Herstellung und Charakterisierung von Polymer-Mikroelektroden-Arrays. Diplomarbeit in Biophysik

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1 Herstellung und Charakterisierung von Polymer-Mikroelektroden-Arrays Diplomarbeit in Biophysik von Angelika Murr am Fachbereich Physik Technische Universität Kaiserslautern unter Betreuung von Juniorprof. Dr. Axel Blau Prof. Dr. Christiane Ziegler August 2007

2 INHALTSVERZEICHNIS 1 EINFÜHRUNG THEORIE Biologische und biophysikalische Grundlagen Elektrogene Zellen Neuronen Herzmuskelzellen (Myocardzellen) Membranpotentiale Ruhemembranpotential Aktionspotential Ersatzschaltbild der Zellmembran Methoden zur Messung der Zellaktivität Intrazelluläre Ableitung mit Mikronadelelektroden Patch-Clamp Methode Extrazelluläre Ableitung mit Mikronadelelektroden Extrazelluläre Messung mit Mikroelektroden-Arrays (MEAs) Optische Methoden Theoretische Grundlagen zur Vermessung und Charakterisierung der MEAs Signal-Rausch Verhalten Impedanz Impedanzspektroskopie MEA-Messsystem Technologische Grundlagen Photolithographie Photolacke Durchführung der Photolithographie Softlithographie Oberflächenaktivierung von PDMS Leitfähige Polymere MATERIAL UND METHODEN Chemikalienliste Material SU Polydimethylsiloxan (PDMS) Poly-3,4-ethylendioxythiophen (PEDOT) Herstellung des Masters Maske Photolithographie mit SU Herstellung des MEAs Abformen der SU-8-Struktur mit PDMS Befüllen der PDMS-Struktur mit Baytron Isolieren der offen liegenden Leiterbahnen Charakterisierung Charakterisierung des Rauschens Messsystem Messung des Rauschverhaltens I

3 Analyse des Rauschverhaltens Impedanzmessung Durchführung der Messung Analyse der Impedanzmessung Messungen an Zellen Messungen mit Herzzellen eines Hühnerembryos Untersuchungen an Hippocampus-Zellkulturen Analyse der Messungen ERGEBNISSE Herstellung des Master Herstellung des PDMS-MEAs Abformen der SU-8-Struktur mit PDMS Befüllen der PDMS-Struktur mit Baytron Isolieren der rückseitig offen liegenden Leiterbahnen Charakterisierung Nomenklatur Messungen zum Rauschverhalten Rauschen der PDMS-MEAs direkt nach der Herstellung Rauschverhalten nach dem Autoklavieren Einfluss des Mediums auf das Rauschverhalten Impedanzmessung Impedanzen bei 1 khz Impedanzverläufe zwischen 100 mhz und 5 khz Zusammenhang zwischen Impedanz und Rauschverhalten Messungen an Zellkulturen Messung mit Herzzellen eines Hühnerembryos Biokompatibilität Messungen an Hippocampus-Zellen ZUSAMMENFASSUNG AUSBLICK ANHANG LITERATUR...77 II

4 Abkürzungsverzeichnis cst DNAse E8 / E 12 ECR-RIE EDTA EIS FBS FITC gr. HBBS HOMO ITO LUMO MCS MEA NBC NBM OLED PBS PDMS PEB PEDOT PECVD PSS rpm Si-Wafer UV Centistokes (entspricht mm²/s), Maß für die kinematische Viskosität Desoxyribonuclease 8 / 12 Tage alter Embryo Electron cyclotron resonance reactive ion etching Ethylendiaminteraessigsäure elektrochemische Impedanzspektroskopie Fetal Bovine Serum Fluoresceinisothiocyanat griechisch Hanks Ballanced Salt Solution Highest occupied molecular orbital (höchstes besetztes Molekülorbital) Indium Tin Oxid (Indiumzinnoxid) Lowest unoccupied molecular orbital (niedrigstes nichtbesetztes Molekülorbital) MultiChannelSystems Mikroelektroden-Array Nano+Bio Centers Neurobaslamedium organic light emitting diodes Phosphat Buffered Saline Polydimethylsiloxan Post Exposure Bake Poly-3,4-ethylenedioxythiophen plasma enhanced chemical vapor deposition (plasmagestützte chemische Gasphasen Abscheidung) polystyrenesulfonic acid rounds per minute (Umdrehungen pro Minute) Silizium-Wafer Ultraviolett III

5 Einführung 1 Einführung Eines der faszinierendsten Felder der Biowissenschaften ist die Erforschung des Gehirns. Die Frage danach, wie Informationen verarbeitet und weitergeleitet werden und ein Bewusstsein entsteht. Bereits Galvani stellte Ende des 18. Jahrhunderts nach seinen Beobachtungen an Froschschenkeln die Vermutung an, dass elektrische Übertragungen für die Reizfortleitung Verantwortlich sind. Im Jahre 1952 konnten Hodgkin und Huxley durch invasive Messungen mit Nadelelektroden zeigen, dass diese elektrische Aktivität ihren Ursprung in Ionenströmen durch Kanäle in der Zellmembran hat [1]. Die von Bert Sackmann und Erwin Neher entwickelte Patch-Clamp Methode erlaubte es, einzelne Kanäle genauer zu untersuchen [2]. Diese Methoden haben jedoch zwei Nachteile. Invasive Messungen töten die Zellen und mit der Patch-Clamp Methode lassen sich nur Einzelzellmessungen durchführen. Aber isolierte Zellen verhalten sich anders, als wenn sie ein Netzwerk bilden. Daher lassen sich aus an einer einzelnen Zelle gewonnenen Erkenntnissen nicht immer zutreffende Rückschlüsse auf das Verhalten in vivo ziehen. Es ist daher von Interesse Zellen in einem Netzwerk untersuchen zu können. Eine Möglichkeit dafür bieten so genannte Mikroelektroden-Arrays (MEA). Dabei handelt es sich um ein Ensemble von in der Regel planaren Mikroelektroden, mit denen die Zellaktivität extrazellulär gemessen werden kann. Erste Ansätze für diese Technik gab es bereits in den 1980er Jahren [3]. Seitdem konnten unter Einsatz moderner Mikrostrukturierungstechniken immer leistungsfähigere MEAs entwickelt werden. Durch eine gleichzeitige Messung der zeitlich und örtlich aufgelösten Aktivität mehrerer Zellen bietet sich ein weites Anwendungsgebiet [4]: Ä Ä Ä MEAs werden in der Grundlagenforschung verwendet, um das Zusammenspiel von elektrogenen Zellen an unterschiedlichen Stellen des gleichen Gewebes und die Signalausbreitung besser zu verstehen. Mit MEAs kann räumlich und zeitlich aufgelöst untersucht werden, welche Wirkung Arzneimittelstoffe und Drogen auf die Aktivität der Zellen haben. Über MEAs kann eine gleichzeitige elektrische Stimulation und Messung erfolgen. Damit kann untersucht werden, welchen Einfluss Signale auf die Aktivität haben. Man verspricht sich Erkenntnisse darüber, wie Information in neuronalen Netzen dargestellt und verarbeitet wird. Die kommerziell erhältlichen MEAs bestehen aus Glas und einem metallischen Leiter. Sie sind daher für Implantationen zur in vivo Messungen nur bedingt geeignet. Neuere Untersuchungen beschäftigen sich mit dem Einatz von Polymeren für die Herstellung von MEAs. Claverol-Tinturé et al. [5] verwenden eine strukturierte Polymerbeschichtung herkömmlicher MEAs, um gezieltes Zellwachstum über metallischen Elektroden zu ermöglichen. Dabei zeigte sich eine gute Biokompatibilität der Polymeroberflächen. Arbeiten von Ludwig et al. [6] beschäftigen sich mit der Modifizierung metallischer Mikroelektroden mit leitfähigen Polymeren. Sie postulieren, dass dies zu einer Verbesserung der Langzeitleistung von MEAs führt. Eine Kombination von Mikroelektroden aus leitfähigen Polymeren in einer Polymer-Struktur böte sich an. 1

