Untersuchung von Signalwegen in Rattenmodellen mit unterschiedlichen Knochenheilungsstörungen. vorgelegt von Dipl.-Ing. Susann Minkwitz geb.

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1 Untersuchung von Signalwegen in Rattenmodellen mit unterschiedlichen Knochenheilungsstörungen vorgelegt von Dipl.-Ing. Susann Minkwitz geb. in Berlin von der Fakultät III Prozesswissenschaften Fachgebiet Medizinische Biotechnologie der Technischen Universität Berlin zur Erlangung des akademischen Grades Doktor der Ingenieurwissenschaften - Dr.-Ing. genehmigte Dissertation Promotionsausschuss: Vorsitzender: Gutachter: Gutachterin: Gutachterin: Prof. Dr. Juri Rappsilber Prof. Dr. Roland Lauster Prof. Dr. Britt Wildemann Prof. Dr. Vera Meyer Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 03. Juli 2015 Berlin 2015

2 Die experimentellen Arbeiten zu dieser Dissertation wurden von Januar 2012 bis März 2015 unter der Leitung von Prof. Dr. Britt Wildemann am Julius Wolff Institut, Charité-Universitätsmedizin Berlin, im Rahmen der Graduiertenschule Berlin Brandenburg School for Regenerative Therapies (BSRT) durchgeführt. Diese Arbeit wurde finanziert durch das Preisgeld der Oskar-Helene-Heim Stiftung (Oskar-Helene Medizinpreis 2011), die Elsa- Neumann- Stiftung des Landes Berlin und die Berlin Brandenburg School for Regenerative Therapies (BSRT). Berlin, 29. April 2015

3 Widmung Für meinen lieben Papa

4 ZUSAMMENFASSUNG I Zusammenfassung Trotz verbesserter operativer Versorgung und fundiertem Wissen über die Heilungsabläufe, treten auch heute noch schwerwiegende Komplikationen während der Knochenheilung auf. Daher ist es von außerordentlicher Bedeutung neue Erkenntnisse zur Pathologie der Knochenheilungsstörung zu gewinnen. Eine Möglichkeit ist der Vergleich unterschiedlicher, klinisch relevanter Tiermodelle. Diese Promotion beschäftigt sich mit der Analyse von drei Heilungsmodellen, die eine i. physiologische Knochenheilung (Kontrollgruppe), ii. hypertrophe Pseudarthrose (Hypertrophiegruppe) und iii. atrophe Pseudarthrose (Atrophiegruppe) imitieren. Dabei wurde die Expression osteogener und angiogener Signalwegkomponenten vergleichend mittels mrna-analyse und Immunhistochemie sowie die Revaskularisierung des Kallusgewebes untersucht. Der Wechsel von einem geschlossenen Frakturansatz (Kontrollgruppe) zu einer offenen Osteotomie (Hypertrophiegruppe), und damit Setzen eines zusätzlichen Weichteiltraumas, führte bereits zu einer verlängerten Heilung mit fehlender knöcherner Überbrückung nach 42 Tagen. qrt-pcr-daten zeigten eine höhere Expression der analysierten osteogenen und angiogenen Faktoren in der Hypertrophiegruppe zu Tag 14. Nach 42 Tagen kam es zu einer signifikanten Reduktion osteogener Faktoren und deren Antagonisten wie Bmp4 und Bambi. Die Inhibierung der Angiogenese durch Fumagillin (Atrophiegruppe) verringerte die Bildung neuer Blutgefäße sowie die Chondrogenese in spaltnahen Bereichen und führte nach 42 Tagen zu einer kompletten Nichtheilungssituation. Angiogene Faktoren zeigten eine Hochregulation über die späteren Heilungszeitpunkte und gleichzeitig waren osteogene Faktoren weniger reguliert zu Tag 14 und 21 im Vergleich zur Kontrollgruppe. Bis heute gibt es keine Studie, die sich mit dem Vergleich mehrerer verzögerter Heilungsmodelle, in Hinblick auf die Unterschiede im osteogenen und angiogenen Signalweg, beschäftigt hat. Besonders aus gesundheitsökonomischer Sicht ist es von außerordentlicher Bedeutung, individuelle Therapieformen zu entwickeln und dabei die Kosten der Therapie so gering wie möglich zu halten. Ein wichtiger Schritt in diese Richtung ist das Verständnis über die Ursachen und sich anschließende Regulationsmechanismen in den unterschiedlichen Knochenheilungsstörungen vor allem auf molekularer Ebene. Das Projekt zur Untersuchung klinisch relevanter Knochenheilungsmodelle am Tier stellt dabei eine enge Verknüpfung von Forschung und Klinik dar.

5 ABSTRACT II Abstract Severe complications in bone healing, such as delayed healing or non-union progressions, are still present although a great deal of information about the general healing process and treatment strategies are available. Therefore, it is of crucial importance to gain an insight into the pathology of healing failure. One possibility is to compare different clinical relevant animal models. The aim of this study was to evaluate biological characteristics of hypertrophic and atrophic non unions in comparison to a physiological healing outcome. In all three healing models expression levels of relevant pathway components important for osteogenic differentiation and angiogenesis were analyzed using mrna analysis and immunohistochemistry. Additionally, the revascularization during the entire healing process was investigated ex vivo by utilization of µct technique in combination with the application of a polymerizing contrast agent. The change from a closed fracture approach (control group) to an open osteotomy (hypertrophy group), and thereby inducing a soft tissue damage, led to a prolonged healing with a lack in bony bridging after 42 days. qrt-pcr data revealed higher expression of osteogenic and angiogenic genes at day 14. After 42 days a significant reduction of osteogenic factors and their antagonists such as Bmp4 and Bambi could be seen. The inhibition of angiogenesis by the application of Fumagillin (atrophy group) not only reduced the number of vessels, but inhibited chondrogenesis in gap regions and led to a complete non-union situation after 42 days. Angiogenic factors were highly upregulated over a longer time whereas osteogenic genes were less regulated compared to the control group. Up to now, no study compared three different clinically relevant bone healing models focusing on both the osteogenic and angiogenic signaling pathway. Understanding the cause and the associated regulation mechanism on molecular level are important steps towards development of individual treatment strategies. This project tightly links science and clinical needs by analyzing clinically relevant bone healing progressions in an animal model.

6 INHALTSVERZEICHNIS III Inhaltsverzeichnis 1. EINLEITUNG KLINISCHE RELEVANZ DER STUDIE EINTEILUNG DER KNOCHENHEILUNGSSTÖRUNGEN DIE HYPERTROPHE PSEUDARTHROSE DIE ATROPHE PSEUDARTHROSE TIERMODELLE IN DER MUSKULOSKELETTALEN FORSCHUNG KNOCHENANATOMIE UND BIOLOGIE ARTEN VON KNOCHENGEWEBEN MIKROSKOPISCHER KNOCHENAUFBAU KNOCHENHEILUNG MOLEKULARE ASPEKTE DER KNOCHENHEILUNG INFLAMMATIONSSTIMULI OSTEOGENESEFAKTOREN ANGIOGENESEFAKTOREN ZUSAMMENSPIEL VON OSTEOGENESE UND ANGIOGENESE WÄHREND DER KNOCHENHEILUNG ZIEL DER ARBEIT HYPOTHESEN MATERIAL UND METHODEN LABORGERÄTE SOFTWARE UND DATENBANKEN CHEMIKALIEN UND VERBRAUCHSMATERIALIEN GEBRAUCHSFERTIGE REAKTIONSSYSTEME PUFFER UND LÖSUNGEN PCR-PRIMERLISTE ANTIKÖRPER PRIMÄRANTIKÖRPER SEKUNDÄRANTIKÖRPER VERSUCHSTIERE HALTUNG GRUPPENEINTEILUNG OPERATIVES VORGEHEN... 34

