Dissertation. zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) im Fach Biologie

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1 Salmonella-Wirt-Wechselwirkungen im Darmlumen: Salmonella Typhimurium unterdrückt konkurrierende Kommensale durch Induktion des antimikrobiellen Wirtslektins Reg3β Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) im Fach Biologie eingereicht an der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I der Humboldt-Universität zu Berlin von Diplombiologe Christian Stelter (geboren am 27. Juni 1977 in Niebüll) Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin Prof. Dr. Dr. h.c. Christoph Markschies Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I Prof. Dr. Lutz-Helmut Schön Gutachter/innen: 1. Prof. Dr. Thomas F. Meyer 2. Prof. Dr. Richard Lucius 3. Prof. Dr. Lothar H. Wieler Tag der mündlichen Prüfung: 06. November 2008

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3 Aus dieser Arbeit ging folgende Veröffentlichung hervor: C. Stelter, C. König, A. Krah, B. Stecher, W.-D. Hardt, D. Bumann, Salmonella kills competing commensals by inducing host lectin RegIIIβ. In Vorbereitung

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5 Zusammenfassung 1.1 Zusammenfassung Hintergrund: Der Darm wird von einer großen Anzahl kommensaler Mikroorganismen kolonisiert, die den Wirt teilweise vor der Ansiedlung von Pathogenen schützen (Kolonisierungsresistenz). Das enteropathogene Bakterium Salmonella enterica Serovar Typhimurium (S. Tm) löst eine Entzündungsreaktion im Darm aus, die die Darmflora so verändert, dass die Kolonisierungsresistenz zusammenbricht. Die beteiligten molekularen Mechanismen sind jedoch nur teilweise verstanden. In einer vorangegangenen Studie wurden S. Tm, die aus dem entzündeten Darm infizierter Mäuse isoliert worden waren, einer ex vivo Proteom-Analyse unterzogen. Dabei wurde ein einzelner Wirtsfaktor identifiziert, der an S. Tm gebunden war: das C-Typ Lektin Reg3β. Für das nahe verwandte Reg3γ ist bekannt, dass es gram-positive Bakterien der Darmflora abtötet. Es stellte sich daher die Frage, ob auch Reg3β eine bakterizide Wirkung hat und an der Veränderung der Darmflora während einer Salmonelleninfektion beteiligt ist. Methoden: Um den Einfluss von Reg3β näher zu charakterisieren, wurde ein Kolonisierungsmodell in Mäusen verwendet, das wichtige Aspekte der durch Salmonella induzierten Unterdrückung von Kommensalen widerspiegelte. Mit Streptomycin vorbehandelte Mäuse wurden dafür mit virulenten und avirulenten S. Tm Mutanten und einem kommensalen E. coli co-infiziert. Die Reg3β Expression wurde durch quantitative Real-Time PCR und die Besiedlung der Modellstämme über die Lebendkeimzahl in den Faeces bestimmt. Über biochemische und mikrobiologische Analysen von Reg3β Varianten und isogenen S. Tm LPS-Mutanten wurde die antimikrobielle Wirkung näher charakterisiert. Ergebnisse: In dem verwendeten Modell induzierte S. Tm mit pro-inflammatorischen Virulenzfaktoren die Expression von Reg3β. Gleichzeitig konnten virulente, aber nicht avirulente Salmonellen E. coli aus dem Darm verdrängen. Die einmalige Gabe von rekombinantem Reg3β führte zur Verdrängung von E. coli und anderen coliformen Bakterien, auch aus einer Co- Besiedlung mit avirulenten Salmonellen, und ermöglichte eine verstärkte Ansiedlung von S. Tm. Rekombinant hergestelltes Reg3β band an Peptidoglykan sowie LPS und wirkte auf zwei unterschiedliche Arten antimikrobiell: (1) Durch direktes Abtöten von gram-negativen Bakterien (komplementäres, antimikrobielles Spektrum zu Reg3γ). Im Gegensatz zu E. coli waren gramnegative S. Tm jedoch resistent gegen Reg3β, u. a. wegen einer Modifikation des Lipopolysaccharids durch lange Polysaccharid-Ketten und einer Hepta-Acetylierung des Lipid A. (2) Durch Induktion bakterieller Aggregation. Die limitierte Proteolyse von Reg3β mit Trypsin resultierte in der Abspaltung eines kurzen, N-terminalen Peptids. Das C-terminale Fragment bildete Präzipitate, die Bakterien selektiv einfingen. Interpretation: S. Tm nutzt die Bildung von Reg3β, eine Wirtsreaktion auf entzündliche Vorgänge im Darm, um die Darmflora zu verändern und damit die eigene Kolonisierung zu erleichtern. Aufgrund dieser Ergebnisse könnte eine selektive Inaktivierung von antimikrobiellen Wirtsprozessen, die nur gegen Kommensale nicht aber gegen Salmonellen wirksam sind, eine Normalisierung der Darmflora und damit ein schnelleres Ende der Erkrankung herbeiführen. 1

6 Abstract 1.2 Abstract Background: The mucosal surface of the intestine is colonized by a vast community of commensal microorganisms, which shield the host from infections with pathogens (colonization resistance). The enteropathogenic bacterium Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Tm) triggers intestinal inflammation that modulates the microflora and subverts the colonization resistance. But the molecular mechanisms at play are poorly understood. An ex vivo proteome analysis, realized in a previous study, lead to the detection of a single host factor, the C-type lectin Reg3β, which was firmly attached to S. Tm that were purified from the inflamed gut of infected mice. The closely related Reg3γ has recently been identified to have bactericidal activity against Gram-positive bacteria. This raised the question for a bactericidal effect of Reg3β and a possible role in Salmonella induced changes in gut microflora. Methods: To determine molecular mechanisms, a simple co-colonization model was established, that reproduced important aspects of Salmonella-induced suppression of commensals. Streptomycin pre-treated mice were co-infected with virulent or avirulent S. Tm mutants and a commensal E. coli strain. Reg3β expression was determined by quantitative Real Time PCR and gut colonization was analyzed by feces-plating. The antimicrobial effect of Reg3β was characterized by biochemical and microbiological analysis of Reg3β variants and isogenic S. Tm LPS-mutants. Results: S. Tm used its pro-inflammatory virulence factors to induce the expression of the host lectin Reg3β. Simultaneously, virulent but not avirulent Salmonella could suppress E. coli intestinal colonization. A single dose of recombinant Reg3β selectively suppressed E. coli and other coliform bacteria, even in a co-colonization with avirulent Salmonella, and enabled S. Tm colonization at increased levels. Recombinant Reg3β bound bacterial targets via interactions with LPS and peptidoglycan and elicited two distinct antimicrobial effects: (1) Direct killing of Gram-negative bacteria (complimentary antimicrobial spectrum to Reg3γ). Compared to E. coli, the Gram-negative S. Tm was resistant to Reg3β. A high rigidity of the LPS layer supported by long polysaccharides and lipid A hepta-acetylation contributed to S. Tm resistance. (2) Induction of bacterial aggregations. Limited proteolysis caused by Trypsin selectively cleaved of a short N-terminal peptide. The C- terminal fragment of Reg3β precipitated spontaneously and entrapped bacteria. Conclusion: S. Tm utilizes the expression of Reg3β, a host response during intestinal inflammation, to modulate gut microflora and subvert colonization resistance. The data suggest that selective inactivation of antimicrobial host responses, directed against commensals but not Salmonella, might support normalization of intestinal microflora and make diarrhea less severe. 2