6 Einführung Ziel der vorliegenden Arbeit war die Herstellung und Charakterisierung solcher Polymer- MEAs. Dabei lag der Schwerpunkt auf der Etablierung eines einfach auszuführenden und kostengünstigen Verfahrens zur Fertigung. Es wurde daher versucht, auf Techniken zurückzugreifen, die in vielen Laboren zur Verfügung stehen. Die angewandten Methoden sollten sich prinzipiell für die Massenfertigung eignen, um eine spätere Automatisierung zu ermöglichen. Die Charakterisierung erfolgte im Hinblick auf das Rauschverhalten, die Impedanz der Elektroden und die Biokompatibilität der Oberfläche. Diese Eigenschaften der Polymer-MEAs wurden untersucht und mit denen eines kommerziellen MEAs verglichen. Die vorliegende Arbeit gibt im 2. Kapitel einen Überblick über die theoretischen Grundlagen. Dabei wird auch auf die Prinzipien der für das Herstellungs- und Messverfahren relevanten Methoden eingegangen. Das 3. Kapitel beginnt mit einer Übersicht über die verwendeten Materialien. Danach wird das Verfahren zur Herstellung der MEAs näher dargestellt. Die Durchführung der Messungen zur Charakterisierung wird aufgezeigt und die Methoden zur Auswertung beschrieben. Das 4. Kapitel beinhaltet die Darstellung und Diskussion der Ergebnisse. Dabei behandelt der erste Teil die Herstellung der MEAs. In diesem Zusammenhang werden auch Gründe dargelegt, warum die Wahl auf ein bestimmtes Verfahren fiel. Im zweiten Teil werden die Messungen zur Charakterisierung präsentiert. Im 5. Kapitel folgt eine kurze Zusammenfassung der gewonnenen Erkenntnisse. Das 6. Kapitel schließt mit einem Ausblick auf weitere denkbare Untersuchungen, welche die Thematik dieser Arbeit fortführen könnten. 2

7 Theorie 2 Theorie 2.1 Biologische und biophysikalische Grundlagen Das Innere der Zellen wird durch die Plasmamembran vom extrazellulären Raum getrennt. Dabei handelt es sich um eine Lipiddoppelschicht mit eingebetteten Proteinen. Diese Membranproteine sind die Hauptfunktionsträger der Plasmamembran. Durch so genannte Transportproteine entstehen Kanäle, durch die ein Stoffaustausch zwischen der Flüssigkeit im Inneren der Zelle (Zytosol) und der extrazellulären Flüssigkeit stattfinden kann. Durch Ionenkanäle können z. B. Ladungsträger wie Na +, K + und Cl - die Membran passieren. [7] Abbildung 1: Schematische Darstellung des Ionentransports über die Membran. Durch Kanäle kann ein Ionenaustausch zwischen Zytosol und Extrazellularraum stattfinden [8] Elektrogene Zellen Neuronen Neuronen sind die elektrisch erregbaren Zellen des Nervensystems, die Informationen verarbeiten und weiterleiten. Ein Neuron besteht im Wesentlichen aus einem Zellkörper (Soma), in dem sich auch der Zellkern befindet; einem Axon, das in einer Vielzahl von Verzweigungen den so genannten Axonterminalen - endet und Dendriten, die verzweigte Fortsätze des Somas sind. Um das Axon herum ist bei Vertebraten eine Myelinscheide, die aus spezialisierten Gliazellen, den Schwann-Zellen, besteht und das Axon elektrisch isoliert. Unterbrochen wird die Myelinscheide durch die so genannten Ranvierschen Schnürringe, wo sich die Ionenkanäle befinden. Die Erregungsausbreitung erfolgt saltatorisch (sprunghaft) von einem Ranvierschen Schnürring zum nächsten. [7] Abbildung 2: links: Aufbau eines Neurons. Durch Ionenflüsse über die Membran kommt es zu Spannungsänderungen, die Aktionspotentiale auslösen können. Diese werden entlang des Axons über die Axonterminalen zu den Dendriten anderer Zellen weitergeleitet [9] rechts: Schematische Darstellung einer chemischen Synapse. [10] 3

8 Theorie Die Kommunikation zwischen einzelnen Neuronen erfolgt an Synapsen chemisch über Neurotransmitter. Unter Synapse versteht man die Kontaktstelle zwischen der Axonterminalen eines Neurons mit einem Dendriten oder dem Soma eines anderen Neurons. Die Neurotransmitter werden an den Axonterminalen ausgeschüttet und gelangen durch den Synaptischen Spalt zu den Dendriten eines benachbarten Neurons. [7] Herzmuskelzellen (Myocardzellen) Die Herzwand ist zum größten Teil aus Myocardzellen aufgebaut. Sie bewirken die rhythmische Kontraktion des Herzmuskels. Die Erregungsausbreitung bei Myocardzellen erfolgt durch elektrische synaptische Kopplung. Hierbei fließen Ionenströme durch Kanalproteine direkt von einer Zelle zur nächsten. Diese Verbindung bezeichnet man als gap junctions. [7] Elektrokardiogramm (EKG) Während der Kontraktion des Herzens breitet sich die Erregung vom Sinusknoten (primärer Schrittmacher) über die Vorhöfe und den AV-Knoten (sekundärer Schrittmacher) bis in die Ventrikel aus. Im Verlauf des Herzschlages liegt nun bereits erregtes Herzgewebe, das an der Außenseite negativ geladen ist, neben noch nicht erregtem Herzgewebe, das an der Außenseite positiv geladen ist. An der Grenze entsteht ein Dipol, dessen elektrisches Feld sich im Körper ausbreitet und auf der Körperoberfläche messbar ist. Dieser Dipol wandert mit der Erregungsausbreitung. Die daraus resultierenden Potentialschwankungen lassen sich mit Hilfe entsprechend auf der Haut positionierter Elektroden als EKG darstellen. Die verschiedenen Phasen des EKGs können den einzelnen Phasen der Erregungsausbreitung zugeordnet werden (vgl. Abbildung 3). Der Verlauf eines EKGs ähnelt sich bei allen Warmblütern. [7] Abbildung 3: EKG Verlauf, gemessen am menschlichen Herzen. Die Erregungsausbreitung lässt sich den einzelnen Phasen zuordnen. 1 Erregung der Vorhöfe 2 Erregungsausbreitung in den Ventrikeln 3 Vollständige Erregung der Ventrikel 4 Rückbildung der Erregung [11] 4