7 INHALTSVERZEICHNIS IV BETÄUBUNGSVERFAHREN IMPLANTATE TIEROPERATIONEN FRAKTURMODELL OSTEOTOMIEMODELL POSTOPERATIVE UNTERSUCHUNGEN AUSWERTUNG DER RÖNTGENBILDER AUFARBEITUNG DER µct PROBEN DREIDIMENSIONALE ANGIOGRAMME KONTRASTMITTELAPPLIKATION MIKRO-COMPUTER TOMOGRAPHIE PRINZIP EINES EX-VIVO MIKRO-COMPUTERTOMOGRAPHEN SCANNEN DER KNOCHENPROBEN AUSWERTUNG DER SCANDATEN HISTOLOGIE EINBETTUNG DER PROBEN UND HERSTELLUNG VON PARAFFINSCHNITTEN HISTOLOGISCHE ÜBERSICHTSFÄRBUNG MIT MOVAT PENTACHROM HISTOMORPHOMETRISCHE AUSWERTUNG DER MOVAT PENTACHROM-FÄRBUNG IMMUNHISTOCHEMIE ANTI-ANGIOPOIETIN 2 FÄRBUNG ANTI-THROMBOSPONDIN FÄRBUNG AUFARBEITUNG DER PROBEN FÜR DIE QRT-PCR-ANALYSE PROBENENTNAHME FÜR DIE RNA-ISOLATION RNA-ISOLATION BESTIMMUNG DER QUANTITÄT DER RNA-PROBEN QUALITATIVER NACHWEIS DER RNA-PROBEN REVERSE TRANSKRIPTASE DER GESAMT-RNA IN CDNA ECHTZEIT-POLYMERASEKETTENREAKTION (QRT-PCR) PRIMERDESIGN QRT-PCR RNA-MICROARRAYS ZUSAMMENFÜHREN DER PROBEN UMSCHREIBEN DER PROBEN IN CDNA UMSCHREIBEN DER CDNA-PROBEN IN FLUORESZENZ-MARKIERTE CRNA AUFREINIGUNG DER MARKIERTEN CRNA UND QUANTIFIZIERUNG HYBRIDISIERUNG WASCHEN DER ARRAYS... 63

8 INHALTSVERZEICHNIS V SCANNEN DES ARRAYS AUSWERTUNG DES ARRAYS STATISTIK ERGEBNISSE VALIDIERUNG DES HEILUNGSVERLAUFES ÜBER RÖNTGENBILDER MIKRO-COMPUTERTOMOGRAPHIE KNOCHENPARAMETER GEFÄßNETZWERK-PARAMETER HISTOLOGIE DESKRIPTIVE ANALYSE HISTOMORPHOMETRIE RNA-QUALITÄT QRT-PCR-DATEN MICROARRAY-DATEN IMMUNHISTOCHEMIE ANGIOPOIETIN THROMBOSPONDIN DISKUSSION LITERATURVERZEICHNIS ANHANG DATEN ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ABBILDUNGSVERZEICHNIS TABELLENVERZEICHNIS LISTE DER PUBLIKATIONEN UND PRÄSENTATIONEN EIDESSTATTLICHE ERKLÄRUNG DANKSAGUNG

9 EINLEITUNG 1 1. Einleitung Knochenheilung ist ein komplexer, durchorchestrierter Ablauf von aufeinanderfolgenden, teils überlappenden Prozessen, die nur realisiert werden können, wenn die Revaskularisierung des verletzten Gewebes erfolgreich ist. Ohne die Rekonstitution der Versorgungsbahnen endet der Heilungsprozess. Auch heute noch ist eine Ursache für ein Heilungsversagen bei Knochenfrakturen darin zu finden, dass die Revaskularisierung gestört ist [1]. Gerade die Analyse der Pseudoarthrose in ihrer unterschiedlichen Ausbildungsform bietet die Möglichkeit, den Einfluss der Revaskularisierung auf die Knochenheilung zu untersuchen. Insbesondere der negative Einfluss von zu viel und zu wenig ist in diesem Modell faszinierend und verdeutlicht, dass die Regulation der für die Knochenheilung wichtigen Prozesse entscheidend für den Heilungserfolg ist. Ohne Blutgefäßversorgung versagt die Heilung, aber eine überscheißende Gefäßbildung ist ebenfalls ein schlechtes Zeichen [2]. Ein besseres Verständnis der Vernetzung der Angiogenese und der Knochenheilung ist essentiell für die Entwicklung zukünftiger Therapieoptionen. 1.1 Klinische Relevanz der Studie Die häufigsten Frakturen langer Röhrenknochen sind Tibiafrakturen. Je nach der anatomischen Position der Fraktur und dem Auftreten zusätzlicher Traumata haben diese Frakturen die höchste Nichtheilungsrate [3]. Retrospektive klinische Studien zur Heilung von Frakturen der Röhrenknochen ermittelten eine Nichtheilungsrate von 3-15% [4-6]. Sobald eine operative Intervention zur Behandlung notwendig, liegt dieser Prozentsatz bei Tibiafrakturen weit höher. Dies ist dann der Fall, wenn eine geschlossene Reposition des Knochenbruches nicht möglich ist oder eine offene Fraktur vorliegt [3]. Durch die Verwendung von Kompressionsplatten und externen Fixateursystemen kam es bei 24-54% der Fälle zur Ausbildung einer Pseudarthrose [7, 8]. Erst die Anwendung von verriegelten intramedullären Nägeln konnte diese hohe Rate vermindern [9]. Trotzdem werden in den USA jährlich etwa Frakturen mit verzögerte Heilung diagnostiziert und über enden als Pseudarthrosen [10]. Die durchschnittlichen Kosten zur Behandlung einer manifestierten Pseudarthrose wurden auf etwa $ berechnet. Wobei hier nur die direkten Kosten der operativen Intervention und Medikation berücksichtigt wurden, nicht aber die indirekten Kosten, wie der Produktivitätsausfall über einen langen Zeitraum [11]. Der kontinuierliche Anstieg der Lebenserwartung führt zudem zu einer höheren Anzahl an Frakturen.