7 Inhaltsverzeichnis 2. Inhaltsverzeichnis 1.1 Zusammenfassung Abstract 2 2. Inhaltsverzeichnis 3 3. Einleitung Infektiöser Durchfall Die Kolonisierungsresistenz Modulation der Darmflora durch Pathogene Salmonella als Modellpathogen Serovar Typhimurium vermittelte Krankheitsbilder in Tiermodellen Induktion der Enteritis durch pro-inflammatorische Virulenzfaktoren Mögliche Wirtsmechanismen Vorkommen und Funktion antimikrobieller Peptide Mechanismen antimikrobieller Peptide Schutzmechanismen gegen antimikrobielle Peptide Antimikrobielle Lektine im Darm Reg-Proteine Struktur von Reg-Proteinen Beobachtung und Hypothese Ergebnisse Klonierung und Aufreinigung von Reg3β Spontane Präzipitation nach limitierter Proteolyse Induktion bakterieller Aggregation Bakterizide Wirkung Strukturelle Unterschiede zwischen Reg3β und Reg3γ Einfluss von Ca LPS vermittelter Schutz von Salmonella gegen Reg3β Inhibierung von Reg3β durch Peptidoglykan und LPS Verdrängung von E. coli durch eine S. Tm induzierte Entzündungsreaktion Rekombinantes Reg3β ersetzt die entzündungsinduzierte Verdrängung S. Tm induzierte Expression von Reg3β Reg3β bricht die Kolonisierungsresistenz Einfluss der bakteriellen Aggregation in vivo Diskussion Reg3β als relevantes Effektormolekül Antimikrobielle Wirkung von Reg3β Bedeutung für entzündliche Durchfallerkrankungen 62 3

8 Inhaltsverzeichnis 6. Material und Methoden Verbrauchsmaterialien und Puffer Stämme und Plasmide Klonierung und Expression von Reg3β Konstruktion des murinen Reg3β Expressionsvektors Konstruktion von Reg3β (R135T) Konstruktion von Reg3β (K6A R12A K17A) Expression und Aufreinigung von Reg3β SDS-PAGE in vitro Analysen limitierte Proteolyse: Trypsin-Verdau und Resistenz Präzipitation bei physiologischem ph nach limitierter Proteolyse ph abhängige Löslichkeit von Reg3β*-Präzipitaten ph abhängige Freisetzung von Bakterien aus Reg3β*-Präzipitaten Peptidoglykan- und LPS-Bindungstest Analyse von Präzipitaten und bakterieller Aggregation Analyse der bakteriziden Aktivität Erstellen von isogenen LPS-Mutanten Transformation durch Elektroporation LPS-Präparation und Silberfärbung Fluoreszenz-markiertes Reg3β Bindung von Reg3β-AlexaFluor647 an gemischter Darmflora Bindung von Reg3β-AlexaFluor647 an definierten Bakterienstämmen Analyse der Reg3β-Expression durch quantitative Real-Time PCR Einführung von Antibiotikaresistenzen in E. coli Tierexperimentelle Arbeiten Das Enteritis Modell der Maus Vorbehandlung mit Reg3β Identifizierung von Reg3β mittels ex vivo Proteomanalyse Allgemeine Techniken und verwendete Kits Datenverarbeitung und statistische Analyse Literaturverzeichnis Abkürzungsverzeichnis Danksagung Curriculum Vitae Publikationsliste Selbstständigkeitserklärung 112 4

9 Einleitung 3. Einleitung 3.1 Infektiöser Durchfall Akute Durchfallerkrankungen sind global betrachtet die größte, einzelne Ursache für Krankheit und Tod. Jährlich verursachen schlechte Wasserqualität, mangelnde sanitäre Einrichtungen und ungenügende Hygiene weltweit 1,7 Millionen Todesfälle (3,1 % aller Todesfälle). Die Verluste sind dabei überwiegend auf die Entwicklungsländer beschränkt. Die höchsten Sterblichkeitsraten finden sich bei Neugeborenen und Kindern mit neun von zehn Todesfällen sowie alten Menschen. In zahllosen anderen Patienten verschlimmert der Durchfall die Unterernährung und erhöht die Anfälligkeit für weitere Infektionen [1, 2]. Akute Diarrhöe ist ein Symptom, das durch sehr häufige (mehr als dreimal tägliche) breiige bis dünnflüssige Darmentleerungen gekennzeichnet ist und zwischen 3 und 14 Tagen anhält. Der Durchfall wird entweder durch eine erhöhte Sekretion oder durch eine reduzierte Absorption von Flüssigkeit im Darm sowie einer gesteigerten Darmmotilität hervorgerufen. In den meisten Fällen sind Bakterien, Viren oder Protozoen und ihre Toxine die Ursache [3]. Die Behandlung der meisten bakteriellen und viralen Durchfallerkrankungen besteht aus dem Ausgleich des Flüssigkeitsverlustes und dem Ungleichgewicht an Elektrolyten durch orale oder parenterale Rehydrierung. Therapien mit Antibiotika werden nur bei sehr schweren, systemischen Erkrankungen eingesetzt, da sie in der Regel wirkungslos sind oder die Erkrankung sogar noch verschlimmern [4]. Trotz der Fortschritte in der Aufklärung der Pathogenese von Darminfektionen ist die Zahl der Durchfallerkrankungen innerhalb der letzten Dekade in vielen Bereichen der Welt weiter angestiegen [5]. Für das auslösende Pathogen stellt die Induktion von Durchfall einen effizienten Weg dar, die Transmission zu neuen Wirten sicherzustellen. Der Durchfall resultiert in einer unkontrollierten Ausscheidung großer Mengen des Pathogens in die Umwelt des Wirtes. Pathogene Bakterien befinden sich dadurch in einer relativ feuchten und nährstoffreichen Nische, bis der nächste passende Wirt sie über kontaminierte Nahrung oder Wasser konsumiert [6]. Eine Grundvoraussetzung für diese Art der Verbreitung ist jedoch die Fähigkeit des Pathogens, sich im intestinalen Ökosystem des Wirtes ansiedeln und rasch eine hohe Populationsdichte etablieren zu können. Dabei wird das Pathogen mit zwei grundlegenden Problemen konfrontiert: es muss (1) mit der normalen Darmflora konkurrieren und (2) der angeborenen Immunantwort des Wirts widerstehen können. Die molekularen Mechanismen, die Pathogenen eine Ansiedlung unter diesen Gesichtspunkten ermöglichen, sind bisher noch in weiten Bereichen ungeklärt. Ein besseres Verständnis würde jedoch eine Grundlage bieten, um neue Strategien gegen Durchfallerkrankungen entwickeln zu können. 5