9 Theorie Membranpotentiale Ruhemembranpotential Im Zytosol und im Extrazellularraum herrschen unterschiedliche Ionenkonzentrationen. Durch die Kanäle können Ionen entlang des Konzentrationsgradienten durch die Membran diffundieren. Der Ionenfluss führt zu einer Potentialveränderung an der Membranoberfläche. Es baut sich ein elektrisches Feld auf, das einer weiteren Diffusion entgegen wirkt. Der Nettostrom kommt zum Erliegen sobald sich die Wirkung des elektrischen Feldes und der Diffusionsdruck gegenseitig aufheben. Nun wandern genau so viele Ionen von Innen nach Außen wie umgekehrt. Das Potential bei dem sich für eine Ionensorte dieses Gleichgewicht einstellt wird Gleichgewichtspotential genannt. Es lässt sich durch die Nernst-Gleichung beschreiben [7]: E x R ÉT ln z É F Å Å Ion Ion Ç Ñ (1) x a x Ç i wobei R = ideale Gaskonstante T = absolute Temperatur in Kelvin z = Wertigkeit des Ions F = Faraday Konstante [Ion x ] a = extrazelluläre Konzentration der Ionensorte x [Ion x ] i = intrazelluläre Konzentration der Ionensorte x. Zum Membranpotential trägt aber nicht nur eine Ionensorte bei. Man betrachtet den Fluss von Na +, K + und Cl -. Dabei unterscheiden sich jedoch die Permeabilitäten für die verschiedenen Ionen. Dieser Umstand wird in der so genannten Goldmann-Gleichung berücksichtigt: E R É T P É Ü Ü Ö ÅK Ça Ü PNa É ÅNa Ça Ü PCl É ÅCl Çi Ü Ü Ö ÅK Ç i Ü P É ÅNa ÇÜ P É ÅCl Ç a K m Ñ ln (2) z É F P K É Na i Cl wobei P x = Permeabilität der Membran für die Ionensorte x. Mit der Goldmann-Gleichung kann das Ruhemembranpotential berechnet werden. Je nach Bedingungen und Ionenkonzentrationen kommen Ruhemembranpotentiale zwischen -120 und -40 mv vor. Die Membran ist an der Innenseite negativ und an der Außenseite positiv geladen. Man spricht von einer Polarisation der Membran. Das Ruhemembranpotential ist in erster Linie auf die K + -Ionen zurückzuführen. Diese haben eine hohe Konzentration im Zytosol und die Permeabilität der Membran für K + ist 30-mal höher als für Na +. [7] Aktionspotential Wird die Zelle aktiv kommt es zu Aktionspotentialen (APs). Dabei handelt es sich um die Weiterleitung eines von außen kommenden Impulses, wodurch die Potentiale verändert werden. Man spricht auch von einem Spike. 5

10 Theorie Abbildung 4: Typischer Verlauf eines Aktionspotentials. Nach überschwelliger Erregung kommt es durch Na+-Einstrom zu einer raschen Depolarisation bis zu positiven Membranspannungen. Eine Inaktivierung der Na+-Kanäle und K+-Einstrom führt zur langsameren Repolarisation bis unter das Membranruhepotential. [12] Ein erhöhter Na + -Einstrom führt zu einer Verschiebung in Richtung des Gleichgewichtpotentials von Na +. Das Membranpotential wird positiver; man spricht von Depolarisation. Steigt das Potential um etwa 20 mv an, übersteigt es das so genannte Schwellenpotential. Es öffnen sich Na + -Kanäle und die Permeabilität für Na + nimmt sprunghaft zu. Es kommt zu einem verstärkten Einstrom von Na + und einer raschen positiven Potentialänderung, dem Aufstrich. Dabei wird das Membranpotential zeitweise sogar positiv. D. h. nun ist die Innenseite der Membran positiv geladen und die Außenseite negativ. Diese Phase wird als Overshoot bezeichnet. Die erhöhte Leitfähigkeit für Na + sinkt bereits während der Spitze des APs wieder ab. Der Na + -Einstrom versiegt. Die Na + -Kanäle bleiben für kurze Zeit nicht aktivierbar. Aber auch die Leitfähigkeit für K + steigt geringfügig. Der K + -Einstrom führt zu einer Repolarisierung des Membranpotentials bis zu Werten, die negativer als das Ruhepotential sind. Wenn wieder die ursprünglichen Permeabilitäten herrschen, stellt sich das Ruhemembranpotential ein. Es folgt die Refraktärphase. In dieser Zeit sind die Na + -Kanäle inaktiv und es kann für ca. 2 ms kein weiteres AP an dieser Stelle der Membran ausgelöst werden. Das bedeutet, dass maximal mit einer Frequenz von 500 APs pro Sekunde stimuliert werden kann. [7] Das AP eines Neurons dauert etwa 1 ms, das einer Skelettmuskelzelle 10 ms. Beim Herzmuskel treten APs mit mehr als 200 ms Dauer auf. Abbildung 5: Vergleich verschiedener Aktionspotentiale. Verlauf und Dauer der einzelnen APs sind bei allen höheren Vertebraten vergleichbar. [7] 6

11 Theorie Ersatzschaltbild der Zellmembran Wie bereits dargelegt wurde, herrschen auf der Innen- und Außenseite der Membran unterschiedliche Ionenkonzentrationen und somit unterschiedliche Ladungen (vgl ). Diese werden durch die Membran als Isolationsschicht getrennt. Die Lipidschicht wirkt dabei wie ein Plattenkondensator. Die Zellmembran hat im Vergleich zum Zytosol und zur extrazellularen Flüssigkeit einen hohen elektrischen Durchtrittswiderstand, der durch die Anzahl und Permeabilität der Ionenkanäle bestimmt wird. Da die Permeabilität die Leitfähigkeit der Kanäle beschreibt, können die Kanäle mit ohmschen Widerständen verglichen werden. Man kann die Membran daher als Kapazität C mit parallelgeschaltetem Widerstand R darstellen. Der Strom durch die Membran hat also auch kapazitive Anteile. Als treibende Kraft wirkt das Gleichgewichtspotential der Ionen. [13], [14] Abbildung 6: Ersatzschaltbild einer Zellmembran Dabei bedeuten C m Membrankapazität, R x Widerstand des Ionenkanals für die Ionensorte x, E x Gleichgewichtspotential der Ionesorte x, E Membranpotential, I x Strom durch den Kanal für die Ionensort x, I l Leckstrom, R l Shuntwiderstand [1] Methoden zur Messung der Zellaktivität Intrazelluläre Ableitung mit Mikronadelelektroden Bei der intrazellulären Ableitung befindet sich das Axon in einer physiologischen Salzlösung. Die Membran wird mit einer Mikronadelelektrode durchstochen und kontaktiert das Zytosol. Das Potential im Inneren der Zelle wird nun gegen die physiologische Lösung gemessen. Bei Aktivität wird der Spannungsverlauf eines APs, wie er in Abbildung 4 dargstellt ist, beobachtet. Die Amplituden der APs liegen je nach Zelltyp zwischen 50 und 100 mv. Mit dieser Methode lässt sich außerdem das Ruhemembranpotential messen. Mit der intrazellulären Ableitung können nur Einzelzellmessungen durchgeführt werden. Problematisch ist das Durchstechen der Zellmembran, da die Zelle dadurch im Laufe der Messung stirbt. [7], [14] 7