10 EINLEITUNG 2 Im adulten Skelett kommt es im Laufe der Jahre zu progressiven katabolischen Veränderungen, die in einer osteoporotischen Erkrankung enden können und einen Anstieg in der Frakturrate zur Folge haben. Dabei wird über die Hälfte der Kosten zur Behandlung von Knochenbrüchen in den USA für die Behandlung von altersbedingten Frakturen ausgegeben [12]. Die Behandlungsoptionen einer gebildeten Pseudarthrose sind sehr variabel und die Herausforderung für den Chirurgen liegt im Verständnis der zugrunde liegenden biologischen Prozesse und darauf basierend dem Einsatz der richtigen Fixationssysteme und eventuell notwendiger osteoinduktiver Substanzen [3] Einteilung der Knochenheilungsstörungen Per Definition ist die Knochenheilung verzögert, wenn nach vier Monaten noch keine Konsolidierung, also eine knöcherne Überbrückung der Fraktur eingesetzt hat [13]. Ein Kriterium für die verzögerte Heilung ist dabei, dass sich der Heilungsprozess trotzdem weiter fortsetzt [14]. Von einer Pseudarthrose wird gesprochen, wenn nach sechs bis acht Monaten keine stabile knöcherne Überbrückung nachgewiesen werden kann [15]. Der gesamte Heilungsprozess ist dabei zum Stillstand gekommen und kann nur noch durch äußere Intervention revitalisiert werden [14, 15]. Die Ursachen, die zur Ausbildung einer Pseudarthrose führen, sind vielfältig. Dabei spielen einerseits Patienten-abhängige Faktoren eine Rolle, wie das Alter, das Geschlecht, der Body-Mass-Index (BMI) sowie mögliche Begleiterkrankungen, wie Diabetes mellitus, Anämie, Osteoporose und Gefäßerkrankungen, eine Alkohlabhängigkeit oder der Nikotinabusus. Auf der anderen Seite stehen Fraktur-abhängige Parameter, wie der Frakturtyp, die Größe des Frakturspaltes, zusätzliche Traumata, die Operationstechnik, die mechanische Stabilität und das Infektionsrisiko [16]. Bereits 1982 wurde eine Klassifizierung der Pseudarthrosen anhand ihrer radiologischen Erscheinung in vitale und nicht vitale Formen durch Weber et al. [17] vorgenommen. Im Laufe der Jahre wurde diese Klassifizierung in vielen Aspekten präzisiert, bleibt aber die Basis für die Definition der Pseudarthrose. So wurde, neben der Lokalisation und der Morphologie der Fraktur [18], die Stabilität der Fixierung berücksichtigt [19] und auch die Schwere des Traumas, beziehungsweise der Grad der Verletzung mit einbezogen [20]. Verschiedene klinische Symptome, wie eine anhaltende Schwellung und das Auftreten von Schmerzen auf der ipsilateralen Seite als Antwort auf physiologische Belastung sowie die Einschränkung der Bewegungsfähigkeit, werden zur Diagnose von Pseudarthrosen herangezogen [21].

11 EINLEITUNG 3 Zu den radiologischen Anzeichen einer Pseudarthrose zählen das Fehlen der knöchernen Überbrückung zwischen den Frakturenden, ein persistierender Frakturspalt, Sklerose der Frakturenden und ein beständiger hypertropher Kallus beziehungsweise das komplette Fehlen eines Kallus um den Frakturspalt [15]. Zusätzlich können Vitalitätsnachweise mithilfe der Szintigraphie erfolgen. Bei diesem nuklearmedizinischen Verfahren werden Radionukleotide injiziert und nachverfolgt. Die Knochenszintigraphie gibt dabei Auskunft über die Durchblutung des Knochens, das Blutgefäßnetzwerk im umliegenden Gewebe und die Osteoblastenaktivität. Mithilfe dieser Parameter können Rückschlüsse auf die Vitalität des Frakturbereiches gezogen werden [22]. Durch diese Untersuchungsmethode lassen sich Pseudarthrosen mit intakter und gestörter Vitalität unterscheiden. Bei Störungen der Frakturheilung, die eine intakte Vitalität mit normaler bis erhöhter Vaskularisierung aufweisen, findet sich häufig ein hypertrophierter Kallus [13]. Nimmt mit abnehmender Vitalität auch die Kallusgröße ab, spricht man von einer oligotrophen Pseudarthrose. Die Ursache der Ausbildung einer hypertrophen/oligotrophen Pseudarthrose wird in einer unzureichenden Stabilisierung des Knochens gesehen. Eine biologisch reaktionslose und avitale Pseudarthrose wird mit einer gestörten Durchblutung in Verbindung gebracht und in drei große Gruppen eingeteilt (Abbildung 1). Durch eine Trümmerfraktur kann es zur Störung der Blutzirkulation kommen und die Frakturenden werden nekrotisch. Bei einer Defektpseudarthrose sind zwar die Frakturenden vaskularisiert, aber durch das Fehlen eines größeren Knochenstückes entsteht eine osteolytisch tote Zone. Von einer atrophen Pseudarthrose spricht man, wenn an den Knochenenden die Knochenneubildung komplett zum Stillstand gekommen ist, obwohl die Frakturenden in Kontakt stehen [23]. Vitale Pseudarthrosen Nicht vitale Pseudarthrosen Drehkeil- Defekt- Pseudarthrose hypertroph oligotroph atroph Abbildung 1: Klassifizierung der Pseudarthrosen. Die Einteilung der Pseudarthrosen in vitale und nicht vitale Formen nach Weber et al., 1982 [17] erfolgt anhand der radiologischen Erscheinung. Zu den vitalen Formen gehören der hypertrophe und der oligotrophe Phänotyp, welche sich durch die Kallusgröße unterscheiden. Zu den nicht vitalen Pseudarthrosen zählen die Trümmerfrakturen, die Defektpseudarthrosen und die atrophen Pseudarthrosen, bei denen die Knochenheilung vollständig zum Erliegen gekommen ist. Die Abbildung basiert auf der Darstellung von Weber et al. (Animationen: Servier Medical Art).

12 EINLEITUNG Die hypertrophe Pseudarthrose Das Knochenszintigramm einer hypertrophen Pseudarthrose weist eine starke Reaktion mit guter Durchblutung auf. Diese Pseudarthrose wird damit als biologisch aktiv klassifiziert [21]. Röntgenologisch zeigt sich ein hypertrophierter Kallus mit aufgetriebenen Konturen und einer fehlenden Überbrückung der Frakturzone [13]. Die Ursachen für die Ausbildung einer hypertrophen Pseudarthrose werden in einer nicht adäquaten Stabilisierung der Fraktur gesehen [15]. Durch die Instabilität der Fraktur kommt es zu einer Verstärkung der sekundären Knochenheilung mit einer endostalen und periostalen Kallusbildung [24]. Ist die Durchblutung nicht gestört, triggert die inadäquate interfragmentäre Bewegung die Bildung eines voluminösen Kallus. Mikrobewegungen bei der Heilung können dabei zu einer verbesserten Knochenheilung führen. Eine übermäßige Belastung zu den falschen Heilungszeitpunkten führt aber zur Zerstörung der neugebildeten Knochenbälkchen und Kapillaren und somit zur Nichtheilung des Knochens [25]. Aufgrund des biologischen Potentials der hypertrophen Pseudarthrose kann durch adäquate Stabilisierung die Frakturheilung vorangetrieben werden [13] Die atrophe Pseudarthrose Die klassische atrophe Pseudarthrose ist geprägt durch einen atrophierten, inerten und biologisch wenig aktiv erscheinenden Kallus. Die Frakturzone ist deutlich zu erkennen und die Kortizes zeigen eine intramedulläre knöcherne Überbauung der jeweiligen Seite, aber nicht über den Frakturspalt hinweg [21]. Durch das reduzierte biologische Potential der atrophen Pseudarthrose haben diese im Gegensatz zur hypertrophen Pseudarthrose eine deutlich schlechtere Heilungsprognose [26]. Eine inadäquate Blutversorgung wird als Hauptursache für die Ausbildung einer atrophen Pseudarthose gesehen. Aufgrund von Traumata, chirurgischen Interventionen, aber auch durch Instabilität des Knochens kann es zur Minderdurchblutung des Gewebes kommen und dies zu einer Verschlechterung der Heilung führen [15]. Allerdings wird die Annahme, dass atrophe Pseudarthrosen auch gleichzeitig avaskular sein müssen, in den letzten Jahren kontrovers diskutiert. Einige Studien zeigten, dass Biopsien von atrophen Kallussen ähnlich viele Gefäße aufweisen, wie hypertrophe Kallusproben [27, 28]. Andererseits konnte bei Patienten nach offener Fraktur mit schwerem Weichteiltrauma, welche in der Angiographie eine gestörte Blutversorgung der unteren Extremität zeigten, eine höhere Prävalenz zur Ausbildung einer Pseudarthrose nachgewiesen werden [29]. Auch in tierexperimentellen Studien konnte ein deutlicher Zusammenhang zwischen einer gestörten Vaskularisierung und der Ausbildung einer atrophen Pseudarthrose hergestellt werden [30, 31].

