PM, Positivkontrolle IgM, Humanserum mit Stabilisatoren. RM, Referenzkontrolle IgM, Humanserum mit Stabilisatoren

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1 Hantavirus Puumala IgG/IgM Art.Nr.: PR59156 Inhalt der Testpackung: 96 Bestimmungen Lagerung: 2-8 C IVD Instruction sheet / Gebrauchsanweisung / Carnet d instruction / instrucciones de uso / gebruiksaanwijzing / istruzioni per l'uso / σελίδα οδηγιών / bruksanvisning / modo de emprego: 1. Hantaviren Verbreitung und Erkrankung Hantaviren sind einzelsträngige RNA-Viren aus der Familie der Bunyaviren mit weltweiter Verbreitung und einem Serotyp-spezifischen Wirtsreservoir. Sie sind die Erreger des hämorrhagischen Fiebers mit renalem Syndrom (HFRS) in Europa und Asien und des hantaviralen kardiopulmonalen Syndroms (HCPS) in Amerika. In Abhängigkeit vom Erregertyp kann die Krankheit einen schweren oder leichten Verlauf nehmen, die Letalität schwankt beim HFRS zwischen 0,1 % und 10% und beim HCPS zwischen 25 und 35% (13). Virusträger sind Nager, die Übertragung auf den Menschen erfolgt meist durch Einatmen virushaltiger Aerosole aus den Ausscheidungen der Wirtstiere. Das HFRS wird durch Hantaan-Virus, das damit eng verwandte Dobrava-Virus, den Seoul und den Puumala Virustyp ausgelöst, wobei in Asien der Hantaan Typ und in Europa der Dobrava Serotyp gefunden werden; für beide sind Apodemus-Spezies (Waldmaus) Reservoirtiere. Der in Deutschland überwiegend (etwa 90%) auftretende Virustyp ist Puumala, sein Reservoirwirt ist die Rötelmaus (Myodes glareolus). Gering in Mitteleuropa und vermehrt bis überwiegend in Ost- und Südeuropa und der Balkanregion treten Infektionen durch das Dobrava-Virus auf, das durch die Brandmaus, Gelbhalsmaus und Schwarzmeerwaldmaus verbreitet wird. Regelmäßige Aktualisierungen über Gefährdung und Verbreitung sowie aktuelle Daten finden sich unter und sowie in den Epidemiologischen Bulletins des Robert-Koch- Instituts. 2. Anwendung des Tests Der Hantavirus Puumala (PUU) IgG/IgM ist geeignet zum Nachweis von spezifischen Antikörpern gegen Puumala-Virus bei Verdacht auf hämorrhagisches Fieber mit renalem Syndrom (HFRS). 3. Testprinzip Die Mikrotiterplatte ist mit rekombinantem Nukleokapsidprotein des Puumala-Virus beschichtet. Zur Bestimmung von IgM-Antikörpern müssen die Patientenseren vor Testbeginn mit Rheumafaktor IgG-Absorber inkubiert werden, um unspezifische Reaktionen durch IgG-Antikörper oder Rheumafaktoren zu vermeiden. Während der Probeninkubation bilden die nachzuweisenden Antikörper Immunkomplexe mit den rekombinanten Beschichtungsantigenen. Nach dem Waschen werden die spezifischen IgG- und IgM-Antikörper mit Peroxidasemarkierten Sekundärantikörpern nachgewiesen. Durch Zugabe einer Substratlösung entsteht proportional zu der spezifisch gebundenen Antikörpermenge ein Farbstoff, der photometrisch gemessen wird. 4. Benötigte, nicht mitgelieferte Materialien und Geräte Destilliertes Wasser Messzylinder Reaktionsgefäße für Serumverdünnungen Präzisionspipetten (5 µl, 20 µl, 50 µl, 200 µl, 1000 µl) Mehrkanal- bzw. Dispensierpipetten (100 µl, 200 µl) -Reader mit 450 nm Filter Einmalhandschuhe Stoppuhr 5. Inhalt des