12 Theorie Abbildung 7: Schematische Darstellung der intrazellulären Ableitung. Mit der Ableitelektrode wird die Zellmembran durchstoßen und das Zytosol (Axoplasma) kontaktiert. Der Fluss im Inneren des Axons wird gegen den Fluss im umgebenden Medium gemessen. [16] Patch-Clamp Methode Bei der Patch-Clamp Methode, für deren Entwicklung Erwin Neher und Bert Sackmann 1991 den Nobelpreis erhielten, wirde eine mit einer Lösung gefüllte Glaskapillare (Patch-Clamp- Pipette) an die Zellmembran angesaugt. Dabei entsteht zwischen dem Inneren der Pipette und der Außenlösung ein Widerstand von mehreren GO. Eine Elektrode wird in die Lösung in der Pipette getaucht. Je nach Stärke des Ansaugens kann darüber die Aktivität eines einzelnen Kanals oder über die ganze Membran gemessen werden. Mit der Patch-Clamp Methode lassen sich also Einzelkanalmessungen oder Messungen an einer einzigen Zelle durchführen. [2], [14] Abbildung 8: Patch-Clamp Methode links: Einzelkanalmessung rechts: Messung einer ganzen Zelle ( whole-cell-recording ) [17] Extrazelluläre Ableitung mit Mikronadelelektroden Bei der extrazellulären Ableitung befindet sich die freigelegte Nervenfaser in einem elektrisch isolierenden Medium. Auf die Faser werden mindestens zwei Elektroden aufgesetzt, sie kontaktieren die Außenseite der Membran. Breitet sich eine Erregung über das Axon aus, so verliert zunächst die Membran unter der ersten Elektrode durch die Depolarisation ihre positive Ladung (vglabbildung 9). Sie wird relativ zur Membran unter der zweiten Elektrode negativ. Gemessen wird daher eine positive Potentialänderung, die etwa die Dauer des intrazellulären APs hat. Wenn die Erregung die zweite Elektrode erreicht, sind die Verhältnisse umgekehrt. Unter der ersten Elektrode ist die Membran jetzt wieder positiv und unter der zweiten stattdessen negativ geladen. Gemessen wird nun eine negative Potentialänderung. [5] Man nennt daher den zwischen zwei Elektroden abgeleiteten Potentialverlauf auch biphasisch. 8

13 Theorie Abbildung 9: oben: Schematische Darstellung der extrazellulären Messung mit zwei Nadelelektroden. Zur Beschreibung siehe Text. unten. bei der gezeigten Messung abgeleitetes biphasisches AP [5] Extrazelluläre Messung mit Mikroelektroden-Arrays (MEAs) Eine weitere Variante der extrazellulären Messung ist die Messung mit Mikroelektrodenfeldern, so genannten Mikroelektroden-Arrays (MEAs). Sie findet in einem elektrisch leitenden Medium statt und beruht auf der Annahme, dass im Ruhezustand im extrazellulären Raum überall die gleichen Ionenkonzentrationen und damit das gleiche Potential herrschen. Im Verlauf eines APs treten Ionen durch die Membran und verändern somit die Konzentration der Ladungsträger. Man benötigt zwei Elektroden. Eine Ableitelektrode in der Nähe der Zellen und eine Referenzelektrode in größerem Abstand zu den Zellen. Die Spannung zwischen diesen beiden Elektroden wird gemessen. Treten nun an einer Stelle Ionen über die Membran, so ändert sich dort die Ionenkonzentration in der extrazellulären Lösung und dadurch das Potential. Misst man nun die Spannung gegen die Referenzelektrode so sieht man bei Aktivität eine Spannungsänderung. [14] Die Amplitude ist geringer als bei intrazellulär gemessenen APs. Sie liegt bei Neuronen im Bereich von 100 µv. Abbildung 10: Schematische Darstellung der extrazellulären Messung mit einem Mikroelektrodenfeld. Die Leiterbahnen sind gegen das Medium elektrisch isoliert, so dass nur die Elektrode freiliegt. Die extrazelluläre Messung hat eine starke räumliche Abhängigkeit. Die Veränderung der Ionenkonzentration ist auf einen kleinen Bereich begrenzt. Je näher die Arbeitselektrode der aktiven Zelle ist, desto größer ist die Konzentrationsänderung und demzufolge auch die Spannungsänderung. 1 á cå Ç ~ (3) Ionx r 9

14 Theorie Die stärksten Signale erhält man daher, wenn die Elektrode die Zelle direkt kontaktiert. Diese Art der extrazellulären Ableitung erlaubt eine nicht-invasive Untersuchung ganzer Zellensembles. Einzelkanalmessungen sind dagegen nicht möglich. Bereits 1972 haben Thomas et al. die Verwendung von planaren MEAs zur Aufzeichnung von Zellkulturen beschrieben. Die ersten erfolgreichen Messungen ließen jedoch noch einige Jahre auf sich warten. Unabhängig voneinander entwickelten Günther Gross (1979) und Jerome Pine (1980) Arrays für die chronische Messung und Stimulation von kultivierten neuronalen Netzwerken. Mit platinierten Goldelektroden konnte Pine Messungen an einzelnen dissoziierten Neuronen durchführen. [3], [4] In den 1990er Jahren fing man an, MEAs auch für Langzeitmessungen zu verwenden. Welsh et al. führten über 3 Tage Messungen an Neuronen durch. Man konnte nun neuronale Netzwerke über einen längeren Zeitraum hinweg kultivieren und untersuchen. Auch im 21. Jahrhundert geht die MEA Entwicklung weiter. Ein Ziel ist die Größe und Anordnung der Elektroden so anzupassen, dass die Wechselwirkung zwischen Netzwerk und MEA optimiert wird. Idealerweise wären dann von allen Zellen die Kanäle mit der größten Aktivität in der Nähe der Elektroden, so dass das gesamte Netzwerk untersucht werden kann. Man will dadurch erforschen wie Netzwerke funktionieren, zusammenarbeiten und sich entwickeln. [4] Heutzutage sind MEAs mit 60 Elektroden kommerziell von verschiedenen Anbietern wie z. B. MultiChannelSystems (MCS) oder Ayanda Biosystems erhältlich. Im Prinzip handelt es sich bei MEAs um ein Ensemble von Elektroden, die von den Zellen kontaktiert werden können. Die Elektroden im Zentrum sind über Leiterbahnen mit Kontaktflächen, den so genannten Pads, am äußeren Rand des Arrays verbunden, an denen die Spannungsänderungen gemessen werden können. Abbildung 11: Kommerzielle MEAs von MultiChannelSystems, Reutlingen (links) und Ayanda Biosystems (rechts) [8], [18] Die MEAs von MCS (MCS-MEAs) gibt es in verschiedenen Ausführungen. Das Standard MEA ist 4,9 x 4,9 cm² groß und hat 60 Elektroden mit je 30 µm Durchmesser und einem Abstand von 100, 200 oder 500 µm, die im Zentrum in einem 8 x 8 Array angeordnet sind, wobei die vier Ecken fehlen. Die Trägersubstanz ist Glas, als Leitermaterial wird Gold oder ITO (Indium Tin Oxid) verwendet und zur Isolierung Siliziumnitrid (aufgebracht durch plasmagestütze chemische Gasphasenabscheidung (PECVD)). [8] 10