13 EINLEITUNG 5 Im gesunden Knochen wird die Kortikalis hauptsächlich über die Gefäße des Markraumes mit Nährstoffen versorgt. Durch eine Fraktur kommt es zur Unterbrechung der lokalen Blutversorgung. Das umliegende Muskelgewebe übernimmt dann die Blutversorgung des periostalen Kallus und auch das Periost zeigt eine erhöhte Gefäßbildung bis die physiologische Blutversorgung wieder hergestellt ist [32]. Bei Unfällen mit schwerem Weichteiltrauma und Deperiostierung ist die periostale Blutversorgung initial gestört und es kommt zu einer Minderdurchblutung der Knochenabschnitte bis hin zur Nekrose dieser Bereiche [26]. Auch operative Interventionen, wie die Weichteilablösung zur Exposition der Fraktur mit anschließender Plattenosteosynthese können zur Schädigung des Periosts und damit zur Ausbildung einer atrophen Pseudarthrose führen [23]. Bei Frakturen mit einer kritischen Defektgröße kommt es ohne Einsatz von Heilungsstimulatoren, wie autologem Knochenersatzmaterial ebenfalls zur Ausbildung einer atrophen Pseudarthrose, wobei die Frakturenden den Markraum einseitig knöchern überbrücken und der Defektbereich mit fibrösem Gewebe ausgefüllt ist [33]. Die Behandlung einer atrophen Pseudarthrose hängt von der jeweiligen Ursache und der Ausprägung der Pseudarthrose ab. In der Regel steht die Revitalisierung der Knochenenden im Vordergrund. Bei kritischen Defekten werden osteokonduktive Materialien, als Strukturgeber, wie autologer oder allogener Knochen, demineralisierte Knochenmatrix, aber auch Kalziumphosphat, Kalziumhydroxyapatit oder Kollagen-Kalziumphosphat Verbindungen in den Frakturspalt eingebracht [34]. Zusätzlich können osteoinduktive Stimulanzien die Heilung positiv beeinflussen. Dazu gehören Wachstumsfaktoren wie das Bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) [35] oder auch Zelltherapien mit mesenchymalen Stromazellen (MSC) oder osteoblastären Vorläuferzellen [36]. Eine Verbesserung der Heilung über den Einsatz biophysikalischer Verfahren, wie elektromagnetischer Felder oder niedrig-intensiver gepulster Ultraschall wurde ebenfalls in klinischen Studien getestet [37]. 1.2 Tiermodelle in der muskuloskelettalen Forschung Studien mit humanem Pseudarthrosematerial spiegeln am besten die Originalsituation wieder. Die Nachteile dieser Studien liegen einerseits in der einmaligen Biopsie des Gewebes zum Zeitpunkt der Operation, wodurch keine Aussage über den zeitlichen Verlauf getroffen werden kann. Andererseits können Patienten-abhängige Parameter wie Alter, Geschlecht und zusätzliche Erkrankungen den Heilungsverlauf negativ beeinflussen [3, 38]. Aus diesem Grund werden Tiermodelle für Longitudinalstudien spezifischer Heilungsproblematiken verwendet.

14 EINLEITUNG 6 Die Limitation bei Tierversuchen liegt in der Manipulation, die notwendig ist, um spezifische Phänotypen der verzögerten Knochenheilung zu induzieren [39]. Dabei bleibt es immer ein Modell, was der Realität nie zu hundert Prozent entsprechen kann. Für die Analyse von physiologischer und nichtphysiologischer Frakturheilung langer Röhrenknochen werden vor allem Mäuse (15%), Ratten (38%) und Kaninchen (19%) verwendet sowie als weiteren Schritt in Richtung klinischer Anwendung Großtiermodelle wie Schafe (11%), Ziegen (4%) und Hunde (9%) [40]. Dabei zeigen alle diese Tiergattungen eine ähnliche Knochenheilung wie im Menschen, allerdings unterscheiden sie sich teilweise stark in der Heilungsrate und Dominanz der einzelnen Heilungsphasen beziehungsweise deren Ausprägung. Für die Ratte ist bekannt, dass die physiologische Frakturheilung etwa vier bis fünf Wochen dauert und sich vornehmlich ein periostaler Kallus bildet, weniger aber ein medullärer Kallus [40]. Zusätzlich zeigen sich in Nagetieren Unterschiede bezüglich des Knochenaufbaus im Gegensatz zu humanem Knochengewebe. Zum einen kommt es nicht zur Verknöcherung der Wachstumsfuge im adulten Tier. Zum anderen zeigen die Knochen der Nagetiere keine Osteonstrukturen (detaillierte Beschreibung in Absatz 1.3.2) und auch der Gehalt an spongiösem Knochen in der Epiphyse der langen Röhrenknochen ist geringer ausgeprägt [41-43]. Im Laufe der letzten Jahre haben sich verschiedene Arbeitsgruppen mit der Etablierung von Tiermodellen zur Simulation humaner verzögerter Knochenheilung und Nichtheilung beschäftigt. Es gibt einige Studien, die mit kritischen Defektgrößen [44-46], Instabilität [47, 48], Periostkauterisierung [49], Induzierung einer Ischämie [50] oder systemischer Gabe von Angiogeneseinhibitoren [30, 51] gearbeitet haben. Dabei stellen kritische Defektgrößen ein robustes Modell für die Ausbildung einer Pseudarthrose im Tiermodell dar [39]. Allerdings spiegelt dieses Modell nur die klinische Situation nach Knochenverlust wider, nicht aber eine mögliche Nichtheilung der Knochen nach einer Fraktur. Ein hohes Risiko zur Ausbildung einer Pseudarthrose besteht bereits bei offenen Frakturen mit einem ausgeprägten Weichteiltrauma [52]. Im Tiermodell kann diese Art der Komplikation durch das Setzen einer offenen Osteotomie mit anschließender interner Fixierung imitiert werden. Das umliegende Gewebe wird bei dieser Methode vom Knochen abgetrennt und es kommt zu einer Exposition des Knochens nach außen. Die Vitalität des Knochengewebes wird dabei nur bedingt gestört und es bildet sich eine hypertrophe Pseudarthrose aus [53]. Für eine gezielte Analyse des Einflusses der Angiogenese auf die Knochenheilung wurden im Tiermodell die Kauterisierung des Periosts durchgeführt oder Angiogenesehemmer appliziert.

15 EINLEITUNG 7 Die Kombination aus kritischem Defekt und Periostmanipulation führt zur Ausbildung einer atrophen Pseudarthrose [54], allerdings zeigen Tierstudien mit Periostkauterisierung nach Fraktur eine verringerte Gefäßanzahl zu Beginn der Heilung aber nicht mehr nach acht Wochen [31, 55]. Eine langfristige Unterbrechung der Gefäßneubildung kann also durch die Periostkauterisierung allein nicht nachgeahmt werden. Die systemische oder lokale Applikation eines Angiogeneseinhibitors simuliert die Knochenbruchheilung bei einer anhaltenden Störung der Gefäßneubildung [30, 56], stellt aber gleichzeitig eine artifizielle Intervention dar, die so in der Klinik nicht auftritt. 1.3 Knochenanatomie und Biologie Das Knochengewebe ist eine Sonderform des straffen Bindegewebes [57]. Die Hauptaufgaben der Knochen, als Bestandteil des Skelettes, bestehen in der Fortbewegung und dem Schutz innerer Organe. Zusätzlich findet im Knochenmark die Reifung hämatopoetischer Stammzellen statt und der Knochen stellt ein Reservoir für Mineralien wie Kalzium und Phosphat dar [58]. Zusammen mit den Bändern und Gelenken bilden die Knochen den passiven Teil des Bewegungsapparates, die Skelettmuskulatur den aktiven Teil [59]. Eine Verbindung zwischen diesen beiden Teilen ist durch die Sehnen gegeben (Abbildung 2). Diese kollagenreichen Bindegewebsstrukturen sind mit den Muskelfasern verwachsen und in der Regel in Zugrichtung ausgerichtet. Über das Periost sind die Sehnen am Knochen in der Nähe zu den Gelenken verankert. Verlaufen die Sehnen über mehrere Gelenke, sind sie von Sehnenscheiden umgeben, um die Reibung zu vermindern. Als elastisches Element überträgt die Sehne die Muskelkraft auf den Knochen. Im Gegensatz dazu werden bewegliche Skelettstrukturen, wie Gelenke, von faserreiche Bindegewebsstränge überzogen, den Bändern, um eine Verbindung und Stabilisierung dieser Strukturen hervorzurufen und einer überschießenden Bewegung entgegenzuwirken [59, 60].

