laborwelt Krebszellanalyse DNA Enrichment Zellbiologie Jetzt neu: Nr. 1 / Jahrgang Farbcode identifiziert Krebszell-Klone

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1 laborwelt Nr. 1 / Jahrgang Krebszellanalyse Farbcode identifiziert Krebszell-Klone DNA Enrichment Anreicherung von Zielgenen mit Mikrofluidik-Chips Zellbiologie Neue Anwendungen für die Durchflusszytometrie Jetzt neu:

2 best of biotech get your business started! // THE INTERNATIONAL BIOTECH & MEDTECH BUSINESS PLAN COMPETITION crevo.net

3 Inhalt Laborwelt 1 / Nachrichten aus der Wissenschaft Eingefrorene Pesterreger; Leuchtturm für Berlin; Biostrom aus der Stratosphäre; Lehrgang in Kommunikation; Fortgeschrittenes Tumorimaging; Forscher bauen Hefemagnete; Evolution: DNA springt mit; Auf den Spuren der Urmenschen 36 Labormarkt im Umbruch Qiagen schrumpft sich gesund Krebszellanalyse TITEL: Krebszellenanalyse Brustkrebszellen, die bei der Operation übersehen werden, sind der Hauptgrund für eine schlechte Prognose. Deutsche und holländische Experten entwickeln derzeit ein Verfahren, das die Krebszellen schon bei der OP sichtbar macht (S. 19) I Wissenschaft Technologie 17 Auffinden einer Mutation für erblichen Hörverlust mit Capture Arrays Burkhard Ziebolz, Roche Applied Science, Penzberg Blitzlicht Fertigung 20 Kunststoff-Know how: Basis für Lab-on-Chips zur Zielgenanreicherung Manfred Konrada, Sony DADC Austria AG, Salzburg Blitzlicht Automation 22 Automation der Zielgenanreicherung für den GS FLX Darren Birr, 454 Life Science, Branford, USA Expertenpanel Diagnostik 24 Sequenzierungs-basierte Diagnostik Kerstin Stangier, Dr. Saskia Biskup, Daniela Steinberger, Hanns-Georg Klein Paperwelt Highlight des Monats 26 Chromothripsis wenn das Genom explodiert Jan Korbel, EMBL, Heidelberg Zellbiologie III Wissenschaft Einzelzell-Analyse 6 RGB marking: Klonale Analyse von Krebszellen Boris Fehse et al., Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf Expertenpanel Imaging 9 Krebs sehen während der Operation Dr. Werner Scheuer, Roche Pharma, Penzberg; Prof. Dr. Go van Dam, Universitätsklinik Groningen, Niederlande Paperwelt Highlight des Monats 10 DNA-Methylierung als Marker für die Chemotherapie-Resistenz Matthias Ebert, Universität Heidelberg Blitzlicht Mikrofluidik 12 Isolierung zirkulierender Tumorzellen Markus Gusenbauer und Thomas Schrefl, Fachhochschule St. Pölten, Österreich Blitzlicht Proteomics 14 Validierung neuer Protein-Biomarker im Kampf gegen Prostatakrebs Ralf Schiess et al., Proteomedix AG, Schlieren, Schweiz Zellbiologie Spätestens seit EU-Politiker das Thema Tierversuche entdeckt haben, wird immer mehr Geld in zellbasierte Toxizitätstests investiert. Was die Tests können und nicht können, diskutieren Thomas Hartung, Jürgen Hescheler und Dirk Dressler im Expertenpanel auf Seite 35. Blitzlicht Zellkultur 28 Schneller Erregernachweis mit Nanomembranen Bret Barnhizer, Nanologix Inc, Hubbard, USA Blitzlicht Durchflusszytometrie 30 ReadyFlow lange Leuchtdauern für Flow Cytometry-Analysen Dr. Martin Gründkemeyer et al., Technologieförderung Münster GmbH Paperwelt Impfstoffe 32 Ein Baukasten für Impfstoffverstärker Carlos Guzman, Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung, Braunschweig DNA Enrichment II Zielgen-Anreicherung Bis auf das PacBio RS-System sind alle Next-Generation-Sequenzer auf einen PCR-Schritt vor der eigentlichen Sequenzierungsarbeit angewiesen, der Zielsequenzen anreichert. Eine mit dem GS FLX kompatible Plattform hat jetzt die Firma Hamilton Robotics vorgestellt (S. 22). Blitzlicht Imaging 33 Zellteilungsdauer im High-Content-Screening bestimmen Andreas Pippow et al., Fraunhofer FIT, St. Augustin; Bayer Healthcare, Berlin 37 Stellenmarkt Aktuelle Jobangebote 38 Verbände Kontakt zu den LABORWELT-Partnerverbänden 39 Produktwelt Neu auf dem Labormarkt 41 Termine Aktuelle Ankündigungen 42 Ausblick/Impressum LABORWELT 13. Jahrgang Nr. 1/2012 3