10 Einleitung 3.2 Die Kolonisierungsresistenz Das Konzept der Kolonisierungsresistenz [7] oder mikrobiellen Interferenz [8] ist seit langem bekannt und besagt, dass die kommensale Darmflora pathogene Mikroorganismen teilweise daran hindert, sich im Darm des Wirtes zu vermehren und anzusiedeln [9]. Der Aufbau der Kolonisierungsresistenz beginnt bereits kurz nach der Geburt. Während der Darm des Fötus noch steril ist, beginnt durch den Kontakt mit der Umwelt die sukzessive Kolonisierung durch unterschiedliche Mikrobengesellschaften [10]. Beim Menschen repräsentieren z. B. Vertreter der Gattungen Enterobacterium und Bifidobacterium frühe Kolonisierer, bevor sich im weiteren Verlauf Stämme anderer Gattungen ansiedeln [11, 12]. Diese Pionierstämme modulieren dabei die Genexpression des Wirtes, schaffen sich ein für sie passendes Umfeld und selektionieren so die Ansiedlung weiterer Stämme [13, 14]. Die fertig ausgebildete Darmflora, sowohl beim Menschen als auch bei der Maus, besteht nur aus wenigen Phyla und wird dominiert von den Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria und Proteobacteria. Diese wenigen Phyla verzweigen sich letztendlich zu hunderten von Bakterienarten ( ) und tausenden verschiedener Stämme [15]. Die Gesamtheit der im Darmlumen residierenden Flora umfasst ungefähr mikrobielle Zellen, mit Zelldichten von bis zu Zellen/ml [13, 16]. Die Zusammensetzung der Darmflora ist dabei in einem gesunden Darm relativ stabil [17] und wird, neben der Verfügbarkeit von Nährstoffen und lokalen Faktoren wie dem ph- Wert, wahrscheinlich auch durch das Immunsystem des Wirtes geformt und stabilisiert [18]. Oral aufgenommene, exogene Mikroorganismen, die trotz der Magensäure, der Galle und Pankreassekreten bis in das Duodenum gelangen, können dort Zahlen von bis zu 10 6 CFU/g erreichen. Die Kolonisierungsresistenz verhindert jedoch eine dauerhafte Ansiedlung dieser exogenen Mikroben, die deshalb auch als transient bezeichnet werden [14, 19-21]. Von der Kolonisierungsresistenz sind somit nicht nur Pathogene betroffen, sondern auch Mikroorganismen, die durchaus positive Effekte auf den Wirt ausüben können. So konnten bisher noch keine probiotischen Stämme dauerhaft im Darm angesiedelt werden [22, 23]. Die Kolonisierungsresistenz ist allerdings von besonderer Bedeutung, um die Gewebeinvasion durch Pathogene zu verhindern. Tiere, die keimfrei gehalten werden und keine Darmflora entwickeln können, sind bedeutend anfälliger für Infektionen als Tiere mit normaler Darmflora [24-28]. Diese erhöhte Empfindlichkeit ist auch bei oralen Behandlungen mit Antibiotika zu beobachten, bei der die Darmflora deutlich reduziert wird [29, 30]. Die Kolonisierungsresistenz betrifft neben den exogenen auch opportunistische, endogene Mikroorganismen, die im Darm zwar permanent vorhanden, in ihrem Wachstum jedoch normalerweise eingeschränkt sind. Das Gleichgewicht zwischen den verschiedenen Arten der Darmflora sorgt normalerweise für Stabilität innerhalb der mikrobiellen Population [31]. Auch hier 6

11 Einleitung kann der Gebrauch von Antibiotika die ökologische Homöostasis stören und das Überwachsen von potentiellen Pathogenen ermöglichen [29]. Es wurden zahlreiche Theorien aufgestellt, durch welche Mechanismen die kommensale Flora die Ansiedlung und Vermehrung von Pathogenen inhibieren könnte [32]: (1) Durch die Konkurrenz um Nährstoffe, die von den kommensalen Stämmen besser verwertet werden können [33], (2) durch die Konkurrenz um Adhäsion an der Zelloberfläche des Darmepithels und den Mukus-Glykoproteinen [34, 35], (3) durch die Erzeugung physiologisch einschränkender Umweltbedingungen (z. B. ph- Wert) [36, 37], (4) durch die Produktion inhibitorischer Substanzen (z. B. Microcin J25) [38, 39], (5) durch die Hemmung von Zytotoxinen eingedrungener Pathogene (von z. B. Clostridium difficile) [40-42] oder (6) durch einen immunmodulatorischen Effekt der kommensalen Flora auf die Mechanismen der Wirtsverteidigung (z. B. Expression und Sekretion von Defensinen) [25, 43-46]. Spezifische Bakterienstämme, die für die Schutzfunktion verantwortlich sind, und ihre Rolle in dem Netzwerk der kommensalen Darmflora konnten bisher noch nicht identifiziert werden [47]. 3.3 Modulation der Darmflora durch Pathogene Fragen nach Mechanismen, die es Pathogenen ermöglichen mit der kommensalen Darmflora zu konkurrieren, blieben lange Zeit ungeklärt. Es konnten erst vor kurzem erste Erkenntnisse darüber gewonnen werden, als man begann, die Zusammensetzung der Darmflora bei Infektionen und Entzündungsreaktionen zu betrachten [48]. Bakterienstämme besitzen unterschiedliche Fähigkeiten, den Darm eines Wirtes zu kolonisieren und dabei Entzündungsreaktionen hervorzurufen. Infektionen mit den Pathogenen Citrobacter rodentium, Campylobacter jejuni und Helicobacter hepaticus resultieren im Darm von Mäusen in stabilen Populationen [49, 50]. Im Gegensatz dazu stehen apathogene Escherichia coli, die an der Kolonisierung des Darmes scheitern [50]. Von den betrachteten Pathogenen löst jedoch nur Citrobacter rodentium während der erfolgreichen Kolonisierung eine Entzündung aus [49, 50]. Die Fähigkeit eines Pathogens in einem Wirt eine stabile Besiedlung zu etablieren, lässt sich somit in einigen Fällen von einer Entzündungsreaktion trennen. Für die Pathogene Citrobacter rodentium, Shigella flexneri und Vibrio cholerae konnte jedoch beobachtet werden, dass die Inhibierung der für sie charakteristischen Darmentzündung, durch Störung der Wirtsantwort oder der bakteriellen Virulenzfaktoren, in einer reduzierten Darmbesiedlung resultiert [51-53]. Dieses ließ vermuten, dass die Immunantwort des Wirtes für die Kolonisierung einiger Enteropathogene notwendig sein könnte. Es konnte gezeigt werden, dass Darmentzündungen bedeutende Auswirkungen auf die normale Darmflora besitzen. Entzündungsreaktionen, ausgelöst durch Infektionen mit Citrobacter rodentium als auch durch oral appliziertes Dextran Sodium Sulphate (DSS), reduzieren in Mäusen die bakterielle Dichte und das Vorkommen der dominanten Phyla. Hierbei werden insbesondere 7