15 Theorie Abbildung 12: Aufnahme der Elektroden eines MCS-MEAs. Rechts 8 x 8 Gitter der 30 µm großen Elektroden. [8] Neben der Standard-Version sind auch 3D-MEAs, deren Elektroden nicht flach sondern kegelförmig sind und somit tote Zelllagen bei Gewebeschnitten durchdringen können; HexaMEAs, bei denen Elektroden unterschiedlicher Größe hexagonal angeordnet sind und einige weitere erhältlich [8] Optische Methoden Kurz erwähnt sei noch die optische Methode, bei der Spannungsabhängige Farbstoffe verwendet werden. Die Potentialänderung im Verlauf eines Aktionspotentials führt zu einer Veränderung der Lichtintensität. Diese Änderungen liegen allerdings im Bereich von 1 %, was die Detektion erschwert. [19] 2.2 Theoretische Grundlagen zur Vermessung und Charakterisierung der MEAs Signal-Rausch Verhalten Die Qualität einer Messung hängt vom Signal-Rausch-Verhältnis ab. Darunter versteht man das Verhältnis zwischen der Leistung des Signals und der Leistung des Rauschens. Je geringer das Rauschen ist, desto besser ist die Qualität. Allgemein versteht man unter Rauschen jede ungewollte Störung, die einem Signal überlagert ist. Dabei kann es sich z.b. auch um eine Wechselwirkung mit elektromagnetischen Wellen handeln, die durch eine ausreichende Abschirmung jedoch vermieden wird. Im engeren Sinne bezeichnet man als Rauschen daher Fluktuationen, die durch die physikalischen Eigenschaften eines Systems hervorgerufen werden. Das thermische Rauschen, wegen seiner Frequenzunabhängigkeit auch als weißes Rauschen bezeichnet, hat den Hauptanteil an der Rauschcharakteristik eines Systems, wenn in diesem System kein Gleichstrom fließt, und eine hohe Impedanz herrscht. Thermisches Rauschen wird hervorgerufen durch die Brownsche Molekular Bewegung der Ladungsträger in einem Widerstand. Für den Spannungsanteil des Rauschens gilt folgender Zusammenhang [20]: 11

16 Theorie V n àrmsâ É k ÉT É R É áf Ñ 4, (4) wobei k B = Boltzmannfaktor, T = absolute Temperatur R = Widerstand Äf = Bandbreit des Detektors B V n (rms) ist das rms-spannungsrauschen des Systems. Gleichzeitig entspricht V n (rms) bei einer statistisch verteilten Fluktuation der Breite der Verteilung [20]. Eine statistische Verteilung låsst sich als GauÇverteilung darstellen. Ein MaÇ fér ihre Breite ist die Standardabweichung. Nach [21] gilt fér die Standardabweichung Ñ: à â 2 ä x Ö xi Ä Ñ, (5) n Ö 1 wobei x = Mittelwert der Messwerte x i = Wert der einzelnen Messwerte n = Anzahl der Messwerte Impedanz Unter Impedanz versteht man den frequenzabhångigen Widerstand eines Systems; es ist also der Wechselstromwiderstand gemeint. Die Impedanz Z ist eine komplexe GrÖÇe Z Ñ R Ü ix, (6) Dabei beschreibt der Realteil den Wirkwiderstand und der ImaginÅrteil den Blindwiderstand. Der Wirkwiderstand kommt durch ohmsche WiderstÅnde zustande. Der Blindwiderstand beschreibt kapazitive und induktive Anteile. Die Beitrag X C einer KapazitÅt berechnet sich dabei nach: wobei Ü = Frequenz C = KapazitÅt Bei hohen Frequenzen sinkt der kapazitive Anteil. Xc Ñ 1 ÅC,, (7) Als komplexe GrÖÇe låsst sich die Impedanz auch in der Polardarstellung schreiben: Z e i Ç Ñ Z É, (8) wobei á die Phasenverschiebung zwischen Strom und Spannung beschreibt. [22] 12

17 Theorie Abbildung 13: Zeiger Diagramm des komplexen Widerstandes. Der Realteil ist der ohmsche Widerstand, der Imaginärteil wird durch Kapazitäten und Induktivitäten verursacht. [23] Die relevante Größe für die Charakterisierung der MEAs ist der Betrag der Impedanz, der das Rauschen mit bestimmt. Er wird als Scheinwiderstand bezeichnet: Z Ñ 2 R Ü X 2. (9) Die Impedanz ist flächenabhängig. Je größer die Fläche, desto geringer ist die Impedanz. Um daher Vergleiche mit kommerziellen Systemen ziehen zu können, muss die Impedanz normiert werden ist. [24] Impedanzspektroskopie Eine Möglichkeit die Impedanz zu messen ist die elektrochemische Impedanz-Spektroskopie (EIS), mit der sich die Eigenschaften der Elektrodengrenzfläche im Elektrolyten bestimmen lassen. Sie findet u. a. Anwendung in der Korrosionsforschung und bei der Fertigung von elektrochemischen Sensoren. [25] Mit Hilfe der EIS kann die Impedanz innerhalb eines Frequenzbereichs bestimmt werden. Man legt an die Probe eine Wechselspannung mit variierender Frequenz und kleiner Amplitude an. Die kleine Amplitude begründet sich dadurch, dass elektrochemische Redoxprozesse im Allgemeinen einen nichtlinearen Zusammenhang zwischen Strom und Spannung aufweisen. Erfolgt die Erregung jedoch mit geringer Spannung (ca. 2 bis 10 mv) kann eine lineare Näherung angenommen werden. [24], [25] Die Beschreibung eines Messaufbaus für die EIS findet sich u.a. bei Ende und Mangold [25]. Abbildung 14: Schematische Darstellung der elektrochemischen Impedanzspektroskopie. Die Messung erfolgt mit drei Elektroden. Die Sinusspannung wird mit einem Potentiostat erzeugt. nach [25] In Abbildung 14 ist ein Aufbau mit drei Elektroden dargestellt, wie er auch bei der vorliegenden Arbeit verwendet wurde. Es werden eine Referenz- eine Gegen- und eine 13

18 Theorie Arbeitselektrode benötigt. Die Messung erfolgt über ein Medium in der Messzelle, über das der Stromkreis geschlossen ist. Der Strom fließt dabei zwischen Arbeits- und Gegenelektrode. Die Gegenelektrode muss möglichst großflächig sein, dann kann ihr Impedanzanteil vernachlässigt werden. Mit der Referenzelektrode wird die angelegte Spannung kontrolliert. Mit dem Potentiostat wird eine sinusförmige Wechselspannung auf die Messzelle übertragen und ein Spannungssignal erzeugt, das dem durch die Messzelle fließenden Strom proportional ist. Der Frequenzanalysator besteht aus dem Generator und dem Analysator. Der Generator erzeugt die Wechselspannung, die vom Potentiostaten appliziert wird. Der Analysator bestimmt aus dem Spannungssignal, das dem durch die Messzelle fließenden Wechselstrom proportional ist, und der vom Generator erzeugten Wechselspannung die Impedanz der Probe. Da der Wechselstrom eine komplexe Größe ist müssen zwei Komponenten bestimmt werden. Dabei kann es sich entweder um die Amplitude des Stromsignals und die Phasenverschiebung oder um den Real- und Imaginärteil des Wechselstroms handeln. Daraus lässt sich die Impedanz berechnen. Bode-Diagramm Die Darstellung der Impedanz kann in einem Bode-Diagramm erfolgen. Hierbei wird der Betrag der Impedanz doppel-logarithmisch gegen die Frequenz aufgetragen. Aus einem Bode-Diagramm ist also der Verlauf der Impedanz über den Frequenzbereich ersichtlich. Abbildung 15: Beispiel für ein Bode-Diagramm eines RC-Gliedes. Aufgetragen ist der Betrag der Impedanz über die Frequenz bei doppelt-logarithmischer Skalierung. (Quelle: Testmessung aus dem Programm PowerSuite für die Impedanzspektroskopie) MEA-Messsystem Wie erwähnt können mit einem MEA extrazelluläre Messungen durchgeführt werden. Die dafür nötigen Komponenten sind in Abbildung 16 schematisch dargestellt. MEAs können sowohl zur elektrischen Erfassung kapazitiver Ströme als auch zur elektrischen Stimulation verwendet werden. [26] 14