4 Nachrichten Aktuelles Forschung Den Pesterreger einfrieren Braunschweiger Forscher haben eine trickreiche Strategie zur Bekämpfung der Pest entwickelt. Angriffspunkt des Teams um Katja Böhme vom Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung in Braunschweig ist ein Regulatorprotein, das den Erreger bei Temperaturen unter 37 C ruhen lässt. Inaktivierten sie das molekulare Thermometer durch genetische Manipulation, konnte ein naher Verwandter des Pesterregers das Durchfallbakterium Yersinia pseudotuberculosis nicht mehr sein krankmachendes Programm im menschlichen Körper starten. Dieses wird durch das Schlüsselprotein LcrF aktiviert. Damit LcrF das bakterielle Verteidigungsprogramm scharfstellen kann, muss jedoch erst der Transkriptionsrepressor YmoA von der DNA gelöst werden. Dies geschieht in intakten Krankheitserregern, sobald sie in den Körper gelangen und die Temperatur auf 37 C steigt. Auch die LcrF-mRNA kann nur bei Körpertemperatur abgelesen werden; vorher bildet sie ein nicht ablesbares Knäuel. Wir konnten die Temperaturkontrolle von LcrF gleich auf zwei Ebenen beeinflussen, so Böhme. Zunächst haben wir die Menge von YmoA künstlich gesteigert und so das Gen für den Regulator LcrF inaktiviert. Zusätzlich tauschten die Forscher einzelne mrna-bausteine aus, so dass sich YmoA auch bei Körpertemperatur nicht mehr in seine Funktionsform entfalten konnte. Daraufhin war das Immunsystem in der Lage, die Erreger zu beseitigen. Ihre Forschungsergebnisse sehen die Forscher als Grundlage für die Entwicklung eines neuen Medikamentes. Ein Molekül, das die mrna von LcrF wie eine Klammer zusammenhält, würde die Yersinien inaktivieren und sie so dem Immunsystem ausliefern, so Abteilungsleiterin Petra Dersch. Außerdem würde ein solcher Wirkstoff ausschließlich die krankmachenden Yersinien treffen, da nur sie dieses molekulare Thermometer besitzen. Kommunikation Nachhilfe in Medienkompetenz Keine Geheimbünde, kein Elfenbeinturm und kein Fachkauderwelsch Wissenschaftler sollen ihre gewonnenen Erkenntnisse publik machen. Ein neugegründetes Institut wird den gewillten Forschern künftig beibringen, wie man gut mit der Öffentlichkeit kommuniziert: Wie Ende Februar bekannt wurde, soll das von der Klaus-Tschira-Stiftung gegründete Nationale Institut für Wissenschaftkommunikation (NaWik) im Oktober 2012 mit dem Lehrbetrieb beginnen. Es ist am Karlsruher Institut für Technologie (KIT) angesiedelt und wird zunächst für fünf Jahre mit insgesamt bis zu 10 Mio. Euro gefördert. Das NaWik kooperiert mit der Nature Publishing Group, zu der unter anderem auch Spektrum der Wissenschaft, Nature und Scientific American gehört. Zunächst ist geplant, Module zu entwickeln, die in die naturwissenschaftliche Ausbildung von Doktoranden und Master-Studenten am KIT integriert werden. Später sollen dann die besten Modelle deutschlandweit an Universitäten und Forschungsinstituten angeboten sowie Weiterbildungsmöglichkeiten auch für Postdocs und Gruppenleiter geschaffen werden. Forschung Leuchtturm für die Hauptstadt Ende Februar fiel die Grundsatzentscheidung: Teile des Max-Delbrück-Centrums für