12 Einleitung Bakterien der Cytophaga-Flavobacter-Bacteroides (CVB) Klasse eliminiert. Gleichzeitig werden residente oder eingeführte aerobe Bakterien, insbesondere die der Enterobacteriaceae, in ihrem Wachstum gefördert. Apathogene Escherichia coli, gegen die vorher eine natürliche Kolonisierungsresistenz vorlag, profitieren von dieser Modulation der Darmflora und können im Entzündungszustand den Darm der Mäuse erfolgreich besiedeln [50]. Bei Pathogenen, die ohne Entzündung eine Kolonisierung etablieren können, bleibt die Darmfora während einer Infektion dagegen weitestgehend unverändert [48-50]. Eine Entzündung des Darms ist somit ausreichend, um die Zusammensetzung der Darmflora zu verändern und eine Ansiedlung von aero-toleranten Bakterien zu ermöglichen. Die funktionellen Konsequenzen der entzündungsinduzierten Veränderung der Darmflora konnten vor kurzem für das Pathogen Salmonella enterica Serovar Typhimurium (S. Tm) näher bestimmt werden. Auch bei diesem Pathogen ist die Infektion mit einer starken Immunantwort und einer Modulation der Darmflora verbunden. Eine Infektion mit S. Tm führt zu einer Reduktion der Bakterien im Caecum um 95 %. Vertreter von Lactobacillus und Enterococcus werden bereits zu einem frühen Zeitpunkt eliminiert und es kommt zu einem dominanten Anstieg der Enterobacteriaceae-Population [47, 54]. Als verantwortliche Faktoren für die Modulation der Darmflora und somit den Verlauf der Infektion, Erkrankung und Transmission wurden die proinflammatorischen Virulenzfaktoren TTSS-1 und TTSS-2 von S. Tm identifiziert [47, 54-57]. Avirulente Mutanten, die keine Entzündung induzieren, können die Kolonisierungsresistenz nicht von sich aus überwinden, sondern werden von der normalen Darmflora verdrängt. Die Kolonisierung dieser Mutanten kann jedoch ermöglicht werden, wenn die Entzündungsreaktion wieder hergestellt wird sowohl durch Co-Infektion mit Wildtyp S. Tm als auch in Mäusen mit chronisch entzündlicher Darmerkrankung (IBD). Die TTSS-1/TTSS-2 vermittelte Entzündungsreaktion verschiebt also die Zusammensetzung der Darmflora in eine Richtung zugunsten des Pathogens. Die entzündungsinduzierte Modulation ist dabei für S. Tm sowohl notwendig als auch ausreichend, um die Kolonisierungsresistenz zu überwinden [47]. Damit wurde für S. Tm eine neuartige Besiedlungsstrategie aufgezeigt, in der das Pathogen die Wirtsantwort ausnutzt, um mit der kommensalen Darmflora zu konkurrieren. Doch dieses Ergebnis stellt nur einen ersten Schritt dar. Es konnte bisher nicht geklärt werden, zu welchen Anteilen die Wirtsantwort und das infizierende Bakterium an der Störung der Darmflora beteiligt sind, und ob die ausgelöste Immunantwort des Wirtes die konventionelle Darmflora unterdrückt oder das Wachstum des Pathogens fördert. 3.4 Salmonella als Modellpathogen Infektionen mit Salmonella enterica Serovar Typhimurium (S. Tm) sind eine wichtige Ursache für akute Durchfallerkrankungen und wurden bereits intensiv studiert, da S. Tm leicht zu kultivieren und 8

13 Einleitung molekularbiologisch zu manipulieren ist. Zudem stehen zahlreiche gute Tiermodelle zur Verfügung [58]. S. Tm bietet somit ideale Voraussetzungen, um mit ihm als Modellpathogen diejenigen Mechanismen näher zu charakterisieren, die an der Aufhebung der Kolonisierungsresistenz beteiligt sind. Salmonellen sind Darmpathogene von warm- und kaltblütigen Tieren, die sich vor Millionen Jahren von der Gattung Escherichia abspalteten [59, 60]. Die gram-negativen, stäbchenförmigen Bakterien gehören zu der Familie der Enterobacteriaceae. Sie sind peritrich begeißelt, fakultativ anaerob und fakultativ intrazellulär. Sie wurden zuerst 1880 von Karl Joseph Eberth und Robert Koch beschrieben und 1884 von Georg Gaffky kultiviert [61]. Die Namensgebung erfolgte 1885 nach Daniel Elmer Salmon. Jüngere Analysen haben ergeben, dass die Gattung Salmonella nur zwei Arten und sechs Unterarten umfasst. Neben Salmonella bongori, der von S. enterica abstammt und den Verdauungstrakt von poikilothermen Tieren besiedelt, hat sich S. enterica nachträglich zu fünf Unterarten weiterentwickelt. Die Unterarten werden durch Unterschiede in ihren Flagellen-, Kohlenhydrat- und Lipopolysaccharid- (LPS) Strukturen in mehr als 2500 Serovare differenziert [62-65]. Diese können in unterschiedlichem Maße bei einer Vielzahl von Kalt- und Warmblütern Erkrankungen hervorrufen. Da hierbei sowohl der Mensch als auch Nutztiere der Lebensmittelindustrie infiziert werden, stellt Salmonella weltweit ein großes gesundheitliches als auch wirtschaftliches Problem dar [66]. Infektionen führen beim Menschen zu den vier verschiedenen Krankheitsbildern: Typhusfieber, selbst limitierende Enterokolitis (Diarrhöe), Bakteriämie und chronischer, asymptomatischer Überträger [59, 60]. Das resultierende Krankheitsbild hängt dabei sowohl von dem betroffenen Wirt als auch dem infizierenden Serovar ab. Serovare, die ein sehr eingeschränktes Wirtsspektrum besitzen, führen im Menschen oftmals zu invasiven, lebensbedrohenden Infektionen. Die an Primaten adaptierten Serotypen Typhi und Paratyphi verursachen das Typhusfieber, eine systemische Infektion bei der Durchfall nur ein untergeordnetes Symptom ist, das rund ein Drittel der Patienten entwickelt [67]. Geschätzte 17 bis 22 Millionen Fälle von Typhus und Paratyphus führen jährlich zu bis Todesfällen [68-70]. Zwischen 1 % und 6 % der mit S. Typhi infizierten Menschen werden zu chronischen Überträgern, teilweise ohne jemals Symptome gezeigt zu haben [71]. Der Rind-adaptierte Serotyp Dublin und der Schwein-adaptierte Serotyp Choleraesuis sind dagegen für die relativ selten auftretende Bakteriämie verantwortlich [72]. Die meisten Serotypen besitzen jedoch ein breites Wirtsspektrum und lösen beim Menschen eine in den meisten Fällen harmlose Gastroenteritis aus. Hauptverursacher sind Salmonella enterica Serovar Enteritidis und Serovar Typhimurium [73]. Salmonella verursacht hierbei eine lokal begrenzte Darminfektion, die normalerweise nach wenigen Tagen abklingt und deren klinischer Verlauf üblicherweise plötzlich auftretendes Fieber, Abdominalschmerzen, Übelkeit und Durchfall umfasst [74]. Sehr junge Menschen und solche mit geschwächtem Immunsystem können jedoch besonders 9