19 Theorie Abbildung 16: oben: Die aktiven Zellen werden auf die Elektroden aufgebracht. Über die Elektroden kann sowohl eine Messung als auch eine Stimulation erfolgen. unten: Schema der für eine Messung mit MEAs wichtigen Komponenten. Die Zellen stellen die Signalquelle dar, das Medium den Volumen Conductor. Elektroden, Filter und Verstärker gehören zur Analogschicht. Beim Sampling wird das analoge Signal in ein digitales umgewandelt. Die Aufarbeitung der Daten wird mit der Software durchgeführt. [8] Die Zellen liegen über bzw. auf den Elektroden. Kommt es zur Aktivität, fließen Ionen durch die Zellmembran. Diese kapazitiven Ströme führen zu Potentialänderungen an der Schnittstelle zwischen Zellen/Medium und Elektroden. Die Signale werden von den Elektroden aufgenommen und an die Pads weitergeleitet. Bei den Signalen handelt es sich um analoge Spannungssignale. Sie müssen in einen digitalen Datenstrom umgewandelt werden, der die Aufzeichnung und Analyse mit einem Computer erlaubt. Diese Umwandlung geschieht mit Hilfe eines Analog/Digital-Wandlers (A/D- Wandler). A/D-Wandler arbeiten im Bereich zwischen ±10 V. Das Auflösungsvermögen beträgt meist 12 bit, und liegt damit etwa bei 5 mv [19]. Da die neuronalen Signale im µv-bereich liegen, müssen sie zuerst um mindestens den Faktor 1000 verstärkt werden. Bei anderen Zellen wie z. B. Myocardzellen treten Spannungen bis zu wenigen mv auf. Dadurch gibt es eine Obergrenze für die Verstärkung, damit 10 V nicht überschritten werden. Die Verstärkung erfolgt mit einem rauscharmen Operationsverstärker. Das Signal wird zusätzlich gefiltert. Dadurch wird das Einkoppeln von Störquellen, die zu falschen Signalen führen oder schwache Signale von Nervenzellen überdecken, verhindert. Solche Störquellen können die Netzspannung (50 Hz) oder das Hochfrequenzrauschen vom Computer (>10 khz) sein [19]. Zudem ist das Rauschen über alle Frequenzen verteilt und wächst mit zunehmender Bandbreite des Detektors (vgl 2.2.1, Gl. 4). Daher wird das Signal durch einen Bandpass gefiltert. Mit Verstärker und Filter werden die Auflösung und die Qualität der Messung verbessert. Mit dem A/D-Wandler wird das das analoge Signal nun digitalisiert, also in nach in Zeit und Amplitude konkrete Werte umgewandelt, welche die Verarbeitung mit einem Computer erlauben. Die gemessene Spannung wird durch diskrete Werte dargestellt. Dabei ist jedem Zeitpunkt ein Spannungswert zugeordnet. Die Anzahl der Zeitpunkte bestimmt sich aus der Abtastrate. Diese gibt die Frequenz an, mit der die jeweils momentane Spannungsamplitude als konkreter Wert gemessen wird. Man spricht vom Sampling. Die Daten werden mit einem Computer dargestellt und für spätere Auswertungen aufgezeichnet. 15

20 Theorie 2.3 Technologische Grundlagen Photolithographie Der Begriff Photolithographie leitet sich von photos (gr. Licht), lithos (gr. Stein) und graphein (gr. schreiben) ab. Die klassische Photolithographie für die Mikrostrukturierung besteht aus fünf Schritten: 1.) Aufbringen des Photolacks auf das Substrat 2.) Belichtung des Photolacks durch eine Maske 3.) partielles Entfernen des unvernetzten Photolacks 4.) Ätzen des ungeschützten Substrat und schließlich 5.) Entfernen des restlichen Photolacks. [27] Es gibt auch Photolacke, wie z. B. SU-8 die selber als Substrat verwendet werden können. Die Ätzung und die Entfernung des Photolacks entfallen dann. Abbildung 17: Schema der allgemeinen Schritte bei photolithographischen Prozessen. Das Substrat ist das Material aus dem die Struktur entstehen soll. Evtl. befindet es sich noch auf einem Trägermaterial (z. B. Si-Wafer). Das Substrat wird mit einer Lage Photolack beschichtet. Durch eine Maske erfolgt die Belichtung. Bei der nachfolgenden Entwicklung wird nicht vernetzter Photolack entfernt. Die nicht mehr durch den Photolack geschützte Schicht kann weggeätzt werden. Zum Schluss wird der verbliebene Photolack entfernt. [27] Photolacke Photolacke (auch Photoresists genannt) sind Lacke, die bei Bestrahlung mit Licht bestimmter Wellenlängen ihre Struktur bzw. ihren Vernetzungsgrad ändern. Es gibt polymerbasierte und solche auf Epoxid-Harz-Basis. Die Letzteren setzen sich aus drei Komponenten zusammen: Epoxid-Harz, Lösungsmittel und einer photosensitiven Komponente. [12] Epoxid-Harze haben eine 1,2-Epoxy-Gruppe, die zu dreidimensionalen Strukturen vernetzen kann. Man unterscheidet zwischen so genannten negativen Resisten und positiven Resisten. Die photosensitive Komponente entscheidet darüber, um welchen Typ es sich handelt. Bei negativen Resisten kommt es durch Belichtung zur Vernetzung. Der Photoinitiator kann hierbei das Salz einer Säure sein (z. B. Triarylium-sulfonium Salz im Photolack SU-8), das durch die Belichtung wieder in eine Säure verwandelt wird. Während eines nachfolgenden Heizschritts reagiert die Säure mit der Epoxy-Gruppe des Epoxidharzes. Dabei entstehen Radikale, die eine weitere Polymerisierung auslösen und vernetzen. Die belichteten Bereiche verfestigen sich. [29] Positive Resiste werden zunächst durch einen Temperierungsschritt polymerisiert. Durch Belichtung werden die Vernetzungen wieder gelöst. Der Photoinitiator kann z.b. ein Diazonaphtoquinon-(DNQ)-Sulfonat sein. Er wandelt sich durch Belichten unter Wasseraufnahme in eine Indenkarbonsäure um, deren Löslichkeit im Entwickler um eine Größenordnung über der des unbelichteten DNQ-Sulfonats liegt. Die nicht belichteten Bereiche bleiben weiter vernetzt. [27] 16