Molekulare Medizin und der Charité Universitätsmedizin Berlin werden zusammengeführt. Die Erwartungen, die Bundesforschungsministerin Annette Schavan an das neue Berlin Institute of Health stellt, sind groß: Mit diesem Projekt können wir eine Einrichtung von Weltrang für die Gesundheitsforschung schaffen und zwar in Sachen Spitzenforschung, wie auch die Nachwuchsförderung. Die Entscheidung hat Signalwirkung für ganz Deutschland. Wenn mit der Exzellenzinitiative 2017 bedeutende Geldmittel vom Bund wegfallen, dürfte an einigen Unis der Ruf nach alternativen Finanzierungskonzepten laut werden. Einrichtungen wie das Karlsruhe Institute of Technology (KIT) oder das Berlin Institute of Health könnten dann als Vorbild dienen. Von 2013 an sollen die beiden Einrichtungen verstärkt miteinander kooperieren, in einer zweiten Phase soll dann die strukturelle Weiterentwicklung hin zum Berlin Institute of Health erfolgen. Ob und wieviel Geld es dafür gibt, wurde indes nicht bekannt. Brennstoffzelle Biostrom aus der Stratosphäre Biologen der Universität Newcastle haben aus einer Flusswasserprobe sieben exoelektrogene Bakterien isoliert und zur Stromproduktion in einer mikrobiellen Brennstoffzelle eingesetzt. Die Ergebnisse des Teams um Jinwei Zhang und Grant Burgess wurden in Environmental Science and Technology veröffentlicht. Ließen die Briten die Mikroben als Biofilm auf den Kohlenstoffeletroden wachsen, produzierten sie soviel Strom, dass eine Lampe aufleuchtete. Als besonders effektiv erwiesen sich dabei zwei Außerirdische, auf die die Wissenschaftler überraschenderweise in ihrer Probe gestoßen waren: Bacillus stratosphericus und Bacillus altitudinis kommen in den oberen Schichten der Atmosphäre vor. In den mikrobiellen Brennstoffzellen (microbial fuel cells, MFC) der Forscher besiedeln die exoelektrogenen Mikroorganismen als Biofilm die Kohlenstoffelektroden. Über den Prozess der katalytischen Oxidation setzen sie dort organische Verbindungen in Elektrizität um. Jinwei und Burgess fanden heraus, dass auch die Zusammensetzung des Biofilms Einfluss auf die Stromproduktion hat: Biofilme aus einer einzigen Art waren denen aus mehreren Arten unterlegen. Mit einem Mix aus den 25 besten (bereits bekannten und neu entdeckten) exoelektrogenen Bakterienarten erreichten die Forscher eine Leistung von 200 mw pro Quadratmeter. Allerdings ist der Weg von der Labor-MCF zur Stromproduktion noch weit. Vom Labormaßstab bis in die großtechnische Produktion veranschlagen Experten rund 10 bis 20 Jahre Jahrgang Nr. 1/2012 LABORWELT

5 Aktuelles Nachrichten Forschung Echtzeit-Imaging verrät Tumorgewebe Irische Forscher haben ein neues Verfahren entwickelt, mit dessen Hilfe man in Echtzeit genau beobachten kann, wo sich im Körper Tumorgewebe befindet. Ziel der Gruppe um Erstautorin Michelle Cronin vom Universitäts- College Cork (UCC) ist es, Bakterien zur Bekämpfung von Krebs einzusetzen. Weil die Mikroben sich mit Vorliebe in Tumorgewebe aufhalten, versprechen sie ein exaktes Tumortargeting. Um das Fernziel zu erreichen, mussten die Mikrobiologen jedoch zuerst sicherstellen, dass die Bakterien das Krebsgewebe verlässlich erkennen und besiedeln. Ende Januar gelang der Nachweis: die Iren präsentierten ein Bildgebungsverfahren, mit dem sie den Weg der Bakterien dreidimensional in vivo verfolgen können. Dazu injizierten sie mit einem Biolumineszenz-Gen ausgestattete Bakterien ins Blut von Mäusen. Dank neuer optischer 3D- Tomographen konnten sie den Aufenthaltsort und die Anzahl der leuchtenden