Testkits 5.1. Inhalt des Testkits (PR59156) MTP, Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen, beschichtet mit rekombinantem Puumala-Antigen, mit Trockenmittel im Aluminiumbeutel verpackt. Bei Bedarf können einzelne Näpfe von den Streifen abgebrochen werden. PG, Positivkontrolle IgG, Humanserum mit Stabilisatoren PUU-spezifische IgG-Antikörper (grüner Deckel). RG, Referenzkontrolle IgG, Humanserum mit Stabilisatoren PUU-spezifische IgG-Antikörper (roter Deckel). PM, Positivkontrolle IgM, Humanserum mit Stabilisatoren PUU-spezifische IgM-Antikörper (gelber Deckel). RM, Referenzkontrolle IgM, Humanserum mit Stabilisatoren PUU-spezifische IgM-Antikörper (blauer Deckel). NEG, Negativkontrolle, Humanserum mit Stabilisatoren und Konservierungsmittel, 1 Microtube, 1,9 ml. Enthält keine spezifischen IgG- und IgM-Antikörper (farbloser Deckel). SB 20x, Probenpuffer (20x), PBS ph 7,4, enthält Konservierungsmittel, rot gefärbt, 1 Flasche, 20 ml. Vor Gebrauch WASH 20x, Waschpuffer (20x), PBS ph 7,5, enthält Konservierungsmittel, 1 Flasche, 50 ml. Vor Gebrauch CG 20x, Anti-IgG-Peroxidase-Konjugat (20x), 1 Microtube, 750 µl (20x) (schwarzer Deckel). Vor Gebrauch CM 20x, Anti-IgM-Peroxidase-Konjugat (20x), 1 Microtube, 750 µl (20x) (weißer Deckel). Vor Gebrauch PR59156 Hanta (PUU) IgG+IgM de_v12.docx2 1

2 S, Substrat, Tetramethylbenzidin (TMB), 1 Flasche, 12 ml. STOP, Stopplösung, 0,5 M Schwefelsäure, 1 Flasche, 12 ml. ABS, Rheumafaktor IgG-Absorber, Anti-human-IgG mit Stabilisatoren und Konservierungsmittel, 1 Microtube, 1,5 ml. Abklebefolien für -Teststreifen; 2 Stück. 6. Testvorbereitung 6.1. Untersuchungsmaterial und Probenlagerung Mit dem PUU IgG/IgM werden u.a. Humanseren untersucht. Diese können bis zu 6 Wochen bei 2-8 C gelagert werden. Bei -20 C können sie mehrere Monate aufbewahrt werden. Die Proben dürfen nicht mehrfach aufgetaut und eingefroren werden Vorbereitung der Komponenten Testkit auf Raumtemperatur (20-26 C) bringen. Pufferkonzentrate können konzentrationsbedingt Salzkristalle enthalten, die sich bei 37 C rasch lösen. Vor Gebrauch muss der Puffer wieder auf Raumtemperatur (20-26 C) abgekühlt sein. Benötige Reagenzmengen unmittelbar vor Gebrauch Gebrauchsfertiger Probenpuffer, 1+19 Beispiel für 8 Testvertiefungen: 1 ml SB 20x in 19 ml destilliertem Wasser verdünnen. Gebrauchsfertiger Waschpuffer, 1+19 Beispiel für 8 Testvertiefungen: 1 ml Wash 20x in 19 ml destilliertem Wasser verdünnen. Gebrauchsfertige Konjugate, 1+19 Beispiel für 8 Testvertiefungen: 50 µl CG 20x oder CM 20x in 950 µl gebrauchsfertigem Waschpuffer verdünnen. Verdünnen der Patientenproben, IgG: 5 µl Serum mit 1000 µl gebrauchsfertigem Probenpuffer mischen. IgM: Verdünnung wie bei IgG. Dann zu 250 µl verdünntem Serum 15 µl ABS pipettieren, 30 Min. bei Raumtemperatur (20-26 C) inkubieren lassen. 