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1 Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung Die ursprüngliche Idee dieser Arbeit: Die Anwendung der Oberflächenanalytik auf Protein-Protein-Interaktionen Maßgeschneiderte Oberflächen- die Bedeutung der Biosensorik am Beispiel der Funktionsweise von hgbp Proteinresistente (Bio-)Oberflächen Zielsetzung Theoretische Grundlagen Spezifische und unspezifische (Protein-)Adsorption an Oberflächen bei der Entwicklung von (Bio)sensoren Allgemeine mechanistische Aspekte der Proteinadsorption an Festkörperoberflächen Bestimmende Faktoren der Proteinadsorption an Festkörper-oberflächen Die Besonderheiten der Oligoethylenglykol(OEG)-SAM-Oberflächen Herstellung von selbstorganisierenden Monolagen (SAMs) Peptidthiol-SAMs Die Verwendung des Biotin-Streptavidin-Systems als Immobilisierungs-Assay Das Immunprotein hgbp1- ein Vertreter aus der Dynamin Superfamilie Interferone als Botenstoffe der Immunantwort Gemeinsamkeiten GTP-bindender Protein Die GBPs als Vertreter der Dynamin-verwandten Proteine Mx-Proteine als Vertreter der Dynamin Superfamilie mit antiviraler Aktivität Die Familie der Guanylat-bindenden Proteine Das Humane Guanylat-bindende Protein 1- funktionelle und strukturelle Aspekte Kurzdarstellung anderer verwendeter Proteine Material und Methoden Materialien für Oberflächenanalytik Verwendete Substrate Metalle für thermische Bedampfung im Vakuum Puffer und Lösungsmittel... 38

2 3.1.4 Thiolierte Reagenzien für Oberflächenmodifikation Verwendete Proteine Methoden für die Oberflächenanalytik Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie Metallisierung der Substrate für die SPR-Messungen Präparation der SAMs Oberflächenplasmonenresonanzmessungen zur Untersuchung verschiedener hgbp1-mutanten und ihres Dimerisierungsverhalten Überprüfung der Proteinresistenz von Peptidthiolen Rasterkraftmikroskopie Kontakt- und Tapping-Modus Nanoshaving und Nanografting Mikrokontaktstempeln Experimenteller Teil Metallisierung der Substrate für die AFM-Messungen Herstellung lateral strukturierter Oberflächen Infrarotspektroskopie/-mikroskopie FT-IR Mikroskopie Infrarotspektroskopie an Proteinen Experimenteller Teil Attenuated total reflection (ATR)-FT-IR-Messungen Messungen am IR-Mikroskop Überprüfung der Peptidthiol-Monolage Einfluss von Trifluorethanol (TFE) auf die Sekundärstruktur des Peptidthiols Inkubation von Puffer in Abhängigkeit von der Zeit IR-Messungen des Peptidthiols in Lösung Quartz Crystal Microbalance Dissipation (QCM-D) Experimenteller Teil QCM-Messungen zur Untersuchung verschiedener hgbp1-mutanten und ihres Dimerisierungsverhaltens Konfokale Fluoreszenzmikroskopie Experimenteller Teil Herstellung fluoreszeinmarkierter Proteine... 71

3 Messungen mit dem Fluoreszenzmikroskop Materialien für die molekularbiologischen und biophysikalischen Methoden Chemikalien Verbrauchsmaterialien Reagenzienkits Enzyme und Marker Säulenmaterialien Antibiotika Mikroorganismen Nährmedien Vektoren Mutationsprimer Sequenzierprimer Puffer Molekularbiologische Methoden Isolierung von Plasmid-DNA Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) Sequenzierung Herstellung kompetenter Zellen Quick Change Site Directed Mutagenesis Transformation Verdau von DNA mittels Restriktionsenzymen Ligation Proteinbiochemische Methoden Präparative Proteinexpression Zellernte Zelllyse Co 2+ -NTA-Affinitätschromatographie Größenausschlusschromatographie Aufkonzentrierung über Ultrafiltration SDS-PAGE (Sodium Dodecyl sulphate Polyacrylamide Gel Electrophoresis) Proteinkonzentrationsbestimmung nach Gill und von Hippel (1989) Biotinylierung von Proteinen mit Maleimid-PEG 11 -Biotin... 85

