Einige wichtige Methoden zur Untersuchung Elektrophorese Zentrifugation 42

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1 Inhaltsverzeichnis Teil 1 Grundlagen 1 Lebensformen: Zellen mit und ohne Kern Einleitung Eukaryoten Prokaryoten 26 Literatur DNA: Träger der genetischen Information Einige wichtige Methoden zur Untersuchung von DNA 41 Bausteine: Nudeotide. 9Q Elektrophorese Zentrifugation 42 Der Sedimentationskoeffizient oder S-Wert DNA-Helices: Flexibilität. 32 Isopyknische oder Gleichgewichtszentrifugation Elektronenmikroskopie Enzyme als Hilfsmittel: Deoxyribonucleasen 46 Natürliche DNA-Moleküle 37 Endonucleasen, Exonucleasen 46 Restriktionsendonucleasen 46 DNA-Ringe: Helix und Superhelix 39 Literatur 49 RNA: Überträger und Regulator der genetischen Information 51 Gunter Meister 3.1 Einleitung Zelluläre Funktionen von RNAs Aufbau und räumliche Faltung von RNA-Molekülen Literatur RNA-Klassen Proteine: Funktionsträger der Zelle Einleitung Tertiärstruktur: komplexere Faltung der Aminosäurekette Primärstruktur: Sequenz der Aminosäuren Proteindomänen Aminosäuren Peptidbindung Wechselwirkungen zwischen Aminosäureseitenketten Quartärstruktur: Aufbau aus Untereinheiten Proteinfaltung Sekundärstruktur: a-helix und ß-Faltblatt Literatur a-helix, ß-Faltblatt 61

2 Transkription, Translation und der genetische Code Einleitung 5.2 Transkription: die Synthese von RNA RNA-Polymerase Genanfang: der Promotor Ereignisse am Promotor Elongation der RNA-Kette... Termination Stabile und nicht stabile RNA Ribosomen: eine kurze Beschreibung Proteinsynthese: Genauigkeit des Starts Initiation der Translation Elongation: die programmierte Verknüp 69 fung von Aminosäuren Termination der Translation Geschwindigkeit und Genauigkeit der 73 Translation Besonderheiten der Translation bei Bakte 75 rien Transfer-RNA (trna) und die Aktivierung von Aminosäuren Struktur der trna.. Beladung der trna. Translation: Ribosomen und Proteinsynthese Der genetische Code Rückblicke Codewörter Wobble" bei der Erkennung von Codon und Anticodon Der genetische Code in der Zelle Selenocystein und Pyrrolysin Verwendung von Codewörtern 96 Literatur 97 Escherichia coli und der Bakteriophage Lambda: Gene und Genexpression Einleitung Exkurs: Bakteriophagen Vermehrung von Bakterien Ausblick Die DNA als Nucleoid Nudeoidassoziierte Proteine Organisation bakterieller DNA Das Genom Die biologische Genkarte und das F-Plasmid F-Plasmide Konjugation und Genkartierung 6.3 Grundlagen bakterieller Genregulation Regulons: Gengruppen unter gemeinsamer Kontrolle III Beispiel: Hitzeschock-Gene III Alternative o-fa ktoren 113 Stringente Kontrolle Negative und positive Genregulation: das (ac-operon als Bezugssystem 118 Die Genprodukte 118 Mutanten mit veränderter Genregulation 119 Das Jacob-Monod-Modell 120 Der Lac-Repressor Positive Regulation: das CRP-Protein Der Bakteriophage Lambda und seine 101 Gene Das Lambda-Genom Proteincodierende Gene 105 Kontrollelemente 108 Integration und Exzision Expression der Lambda-Gene Frühe Transkription Entscheidung zwischen Lyse und Lysogenie... Der Cll-Aktivator Der Lambda-Repressor Transkription des int-gens Induktion und lytischer Infektionsweg Wege der Lambda-Replikation Das Ende des lytischen Infektionswegs... Entstehung der Phagenpartikel Am Ende des lytischen Infektionswegs Literatur