Einzeller so genau wie nie zuvor bestimmen. Bereits seit 15 Jahren wird am Tumortargeting mit Bakterien geforscht am intensivsten an Salmonella typhimurium. Erste klinische Studien mit Salmonellen ergaben indes, dass der therapeutische Nutzen die Gefahr, eine Immunantwort oder Krankheiten auszulösen, nicht aufwiegt. Die irischen Onkologen testeten daher auch nicht-pathogene Bakterien. Das Fazit der Forscher: Sie finden Krebs ebenso effektiv wie Salmonellen. Diese wollen die Iren nutzen, um Chemotherapeutika gezielt in den Tumor zu schleusen. Genetik Evolution: DNA springt mit Wiener Tiermediziner haben bei der Taufliege Drosophila malanogaster erstmals alle springenden Gene und deren Einbauorte komplett kartographiert. Die Transposons beeinflussen die Evolution offenbar viel stärker als gedacht, so das Fazit der Wiener Forschergruppe um Christian Schlötterer. Nach Durchzählen aller mobilen DNA-Elemente in einer Drosophila-Population mit einem eigens für diesen Zweck entwickelten Verfahren stellten die Forscher überraschenderweise fest, dass es im Genom viel mehr Stellen gibt, in die die Transposons potentiell springen können, als bisher gedacht (PLoS Genetics (2012): 8(1):e ). An insgesamt 13 Einbaustellen bisher waren nur zwei bekannt fanden die Forscher stabil eingebaute springende Gene, die sich sich offenbar positiv auf die Tiere auswirken. Für Schlötterer ein Beweis für die Bedeutung der Transposons in der Evolution: Wir sollten sie überhaupt nicht als Parasiten sehen. Sie gehören möglicherweise zu den Mechanismen, mit denen Organismen ihr genetisches Repertoire vergrößern, um besser auf zukünftige Herausforderungen vorbereitet zu sein. Mikrobiologie Forscher bauen Hefe-Magneten Forscher der Universität Harvard (Boston, USA) haben Hefezellen magnetisch gemacht. Dafür bedarf es nur überraschend weniger molekularer Tricks: Wie sie im Fachmagazin PLoS Biology berichten, orientiert sich die aufgerüstete Bäckerhefe in der Petrischale entlang magnetischer Feldlinien. Um Saccharomyces cerevisiae den Sinn für Magnetismus einzuimpfen, mussten die Forscher um Pamela Silver und Keiji Nishida zunächst das Gen für ein Eisentransportprotein zerstören, das das Eisen in die Vakuolen der Zelle entsorgt. Da das so im Zytosol angereicherte Eisen auch toxisch wirken kann, ließen die Forscher die Hefen daraufhin das menschliche Eisenspeicherprotein Ferritin herstellen. Ferritin umhüllt die Eisenionen. Damit kann eine größere Menge Eisen in der Zelle toleriert werden. Diese beiden Veränderungen reichten schon aus, um die Zelle für einen Magneten zu sensibilisieren. Doch Nishida und Silver war das nicht genug: Sie identifizierten ein Hefe-Gen, das die magnetische Sensibilität beeinflusst. Nachdem sie Extrakopien dieses Gens in die Hefezellen eingeschleust hatten, wurden die Zellen nochmals magnetischer. Neben dem wissenschaftlichen Erkenntnisgewinn versprechen magnetisch gemachte Zellen eine Reihe künftiger Anwendungen: die gezielte Verabreichung von Medikamenten, die Aufreinigung von Zellpopulationen oder die Detektion von Krebszellen. Allerdings sei es bis zu möglichen Anwendungen laut den Forschern noch ein weiter Weg. Mit Magneten in Form gebrachte Hefezellen Paläogenomik Auf den Spuren der Ur-Menschen Vor zwei Jahren überraschten die Leipziger Paläogenetiker um Svante Pääbo vom Max- Planck-Institut für Evolutionäre Anthropologie mit der Entdeckung einer neuen fossilen Menschenform. Jetzt haben sie im Internet die komplette DNA-Sequenz des Genoms des Denissova-Menschens