14 Einleitung schwere Formen der Enteritis entwickeln, bei denen systemische Infektionen mit einer hohen Sterblichkeitsrate auftreten [75]. Im gesunden Erwachsenen ist eine Enteritis normalerweise selbstlimitierend. Man geht von jährlich zwischen 200 Millionen und 1,3 Milliarden Fällen von durch Salmonella induzierter Enteritis mit bis zu 3 Millionen Todesfällen aus [69, 76]. 3.5 Serovar Typhimurium vermittelte Krankheitsbilder in Tiermodellen Tiermodelle sind unerlässlich für Studien über Infektionskrankheiten. Im Gegensatz zu in vitro Versuchen reflektieren sie die natürlichen Bedingungen in zahlreichen Aspekten wesentlich besser, wobei jedoch auch sie nicht vollständig der Situation im menschlichen Wirt entsprechen. Für Salmonella Infektionen wurden daher mehrere Modelle etabliert, die unter Verwendung von verschiedenen Wirtsspezies die Betrachtung der unterschiedlichen Krankheitsbilder erlauben. Eine Infektion durch Salmonella enterica Serovar Typhimurium (S. Tm) führt im Menschen und im Rind zu einer durch Durchfall charakterisierten, selbstlimitierenden Enteritis [77]. Im Krankheitsverlauf kolonisiert S. Tm nach der oralen Aufnahme den Darm in hohen Zahlen und dringt in die Darmmukosa ein [78]. Die Invasion von Enterozyten und M-Zellen resultiert in dem Ausstoß infizierter Epithelzellen in das Darmlumen, der daraus folgenden Abstumpfung der Mikrovilli und dem Verlust an absorptionsfähiger Oberfläche [79]. S. Tm löst weiterhin ein Einwandern von polymorphonuklearen Leukozyten (PMN) in die infizierte Mukosa aus und induziert dadurch einen wässrigen Durchfall, der Blut enthalten kann [80, 81]. Die Infektion bleibt auf den Darm und die mesenterischen Lymphknoten beschränkt [82]. Die Maus, die als Wirtsmodell für die meisten Studien einer Wirts-Pathogen-Interaktion verwendet wird, ist dagegen im Wesentlichen resistent gegen eine S. Tm vermittelte Enteritis und entwickelt nach oraler Infektion eine systemische Erkrankung [77]. S. Tm repliziert dabei nicht effizient im Darm, sondern penetriert die epitheliale Barriere durch Invasion der M-Zellen und der Enterozyten. Nach der Penetration kolonisiert S. Tm die Peyerschen Platten und mesenterischen Lymphknoten und besiedelt von dort ausgehend die Leber und Milz [77, 83, 84]. Ferner löst S. Tm in der Maus eine Infiltration der Mukosa durch mononukleäre Leukozyten aus [85, 86]. Das Krankheitsbild ähnelt dem des menschlichen Typhus, wie er durch Infektionen mit den wirtsbeschränkten Serotypen Typhi und Paratyphi A, B, and C verursacht wird, die ausschließlich Menschen und einige andere Primaten infizieren können [87]. Die Mäuse verenden an der systemischen Infektion, zeigen jedoch nur wenige Zeichen einer Darmentzündung, wie sie im Rind oder Menschen bei diesem Serovar zu beobachten ist. Der unterschiedliche Krankheitsverlauf in Maus und Mensch wird durch genetische Unterschiede der Wirtsspezies verursacht. Wahrscheinlich sind Unterschiede in der Erkennung durch das angeborene Immunsystem [77] und die Fähigkeit der Makrophagen, die Bakterienproliferation zu kontrollieren, dafür verantwortlich [88]. Aus diesem Grund wurde die Infektion der Maus mit S. Tm 10