16 EINLEITUNG 8 Oberschenkelmuskulatur Femur Extensorsehne Patella Ligament der Patella Tibia Abbildung 2: Darstellung des Zusammenspieles von Muskeln, Sehnen, Bändern (Ligamenten) und Knochen am Beispiel des Kniegelenkes. Die Sehnen verbinden die Muskeln mit den Knochen, die Bänder verbinden zwei Knochen miteinander. Abbildung adaptiert von Servier Medical Art. Jeder Knochen unterliegt einem ständigen Auf- und Abbau. Einerseits um sich an biomechanische Kraftänderungen anzupassen, aber auch um Mikroverletzungen zu beheben oder um altes Knochengewebe zu ersetzen [61]. Die Knochenumsatzrate pro Jahr liegt bei einem Erwachsenen bei etwa 10% des gesamten Skelettes [62]. Es gibt im gesamten adulten Skelett etwa 200 Einzelknochen, die aufgrund ihrer äußeren Form in vier verschiedene Gruppen eingeteilt werden können: lange und kurze Röhrenknochen, platte Knochen und unregelmäßige Knochen [60]. Die langen Röhrenknochen setzen sich aus einem Knochenschaft, der Diaphyse, einer kegelförmigen Metaphyse unterhalb der Wachstumsfuge und einer abgerundeten Epiphyse oberhalb der Wachstumsfuge zusammen (Abbildung 3). Die Wachstumsfuge ist eine Knorpelzone, durch die das Längenwachstum des Knochens postnatal gewährleistet wird. Nach Abschluss des Wachstums verknöchert diese Schicht und wird dann als Epiphysenlinie bezeichnet [60]. Die Diaphyse besteht strukturell vornehmlich aus kortikalem Knochen (Substantia compacta), welcher das Knochenmark umschließt. Die Metaphyse und die Epiphyse setzen sich aus einem Netzwerk trabekulärer Strukturen (Substantia spongiosa) zusammen und werden nur von einer dünnen kortikalen Schicht umrandet [61].

17 EINLEITUNG 9 Der Unterschied zwischen kortikalem und spongiösem Knochen liegt in der unterschiedlichen Architektur (Abbildung 3), wodurch die mechanischen Eigenschaften verändert werden. Kortikaler Knochen bietet durch seine dichte Anordnung eine höhere Resistenz gegen Torsionsund Biegekraft, während der spongiöse Knochen eine höhere Elastizität und Schockresistenz aufweist [57]. Spongiöser Knochen ist zudem metabolisch aktiver und hat eine höhere Knochenumsatzrate als kortikaler Knochen [63]. Epiphyse Metaphyse Periost Endost Spongiöser Knochen Diaphyse Wachstumsfuge Knochenmarkhöhle Kortikaler Knochen Wachstumsfuge Metaphyse Epiphyse Abbildung 3: Aufbau eines langen Röhrenknochens. 3D-Mikro-Computertomographische Darstellung einer Maustibia in der Sagittalebene halbiert mit Vergrößerungen des spongiösen Knochens der Metaphyse und des kortikalen Knochens der Diaphyse in der horizontalen Schnittebene. µct Bilder aus Sugiyama et al. [64]. Das Periost, die Knochenhaut, überzieht den gesamten Knochen mit Ausnahme von überknorpelten Gelenkflächen und Sehnenansätzen [60, 65]. Es setzt sich aus zwei Schichten zusammen. Die äußere Schicht, das Stratum fibrosum, besteht vornehmlich aus Typ I Kollagenfasern und Fibroblasten und dient als Verbindungsstelle zu Sehnen, Bändern und Kapseln [66]. Die innere Schicht, die Kambriumschicht, enthält zahlreiche Blutgefäße und Nervenfasern. Zusätzlich dient sie als Reservoir für Osteoblasten-Vorläuferzellen, die zur Knochenbildung beitragen [66]. Mit zunehmendem Alter nimmt die Kambriumschicht immer weiter ab und damit auch die osteogene Kapazität des Knochens, also die Fähigkeit neuen Knochen aufzubauen [67].

18 EINLEITUNG 10 Die Innenseite der Substantia compacta sowie die Trabekel der Substantia spongiosa werden von einer ähnlichen Struktur überzogen, dem Endost. Es handelt sich dabei um eine dünne zellreiche Schicht, die genauso wie das Periost von Blutgefäßen und Nervenfasern durchzogen ist und das Knochengewebe vom Knochenmark abgrenzt. Zusätzlich kleidet es die Havers- und Volkmann- Kanäle aus [60]. Auch die Zellen im Endost tragen zur Knochenbildung bei. Sowohl die Blutgefäße des Periost als auch des Endost sind für die Versorgung des Knochens über die Volkmann-Kanäle verantwortlich [66]. Im Inneren des Knochenschafts befindet sich die Markhöhle (Cavum medullare), die das Knochenmark (Medulla ossium) beherbergt. Das Knochenmark ist das wichtigste blutbildende Organ im Körper [68]. Es wird das rote hämatopoetische Knochenmark vom inaktiven gelben Fettmark unterschieden. Aus den hämatopoetischen Stammzellen differenzieren sich alle Zellen der Blutzelllinien, dazu gehören die Erythrozyten, die Granulozyten, die Lymphozyten, die Thrombozyten und die Monozyten [69]. Für die Hämatopoese ist eine bestimmte Mikroumgebung (Nische) erforderlich, wobei umliegende Zellen Zytokine und extrazelluläre Matrix produzieren, um die Proliferation und Differenzierung hämatopoetischer Stammzellen zu stimulieren. Dazu gehören MSCs, Endothelzellen, Adipozyten, Makrophagen und Bone lining cells [68] Arten von Knochengeweben Man unterscheidet zwei Arten von Knochengeweben, aufgrund ihrer Morphologie, Entstehung und Funktion: den Geflechtknochen und den Lamellenknochen [70]. Der Geflechtknochen besitzt viermal so viele Osteozyten pro Volumeneinheit und hat eine sehr viel schnellere Knochenumsatzrate verglichen mit dem Lamellenknochen. Strukturell ist dieser Knochentyp geprägt durch eine unregelmäßige, eher zufällige Anordnung von Kollagenfasern, Osteozyten und einem unregelmäßigen Mineralisierungsmuster. Im Lamellenknochen liegen die Kollagenfasern als parallel angeordnete Bündel zusammen und bilden Lamellen mit einer durchschnittlichen Dicke von 4 bis 12 µm mit uniformer Verteilung der Mineralkristalle und Osteozyten aus. Das hat zur Folge, dass Lamellenknochen wesentlich starrer ist als Geflechtknochen und sich weniger verbiegen lässt [67]. Während der Embryonalentwicklung besteht das Skelett zunächst vollständig aus Geflechtknochen, welcher resorbiert und anschließend durch lamellären Knochen ersetzt wird. Der gleiche Mechanismus läuft auch nach einer Fraktur des Knochens ab. Ein kleiner Anteil an Geflechtknochen ist ständiger Bestandteil von Sehnen- und Bänderansätzen, der Schädelnähte sowie die Gehörknöchelchen im Ohr. Zusätzlich besteht die Wachstumszone der langen Knochen aus Geflechtknochen [67].

