der Streucheibe verbeert auch die Beobachtung. Verchiebt man nun den Kreuztich, bewegt ich die Markierung über da Blickfeld de Lichtkegel. Mit Hilfe de eitlich angebrachten Maßtab kann der Durchmeer K de Lichtkegel betimmt werden. Au den Mewerten von H und K lät ich der Winkel betimmen: tan = (K/2)/H. Betimmen Sie die Numeriche Apertur der 3 Objektive und vergleichen Sie die Werte mit den Angaben auf dem Objektiv. Betimmen Sie die Auflöunggrenze der 3 Objektive nach Gleichung (5b). Al Lichtwellenlänge verwende man = 550 nm (maximale Augenempfindlichkeit). (Meunicherheiten angeben - der Einfachheit halber nur mit K rechnen) 2.4 Veruch 4: Brechzahlbetimmung durch Meung der optichen Dicke Trifft ein Lichttrahl (nach Abb. 8) bei B auf eine planparallele Glaplatte, o wird er zweimal gebrochen und läuft nach Verlaen der Glaplatte parallel veretzt weiter. Einem Beobachter ercheint damit der Punkt B nach C angehoben. = Dicke der Platte n = Brechzahl der Glaplatte Für die Anhebung h gilt: Abb.8: Zur Meung der optichen Dicke 1co h 1 n co ' (6a) Bei teilem Einfall gilt näherungweie: n 1 h (6b) n Darau ergibt ich für die cheinbare Dicke: - h = /n bzw. A ' C B h n A C B n (7) h Ein Stück Gla ercheint alo unter dem Mikrokop dünner al in Wirklichkeit. Da Verhältni zwichen der wahren Dicke und dieer cheinbaren Dicke ( - h) it näherungweie gleich der Brechzahl n (Gl.7). Die wahre Dicke wird mit der Schieblehre betimmt.

11 MIK Seite 11/13 Veruchdurchführung und Auwertung Die cheinbare Dicke kann auf zwei verchiedene Arten gemeen werden: Methode a) Man tellt nacheinander da Mikrokop ert auf die obere und dann auf die untere Fläche der Probe charf. Die Anhebung de Tiche, die mit einer Meuhr ermittelt wird, ergibt unmittelbar ( - h). Methode b) Zunächt tellt man auf irgendeine Marke einer Hilfträgerplatte charf ein. (z.b. Strich mit Folientift) Dann legt man die Probe auf den Hilfträger und tellt erneut auf die Marke charf. Au der Abenkung de Tiche ergibt hier unmittelbar die Größe h. Betimmen Sie nach Methode a) die Brechzahl einer ca. 2-4 mm dicken Probenplatte au Gla (z.b. 4 mm dicke braune Filtergla) mit den beiden Objektiven 5x und 10x. (Da Objektiv 20x bzw. 40x nicht verwenden - Bechädigunggefahr!) Betimmen Sie nach Methode b) die Brechzahl der ca. 2-4 mm dicken Probenplatte au Gla und einer ca. 6 mm dicken Probenplatte au Plexigla mit den beiden Objektiven 5x und 10x. Vergleichen Sie die Ergebnie! Betimmen Sie die Meunicherheiten! -h Abb. 9a: Methode a) h Abb. 9b: Methode b)

12 MIK Seite 12/13 3 Tetfragen 1) Wie it ein Mikrokop aufgebaut? Skizzieren Sie den Strahlengang. Wie kommt die Vergrößerung zutande? 2) Wa bedeutet Unendlichoptik 3) Wie verläuft der Strahlengang bei einer Lupe und wie kommt die Vergrößerung zutande? 4) Wo mu man im Mikrokop eine Strichplatte anbringen, damit Größenmeungen am Objekt möglich ind? 5) Warum lät ich die Vergrößerung im Mikrokop nicht unbegrenzt teigern? 6) Welchen Einflu hat die Apertur de Mikrokopobjektiv auf die Auflöunggrenze? 7) Welchen Einflu hat die Apertur de Kondenor auf die Auflöunggrenze? 8) Welche Bedeutung haben die Angaben auf dem Mikrokopobjektiv?

13 MIK Seite 13/13 Anhang: Köhlerche Beleuchtunganordnung beim Mikrokop Bei der Auleuchtung de Objekte mit einem einfachen Kondenor wird die Glühwendel der Lampe auf da Objekt abgebildet. Dadurch ergibt ich eine törende, ungleichmäßige Auleuchtung de Objekte. Forderungen bei der Köhlerchen Beleuchtung 1) homogene und kontrollierbare Auleuchtung de Objekte (Leuchtfeldblende). 2) hinreichend große und kontrollierbare Apertur der Auleuchtung (Aperturblende). Da die Auflöung de Mikrokop weentlich durch die Objektivöffnung (NA) betimmt it, mu gewährleitet werden, da die NA de Objektiv (Öffnung) durch eine hinreichend große Apertur der Beleuchtung auch augeleuchtet wird. Die erte Forderung wird erreicht, indem der og. Kollektor ein vergrößerte Zwichenbild der Lampe in der vorderen Brennebene de eigentlichen Kondenor erzeugt (= grüner Strahlengang). Der Kondenor produziert dann von jedem Punkt der Glühwendel ein parallele Strahlenbündel in der Objektebene. Eine Blende am Kollektor (Leuchtfeldblende) betimmt die Größe dieer Parallelbündel, d.h. die Größe de augeleuchteten Objektfelde. Somit erhält man eine ideale homogene Auleuchtung. Die zweite Forderung wird mit der Kondenorblende (Aperturblende) am Ort de Zwichenbilde in der vorderen Brennebene de Kondenor erreicht. Diee Blende betimmt die (numeriche) Apertur der Beleuchtung und damit auch da Auflöungvermögen de Mikrokop. Die Helligkeit wird nicht über die Aperturblende, ondern über die Lampenhelligkeit oder Filter eingetellt. Durch Kondenor und Objektiv ercheint da 2. Bild der Lichtquelle in der hinteren Brennebene de Objektiv. Beleuchtung Mikrokop Leuchtfeldblende Aperturblende Objekt Lampe Kollektor (Feldline) Kondenor Objektiv Okularfeldline Okular