15 Einleitung als Modell für den menschlichen Typhus verwendet [89, 90]. Für Studien zur nicht-typhösen Salmonellose des Menschen wurden dagegen Infektionsmodelle im Rind verwendet, bevor die Entwicklung des murinen Enteritis-Modell ein passendes Infektionsmodell in kleinen Nagetieren verfügbar machte [30]. Das Phänomen, dass der Darmtrakt von SPF-Mäusen nach oraler Infektion mit S. Tm nur schlecht besiedelt wird (<10 4 CFU/g Kot), kann auf den Effekt der Kolonisierungsresistenz durch die endogene Darmflora zurückgeführt werden [30, 91]. In dem murinen Enteritis-Modell werden die Mäuse mit Streptomycin oral vorbehandelt, um die Kolonisierungsresistenz auszuschalten. Dabei wird die Menge an normaler Flora, die üblicherweise mit den eingeführten Salmonellen konkurrieren würde, so stark reduziert, dass S. Tm den Darm effizient besiedeln kann [37, 92-94]. Das resultierende Maus-Modell ähnelt in zahlreichen Aspekten der S. Tm Infektion im Menschen, einschließlich epithelialer Geschwürbildung, Ödemen, Induktion des interzellulären Adhesionsmoleküls 1 und massiver Infiltration von PMN/CD18+ Zellen [30]. 3.6 Induktion der Enteritis durch pro-inflammatorische Virulenzfaktoren Eine erfolgreiche Wirt-zu-Wirt Übertragung ist für jedes Pathogen unerlässlich, um eine erfolgreiche Verbreitung innerhalb der Wirtspopulation zu gewährleisten. Die Fähigkeit, eine selbst limitierende Durchfallerkrankung zu induzieren ohne den Tod des Wirtes zu verursachen, ist dementsprechend von großer Bedeutung für die Verbreitung von S. Tm über die fäkal-orale Route. Die wesentlichen Kennzeichen der durch S. Tm induzierten Enteritis sind die Induktion (1) einer frühen Entzündungsreaktion und (2) eines sekretorischen Durchfalls [95]. Die Entzündungsreaktion ist für S. Tm notwendig, um die Kolonisierungsresistenz zu brechen [47], der Durchfall, um sich in der Umwelt des Wirtes zu verbreiten [6]. Man geht davon aus, dass S. Tm in 20 % der natürlichen Infektionen eines empfänglichen Wirtes die Kolonisierungsresistenz brechen und die für eine erfolgreiche Transmission notwendigen, hohen Zellzahlen im Darmlumen erreichen kann. Die Wirte mit diesem Super-Shedder Phänotyp sind als Hauptüberträger für 80 % der Neuinfektionen verantwortlich [55, 96]. Der Gebrauch des murinen Enteritis-Modells neben anderen Tiermodellen hat gezeigt, dass für den Verlauf der Besiedlung, Erkrankung und Transmission insbesondere die pro-inflammatorischen Typ III Sekretionssysteme von S. Tm verantwortlich sind [47, 54-57]. S. Tm besitzt zwei Typ III Sekretionssysteme (TTSS-1 und TTSS-2), die durch die chromosomalen Salmonella Pathogenitätsinseln SPI-1 und SPI-2 kodiert werden [59, 97]. Der Krankheitsverlauf im Menschen beginnt normalerweise zwischen 6 und 72 Stunden nach oraler Aufnahme von mehr als Salmonellen. Die adaptive Säure-Toleranz ermöglicht es den Bakterien, den niedrigen ph im Magen zu überleben und den Darm zu erreichen [98]. Im Dünndarm durchquert S. Tm die Mukus-Schicht, entzieht sich der angeborenen Immunantwort des Wirtes (z. B. 11

16 Einleitung IgA, antimikrobielle Peptide) und lagert sich mit Hilfe von Adhesinen an der Oberfläche der Epithelzellen an [99-101]. Anschließend erfolgt die Invasion der (nicht-phagozytischen) Epithelzellen durch eine TTSS-1 vermittelten Endocytose [102]. Diese Fähigkeit ist sowohl für die Ausbildung einer selbstlimitierenden Enteritis als auch für eine systemische Infektion zwingend erforderlich. Bereits wenige Minuten nach der Ankunft im Darm kann man die Invasion erster Salmonellen in die M-Zellen und Enterozyten beobachten [79]. Die SPI-1 kodierten Proteine formen hierfür einen Nadel-Komplex, eine Multi-Proteinstruktur, welche die innere und äußere Membran der Bakterienhülle durchspannt [103]. Um in die Wirtszellen einzudringen, werden über das TTSS Effektorproteine in das Zytosol der Wirtzelle injiziert [75, 95, 104]. Die translozierten Effektoren SopE, SopE2 und SopB aktivieren die Rho-GTPasen des Wirtes, was in einer Neuanordnung des Aktin-Zytoskeletts resultiert. Die Modulation durch die Aktin-bindenen Proteine SipA und SipC führt schließlich zu der Aufnahme der Salmonellen in die Wirtszelle [105]. Gleichzeitig stimulieren die Effektoren die Cl - Sekretion (SopB) und destabilisieren die Tight Junctions zwischen den Epithelzellen. Als Folge kommt es zu einer erhöhten Flüssigkeitssekretion in das Darmlumen [75, 95, 104]. Die Interaktion mit den Effektoren des TTSS-1 resultiert ebenfalls in der Aktivierung der MAPKs (mitogen-activated protein kinase), was zu einer Induktion von NF-κ-B und der Aktivierung einer pro-inflammatorischen Kaskade führt. Wesentliche Kennzeichen sind die Produktion der polymorphonukleären Leukozyten (PMN) und des pro-inflammatorischen Chemokin Interleukin (IL) 8 [75, 95, 104]. Die beschriebene Destabilisierung der Tight Junctions erlaubt die Transmigration der PMNs von der basolateren zu der apikalen Seite des Darmepithels und ermöglicht gleichzeitig Bakterien den Zutritt zu der basolateralen Seite. Nach der initialen Aufnahme der Salmonellen durch Makropinozytose in die Wirtszelle befindet sich das Bakterium im Phagosom [75, 95, 104]. Das Phagosom fusioniert mit Lysosomen, wird angesäuert und legt sich eng an das Bakterium an. Innerhalb der nun sogenannten Salmonella- Containing Vacuole (SCV) wird das SPI-2 kodierte TTSS-2 induziert und sekretiert Effektormoleküle über die Membran des Phagosoms in die Wirtszelle. Die genauen Funktionen der Effektoren sind noch weitestgehend ungeklärt, doch man geht davon aus, dass sie den Vesikeltransport beeinflussen und dadurch nützliche Metabolite zu den SCVs umleiten. Das TTSS-2 ist essentiell für das Überleben und die Replikation von Salmonella innerhalb der Wirtszelle und somit notwendig für die Ausbildung einer systemischen Infektion wie sie beim Typhus vorliegt [106, 107]. Das TTSS-2 spielt jedoch nur eine untergeordnete Rolle in der Induktion der Enteritis [56]. Neben dem TTSS-1 wurden weitere Salmonella-assoziierte Faktoren identifiziert, die ebenfalls an der Auslösung der Enteritis beteiligt sind. Hervorzuheben ist das Flagellin, die monomere Untereinheit der bakteriellen Flagellen, das die IL-8 Sekretion durch Stimulierung des basolateralen Toll-like Receptors (TLR) 5 induziert [75, 95, 104]. 12