19 EINLEITUNG Mikroskopischer Knochenaufbau Aufbau des kortikalen Lamellenknochens Die Interzellularsubstanz des kortikalen Knochens bilden Lamellen, in denen dicht gepackte Kollagenfasern parallel zueinander angeordnet sind und die Knochenzellen, die Osteozyten, dazwischen eingelagert vorliegen. Insgesamt werden drei verschiedene Arten von Lamellen aufgrund ihrer Form und Funktion unterschieden: die Speziallamellen (Lamellae osteoni), die Schaltlamellen (Lamellae interstitiales) und die Grundlamellen [65, 67] (Abbildung 4). Die Speziallamellen liegen konzentrisch angeordnet um einen Zentralkanal, dem Havers Kanal, der sowohl ein bis zwei Blutgefäße als auch Lymphgefäße und manchmal Nervenfasern beinhaltet [60]. Zusammen mit den Speziallamellen bildet dieser Kanal die funktionelle Grundeinheit des Lamellenknochens und wird auch als Havers System oder Osteon bezeichnet. Die Ausrichtung der Osteone ist abhängig von den wirkenden Druck- und Zugkräften und auch der Steigungswinkel der Lamellen ist belastungsabhängig [66]. Im Durchschnitt sind die Osteone einige Zentimeter in der Länge und µm im Durchmesser [67]. Untereinander sind die Osteone durch sogenannte Volkmann-Kanäle miteinander verbunden und versorgen so die gesamte Kompakta mit Nährstoffen. Zwischen zwei Lamellen liegen die Osteozyten in Lakunen der Knochenmatrix eingebettet. Durch kleine Fortsätze, Kanalikuli, sind die Knochenzellen miteinander verbunden [71]. Die Räume zwischen den Osteonen sind mit Schaltlamellen ausgefüllt [60]. Hierbei handelt es sich um Abbaurückstände alter Osteone [71]. Die Grund- oder Generallamellen befinden sich am Rand der Kompakta unterhalb des Periost sowie im inneren Bereich zur Markhöhle hin [60]. Der humane kortikale Knochen durchläuft kontinuierliche Remodellierungsprozesse sowohl während der Entwicklung als auch nach Beendigung des Knochenwachstums. Dabei bauen Osteoklasten den Knochen tunnelartig ab, während der Knochen durch sich anlagernde Osteoblasten schichtartig neugebildet wird. So entstehen neue Osteone. Bei Mäusen und Ratten ist das Knochenwachstum hingegen geprägt durch appositionelles Wachstum des Lamellenknochens auf der periostalen Knochenoberfläche und Resorption des Knochenmaterials endostal. Die kontinuierliche Remodellierung der Kortikalis, wie sie beim Menschen zu beobachten ist, tritt bei Mäusen und Ratten fast nicht auf. In adulten Tieren bilden sich im Alter allerdings große mit Knochenmark-gefüllte intrakortikale Poren aus [72].

20 EINLEITUNG 12 Osteozyt Lakune Kanalikuli Speziallamellen Osteon Schaltlamellen Blutgefäße Lympfgefäße Grundlamellen Periost: fibröse Schicht osteoblastäre Schicht Haverskanal Volkmann-Kanal Periostale Vene Periostale Arterie Knochenmarkhöhle Trabekel Geflechtknochen Kompakter Knochen Abbildung 4: Schematischer Aufbau des kortikalen Knochens. Das Osteon, die Grundeinheit des kortikalen Knochens, besteht aus Lamellen, die konzentrisch um einen Havers-Kanal angeordnet sind. Die Lamellen setzen sich aus den Osteozyten und der umgebenen extrazellulären Matrix reich an Kollagenfasern zusammen. Die Nährstoffversorgung der Osteozyten findet über kleine Zellausläufer, den Kanalikuli, statt. Die Abbildung wurde adaptiert nach John Wiley and Sons Inc. Zelluläre Zusammensetzung Zu den knochenaufbauenden Zellen gehören die Osteoblasten, die Osteozyten und die Bone lining cells (Abbildung 5). Sie differenzieren sich aus den mesenchymalen Stromazellen (MSCs). Diese multipotenten Zellen kommen sowohl im Knochenmark als auch im Endost und im Periost vor und sind in der Lage je nach Umgebungsbedingung und Stimuli in osteoblastäre, chondrozytäre, fibroblastäre und auch in adipozytäre Vorläuferzellen zu differenzieren [61]. Bei der Reifung der präosteoblastären Zellen zu Osteoblasten wird die Zellproliferation gestoppt und die Zellen ändern ihren Phänotyp von spindelförmig zu einem charakteristischen ziegelsteinförmigen Aussehen mit großem Zellkern [57]. Dieser Zelltyp befindet sich enggepackt auf der Oberfläche des Knochens und synthetisiert die organische Matrix, das Osteoid, des Knochens. Die Weiterentwicklung der Osteoblasten kann in drei verschiedene Richtungen stattfinden: 1) entweder bleiben sie als aktive Osteoblasten auf der Knochenoberfläche erhalten, 2) sie werden von der extrazellulären Matrix eingeschlossen und werden zu Osteozyten oder 3) sie flachen ab und werden zu Bone lining cells auf der Oberfläche des ausgereiften Knochens [57]. Bone lining cells dienen als Barriere zwischen extrazellulären Fluiden und dem Knochen, fördern aber auch den Abbau des Knochens, indem Bindungsstellen für Osteoklasten an definierten Stellen der Knochenoberfläche frei gemacht werden [67].

21 EINLEITUNG 13 Der dritte Zelltyp, der Osteozyt, macht etwa 90% der Knochenzellen aus. Osteozyten haben ebenfalls eine eher abgeflachte Form und sind in Lakunen eingebettet. Durch Kanalikuli in der Knochenmatrix stehen die Zellen über ihre zytoplasmatischen Ausläufer in Verbindung. Dadurch kommt es zum Austausch von Nährstoffen zwischen den Zellen und dem Blutsystem sowie zur Kommunikation zwischen den Zellen. Dieses Zellnetzwerk agiert sensibel auf mechanische Deformationen und steuert somit den koordinierten Aufbau und die Resorption des Knochens [67]. Hämatopoetische Stammzelle Mesenchymale Stromazelle Osteoklast Osteoklastäre Vorläuferzellen Osteoblastäre Vorläuferzellen Osteoblasten Osteoid Osteozyten Mineralisierte Knochenmatrix Abbildung 5: Graphische Darstellung der am Knochenauf- und abbau beteiligten Zellen. Mesenchymale Stromazellen differenzieren zu osteoblastären Vorläuferzellen, die dann entweder als ziegelförmige Osteoblasten das Osteoid ausbilden, die Knochenoberfläche als abgeflachte Bone lining cells überziehen oder eingemauert als Osteozyten im Knocheninneren vorliegen. Der Knochenabbau wird durch mehrkernige Osteoklasten realisiert, die sich aus den hämatopoetischen Stammzellen differenzieren. Die Zeichnung wurde nach dem Vorbild von Downey et al. [57] angefertigt (Animationen: Servier Medical Art). Die knochenabbauenden Zellen werden als Osteoklasten bezeichnet und entstehen aus hämatopoetischen Stammzellen. Diese Stammzellen differenzieren zu Osteoklasten- Vorläuferzellen, proliferieren und fusionieren dann zu einem großen mehrkernigen Osteoklasten [73]. Durch Integrine binden Osteoklasten an die Knochenoberfläche und bilden einen Bürstensaum in Richtung Knochen aus. Die Knochendegradation wird durch die Bildung einer resorptiven, sauren Mikroumgebung zwischen Osteoklast und Knochen sowie durch die Sekretion von Cathepsin K generiert [74]. Es entstehen flächige Ausbuchtungen in der Knochenmatrix, sogenannte Resorptionslakunen oder auch Howship-Lakunen genannt, in denen sich Osteoblasten anlagern und neuen Knochen aufbauen können [75].