21 Theorie Mit EntwicklerlÖsung werden nicht verfestigte Bereiche gelöst und entfernt. Nur vernetzte Strukturen bleiben stehen. Photolacke sind sensitiv im UV-Bereich. Die Belichtung erfolgt je nach Photoinitiator mit der g-, h- oder i-linie. Abbildung 18: Unterschied zwischen negativem und positivem Resist. Beim positiven Resist bleiben die nicht belichteten Bereiche stehen. Beim negativen Resist bleiben die belichteten Bereiche stehen. [30] Durchführung der Photolithographie Als erstes wird der Photolack aufgebracht. Die Beschichtung des Substrats mit Photolack kann z. B. durch Spin- oder Spraycoaten erfolgen. Beim Spincoaten wird der fléssige Photolack mittels einer Lackschleuder auf das Substrat aufgeschleudert. Beim Spraycoaten wird ein Aerosol des Photolacks auf das Substrat aufgespréht. Der Vorteil des Spraycoaten gegenéber dem Spincoaten ist, dass beliebig geformte Substrate beschichtet werden können und eine homogene Bedeckung der Kanten mit Photolack möglich ist. [27] Nach dem Beschichten folgt ein Heizschritt, der Softbake. Dabei soll das LÖsungsmittel aus dem Photolack abdampfen. Dadurch wird u.a. ein Ankleben an die Maske verhindert, die Lackhaftung verbessert und die Blasenbildung durch N 2 beim Belichten vermindert. Als nåchstes wird durch eine Maske hindurch belichtet. Die Maske muss vollkommen undurchlåssig fér UV-Licht sein. HÅufig werden v.a. fér kleine Strukturen Chrommasken eingesetzt, aber es genégt auch eine lichtundurchlåssige Folie. Der Photolack wird nur an den Stellen belichtet, wo die Maske LÖcher aufweist. Die Belichtung erfolgt mit Licht im nahen UV-Bereich (à = 200 â 400 nm), das z. B. mit einer Quecksilberdampflampe erzeugt werden kann, deren Spektrum im UV-Bereich scharfe, intensive Linien aufweist. [27] Das optische System der nachfolgenden Beleuchtungseinheit sorgt dafér, dass die Maske gleichmåçig mit parallelem Licht beleuchtet wird. Das AuflÖsungsvermÖgen des Belichters wird durch Beugungseffekte begrenzt. Nach [31] gilt fér die maximal auflösbare StrukturgrÖÇe der Zusammenhang: ê 1 ç ë É é s Ü t ã, (9) min è å CD 2 wobei CD min = critical dimension, minimal GrÖÇe der auflösbaren Struktur à = WellenlÅnge, mit der belichtet wird s = Abstand zwischen Maske und Photolack (ägapã) t = Schichtdicke des Photolacks 17

22 Theorie Da die Auflösung vom Abstand zwischen Maske und Photolack abhängt, können zwei Verfahren unterschieden werden: das Kontakt- und das Proximity-Verfahren. Abbildung 19: Unterschied zwischen Contact- und Proximity-Verfahren. Beim Proximity-Verfahren ist während der Belichtung eine Lücke zwischen Photolack und Maske. Beim Contact-Verfahren liegt die Maske direkt auf dem Photolack. [32] Beim Kontakt-Verfahren liegt die Maske auf dem Substrat auf. Dadurch erhält man eine bessere Auflösung. Allerdings können Substrat oder Maske dabei beschädigt werden. Beim Proximity-Verfahren bleibt zwischen Substrat und Maske ein Spalt. Die Auflösung wird dadurch auf Grund von Beugungseffekten an den Kanten der Maskenöffnungen schlechter. Es besteht jedoch keine Gefahr mehr, Substrat oder Maske zu zerstören. [30] Nach der Belichtung erfolgt ein weiterer Heizschritt, der Post Exposure Bake (PEB). Dabei werden mechanische Spannungen in der Lackschicht abgebaut. Bei negativen Resisten ist ein PEB immer nötig, um die bei der Belichtung initalisierte Quervernetzung zu Ende zu führen. Der belichtete Photolack verändert seine Beschaffenheit (vgl ) Mit einer Entwicklerlösung können selektiv nicht-verfestigte Bereiche vom Substrat abgelöst werden. Die nicht mehr vom Photolack geschützten Substratstellen werden durch Ätzen entfernt. Der verbliebene Photolack wird mit einer Entwicklerlösung entfernt. Es gibt auch Photolacke, wie z. B. SU-8 die selber als Substrat verwendet werden können. Die Ätzung und die Entfernung des Resists entfallen dann. Abbildung 20: Schematische Darstellung der Schritte bei der Photolithographie mit SU-8 als Substrat. Der Photolack ist gleichzeitig das Substrat für die späteren Strukturen. Es ist daher keine weitere Schicht nötig. Die Ätzung entfällt. [33] 18

23 Theorie Softlithographie Die Softlithographie wurde von Xia und Whitesides entwickelt und kann als Alternative oder Ergänzung zur Photolithographie gesehen werden [34]. Mit ihr können kostengünstig Strukturen mit Strukturbreiten bis in den nm-bereich erzeugt werden. Der erste Schritt bei der Softlithographie ist immer die Herstellung eines Polymerstempels mit reliefartiger Oberfläche. Dazu wird ein flüssiges Polymer über eine Masterstruktur gegossen und vernetzen gelassen. Das vernetzte Polymer kann vom Master abgelöst werden. Es hat die negative Struktur des Masters. Als Polymer wird im allgemeinen Polydimethylsiloxan (PDMS) verwendet. [34] Abbildung 21: Herstellung einer PDMS Struktur. Der Master wird mit flüssigem PDMS übergossen. Nach dem Aushärten kann das strukturierte PDMS abgezogen werden. [33] Der Stempel dient dann zur Erzeugung der weiteren Strukturen. Dafür sind verschiede Techniken bekannt, von denen hier nur das Put-down und das Lift-up Verfahren kurz erwähnt werden sollen. Diese Methoden werden v. a. mit PEDOT/PSS (vgl ) angewendet. Das PEDOT/PSS wird dabei entweder mit dem Polymerstempel auf ein Substrat aufgebrach (Put down) oder von diesem entfernt (Lift up) [35]. Hierbei entwickelte Vorgehensweisen, für die Anhaftung von PEDOT/PSS an PDMS sind auch für die vorliegende Arbeit von Interesse (vgl ). Der Polymerstempel ist an sich bereits eine Struktur, die auch für andere Zwecke als zum Stempeln verwendet werden kann Oberflächenaktivierung von PDMS PDMS ist hydrophob und inert. Um PDMS beschichten oder binden zu können, muss die Oberfläche aktiviert werden. Neben der Anwendung chemischer Adhäsionsvermittler und thermischen Schweißens kann die Plasmaaktivierung mit O 2 -Plasma verwendet werden [36], [37]. Die Plasmabehandlung hat zwei hauptsächliche Effekte auf die PDMS-Oberfläche. Zum einen werden durch das Plasma Verunreinigungen entfernt. Die Haftung wird erleichtert. Der entscheidendere Effekt ist jedoch die chemische Veränderung der Oberflächenschicht. Genauer gesagt wird im O 2 -Plasma die -O-Si(CH 3 ) 2 - Gruppe in eine Silanol Gruppe (-Si-OH) umgewandelt [38]. Die Oberfläche wird dadurch hydrophil und das aktivierte PDMS kann an ein anderes aktiviertes PDMS oder an Glas binden. Die Theorie besagt allerdings, dass eine zu lange oder zu intensive Plasmabehandlung auf der PDMS-Oberfläche eine glasartige Schicht erzeugt. Eine Bindung wird dann unmöglich. [36] Die plasmaaktivierte Bindung ist irreversibel. Sie lässt sich mechanisch nicht mehr lösen. Allerdings kann längerer Kontakt mit Wasser die Bindung schwächen. [36] 19