3 DNA im Zellkern: Chromatin und Chromosomen. 141 Elmar Schiebel Der Zellkern Modifikation von Histonen 151 Posttranslationale Modifikation von Histonen Veränderungen des Chromatins durch Histonmodifikationen Einige wichtige Nicht-Histonproteine Chromatinfasern Das Chromatin Chromosomen Chromosomen des Menschen Chromosomensätze Polytäne Chromosomen Literatur 159 Teil 2 Molekulare Dynamik chromosomaler DNA 8 DNA-Replikation: Verdopplung der genetischen Information Peter Dröge Einleitung Molekulare Grundlagen der Replikation Erste Hinweise auf semikonservative Replikation Allgemeine Polymerisationsreaktion von Deoxynucleotiden Prokaryotische DNA-Polymerasen und wichtige replikative Hilfsproteine DNA-Polymerase I DNA-Polymerase II DNA-Polymerase III Primase DNA-Ligasen DNA-Helikasen Eukaryotische DNA-Polymerasen Drei Phasen der DNA-Replikation Replikation des bakteriellen Genoms.. Die Initiation bakterieller DNA- Replikation Elongationsphase bakterieller DNA- Replikation Beendigung (Termination) der bakteriellen DNA-Replikation Regulation der Initiation bakterieller Replikation Topologische Probleme während der Replikation 181 Topoisomerasen 181 Typ-I-DNA-Topoisomerasen 183 Typ-Il-DNA-Topoisomerasen 184 Topologische Probleme während der Initiation und der Elongation 185 Topologische Probleme während der Termination 187 Andere Probleme während der DNA- Replikation 187 Replikation des eukaryotischen Genoms 188 Replikationsstartpunkte 188 Aktivität von Replikationsstartpunkten 188 Replikation und Strukturen des Zellkerns 190 Nucleotidsequenzen von Replikationsstartpunkten 190 Initiation eukaryotischer Replikation 190 Elongationsphase eukaryotischer Replikation 192 Termination eukaryotischer Replikation Telomere 193 Telomerasen 194 Replikation im Chromatin 196 Schwer zu replizierende Genomabschnitte 197 Literatur 197

4 9 Segregation der Chromosomen: Zellzyklus, Mitose und Meiose. Elmar Schiebel Einleitung 9.2 Zellzyklus Zellzyklusphasen Die Gi-Phase Die S-Phase Die GrPhase Die Mitose Molekulares Verständnis des Zellzyklus. Zellzyklusgene G,/S-Übergang Lizenzierung der DNA-Replikation in dertelophase/gi-phase Regulation der DNA-Replikation Der Cohesinkomplex Der Condensinkomplex 199 Der Eintritt in die Mitose Kontrollpunkte des Zellzyklus Zusammenbau der mitotischen Spindel Der Übergang von Metaphase zur Anaphase Der Spindelkontrollpunkt (spindle assembly 201 Checkpoint, SAC) Cytokinese Defekte bei Chromosomentrennung und 202 Cytokinese Meiose Zellzyklusregulation der Meiose Meiose I Meiose Literatur Rekombination der DNA. Peter Dröge Einleitung Illegitime Rekombination Homologe Rekombination Grundlagen der homologen Rekombination Homologe Rekombination in prokaryotischen Zellen 222 Das RecA-Protein und der DNA-Strangaustausch 222 Das RecBCD-Enzym 225 Bewegliche Holliday-Strukturen und Genkonversion Homologe Rekombination in eukaryotischen Zellen 227 Meiotische Rekombination 228 Genkonversionen in Eukaryoten Ortsspezifische Rekombination Grundlagen der ortsspezifischen Rekombination Ortsspezifische Rekombination in prokaryotischen Zellen Bewegliche genetische Elemente bei Bakterien 232 Insertionssequenzen (IS-Elemente) 232 Transposons 233 Transponierbare Bakteriophagen 235 Ablauf der Transposition 235 Konsequenzen der Transposition: Veränderungen im Genom Bewegliche genetische Elemente bei Eukaryoten 237 Ac/Ds-Transpositionen in Pflanzen 238 Tcl/moriner-Transpositionen 239 P-Element Transpositionen im Drosophila-Genom 239 Ortsspezifische Transpositionen in Immunzellen 240 Retrotranspositionen 243 Retroviren: ein Überblick 243 Retroviren: Struktur und Vermehrung 243 Retroviren: Integration 244 Retrotransposons 246 Literatur Mutationen, DNA-Schädigungen und DNA-Reparatur 250 Pete r Dröge Einleitung Allgemeine Grundlagen 250 Arten von Mutationen 250 Chromosomen-Mutationen 250 Punktmutationen 251