7. Stabilität Alle in der Packung enthaltenen Komponenten sind ungeöffnet bis zum aufgedruckten Verfallsdatum bei 2-8 C haltbar. Stabilität nach Anbruch: Alle Komponenten sind nach Anbruch 3 Monate bei 2-8 C haltbar (unverdünnte Komponenten, MTP im Aluminiumbeutel mit Trockenmittel). Stabilität nach Verdünnung: Gebrauchsfertige Waschpuffer und Probenpuffer sind 1 Woche bei 2-8 C haltbar. Gebrauchsfertige Konjugatlösung muss innerhalb von 60 Min. verwendet werden. Waschen: Mikrotiterstreifen entleeren und 200 µl gebrauchsfertigen Waschpuffer pro Testvertiefung einfüllen, 3x wiederholen und dann auf saugfähiger Unterlage ausklopfen. Konjugatinkubation: 100 µl gebrauchsfertiges Konjugat (IgG oder IgM) pro Testvertiefung pipettieren. Teststreifen mit Folie abdecken. Bei 37 C 45 Min. inkubieren. Waschen: Mikrotiterstreifen entleeren und wie oben beschrieben waschen (4 x 200 µl pro Testvertiefung). Substratreaktion: Pro Vertiefung 100 µl gebrauchsfertiges Substrat pipettieren. 10 Min. bei Raumtemperatur (20-26 C) inkubieren. Stoppen: Durch Zugabe von je 100 µl STOP die Farbreaktion abstoppen. Intensität der Farbreaktion innerhalb von 20 Min. bei 450 nm messen (Referenzwellenlänge 650 nm). 9. Hinweise Gebrauch nur durch Fachpersonal! Wichtig für Präzision und Richtigkeit: Hämolytische, lipämische, ikterische oder mikrobiell kontaminierte Proben können zu falschen Ergebnissen führen. Inkubationstemperatur 37 C, bzw C einhalten. Inkubationszeit ±10% einhalten. Sie beginnt nach dem Einpipettieren der letzten Probe. Einhaltung der Pipettierreihenfolge: Einpipettieren der Proben: maximal 60 Sec. pro -Teststreifen. Einpipettieren von Konjugat-, Substrat- sowie Stopp-lösung: maximal 10 Sec. pro -Teststreifen. Sicherheitshinweise Stopplösung (Schwefelsäure) und Bestandteile des Substrats können zu Reizungen der Haut führen. Sollten diese Lösungen in die Augen gelangen, sofort mit viel Wasser auswaschen und Arzt aufsuchen. Kontrollseren sind HBsAg-negativ, HIV- und HCV- Antikörper-negativ. Trotzdem sollten diese Komponenten wie die Proben als potenziell infektiös behandelt werden. Die Reagenzien enthalten teilweise Konservierungsmittel. Nicht schlucken, Haut- und Schleimhautkontakt vermeiden! Sicherheitsdatenblatt wird auf Anfrage versendet. Entsorgungshinweise Bei der Beseitigung der Testpackung sind die nationalen gesetzlichen Bestimmungen in der jeweils aktuellen Fassung zu beachten. Chemikalien und Zubereitungen, die als Reststoffe anfallen, sind in der Regel Sonderabfälle. Besondere Hinweise zur Entsorgung sind zusätzlich im Sicherheitsdatenblatt aufgelistet. Maßnahmen bei Beschädigung Im Falle einer erheblichen Beschädigung der Testpackung ist der Hersteller zu benachrichtigen. Falls einzelne Komponenten erheblich beschädigt sind, dürfen diese nicht zur Testdurchführung verwendet werden. Sie sollten so lange aufbewahrt werden, bis der Transportschaden geregelt ist. Danach sollten sie ordnungsgemäß entsorgt werden. 8. Testablauf Probeninkubation: 100 µl Negativ-, Positiv-, Referenzkontrollen sowie verdünntes (evtl. mit ABS vorbehandeltes) Patientenserum in die entsprechenden Vertiefungen der Mikrotiterplatte pipettieren. Teststreifen mit Folie abdecken. Bei 37 C 45 Min. inkubieren PR59156 Hanta (PUU) IgG+IgM de_v12.docx2 2