17 Einleitung 3.7 Mögliche Wirtsmechanismen Bei dem Darm handelt es sich um ein extrem komplexes Organ, das die größte Oberfläche des Körpers darstellt mit mehr als 300 m 2 bei einem erwachsenen Menschen. Das Darmepithel bildet dabei jedoch nicht nur eine einfache, physikalische Barriere, um das Eindringen von Mikroorganismen in den Organismus zu verhindern. Es ist durchsetzt von spezialisierten Zellen, die Mukine, antimikrobielle Peptide (AMPs) und Lektine [ ] sowie andere antimikrobielle Moleküle, wie Lysozym, sekretieren und zusammen mit der residenten Darmflora eine erste Verteidigungslinie gegen oral aufgenommene Pathogene darstellen [32, 111]. Im Rahmen einer Entzündungsreaktion kommt es zu einer erhöhten Freisetzung der antimikrobiellen Effektormoleküle, mit denen der Wirt versucht, die auslösenden Faktoren zu entfernen und einen Heilungsprozess für das geschädigte Gewebe einzuleiten. Als Komponenten des angeborenen Immunsystems kann der Wirt mit diesen Effektormolekülen innerhalb weniger Stunden auf Infektionen reagieren, lange bevor das adaptive Immunsystem aktiv wird. Dadurch wird es dem Wirt ermöglicht, das Wachstum der eingedrungenen Pathogene bereits kurz nach der Infektion zu verzögern oder sogar vollständig aufzuhalten. Bedingt durch diese schnelle Reaktionzeit handelt es sich jedoch um unspezifische Abwehrmechanismen, die nicht nur auf das Pathogen sondern gleichermaßen auf die konventionelle Darmflora einwirken. Es besteht daher die Möglichkeit, dass einzelne Komponenten der Wirtsverteidigung die Ansiedlung von Pathogenen wie Salmonella Typhimurium ungewollt unterstützen könnten. Es wurden bisher zwei mögliche Mechanismen zur Diskussion gestellt [47, 48]: (1) Das Wachstum des Pathogens wird z. B. durch eine veränderte Nährstoffverfügbarkeit im entzündeten Darm gefördert. In einer aktuellen Studie konnte gezeigt werden, dass S. Tm die während einer Entzündung erhöhte Sekretion von Mukinen als Nährstoffquelle für ein verstärktes Wachstum nutzen kann [110]. (2) Antimikrobielle Faktoren unterdrücken die Darmflora, die normalerweise das Wachstum von S. Tm im gesunden Darm inhibieren würde. Die betroffene Darmflora kann dabei entweder direkt den Schutz vermitteln, oder aber im Rahmen eines Kommensalen-Netzwerkes indirekt für das Wachstum der schützenden Stämme notwendig sein. Dieses Konzept setzt jedoch voraus, dass Kommensale und Pathogen unterschiedlich empfindlich gegenüber den verantwortlichen, antimikrobiellen Faktoren sind. Die Resistenzen, über die S. Tm gegen antimikrobielle Peptide und Sauerstoff- und Stickstoffradikale verfügt, lassen einen derartigen Mechanismus jedoch möglich erscheinen [ ]. 3.8 Vorkommen und Funktion antimikrobieller Peptide Antimikrobielle Peptide (AMPs) sind natürliche Antibiotika, die von fast jeder studierten Lebensform produziert werden: von Bakterien, Pflanzen, Invertebraten und Vertebraten [115, 116]. 13

18 Einleitung AMPs werden als evolutiv alte aber dennoch effiziente Komponente des angeborenen Immunsystems betrachtet [117]. AMPs wirken direkt bakterizid und können sowohl gegen eine Vielzahl von gram-positiven und gram-negativen Bakterien, wie auch gegen Pilze, Viren und Protozoen gerichtet sein [ ]. Zum ersten Mal wurden AMPs in den polymorphonukleären Neutrophilen (PMNs) und Makrophagen identifiziert. Mittlerweile ist bekannt, dass viele Zellen des Immunsystems (z. B. Eosinophile, T-Lymphozyten und natürliche Killerzellen) oder der mukosalen Epithelien höherer Wirbeltiere AMPs bilden können [122, ]. Nach Zellaktivierung und Degranulierung werden die Vesikel-assoziierten Peptide entweder intrazellulär mit Pathogenenthaltenen Vakuolen fusioniert oder extrazellulär sekretiert [128]. Im Darm sind die Paneth-Zellen die Hauptproduzenten von AMPs, von denen die Defensine die prominenteste Gruppe darstellen. Sie wirken in vitro antimikrobiell und besitzen in vivo wahrscheinlich wichtige Funktionen, die bisher jedoch noch unvollständig verstanden sind. Es wurden bisher mehrere Funktionen vorgeschlagen [129]: (1) Erhaltung einer niedrigen Populationsdichte im Dünndarm, (2) Regulierung der Zusammensetzung der Darmflora, (3) Schutz der Stammzellen gegen kommensale Bakterien und (4) Schutz gegen durch Wasser und Nahrungsmittel übertragene Pathogene. Die α-defensine, in der Maus auch als Cryptidine bekannt, werden während der Homöostasis der Darmflora und sogar unter keimfreien Bedingungen konstitutiv exprimiert [130]. Im Zustand der Entzündung wird die Expression hochreguliert und größere Mengen, der in den sekretorischen Vesikeln der Paneth-Zellen gespeicherten AMPs, in das Darmlumen entlassen [ ]. Die Freisetzung der antimikrobiellen Substanzen wird durch gram-negative und gram-positive Bakterien, Lipopolysaccharide, Lipoteichonsäure, Lipid A und Muramyldipeptid, jedoch nicht durch lebende Pilze oder Protozoen stimuliert [44]. Die Defensine werden in den Paneth Zellen als inaktive Propeptide gespeichert und nach Freisetzung in das Darmlumen durch Proteolyse in die aktive Form überführt. Beim Menschen geschieht dieses durch Trypsin, in der Maus durch Matrilysin (Matrix-Metalloproteinase-7) [134, 135]. Die Fähigkeit, das Darmepithel gegen Mikroorgansimen zu verteidigen, wird durch die Menge an reifen, aktiven Peptiden im Darmlumen bestimmt [136]. Mäuse, bei denen die Ausreifung der Defensine gestört ist, besitzen nur eine eingeschränkte Fähigkeit, die Ansiedlung von oral verabreichten Darmbakterien wie Escherichia coli zu verhindern. Zudem sind sie weitaus empfindlicher gegenüber Infektionen mit virulenten Salmonellen [137]. Dagegen sind transgene Mäuse, die zusätzlich das menschliche Paneth-Zell Defensin HD5 exprimieren, besser gegen oral verabreichte, virulente Salmonellen geschützt [138]. Für den Menschen konnte vor kurzem gezeigt werden, dass eine reduzierte Expression von α-defensinen mit einem erhöhten Risiko für infektiösen Durchfall assoziiert ist [139]. Für CD-Patienten (Crohn s Disease) wurde ebenfalls eine Defizienz in der Expression von α-defensinen festgestellt [140]. 14