5 Insertionen und Deletionen 253 Reversionen und Suppressionen Mutationen in eukaryotischen Zellen 254 Mutationen in Körper- und Keimzellen 254 Rezessive und dominante Mutationen 255 Komplementationstests Häufigkeiten von Mutationen Spontan auftretende Mutationen Hot Spots spontaner Mutationen Entstehung und Vermeidung von Mutationen bei der DNA-Synthese Alkylierte DNA-Basen und Reparatur 267 Alkylierung von Basen 267 Reparatur der Basenalkylierung Oxidative Basenschäden und Reparatur Unförmige Anheftungen an DNA DNA-Schäden durch ultraviolettes Licht und ihre Reparatur 271 Photoreaktivierung 272 Nudeotid-Exzisionsreparatur bei Bakterien Reparatur durch Rekombination bei Bakterien. 274 Nudeotid-Exzisionsreparatur bei Eukaryoten Überschreitungen ohne Fehler und mit Fehlern Falscheinbauten von Deoxyribonucleotiden Korrekturlesen Falscheinbau von Ribonucleotiden in die DNA Mismatch-Reparatur Entstehung von Indels Mutationen durch Schäden von DNA-Basen AP-Stellen und Reparatur 264 Transläsionssynthese 265 Basenexzisionsreparatur Induktion und Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen DNA-Schäden durch Strahlen DNA-Schäden durch gebremste Replikationsgabeln Reparatur von Doppelstrangbrüchen Zusammenfassung Literatur 282 Teil 3 Gene und Genprodukte 12 Struktur eukaryotischer Gene 12.1 Einleitung Definition des Genbegriffs Pol-l-transkribierte Gene Struktur der Pol-I-transkribierten Gene: rrna-gene Promotoren für die RNA-Polymerase I Pol-ll-transkribierte Gene Struktur der proteincodierenden Pol-IItranskribierten Gene Promotoren für die RNA-Polymerase II Regulatorische Elemente der Pol-II-Gene: Enhancer, Silencer 292 Proximale regulatorische Elemente 293 Distale regulatorische Elemente Nicht-proteincodierende Pol-II-transkribierte Gene Pol-lll-transkribierte Gene Struktur von Pol-III-Genen Promotoren für die RNA-Polymerase III Exons und Introns Exon-Intron-Struktur proteincodierender Gene am Beispiel von Globin-Genen Eigenschaften von Exons und Introns Vorkommen von Introns in eukaryotischen Genen Bedeutung von Introns CpG-lnseln Pseudogene Repetitive DNA-Elemente Literatur 303

6 13 Eukaryotische Transkription: Funktion und Regulation der RNA-Polymerasen Einleitung 305 Allgemeine Prinzipien der eukaryotischen Transkription 305 RNA-Polymerasen Funktion der RNA-Polymerasen Struktur der RNA-Polymerasen Drei Phasen der Transkription Generelle und regulatorische Transkriptionsfaktoren Das Transkriptionssystem der RNA-Polymerase I 312 Generelle Transkriptionsfaktoren der Pol I 312 Regulation der Pol-I-vermittelten Transkription 313 TFHA und TFHB 318 TFIIE und TFIIF 318 TFIIH 318 TFIIS 320 Interaktion von Transkriptionsfaktoren während der unterschiedlichen Phasen der Transkription 320 Zusammenbau des Präinitiationskomplexes (PIC) 320 Initiation der Transkription 320 Elongationsphase der Transkription 321 Terminierung der Transkription Regulation der Pol-II-vermittelten Transkription Das Transkriptionssystem der RNA-Polymerase III Zusammenbau des Präinitiationskomplexes Regulation der Pol-lll-vermittelten Transkription Regulation eukaryotischer Transkription durch die Struktur des Chromatins Strukturmotive von DNA-bindenden Proteinen Das Transkriptionssystem der RNA-Polymerase II Homöodomäne Basische Helix-Loop-Helix-Domäne Generelle Transkriptionsfaktoren der Pol II 315 (bhlh-domäne) 329 TFIID Basische Leucin-Zipper-Domäne (bzip- Domäne) Zinkfingermotiv Schleifenmotiv Das Transkriptom der eukaryotischen Zelle Literatur Signalgesteuerte Genregulation. Einleitung 336 Prinzipien der intrazellulären Signalübertragung 336 MAPK-Signalkaskade: Genaktivierung innerhalb von Sekunden 337 camp-signalgebung: CREB als Effektor des sekundären Botenstoffs camp 339 Aktindynamik: Kommunikation zwischen Cytoskelett und Genom durch MRTF/SRF TGFß-Signalgebung: SMADs als regulatorische Transkriptionsfaktoren Wnt-Signalkaskade: ß-Catenin als Transkriptionsfaktor Sauerstoff: HIF als Sensor und Transkriptionsfaktor Steroide: nudeäre Hormonrezeptoren regulieren die Genexpression Signalgebung durch Abbau von Proteinen im Proteasom Cytokinsignalgebung Literatur JAK/STAT-Signalkaskade Aktivierung von NF-KB 344

