Einflußfaktoren auf die serologische Einzeltierdiagnostik der Paratuberkulose mittels ELISA

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1 Einflußfaktoren auf die serologische Einzeltierdiagnostik der Paratuberkulose mittels ELISA Heike Köhler Bundesforschungsanstalt für Viruskrankheiten der Tiere, Standort Jena NRL Paratuberkulose

2 Diagnostik der Paratuberkulose am lebenden Tier Antikörpernachweis mittels ELISA schnell automatisierbar eingeschränkte Spezifität und Sensitivität Grenzen des Antikörpernachweises: Antikörper erst im Alter von 2-3 Jahren nachweisbar nicht alle infizierten Tiere bilden Antikörper aus hohe Antigenverwandtschaft zwischen Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis und anderen Mykobakterien

3 Ursachen der Antigenverwandtschaft genetisch DNA-Homologie zu M. avium ssp. avium > 99% hohe DNA-Homologie zu anderen Mykobakterien phänotypisch komplexe Zellwand viele speziesübergreifende Proteinantigene Kreuzreaktionen mit anderen Mykobakterien

4 In Deutschland zugelassene Paratuberkulose-ELISAs ELISA Antigen Erhöhung der Spezifität IDEXX/ Ganzzellantigen von Map Vorabsorption mit M. phlei Scandinavia Pourquier/ protoplasmatischer Extrakt von Map Vorabsorption mit M. phlei Frankreich SVANOVIR/ Zellwandantigen (LAM) von Map - Schweden Synbiotics/ protoplasmatisches Ag von M. avium ssp. - USA

5 Zielstellung Validierung von in Deutschland zugelassenen ELISA s für die Einzeltierdiagnostik der Paratuberkulose im Serum von Milchrindern Versuch der Bewertung der diagnostischen Aussagekraft der einzelnen Tests unter den Gesichtspunkten der Erkennung infizierter Herden und der Bekämpfung Ermittlung von Einflussfaktoren auf den Antikörpernachweis bei Paratuberkulose-positiven Tieren

6 Tiere Negative Population 187 Milchkühe aus einem slowakischen Milchviehbestand seit 1990 regelmäßige serologische und kulturelle Diagnostik seit 2000 bei zweimaliger jährlicher Untersuchung kulturell und serologisch (AGID, KBR) negativ zum Zeitpunkt der Blutentnahme alle Tiere kulturell negativ 99 Milchkühe aus 3 schwedischen Milchviehbeständen frei von Paratuberkulose, durch Schlachttiermonitoring bestätigt

7 Tiere Positive Population 110 Milchkühe aus zwei deutschen Milchviehbeständen 83 Tiere mit positivem pathologisch-anatomischen Befund sowie den Ergebnissen der kulturellen Anzüchtung von Kot-, Lymphknoten- und Organproben 27 Tiere ohne Sektion mit positivem Kotbefund davon 74 Tiere mit Kotbefund > 3 Monate vor Blutentnahme sowie Kotbefund vom Tag der Blutentnahme

8 Weitere Charakterisierung der positiven Tiere Alter in Jahren Zeitspanne seit der letzten Abkalbung Vorbericht zu klinischen Symptomen klinisch gesund (ohne) klinische Symptome, die nicht auf Paratuberkulose hinweisen (unspezifisch) klinische Symptome, die für Paratuberkulose sprechen (typisch) Ausmaß der pathologisch-anatomischen Veränderungen gering mittel schwer

9 ELISA-Tests Test A (Pourquier) - Protoplasmatisches Ag + Vorabsorption mit M. phlei Test B (IDEXX) - Ganzzell-Antigen + Vorabsorption mit M. phlei Test C (Svanovir) - Zellwandantigen (LAM) ohne Vorabsorption

10 Berechnungen Spezifität und Sensitivität Vorhersagewerte Berechnungen zur Prävalenzschätzung Abhängigkeit des Antikörpernachweises vom Alter der Tiere Zeitraum seit dem letzten Abkalben klinischen Bild Ausmaß der pathologisch-anatomischen Veränderungen Ausscheidungsstatus

11 Sensitivität (Se) und Spezifität (Sp) der Tests Sensitivität (%) Spezifität (%) Test A 53,6 99,3 Test B 55,5 94,8 Test C 70,0 76,6 Kot-BU 44,6 (100)

12 Spezifität bei unterschiedlichen Teilpopulationen (in %) gesamt Schweden Slowakische χ 2 -Test Republik Test A 99,3 99,0 99,5 n.s. Test B 94,8 94,9 94,7 n.s. Test C 76,6 67,7 81,3 0,97 %

13 Einzeltierdiagnostik - Vorhersagewerte der Tests Positiver Prädiktiver Wert* Wahrscheinlichkeit, dass ein Tier bei positivem Testergebnis tatsächlich erkrankt ist PPV = P * Se (P * Se) + ((1 - P) (1 - Sp)) Negativer Prädiktiver Wert* Wahrscheinlichkeit, dass ein Tier bei negativem Testergebnis tatsächlich gesund ist NPV = (1 - P) * Sp ((1 - P) * Sp) + (P * (1 - Se)) * nach Gardner, I. A. und Greiner, M., 2000

14 Einzeltierdiagnostik - Vorhersagewerte der Tests Positiver Prädiktiver Wert Negativer Prädiktiver Wert Prävalenz Test A Test B Test C Test A Test B Test C 1 % 43,61 9,73 2,93 99,53 99,53 99,61 5 % 80,12 35,97 13,60 97,60 97,59 97,98 10 % 89,48 54,25 24,95 95,06 95,04 95,83 20 % 95,04 72,74 42,79 89,54 89,50 91,08 30 % 97,04 82,06 56,18 83,32 83,25 85,63