4 Quantifizierung der Biotinylierung von Proteinen Biophysikalische Methoden Ermittlung von Nukleotidkonzentrationen Analyse von Nukleotiden mittels reversed-phase HPLC Messungen der Nukleotidhydrolyse Zirkulardichroismus (Circular Dichroism, CD)-Spektroskopie Experimenteller Teil MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation-Time of Flight) Experimenteller Teil Überprüfung der Reinheit der Peptidproben Detektion verschiedener immobilisierter Proteine auf einer Goldoberfläche Detektion von Streptavidin und hgbp Das Streptavidin-hGBP1-System als Fallbeispiel für den Aufbau eines Multikomponentensystems auf SAM-Oberflächen Synthese und Aufreinigung von hgbp Biotinylierung von hgbp Biotinylierung über einen lysinspezifischen Biotinamidocaproylanker Diskussion der Ergebnisse Biotinylierung über einen cysteinspezifischen Biotinmaleinimidanker Zusammenfassung und Diskussion der Ergebnisse Oberflächenspektroskopische Untersuchungen des Streptavidin- hgbp1-systems Massenspektrometrischer Nachweis des immobilisierten Streptavidin und hgbp1 an der Biotin-SAM-Oberfläche Zusammenfassung und Diskussion der Ergebnisse Oberflächenplasmonenresonanzmessungen Einfluss der verwendeten Biotinthiolkonzentration auf die Immobilisierung von hgbp Zusammenfassung und Diskussion der Ergebnisse Überprüfung der unspezifischen Adsorption von Streptavidin und hgbp1 auf einem reinen OH-Thiol-SAM Kontrolle der Streptavidinbelegung Schichtdickenbestimmung mittels AFM und QCM

5 Zusammenfassung und Diskussion der Ergebnisse Überprüfung der GTP-Hydrolyse Aktivität der hgbp1-mutanten in Lösung und an der Oberfläche Zusammenfassung und Diskussion der Ergebnisse Dimerisierungsstudien von immobilisiertem hgbp1: Das StreptavidinhGBP1/hGBP1-System Oberflächenspektroskopische Untersuchungen des Streptavidin-hGBP1/hGBP1- Systems SPR-Bindungsstudien von hgbp1 wt mit den immobilisierten hgbp1- Mutanten Zusammenfassung und Diskussion der Ergebnisse Untersuchung der Dimerisierung von hgbp1 an die immobilisierten hgbp1- Mutanten mittels AFM und QCM Überprüfung der Dimerisierung von hgbp1 wt mittels konfokaler Fluoreszenzmikroskopie Diskussion der Ergebnisse Kinetikstudien zur Dimerisierung von hgbp1 mittels SPR Synthese und strukturelle Untersuchung von proteinre-sistenten Thiolen auf der Basis von Peptiden Zusammenfassung der Ergebnisse für das 10er-Peptidthiol Synthese und strukturelle Analyse des 25er-Peptidthiols Synthese und Charakterisierung des 25er-Peptidthiols mittels HPLC und MALDI-TOF Herstellung des Peptid-SAMS und Überprüfung der Proteinresistenz mittels SPR Sekundärstrukturanalysen des Peptidthiols mit der Infrarotspektroskopie Trockenmessungen im Volumen (Transmission) und im SAM (Reflexion) Sekundärstrukturanalyse des Peptidthiols in Lösung mittels IR und CD IR- und CD-Messungen in D 2 O Einfluss von Trifluorethanol auf die Sekundärstruktur des Peptidthiols Messungen des Peptidthiols an der Oberfläche in Pufferlösung

6 ATR FT-IR-Messung im Fluss (D 2 O) ATR FT-IR-Messungen des Peptidthiol-SAMs am Hyperion IR- Mikroskop (Bruker) Zusammenfassung und Diskussion der Ergebnisse Zusammenfassungen und Ausblick Das Streptavidin-hGBP1-System als Fallbeispiel für den Aufbau eines Multikomponentensystems auf SAM-Oberflächen Dimerisierungsstudien von oberflächengebundenem hgbp1: Das StreptavidinhGBP1/hGBP1-System Synthese und strukturelle Untersuchung proteinresistenter Thiole auf der Basis von Peptiden Quellenverzeichnis Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis Abkürzungsverzeichnis Publikationen Lebenslauf Danksagung

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