7 RNA-Prozessierung. Komponenten des Spleißapparats: das Spleißosom, ein komplexer snrnp Aufbau des Spleißosoms und Ablauf des Polyadenylierung am 3'-Ende mrna-editing Koordination von Transkription und mrna-prozessierung mrna-stabilität und Abbau 382 mrna-abbau durch destabilisierende Sequen 359 zen Qualitätskontrolle und Eliminierung geschädig 361 ter mrna 383 Beispiele regulierter mrna-stabilität mrna-export aus dem Zellkern Prozessierung von prä-trna Literatur Translation: Proteinsynthese in Eukaryoten. Gunter Meister Ablauf der eukaryotischen Translation Initiation der Translation in Eukaryoten Elongation, Termination und Ribosomen- 390 recycling Peptidsynthese Literatur Regulation der eukaryotischen Translation.. Gunter Meister Einleitung Regulation der eukaryotischen Translationsinitiation 398 Regulation auf der Ebene der mrna- Sequenz 398 Regulation von eif4e 399 Regulation von elf Translation von sezernierten oder membranständigen Proteinen 403 Komponenten der Proteintranslokationsmaschinerie 403 Proteintranslokation 404 Nonsense-vermittelter mrna-abbau (NMD) IRES - Initiation ohne Cap-Struktur NMD-Komponenten 405 Identifizierung eines PTCs und der Mechanismus des NMDs 405 NMD in der Hefe 406 Literatur 407

8 18 Regulatorische RNAs Gunter Meister Einleitung 409 RNA-Interferenz (RNA!) Das CRISPR-System: eine Verteidigungslinie von Bakterien gegen Phagen sirnas (short inteifering RNAs) Mechanismen der RNA-Interferenz Genregulation durch mikrornas MikroRNA-Gene 411 Biogenese von mikrornas 412 Regulation der mirna-biogenese Funktion von mirnas Virale mirn As pirnas Genomische Organisation eines CRISPR-Locus CRISPR-Aktivität und Phagenabwehr. Lange, nicht-codierende RNAs (IncRNAs) IncRNA-Gene Dosiskompensation und IncRNAs Genomische Prägung (Jmprinring) und IncRNAs HOTAIR und IncRNAs Literatur Gene in Mitochondrien und Chloroplasten Rolf Knippers Sequenzunterschiede mitochondrialer 422 Einfügen von Nudeotiden: RNA-Editing in Mitochondrien von Trypanosomen Evolution von Eukaryoten und Endosymbiosen DNA in Chloroplasten Allgemeine Merkmale der Chloroplasten- 427 DNA Anordnung und Funktion der Gene auf derctdna Expression von Genen auf der ctdna Literatur Teil 4 Epigenetik 20 Epigenetische Mechanismen. Jörn Walter 20.1 Einleitung Molekulare Grundlagen: Modifikation chromosomaler DNA und Proteine Histonmodifikationen und epigenetische Prozesse Histonmodifikationen als epigenetisches Gedächtnis Histonmodifikationen und Genomstruktur 446 Modelle der Vererbbarkeit von Histonmodifikationen 447 Epigenetische Steuerung der Entwicklung durch PRC-Komplexe 449 Etablierung von ortsspezifischem Heterochromatin durch histonmodifizierende Enzyme 449