22 EINLEITUNG 14 Zusammensetzung der extrazellulären Knochenmatrix (EZM) Die Knochenmatrix macht etwa 90% des Gesamtvolumens des Knochens aus und besteht zu 65% aus einer festen mineralischen Phase (anorganische Matrix), zu etwa 20% aus organischem Material, zu 5 bis 10% aus Wasser und weniger als 3% aus Lipiden [61, 67]. Die organische Matrix ist für die Formgebung des Knochens verantwortlich und setzt der auftretenden Spannung im Knochen Widerstand entgegen. Das Knochenmineral hingegen dient der Kompressionsresistenz. Knochen, die demineralisiert werden, behalten ihre Form, können aber flexibel verbogen werden, ohne zu brechen. Die Entfernung der organischen Komponente würde zu einer sehr porösen und frakturanfälligen Struktur führen [67]. Eine wichtige Aufgabe der anorganischen Matrix ist die Speicherfunktion lebenswichtiger Mineralien. Etwa 99% des körpereigenen Bedarfes an Kalzium, 85% an Phosphor und 40-60% an Natrium und Magnesium werden über die Knochenmineralkristalle abgedeckt. Der Hauptbestandteil ist dabei Kalziumhydroxyapatit, [Ca 5(PO 4) 3OH] ein Kristall aus Kalzium und Phosphat [57, 61, 67]. Die organische Matrix besteht zu 90% aus Kollagenfasern, hauptsächlich Kollagen Typ I, aber auch in kleinen Mengen Typ V, VI, VII und XII [57]. Die restlichen 10% der Proteine sind nicht-kollagene Glykoproteine und knochenspezifische Proteoglykane [66, 67]. Die Alkalische Phosphatase stellt dabei das hauptsächliche Protein im Knochen dar und kommt gebunden an Osteoblasten, aber auch frei in der mineralisierten Matrix vor [61]. Weitere wichtige Proteine sind Osteonektin, Osteopontin, Tetranectin und Bone sialoprotein. Bone sialoprotein und Osteopontin binden dabei das Hydroxyapatit im Knochen. Zu den Proteoglykanen gehören Dekorin, Biglycan, Osteokalzin und Matrix-GLA-Protein (Vitamin K-dependent carboxylation/gamma-carboxyglutamic protein). Zusätzlich befinden sich Wachstumsfaktoren und proteolytische Proteine (Metalloproteinasen) sowie ihre Inhibitoren gebunden in der extrazellulären Matrix [76]. Somit hat die extrazelluläre Matrix des Knochens nicht nur stützende Funktion, sondern auch direkten Einfluss auf die Funktion und Differenzierung der Knochenzellen [77]. Mineralisierung der extrazellulären Matrix Das in den Osteoblasten gebildete Hydroxyapatit wird über Matrixvesikel, extrazelluläre membrangebundene Strukturen, in das umliegende Osteoid abgegeben. Durch das Wachsen der Kristalle kommt es zum Zerreißen der Vesikelmembran und zur Ablagerung der Kristalle zwischen den Faserfibrillen, bis dieser Raum ausfüllt ist [67]. Dieser Prozess spielt sich vornehmlich in der Kalzifikationslinie des Osteoids ab. Dabei regulieren Kalzium- und Phosphatbindende Proteine, wie die Alkalische Phosphatase, Osteokalzin und Matrix-GLA-Protein, die geordnete Ablagerung sowie die Menge an Hydroxyapatitkristallen und deren Größe [61].

23 EINLEITUNG 15 Blutversorgung Die Arteria nutrica, die im Knochenmark verläuft, versorgt über Gefäßverzweigungen das umliegende Knochengewebe bis hin zum Periost. Über kleine periostale Arteriolen wird zusätzlich die äußere kortikale Schicht an Muskelansätzen mit Blut versorgt. Der Abfluss erfolgt über weitlumige venöse Sinusse [78]. Das mittlere Gefäßsystem der Substantia compacta umfasst die Havers-Gefäße, welche vertikal im Zentrum der Osteone verlaufen und die Volkmann-Gefäße, die im rechten Winkel dazu liegen und am Periost beginnen [70]. Die Organisation in Gefäßkanälen sorgt dafür, dass keine Zelle weiter als 300 µm vom nächsten Gefäß entfernt ist und über ihre Fortsätze die Blutgefäße erreichen kann [67]. 1.4 Knochenheilung Während der Knochenheilung wird der Prozess der Knochenentwicklung rekapituliert [79] und im Gegensatz zum Knorpel und den meisten anderen Geweben besitzt Knochengewebe die Fähigkeit der vollständigen Regeneration [80]. Man unterscheidet die primäre, direkte Knochenheilung, und die sekundäre indirekte Knochenheilung. Bei der primären Knochenheilung wird der Frakturspalt direkt, ohne Zwischenstufe einer Kallusbildung, überbrückt. Sobald kein direkter Kontakt zwischen den beiden Kortikalisenden besteht und die Stabilität vermindert ist, kommt es zur sekundären Knochenheilung [81]. Die Mehrheit aller Frakturen heilen über diese indirekte Knochenheilung [82], welche sich in fünf Phasen unterteilen lässt: 1. Hämatombildung, 2. Inflammationsphase, 3. Ausbildung eines weichen Kallus, 4. Ossifikation und 5. Remodellierung (Abbildung 6).