15 Herdendiagnostik - Schätzung der wahren Prävalenz AP + Sp - 1 P RG * = Se + Sp P-RG P RG als Funktion der Sensitivität und Spezifität in Relation zur scheinbaren Prävalenz (Seroprävalenz) * nach Rogan und Gladen, Seroprävalenz % (AP) Pourquier IDEXX SVANOVIR

16 Herdendiagnostik - Schätzung der wahren Prävalenz AP + Sp - 1 P RG * = Se + Sp P-RG P RG als Funktion der Sensitivität und Spezifität in Relation zur scheinbaren Prävalenz (Seroprävalenz) * nach Rogan und Gladen, Seroprävalenz % (AP) Pourquier IDEXX SVANOVIR

17 Herdendiagnostik - Schätzung der wahren Prävalenz AP + Sp - 1 P RG * = Se + Sp P-RG P RG als Funktion der Sensitivität und Spezifität in Relation zur scheinbaren Prävalenz (Seroprävalenz) * nach Rogan und Gladen, Seroprävalenz % (AP) Pourquier IDEXX SVANOVIR

18 Herdendiagnostik - Schätzung der wahren Prävalenz AP + Sp - 1 P RG * = Se + Sp P-RG P RG als Funktion der Sensitivität und Spezifität in Relation zur scheinbaren Prävalenz (Seroprävalenz) * nach Rogan und Gladen, Seroprävalenz % (AP) Pourquier IDEXX SVANOVIR

19 Einflußfaktoren Positive Befunde in Abhängigkeit vom Alter % positiv , Altersklassen Test A Test B Test C Kotkultur

20 Einflußfaktoren Positive Befunde in Abhängigkeit vom Zeitpunkt der Abkalbung % positiv Test A Test B Test C Kot-BU 0-1 Mo p.p Mo p.p.

21 Einflußfaktoren Positive Befunde in Abhängigkeit vom Ausmaß der pathologisch-anatomischen Veränderungen % positiv Test A Test B Test C Kot-BU * gering mittel bis schwer

22 Einflußfaktoren Positive Befunde in Abhängigkeit von der Klinik % positiv * * * * Test A Test B Test C Kot-BU ohne unspezifisch typisch

23 Übereinstimmung der Kotbefunde (χ 2 -Test) Kot-BU zum Zeitpunkt der Blutentnahme Σ Kot-BU Vorbericht positiv negativ positiv negativ Σ χ 2 = 0,57 α = 45,03 % n.s.

24 Beziehung zwischen ELISA-Ergebnis und Kot-Befund (χ 2 -Test) Kot-BU Vorbericht Kot-BU Blutentnahmezeitpunkt Gesamt (n) α α Test A pos n.s < 0,1 % Test B pos n.s < 0,1 % Test C pos n.s < 0,1 %

25 Zusammenfassung und Schlussfolgerungen Die geprüften ELISA s zum Nachweis von Antikörpern gegen Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis im Serum weisen nur eine begrenzte Sensitivität und z. T. unzureichende Spezifität auf. Der Antikörper-Nachweis wird von einer Reihe von Faktoren beeinflußt: (Alter, Zeitpunkt nach der Abkalbung) Stadium der Erkrankung (Auftreten klinischer Symptome) Ausscheidungsstatus der Tiere zum Zeitpunkt der Probenahme Die aktuelle Zusammensetzung der positiven Teil-Herde beeinflusst die Sensitivität des Antikörpernachweises.

26 Zusammenfassung und Schlussfolgerungen Screening und Monitoring, Zertifizierung freier Herden: Einsatz von Tests mit hoher Spezifität Senkung des Anteils falsch positiver Ergebnisse Einzeltierdiagnostik (Sanierungsprogramme, Tierhandel): Mit Hilfe des Antikörpernachweises nicht sicher möglich Wahl des Tests abhängig vom Ziel der Untersuchung Abwägung der Kosten-Nutzen-Relation nötig Kenntnis der epidemiologischen Situation wichtig Direkter Erregernachweis (Kotkultur) ist unverzichtbar.

27 Vielen Dank! Beate Burkert Uta Möller Renate Putsche Irmgard Moser Erika Bacher Pavol Miškovic Ivo Pavlik Carsten Schroeder Dieter Uthe Sonja Kleinhans Jürgen Plötner Helmut Ludwig

28 400% 380% 360% 340% 320% n = 396 Test A Sensitivität = 53,6% Spezifität = 99,3% S/P Prozentsatz 300% 280% 260% 240% 220% 200% 180% 160% + 140% 120% 100% 80% 60% 40% 20% +/- - 0% getestete Seren (Rind) positiv (Deutschland) negativ (Schweden) negativ (Slowakische Republik)

29 S/P Verhältnis 2,85 2,7 2,55 2,4 2,25 2,1 1,95 1,8 1,65 1,5 1,35 1,2 1,05 0,9 0,75 0,6 0,45 0,3 0,15 0-0,15-0,3 n = 396 Test B positiv (Deutschland) negativ (Schweden) getestete Seren (Rind) Sensitivität= 55,5% Spezifität= 94,8% negativ (Slowakische Republik) + +/- -

30 140% n = 396 Test C Sensitivität = 70,0% Spezifität = 76,6% 130% 120% 110% 100% 90% + Probenwert (%) 80% 70% 60% 50% 40% +/- 30% 20% 10% - 0% getestete Seren (Rind) positiv (Deutschland) negativ (Schweden) negativ (Slowakische Republik)

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