19 Einleitung Auch für die übrigen Gruppen von antimikrobiellen Peptiden wurde die Bedeutung in der Verteidigung gegen oral aufgenommene Pathogene belegt. Das Cathelicidin der Maus trägt wesentlich dazu bei, die Schwelle für eine erfolgreiche Infektion durch adherente Pathogene wie Citrobacter rodentium zu erhöhen [141]. Das Bactericidal/Permeability-Inducing Protein (BPI) besitzt die Fähigkeit, LPS zu neutralisieren und gram-negative Bakterien abzutöten [142, 143]. Und für das Resistin-like Molecule B wurde gezeigt, dass es den Darm gegen Helminthen verteidigt, indem es die Chemotaxis der Würmer inhibiert [144, 145]. 3.9 Mechanismen antimikrobieller Peptide Antimikrobielle Peptide (AMPs) greifen an einem Punkt an, der es ihnen erlaubt, zwischen den bakteriellen Zielzellen und den eukaryotischen Zellen des Wirtes zu unterscheiden: der Zellmembran. Während die bakterielle Membran stark anionisch geladen ist, besitzt die Oberfläche eukrayotischer Membranen keine Nettoladung. Die negativen geladenen Lipide weisen hier in Richtung des Cytoplasmas. Wesentliches Merkmal der AMPs für eine Interaktion mit der bakteriellen Membran ist somit eine positive Nettoladung und ein amphipathischer Charakter [146]. Für die Wirkung von AMPs wurden verschiedene Hypothesen erstellt. Sie umfassen (1) eine Depolarisierung der bakteriellen Membran [147], (2) die Ausbildung von Poren, die zum Auslaufen des Cytoplasmas führen [148], (3) die Aktivierung von tötlichen Prozessen (z. B. Induktion von Hydrolasen, die die Zellwand abbauen) [149] und (4) die Schädigung interner Angriffsziele nach Aufnahme der AMPs in die Zielzelle (z. B. bei Pyrrhocoricin) [150]. Man vermutet jedoch, dass die bakterizide Aktivität der meisten AMPs durch (5) eine unspezifische Störung der Membranintegrität zustande kommt. Dieser Mechanismus wurde als Shai-Matsuzaki- Huang Modell beschrieben [116, 124, ]. Nach diesem Modell interagieren die kationisch geladenen AMPs (CAMPs) mit den negativ geladenen Phospholipidgruppen der äußeren Membran von Bakterien durch elektrostatische Anziehung. Die Peptide sammeln sich auf der Membranoberfläche an, fügen sich zwischen die Phospholipidgruppen ein und beginnen so die Lipide zu verschieben. Diese Ansammlung schwächt die Membran, da die Oberfläche der äußeren Lipidschicht relativ zur inneren expandiert und sich Spannungen im Bilayer aufbauen. Ein Phasenübergang setzt die Spannungen schließlich frei, die Peptide beginnen sich neu zu orientieren und Poren auszubilden. Mit dem Fortschritt dieses Prozesses beginnt die Membran in Vesikel zu zerfallen, die mit Peptiden überzogen sind. Tatsächlich sind nur wenige AMPs bekannt, die ihre bakterizide Wirkung nicht durch Disruption der Membran erreichen. Bei den meisten nicht-lytischen AMPs ist die Ausbildung von Poren jedoch ebenfalls ein bedeutender Schritt und dient der Translokation der AMPs in das Zellinnere [154]. In nur wenigen Fällen verwenden AMPs bakterielle Transporter, um die internen Angriffsziele zu erreichen (z. B. Apidaecin) [155]. 15

20 Einleitung 3.10 Schutzmechanismen gegen antimikrobielle Peptide Im Gegensatz zu traditionellen Antibiotika, die spezifisch Zielmoleküle angreifen, wirken die meisten antimikrobiellen Peptide (AMPs) unspezifisch durch das Aufbrechen der bakteriellen Membran. Die kurzfristige Ausbildung von Resistenzen ist gering, weshalb AMPs auch als therapeutische Alternativen zu konventionellen Antibiotika angesehen werden [156, 157]. Da die Proteinstruktur und Funktion der AMPs jedoch stark konserviert ist, haben bakterielle Pathogene wie Salmonella im Zuge langfristiger Evolution Mechanismen entwickelt, um die Effizienz der AMPs zu limitieren [129, 158, 159]. Die prinzipiellen Mechanismen umschließen: (1) eine reduzierte Affinität durch Modifikation der Bakterienoberfläche, (2) die Sekretion von AMPbindenden Proteinen ( external trapping ), (3) Membran-Efflux-Pumpen, (4) die bakterielle Sekretion von Peptidasen und (5) eine Herunterregulierung der AMP-Expression in den Wirtszellen. Die poly-kationische Ladung und die amphipathische Struktur der AMPs erklärt ihre Fähigkeit, LPS zu binden und so mit der Membran gram-negativer Bakterien zu interagieren [115, 160, 161]. Modifikationen der Bakterienoberfläche und insbesondere des LPS, die zu Ladungsänderungen führen, verhindern die Bindung und das Eindringen der Peptide [162]. Viele Pathogene verfügen über regulatorische Netzwerke, welche die Expression der Virulenzfaktoren in Abhängigkeit von den Umweltbedingungen in den Nischen des Wirtes koordinieren. Das PhoP/PhoQ Zwei-Komponenten-System von Salmonella kontrolliert die Transkription von wenigstens 25 genetischen Loci in Abhängigkeit von den extrazellulären Konzentrationen von Magnesium und Calcium. Der PhoP/PhoQ Regulator fördert dabei auch die Umgestaltung der bakteriellen Oberfläche, einschließlich der Enzyme, welche die Ladung des LPS verändern [ ]. Mutationen des PhoP/PhoQ Operons reduzieren die Überlebensrate von Salmonella in Makrophagen und erhöhen die Empfindlichkeit gegenüber kationischen AMPs und saurem ph [163, ]. Ein zweites Zwei-Komponenten Regulationssystem, das ebenfalls an der Vermittlung der AMP-Resistenzen beteiligt ist und von PhoP moduliert wird, ist der PmrA/PmrB Regulator [170]. Weitere Gene von Salmonella, die Homologien zu den Regulatoren VirK, SomA und RcsC von Shigella aufweisen, stehen ebenfalls im Verdacht an der Modifikation der Bakterienoberfläche beteiligt zu sein [171]. Eine wichtige Modifikation des LPS, vermittelt durch PmrA/PmrB, besteht im Hinzufügen von 4- Aminoarabinose (Ara4N) an die Phosphatgruppe des Lipid A Grundgerüsts, wofür zwei genetische Loki benötigt werden: pmre und pmrhfijklm. Alle Gene außer pmrm sind hierbei essentiell für die Modifikation des Lipid A. [170, 172]. Weitere Mechanismen der AMP-Resistenz konnten den von PhoP/PhoQ regulierten Genen pagp, lpxo und pagl zugeordnet werden, deren Funktionen die Palmitoylierung (PagP), die Hydroxylierung (LpxO) und Deacylierung von Lipid A (PagL) katalysieren [173]. Hierbei führen die verschiedenen Modifikationen von Lipid A zu Resistenzen gegen verschiedene Klassen von AMPs. Während das Anfügen von Palmitat durch PagP die 16

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