24 EINLEITUNG 16 Stadien der Knochenheilung 1. Hämatom Biologische Prozesse Umschließen des Frakturspaltes mit Hämatom Rekrutierung von Immunzellen und MSC Molekulare Regulatoren IL-1, IL-6 TNF-α RANKL & M-CSF OPG 2. Inflammation BMP-2 TGF-β GDF-8 3. Weicher Kallus Chondrogenese in Spaltnähe Intramembranöse Ossifikation von der Peripherie ausgehend Vaskulogenese und Angiogenese TGF-β2, -β3 GDF-5 BMP-5, -6 VEGFs Angiopoietin-1, Ossifikation Hypertrophe Chondrozyten Knorpelresorption Angiogenese Kallus besteht vorwiegend aus Geflechtknochen VEGFs Angiopoietine BMP-3, -4, -7, Remodellierung Osteoklastenaktivität Remodellierung des Geflechtknochens zu Lamellenknochen Entstehung des Knochenmarks IL-1, IL-6 TNF-α RANKL & M-CSF Abbildung 6: Stadien der Knochenheilung. Die sekundäre Knochenheilung kann in fünf Phasen anhand der ablaufenden biologischen Prozesse eingeteilt werden. Nachdem sich ein Hämatom um den Frakturspalt gebildet hat, werden Immunzellen und mesenchymale Stromazellen (MSCs) rekrutiert. Diese MSCs differenzieren zu Chondrozyten und bilden den weichen Kallus um den Frakturspalt aus oder sie differenzieren zu Osteoblasten und bewirken die intramembranöse Ossifikation. Der weiche Kallus wird in der vierten Phase resorbiert und von Blutgefäßen durchzogen. Am Ende der Heilung kommt es zur Remodellierung des Kallusgewebes zu Lamellenknochen. Die Abbildung basiert auf der Vorlage von Lauzon et al [83] und Informationen aus Ai-Aql et al., 2008 [84]. Animationen adaptiert von Servier Medical Art. Jede Phase ist durch die Ausbildung bestimmter Gewebearten, einer unterschiedlichen Zellzusammensetzung sowie der Expression verschiedener Faktoren, die den Heilungsprozess steuern, charakterisiert. Nach einem Trauma kommt es durch die Zerstörung von Blutgefäßen, die die Frakturlinie durchkreuzen, zur Einblutung in den Frakturspalt. Das Blut koaguliert zu einem Hämatom, was den Frakturbereich umschließt. Es kommt zu einer akuten inflammatorischen Reaktion, wobei Zellen des peripheren und intramedullären Blutes sowie Knochenmarkzellen Zytokine sekretieren und dadurch Immunzellen wie Monozyten, Makrophagen, Lymphozyten, und Leukozyten, aber auch Fibroblasten und MSC zur Frakturstelle rekrutiert werden [81, 85]. Das Hämatom wird reorganisiert zu fibrinreichem Granulationsgewebe, was die Revaskularisierung fördert. Die rekrutierten MSCs sind in der Lage zu proliferieren und sich sowohl in die osteogene als auch in die chondrogene Richtung zu differenzieren.

25 EINLEITUNG 17 Zu Beginn der Heilung entwickelt sich ein extraossäres Blutversorgungssystem vom umliegenden Gewebe ausgehend, was die Blutversorgung des externen Kallus zunächst vollständig übernimmt, bis sich das Gefäßsystem im Knochen und Knochenmark neugebildet hat [86]. Die zweite Phase der Knochenheilung ist einerseits geprägt durch die Bildung von knorpeligem Gewebe, welches den Frakturspalt überbrückt und anderseits durch intramembranöse Knochenbildung in spaltfernen stabilen Kallusbereichen. Von einer intramembranösen Ossifikation wird gesprochen, wenn MSCs aus dem Periost direkt zu Osteoblasten differenzieren ohne eine Zwischenstufe der Chondrogenese zu durchlaufen. Die Osteoblasten bilden dann das Osteoid aus und durch Mineralisierung kommt es zur Geflechtknochenbildung. Dadurch entsteht der sogenannte harte Kallus [85]. In spaltnahen und sauerstoffarmen Kallusbereichen differenzieren die MSCs zu Chondrozyten, welche zunächst stark proliferieren und eine extrazelluläre Matrix reich an Kollagen II und Aggrekan produzieren. Es entsteht der weiche Kallus. Dies führt im Zentrum jeder Knorpelinsel zum Zellzyklusarrest einiger Chondrozyten und zur hypertrophen Differenzierung, wobei die Chondrozyten ihr Lumen vergrößern, terminal differenzieren und absterben [87]. Die verbleibende Knorpelmatrix wird durch Sekretion von Proteasen abgebaut und verkalkt durch die Einlagerung von Mineralsalzen. Sie dient gleichzeigt als strukturführendes Element für die Gefäßeinsprossung, wodurch Chondroklasten für den weiteren Knorpelmatrixabbau und MSCs für den Knochenaufbau rekrutiert werden. Dabei stammen die Kapillaren aus periostalen Kallusregionen mit neugebildetem Knochen [88]. Am Ende der 4. Phase besteht der weiche Kallus ebenfalls aus Geflechtknochen. Während der Remodellierungsphase wird dann der Geflechtknochen über Osteoklasten resorbiert und in Lamellenknochen umgebaut [85]. Dabei bauen die Osteoklasten den alten Knochen tunnelförmig ab. Im nächsten Schritt sprießen Blutgefäße ein und Osteoblasten lagern sich als eine dünne Schicht an die Tunnelwand und bilden den lamellären Knochen des neuen Osteons aus. Dieser Prozess ist vergleichbar mit den ständigen Umbauprozessen im normalen Skelett [89]. Die extrazelluläre Matrix durchläuft während der Frakturheilung ebenfalls mehrere Umbauprozesse. So besteht ein Großteil der extrazellulären Matrix während der Inflammationsphase aus Kollagen Typ III. Kollagen Typ I kommt dagegen in der Knochenmatrix vermehrt vor. Bei der Chondrogenese ist die Bildung von Kollagen Typ II sowie Typ IX und Aggrekan typisch. Hypertrophe Chondrozyten hingegen bilden vornehmlich Kollagen Typ X aus [90].

26 EINLEITUNG Molekulare Aspekte der Knochenheilung Inflammationsstimuli Während der frühen Phase der Knochenheilung werden inflammatorische Zytokine und Wachstumsfaktoren wie Interleukin-1a (IL-1a), IL-1b und IL-6 sowie der Tumornekrosefaktor alpha (TNF-α) freigesetzt, um weitere inflammatorische Zellen zu rekrutieren, die Synthese der EZM zu erhöhen und die Angiogenese zu initiieren. Zusätzlich werden MSCs zur Frakturstelle gelockt und die Proliferation und Differenzierung in die osteogene und chondrogene Richtung stimuliert. Die Sekretion der Zytokine erfolgt über Makrophagen, Immunzellen und MSCs innerhalb der ersten 24 Stunden bis maximal drei Tagen [84]. Während der Remodellierungsphase des Knochens spielen diese Faktoren wieder eine Rolle. IL-1 und IL-6 sind in dem Prozess der sekundären Knochenbildung involviert, während TNF-α zur Apoptose hypertropher Chondrozyten während der enchondralen Ossifikation führt [82]. Weitere Faktoren, die sowohl in der initialen Heilungsphase als auch während der Knochenremodellierung eine wichtige Rolle spielen, sind der Receptor activator of NF-κB ligand (RANKL), Osteoprotegrin (OPG) und der Monozytenkolonie-stimulierender Faktor (M-CSF) [84]. Dabei reguliert RANKL die zelluläre Interaktion zwischen Osteoblasten und Osteoklasten und stimuliert durch Bindung an den Rezeptor RANK die Differenzierung präosteoklastärer Zellen sowie die Aktivität von Osteoklasten. RANKL sowie OPG werden vornehmlich von Osteoblasten während der Knochenheilung sekretiert [91, 92]. OPG führt als Antagonist von RANKL zur Verminderung der Knochenresorption [93] und ein gestörtes Gleichgewicht dieser Faktoren wurde mit Osteoporose, dem Knochenschwund, in Verbindung gebracht [94]. Der Faktor M-CSF zeigt sich genau wie RANKL während der Resorption des mineralisierten Knorpels sowie während der Umbauprozesse zum Lamellenknochen erhöht exprimiert [79] Osteogenesefaktoren Die Komplexität der Knochenheilung basiert auf einem koordinierten Zusammenspiel vieler Faktoren und Signalwege. Dazu gehören unter anderem die Wachstums- und Differenzierungsfaktoren der TGF-β Superfamilie, der kanonische und nicht- kanonische WNT- Signalweg, das Indian Hedgehog-Protein (IHH), Fibroblasten-Wachstumsfaktoren, Notch, hormonelle Regulationsprozesse z. Bsp. über das Parathormon (PTH), aber auch die EZM auf- und abbauenden Proteine [79, 95]. Dabei sind die am intensivsten untersuchten Faktoren in der Skelettogenese und der Frakturheilung Mitglieder der TGF-β-Superfamilie [79].