9 20.4 Regulatorische RNAs und epigenetische Prozesse 20.5 DNA-Methylierung Vorkommen und allgemeine Prinzipien Oxidierte Modifikationsformen von 5-Methylcytosin Auswirkung der DNA-Methylierung im Genom Welche Enzyme kontrollieren die DNA- Methylierung? Einfluss der DNA-Methylierung auf die genetische Information Methylierung der richtigen" DNA- Sequenzen RNA-abhängige DNA-Methylierung Epigenomforschung: ein Ausblick Literatur Epigenetische Kontrolle biologischer Prozesse 460 Jörn Walter 21.1 Einleitung Cenomweite epigenetische Reprogrammierung und Entwicklungsprozesse in Säugetieren Epigenetische Reprogrammierung im frühen Embryo Reprogrammierung in der Keimbahn Epigenetische Kontrolle der X-chromosomalen Cendosis 464 Genomische Prägung 467 Genomische Prägung in der medizinischen Genetik 470 Literatur 471 Teil 5 Cenomik 22 Von der Genkarte zur Cenomsequenz 475 Martin Vingron/Rolf Knippers 22.1 Einleitung Sequenzierung von Genomen Von der biologischen zur physikalischen Schrotschuss-Sequenzierung Hochdurchsatz-Sequenzierung Annotierung sequenzierter Genome Beispiele für Genomannotierungen Evolution von Genomen Ausblick 491 Literatur Funktionelle Cenomik Martin Vingron Einleitung Proteomik 499 Massenspektrometrie Expressionsanalytik Funktionelle Analytik Analyse der Genexpression durch RNA-Sequenzierung RNA-Analytik über quantitative RT-PCR Computergestützte Analyse von Genexpres Yeast two hybrid-system Bestimmung der Bindungsstellen von Proteinen im Chromatin Systematischer Knock-down von Genen Literatur

10 24 Variabilität des Genoms 24.1 Einleitung 24.2 Einzelnudeotid-Polymorphismen (SNPs) SNPs als DNA-Marker Haplotypen DNA-Chips Genotypisierung 24.3 Kopienzahl-Varianten (CNVs) Mikrosatelliten-Polymorphismen Mikrosatelliten-DNA zur Identifizierung von Personen Mikrosatelliten in Genen: Trinucleotidfolgen Retrotransposon-Insertionspolymorphismen (RIPs) Literatur 519 Teil 6 Schlüsseltechnologien 25 Bioinformatik Martin Vingron 25.1 Einleitung 25.2 Sequenzvergleich Dotplot und Alignment Datenbank-Recherche 25.3 Hochdurchsatz-Sequenzierung und die Kartierung der Teilsequenzen 25.4 Information in Cenfamilien 25.5 Regulatorische DNA-Elemente Sequenzierung und Genom-Assemblierung Genvorhersage Proteinstrukturvorhersage und Homologiemodellierung Molekulare Evolution und phylogenetische Stammbäume Literatur DNA-Analysen 26.1 Einleitung 26.2 Polymerasekettenreaktion (PCR) 26.3 Gentechnik oder das Klonieren von DNA-Fragmenten Traditionelles Klonieren und Herstellung von Genombibliotheken cdna-klonieren PCR-Klonieren DNA-Sequenzierung DNA-Sequenzierung nach der Kettenabbruch- oder Dideoxymethode Sequenziermethoden der nächsten Generation Expressionsanalytik durch RNA-Seq Literatur 541

11 Funktionelle Genomanalysen Einleitung 543 RNA-Interferenz: sirna/shrna-screens 543 Gunter Meister Knock-out-Technologie: homologe Rekombination im Genom der Maus Induzierte pluripotente Stammzellen (ips-zellen) Jörn Walter 27.5 Proteomanalyse Literatur 550 Glossar einiger Begriffe aus der klassischen Genetik Sachverzeichnis