3 10. Qualitätskontrolle Als Qualitätskontrollparameter für eine gültige Durchführung des Tests müssen folgende Kriterien erfüllt sein: PG RG NE G RG PM RM NE G RM OD Positivkontrolle IgG oder OD Positivkontrolle IgM OD Positivkontrolle IgG OD Referenzkontrolle IgG OD Negativkontrolle IgG OD Referenzkontrolle IgG OD Positivkontrolle IgM OD Referenzkontrolle IgM OD Negativkontrolle IgM OD Referenzkontrolle IgM > 0,8 > 1,8 < 0,5 > 2 < 0,5 Der Testlauf ist ungültig und muss wiederholt werden, wenn obige Bedingungen nicht erfüllt sind. 11. Auswertung/Interpretation der Ergebnisse Zur Ermittlung der Ergebnisse wird der Quotient aus der optischen Dichte (OD) der Patientenprobe und der Referenzkontrolle bestimmt: OD Patientenprobe OD Referenzkontrolle und wie folgt ausgewertet: Q 12. Evaluierung des Tests a) IgG Die Evaluierung des Hantavirus (Puumala) IgG parallel mit dem Hantavirus (Dobrava/Hantaan) IgG sowie Hantavirus Dobrava/Hantaan Antibody IF Test, Hantavirus Puumala Antibody IF Test, Hantavirus Seoul Antibody IF Test, ergab nachfolgende diagnostische Effizienz a : Seoul IFT n 38 PUU-IFT n 29 HTN-IFT n 56 IFT 95% 88% 99% Dobrava/ Hantaan IgG 75% 98% 84% Puumala IgG Sensitivität und Spezifität wurden mit 194 Seren von gesunden Blutspendern und 123 in der Immunfluo-reszenz IgG-positiven Seren überprüft, davon 29 Puumala-Virus- IgG-positiv. Die Sensitivität betrug 99%, die Spezifität für Puumala-Virus 97%. b) IgM Die Evaluierung des Hantavirus (Puumala) IgM parallel mit dem Hantavirus (Dobrava/Hantaan) IgM sowie Hantavirus Dobrava/Hantaan Antibody IF Test, Hantavirus Puumala Antibody IF Test, Hantavirus Seoul Antibody IF Test, ergab nachfolgende diagnostische Effizienz: a) Für IgG-Antikörper Q < 1 1 < Q < 1,5 Q > 1,5 Negativ: keine IgG-Antikörper spezifisch gegen PUU nachgewiesen Keine eindeutige Interpretation möglich. Es sollte eine Verlaufskontrolle nach 10 Tagen durchgeführt werden. Bei bestehendem Verdacht auf Hantavirus-Infektion wird empfohlen, die Probe auf PUU IgM-Antikörper und/oder auf Antikörper der Dobrava/ Hantaan-Serotypen zu testen. Positiv: spezifische IgG-Antikörper gegen Seoul IFT n 47 PUU-IFT n 25 HTN-IFT n 50 95% 74% 100% 68% 99% 62% IFT Dobrava/ Hantaan IgM Puumala IgM Sensitivität und Spezifität wurden mit 194 Seren von gesunden Blutspendern und 122 in der Immunfluo-reszenz IgM-positiven Seren überprüft, davon 25 Puumala-Virus- IgM-positiv. Die Sensitivität und Spezifität lagen bei 99%. b) Für IgM-Antikörper Q < 1 1 < Q < 2 Negativ: keine IgM-Antikörper spezifisch gegen Keine eindeutige Interpretation möglich. Es sollte eine Verlaufskontrolle nach 10 Tagen durchgeführt werden. Bei bestehendem Verdacht auf Hantavirus-Infektion wird empfohlen, die Probe im DOB/HTN-IgM zu testen. 13. Weiterführende Literatur 1. Settergren P, Juto P, Trollfors B, Wadell G and Norrby SR. Clinical characteristics of Nephropathia epidemica in Sweden: Prospective study of 74 cases. Rev Infect Dis 11(6): (1989) 2. Niklasson B, et al. Hemorrhagic fever with renal syndrome: Evaluation of for detection of Puumala-virus-specific IgG and IgM. Res Virol 141: (1990) Q > 2 Positiv: spezifische IgM-Antikörper gegen a Diagnostische Effizienz Spezifität/2 + Sensitivität/ PR59156 Hanta (PUU) IgG+IgM de_v12.docx2 3