in 30-facher Abdeckung offengelegt. In der Denissova-Höhle im Altai-Gebirge fanden russische Forscher 2008 das Fragment eines Fingerknochens. Die Analyse der daraus extrahierten DNA in Leipzig ergab, dass es sich weder um einen modernen Menschen (Homo sapiens) noch um einen Neanderthaler (Homo neanderthalensis) handelte. Der Homo denisova war entdeckt. Er gilt als einer der Vorfahren polynesischer und australischer Ureinwohner wurde die vorläufige Sequenz des Denissova-Genoms mit 2-facher Coverage veröffentlicht. Die Wissenschaftler hoffen, dass mit den neuen, viel genaueren Daten, die auch repetitive genomische Bereiche gut abdecken, genetische Veränderungen aufgespürt werden können, die für die Entwicklung des modernen Menschen wichtig waren. LABORWELT 13. Jahrgang Nr. 1/2012 5

6 Krebszellanalyse Einzelzell-Analyse I Krebszellanalyse RGB marking : Vielfarbige Zellmarkierung zur klonalen Analyse Dr. Kristoffer Weber, Michael Thomaschewski, Michael Warlich, Dr. Kerstin Cornils, PD Dr. Daniel Benten, Prof. Dr. Boris Fehse; Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf Biomarker sind ein Hauptprodukt der Publikationen über Krebs, die jeden Tag erscheinen, und von Großprojekten wie dem internationalen Krebsgenom-Projekt. Die Kunst besteht darin, aus der Fülle Kandidatengene, -RNAs, Proteine und Metabolite die biologisch relevanten herauszufiltern und auf dieser Basis Frühererkennungstests zu entwickeln. Denn noch immer gilt: je früher der Krebs erkannt wird, desto besser die Aussichten für den Patienten. Biomarker gesucht Über einen DNA-Methylierungsmarker, der anzeigt, ob Darmkrebspatienten auf eine Chemotherapie ansprechen, berichtet hier eine Gruppe um Matthias Ebert (Paper of the month). Die Forscher haben per DNA-Sequenzierung nicht nur den Transkriptionsfaktor, sondern auch den betroffenen Signalweg ausgemacht, der die Therapieresistenz bedingt. Mittels massenspektrometrischer Proteomanalyse haben dagegen Forscher der Universitätsausgründung Proteomedix vier Biomarker- Proteine identifiziert, die die Spezifität der Prostatakrebsdiagnose um mehr als 40% verbessert. Ihren Test sieht die Gruppe um Dr. Ralph Schiess als Ergänzung zum PSA-Test. Noch im Forschungsstadium ist dagegen eine von Thomas Schrefl und Kollegen (Technische Hochschule St. Pölten, Österreich) entwickelte Simulationssoftware, die die Optimierung mikrofluidischer Chips ermöglichen soll, die wie ein Molekularsieb zirkulierende Tumorzellen aus dem Blut filtern und so eine Früherkennung der Metastasierung erkennen. Über eine Technik, die es erstmals gestattet, die Entwicklung einzelner Tumorstammzellzellen zu verfolgen, hat jetzt ein Team vom Universitätskrankenhaus Hamburg-Eppendorf entwickelt. Zwar ist der methodische Fortschritt bei der Analyse von Krebs und Tumoren langsam. Die Integration der Daten über Biomarker verspricht für die Zukunft aber ein besseres Verständnis dieses komplexen Krankheitsbildes. Lentivirale Vektoren integrieren in das Zielzellgenom und erlauben so die permanente Markierung genetisch modifizierter Zellen und ihrer Nachkommen. Kodieren die eingebrachten Vektoren für Fluoreszenzproteine, lassen sich markierte Zellen anhand der emittierten Fluoreszenz im Mikroskop oder mit Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS) identifizieren. Wir konnten kürzlich zeigen, dass die simultane lentivirale Expression dreier Fluoreszenzproteine (Rot, Grün, Blau = RGB marking) im Einklang mit dem additiven Farbmodell zur Generierung spezifischer Mischfarben