24 Theorie Die VerÅnderung der OberflÅche ist nicht dauerhaft. An Luft hålt sie etwa 30 min an. Besonders hohe Luftfeuchtigkeit kann dazu féhren, dass die Wirkung schneller vergeht. [36] Eine rasche Verarbeitung ist daher fér eine gute Bindung essentiell. O 2 -Plasma låsst sich mit verschieden Mitteln erzeugen. Eingegangen wird hier nur auf die in der vorliegenden Arbeit verwendeten Methoden der Koronaentladung und des Plasmaofens. Unter Koronaentladung versteht man allgemein gesprochen eine äelektrische Entladung, die durch Ionisation eines Fluides entsteht, das einen elektrischen Leiter umgibtã [12]. Dieses Fluid kann auch Luft sein, in welchem Fall O 2 -Plasma entsteht. Die elektrische Entladung låsst sich mit Mikrowellen oder sehr einfach durch einen Elektroschocker bewirken. Das Plasma entsteht dabei durch StoÇionisation nach einer Spitzenentladung. Der Vorteil gegenéber anderen Arten der Plasmaerzeugung ist, dass das Plasma bei AtmosphÅrendruck erzeugt wird und dadurch einfacher im Labor zu realisieren ist. Ein konstanter Gasstrom wird nicht benötigt. Allerdings wird es schwieriger die OberflÅchenaktivierung homogen zu halten. [39] Im Plasmaofen erfolgt die Plasmaerzeugung im Vakuum. Dabei wird zunåchst die Probenkammer evakuiert, dann das Gas eingeleitet und das Plasma gezéndet. Der Vorteil eines Plasmaofens ist, dass Leistung und Gasfluss verhåltnismåçig konstant bleiben. Dadurch werden ein homogenes Plasma und damit auch eine homogene OberflÅchenaktivierung erreicht. Diese ist wichtig fér eine feste und einheitliche Bindung. Zudem ist sichergestellt, dass mit reinem O 2 -Plasma gearbeitet wird. Abbildung 22: Schematische Darstellung einer Plasmaanlage. ZunÅchst wird der Rezipient evakuiert und dann ein Gas eingelassen. Mit Hilfe eines Hochfrequenzgenerators kann dann an der Elektrode im Rezipienten eine Ionisation erfolgen. Das Plasma wird gezéndet. [40] Leitfähige Polymere Die leitfåhigen Polymere gehören zur Gruppe der organischen Halbleiter. Im Allgemeinen sind organische MolekÉle Isolatoren. Es gibt jedoch Ausnahmen â die organischen Halbleiter. Ihre LeitfÅhigkeit beruht auf delokalisierten Elektronen in einem konjugierten System. Unter konjugierten Systemen versteht man MolekÉle mit kovalenten Bindungen, bei denen sich Einzel- und Doppelbindungen abwechseln (z.b. C-C=C-C=Cusw.) Die beiden Kegel des p z -Orbitals einer Kohlenstoff-Doppelbindung Éberlappen dabei mit den beiden Kegeln des benachbarten p z -Orbitals. Es entsteht ein å-åç (bindend-antibindendes) MolekÉlorbital mit einer Knotenebene. Die Elektronen sind dabei delokalisiert, d.h. Éber das gesamte å-åç-orbital verschmiert. Das bindende Orbital entspricht hierbei dem Valenzband eines Halbleiters und das anti-bindende dem Leitungsband. [41] 20

25 Theorie Abbildung 23: Darstellung der Energieniveaus bei der Überlappung zweier p-orbitale (mittlerer Energieniveaus) zu einem bindenden (unteres Energieniveau) und einem antibindenden (oberes Energieniveau) p- bzw. p*-orbital. Zwischen dem höchsten besetzten Molekülorbital (HOMO) und dem niedrigsten unbesetztem Molekülorbital (LUMO) besteht eine Energiedifferenz. [53] Durch die Dotierung mit einem Donor oder Akzeptor brechen die Doppelbindungen auf und die Delokalisierung der Elektronen wird gestört. Es können freie Ladungsträger im Leitungsoder Valenzband entstehen. Die p z -Orbitale überlappen nicht mehr. In den einzelnen konjugierten Abschnitten des Moleküls ergibt sich daraus eine energetische Lücke (energy gap) zwischen dem höchsten besetzten Molekülorbital (HOMO) und den niedrigsten unbesetzten Molekülorbital (LUMO). Dies ist mit einem Halbleiter vergleichbar. [41] Abbildung 24: Bändermodell der verschiedenen Leitertypen. In einem Atomverband nähern sich die charakteristischen Energieniveaus benachbarter Atome auf Grund elektrostatischer Wechselwirkungen einander an. Dadurch liegen die quantenmechanisch erlaubte Energieniveaus dichter beieinander und können als Kontinuum betrachtet werden ( Energiebänder ). Das Valenzband ist das höchste voll besetzte Band, das Leitungsband ist das darüberliegende nicht voll besetzte Band. Dazwischen gibt es eine verbotene Zone ( Energielücke ). Bei Nichtleitern ist die Energielücke so groß (>3 ev), dass bei Raumtemperatur keine Elektronen vom Valenz- ins Leitungsband gelangen können. Bei Leitern überlappen sich Valenz- und Leitungsband. Bei Halbleitern ist die Energielücke <3 ev und Elektronen können bei Raumtemperatur vom Valenz- ins Leitungsband gelangen. Durch Dotierung können zusätzliche Ladungsträger in einen Halbleiter eingebracht werden, die die Energielücke verringern. [54] Zu den leitfähigen Polymeren gehören u.a. Polyanilin, Polypyrrol und Polythiophene (z.b. Poly-3,4-ethylendioxythiophen (PEDOT)) [41]. 21

26 Material und Methoden 3 Material und Methoden 3.1 Chemikalienliste Photoresist: Nano TM SU Formulation 100 MicroChem Nano TM SU Formulation 10 MicroChem Entwickler: mr-dev 600 micro resist technology Polydimethlsiloxan (PDMS) Elastosil RT 601A (Base) Wacker Silicones ( ) Elastosil RT 601B (Cure) Wacker Silicones ( ) Poly-3,4-ethylendioxythiophen (PEDOT) Baytron P Formulierung CPP 105D H. C. Starck GmbH (Goslar) Lösungsmittel Ethanol (70%ig) Roth (9065.2) Isopropanol Merck Aceton J. T. Baker Fluoreszenzfarbstoff Fluoresceinisothiocyanat (FITC) Roth (3745.1) Adhäsionsvermittler Poly-L-Ornithin Sigma-Aldrich (P-4957) Poly-L-Lysin Sigma-Aldrich (81338) Laminin Sigma-Aldrich (L-2020) Medien PBS (Phosphat Buffered Saline) Gibco (14190) NBS (Neurobasalmedium) Gibco (21103) mit den Zusätzen B27 (2%) Gibco (17504) Lipid-Mixture (0,1%) Sigma-Aldrich (L-0288) Fatty Acid Supplement (0,1%) Sigma-Aldrich (F-7175) Natriumpyruvat (30 mg/l) AG Ziegler Alenyl-Glutamin (2 mm) Sigma-Aldrich (G-8541) HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) Gibco (14170) Trypsin-Lösung HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) Gibco (14170) mit den Zusätzen Trypsin (0,25%) Sigma (T4799) EDTA (0,07%) Fluka BioChemika (62401) D(+)-Glukose (50 mm) Riedel-de Haën (16325) 22