4 3. Grcveska K, Polenakovic M, Oncevski A, Zgrafski D and Gligic A. Different pathohistological presentations of acute renal involvement in Puumala virus infection: report of two cases. Clin Nephrol 34(5): (1990) 4. Gött P, Zöller L, Yang S, Stohwasser R, Bautz EKF, Darai G. Antigenicity of Hantavirus nucleocapsid proteins expressed in E. coli. Virus Res 19: 1-16 (1991) 5. Zöller L, Yang S, Gött P, Bautz EKF, Darai G. Use of recombinant nucleocapsid proteins of the Puumala and Nephropathia epidemica serotypes of Hantaviruses as immunodiagnostic antigens. J Med Virol 39: (1993) 6. Zöller L, Yang S, Gött P, Bautz EKF, Darai G. A novel µ-capture based on recombinant proteins allows sensitive and specific diagnosis of hemorrhagic fever with renal syndrome. J clin Microbiol 31: (1992) 7. Gött P, Zöller L, Darai G, Bautz EKF. A major antigenic domain of hantaviruses is located on the aminoproximal site of the viral nucleocapsid protein. Virus Genes, 14 (1):31-40 (1997) 8. Clement J, Heyman P, McKenna P, Colson P, and Avsic-Zupanc T. The Hantaviruses in Europe: from the Bedside to the Bench. Emerg Infect Diseases Vol. 3 No. 2 (1997) 9. Elgh F, Lundkvist A, Alexeyev OA, Stenlund H, Avsic- Zupanc T, Hjelle B, Lee HW, Smith KJ, Vainionpää R, Wiger D, Wadell G and P Juto. Serological Diagnosis of Hantavirus Infections by an Enzyme-linked Immunosorbent Assay Based on Detection of Immunoglobulin G and M Responses to Recombinant Nucleocapsid Proteins of Five Viral Serotypes. J Clin Microbiol 35(5): (1997) 10. Brus-Sjölander K, Lundkvist A. Dobrava virus infection: serologic diagnosis and cross-reactions to other hantaviruses. J Virol Methods 80: (1999) 11. Araki K, Yoshimatsu KM, Ogino M, Ebihara H, Lundkvist A, Kariwa H, Takashima I and J Arikawa. Truncated Hantavirus Nucleocapsid Proteins for Serotyping Hantaan, Seoul and Dobrava Hantavirus Infections. J Clin Microbiol (2001) 12. Togni G u. a.: Präanalytik. Schweiz. Med. Forum (2002) 13. Aitichou M, Saleh S, McElroy A, Schmaljohn C, Ibrahim MS. Identification of Dobrava, Hantaan, Seoul and Puumala viruses by one-step real-time RT-PCR. J Virol Methods 124:21-26 (2005) 14. Mertens M. Entwicklung serologischer Testverfahren zum Nachweis Hantavirus spezifischer Antikörper und deren Anwendung bei epidemiologischen Untersuchungen. Dissertation Universität Greifswald (2010) 15. Papa A. Genetic Detection of Dobrava/Belgrade Virus, Bulgaria. Letters, Emerg Infect Diseases, Vol. 17, No. 2 (2011) 16. Krüger, DH, Schönrich, G und Klempa, B Human Vaccines 7:6, ; June 2011 PROGEN Biotechnik GmbH Maaßstraße Heidelberg Deutschland Telefon +49 (0) 6221 / Telefax +49 (0) 6221 / Gültig ab: PR59156 Hanta (PUU) IgG+IgM de_v12.docx2 4

5 Schema Hantavirus PUU IgG und IgM Serumverdünnung, µl + 5 µl Nur bei IgM : 250 µl verdünntes Serum + 15 µl ABS 30 Min. bei Raumtemperatur (20-26 C) inkubieren NEG, PG, RG, PM, RM unverdünnt; 100 µl Patientenserum verdünnt 45 Min. bei 37 C inkubieren 4 x mit 200 µl Waschpuffer waschen CON 100 µl 45 Min. bei 37 C inkubieren 4 x mit 200 µl Waschpuffer waschen S 100 µl 10 Min. bei Raumtemperatur (20-26 C) inkubieren STOP 100 µl Optische Dichte bei 450 nm messen (Referenzwellenlänge 650 nm) PR59156 Hanta (PUU) IgG+IgM de_v12.docx2 5

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