2.1 Die Entstehung des Gehirns aus neuralen Stammzellen Transkriptionsfaktoren in der Gehirnentwicklung...16

Transkript

1 Inhaltsverzeichnis Danksagung...3 Inhaltsverzeichnis...5 Abkürzungverzeichnis Zielsetzung Einleitung Die Entstehung des Gehirns aus neuralen Stammzellen Radiale Gliazellen Transkriptionsfaktoren in der Gehirnentwicklung Pax Emx Otx Tlx Die extrazelluläre Matrix Tenascin C Tenascin C in der Entwicklung Tenascin C in Stammzellnischen Tenascin C Funktionen Tnc-Rezeptoren und -Interaktionen Tenascin C vermittelt Neuron-Glia-Interaktionen Die Bedeutung der Tenascin C Isoformen Regulation der Tenascin C Expression durch Transkriptionsfaktoren Regulation der Tenascin C Expression durch Wachstumsfaktoren...35

2 3 Material Chemikalien Lösungen und Puffer Geräte Verbrauchsmaterialien Kits und Anwendungssysteme Enzyme Oligonukleotide Primer Sonden Bakterienstämme Plasmide Antikörper Primäre Antikörper Sekundäre Antikörper und Kopplungsgruppen Methoden Tiere NMRI-Mäuse Small eye-mäuse Gewebepräparationen von Embryonen Zellkulturen Beschichtungen Kultur neuraler Stammzellen als Neurosphären Passagieren von Neurosphären Quantifizierung des Neurosphären-Wachstums Behandlung von Neurosphären-Kulturen mit unterschiedlichen Wachstumsfaktoren...62

3 4.3.6 BrdU-Inkorporation von Neurosphären-Zellen Differenzierung von Neurosphären-Zellen Kulturen neuraler Stammzellen als adhärente Monoschicht Ausbildung von funktionellen radialen Gliazellen aus Neurosphären-Kulturen Transfektion von neuralen Stammzellen mittels Nukleofektion Analyse der von der Transfektion betroffenen Zelltypen Kultur der astrozytären Zelllinie A Kultur primärer embryonaler Maus-Fibroblasten Transfektion von primären Fibroblasten und A7-Zellen Molekularbiologische Methoden Isolierung von RNA aus Gewebe oder Zellkulturen Bestimmung der Nukleinsäurekonzentration Erststrangsynthese von cdna ausgehend von einer RNA-Matrize Polymerase-Kettenreaktion (PCR) PCR mit Korrekturleseaktivität Agarose-Gelelektrophorese DNA-Isolierung aus Agarosegelen DNA-Aufreinigung aus PCR- oder Restriktionsansätzen TOPO-TA-Klonierung von PCR-Produkten Direkte Lyse von Bakterien Minipräparation Midipräparation Anlegen von Bakterien-Stockkulturen Restriktionsverdau mit TypII-Restriktionsendonukleasen Sequenzierungen...72

4 Ligation von DNA-Fragmenten Klonierung von Expressionsvektoren für verschiedene Transkriptionsfaktoren Ermittlung der Kombinatorik alternativ gespleißter FNIII-Domänen von Tenascin C Dot Blots Hybridisierung mit FNIII-dömanenspezifischen Sonden Detektion von Fluorescein (FITC)-gekoppelten Sonden Domänenspezifische PCR Proteinbiochemie Lyse von Zell- oder Gewebeproben und Bestimmung der Proteinkonzentration SDS-PAGE Western Blot Immunologischer Nachweis von Proteinen auf Western Blot- Membranen Immuncytochemie Anwendung der Antikörper Immuncytochemische Färbungen Anfertigung von Kryoschnitten für histochemische Untersuchungen oder in situ Hybridisierungen Hämatoxylin-Eosin-Färbung Immunhistochemie In situ Hybridisierung Herstellung spezifischer Sonden durch in vitro Transkription Durchführung der in situ Hybridisierung Mikroskopie...87

5 4.13 Chromatinimmunpräzipitation Ergebnisse Die Expression von Tenascin C während der Entwicklung des Gehirns Untersuchungen am Gewebe mittels in situ Hybridisierungen und immunhistochemischen Färbungen Untersuchungen mittels RT-PCR und Western Blots Die Expression von Tenascin C bei Pax6-defizienten Mäusen Kulturen neuraler Stammzellen zur Untersuchung von Stammzelleigenschaften Regulation der Tenascin C Expression durch Wachstumsfaktoren Kulturen neuraler Stammzellen aus pax6-defizientem Gewebe Expression von Tenascin C bei Neurosphären aus pax6-defizientem Gewebe Transfektion neuraler Stammzellen mit Expressionsplasmiden für verschiedene Transkriptionsfaktoren Nachweis der erfolgreichen Überexpression von Transkriptionsfaktoren nach Nukleofektion Auswirkungen der Überexpression von Vorderhirn- Transkriptionsfaktoren in neuralen Stammzellen auf die Expression von Tenascin C Durch eine Überexpression von pax6 in neuralen Stammzellen wird die Expression großer Tnc-Isoformen stimuliert Auch otx2 stimuliert die Expression großer Tnc-Isoformen, tlx und emx2 haben keinen Einfluss Die Regulation von Tenascin C durch pax6 ist spezifisch für neurale Stammzellen Chromatinimmunpräzipitation zeigt die Bindung von pax6 and den Tenascin C-Promotor im embryonalen Cortex...137

6 5.12 Ausbildung funktioneller radialer Gliazellen aus Neurosphären In neuralen Stamm-/Vorläuferzellen werden 20 verschiedene Isoformen von Tenascin C exprimiert Auswirkungen einer pax6-überexpression auf Rezeptoren für Tenascin C Diskussion Die Expression von Tnc durch radiale Gliazellen und in Bereichen aktiver Zellmigration Die Regulation von Tnc durch die Wachstumsfaktoren EGF, bfgf und TGFß1 in Kulturen neuraler Stammzellen Durch pax6 wird die Bildung von Neuronen aus neuralen Vorläuferzellen gesteuert Tenascin C ist ein alternativ gespleißtes Molekül und seine Spleißvarianten werden differenziell exprimiert und reguliert Die Wanderungsgeschwindigkeit von Neuronen entlang radialer Gliazellfasern ist langsamer bei sey-neurosphären Modell zur Regulation von Tnc durch pax6 in radialen Gliazellen In neuralen Stamm-/Vorläuferzellen werden 20 verschiedene Isoformen von Tnc exprimiert Der Tnc-Interaktionspartner ITGα7 wird von pax6 reguliert Zusammenfassung der Genregulation von Tenascin C durch Transkriptionsfaktoren und Wachstumsfaktoren Zusammenfassung Literaturverzeichnis Anhang Vektorkarten Eukaryotisches Expressionsplasmid für pax HisB-IRES-GFP Plasmide...206

7 9.2 Sequenzen kodierende Tenascin C Sequenz untranslatierte Region 5000bp von Exon 1 der Tnc-Sequenz Ergebnis der TRANSFAC-Datenbankanalyse zu möglichen Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren innerhalb der 5000bp umfassenden 5 -untranslatierten Region von Tnc...218