führt, welche an die Tochterzellen vererbt und so zu einer klonalen Eigenschaft werden. Darauf aufbauend eignet sich das RGB marking mit lentiviralen LeGO-Vektoren für die Verfolgung von Zellklonen sowohl im Rahmen der normalen Regeneration als auch der Kanzerogenese. Von Retroviren abgeleitete Vektoren haben sich als vielseitige Werkzeuge für die zellbiologische Forschung und die Gentherapie erwiesen. Ihre stabile Integration in das Zielzellgenom erlaubt die in vitro- und in vivo-untersuchung langfristiger Effekte der Expression eingebrachter Transgene 1. Auch für viele Anwendungen in der Gentherapie ist eine stabile Langzeitexpression des eingebrachten, therapeutischen Gens essentiell 2. Umgekehrt können retrovirale Vektoren auch benutzt werden, um interessierende Gene über lange Zeiträume mit Hilfe der RNA-Interferenz abzuschalten oder herunterzuregulieren 3. Allerdings ist die weitgehend ungerichtete Integration retroviraler Vektoren in das Zielzellgenom mit dem Risiko der unbeabsichtigten Aktivierung oder Zerstörung betroffener Genloci durch Insertionsmutagenese verbunden, welche im ungünstigsten Fall zur malignen Transformation der Zelle führen kann 4. Um das Risiko der Insertionsmutagenese zu minimieren, wurde die Architektur retroviraler Vektoren dahingehend optimiert, dass die starken viralen Promotoren und Enhancer aus den long terminal repeats (LTRs) entfernt wurden. Die Entwicklung solcher selbst-inaktivierenden (SIN-)Vektoren mit nicht-viralen Promotoren hat zu einer signifikanten Verringerung des Risikos der Insertionsmutagenese im Tiermodell geführt 5,6. LeGO-Vektoren und Fluoreszenzproteine zur Zellmarkierung Eine weitere Möglichkeit der Risikoverringerung ist die Entwicklung von Vektoren auf Basis von Retroviren, die ein anderes Integrationsmuster aufweisen. So hat sich gezeigt, dass die als Ausgangsbasis für retrovirale Vektoren der ersten Generation benutzten γ-retroviren vom MLV-Typ (MLV = Murines Leukämievirus) eine Tendenz zur verstärkten Integration in Promotor- und Enhancerregionen von Genen aufweisen, die als besonders anfällig für die Insertionsmutagenese gelten 7. Dagegen integrieren vom Humanen Immundefizienzvirus (HIV) abgeleitete, lentivirale Vektoren 1 bevorzugt in transkribierte Sequenzbereiche außerhalb der Promotor- und Enhancerregionen 8. Andere, wie die α-retroviren, scheinen sogar ein völlig neutrales Integrationsbild zu zeigen, was sie zu vielversprechenden Kandidaten für die Vektorentwicklung macht 9. Lentivirale (SIN-) Vektoren werden aufgrund ihrer sehr hohen Effizienz in den unterschiedlichsten Zellsystemen und des angesprochenen geringeren Risikos einer Insertionsmutagenese derzeit in vielen Labors für die Transgenese benutzt. Wir haben kürzlich ein modulares Vektorsystem entwickelt, welches dem Baukastenprinzip folgt. Diese lentiviralen Gen-Ontologie (LeGO)-Vektoren erlauben die permanente Überexpression sowie die Herunterregulation von zu untersuchenden Genen 10, 11. Eine weitere, sehr interessante Anwendung der LeGO-Vektoren ist die permanente Zellmarkierung. Die Markierung und die damit verbundene Wiedererkennbarkeit von Zellen und deren Tochterzellen hat wesentlich zu einem besseren Verständnis normaler Regenerationsprozesse sowie der Entstehung und Entwicklung maligner Krankheiten beigetragen 12. Einen dauerhaften Entwicklungsschub für Markierungsansätze brachte in diesem Kontext die 2008 mit dem Nobelpreis für Chemie ausgezeichnete Entdeckung fluoreszierender Proteine und ihre Entwicklung als Markergene 13, 14. Allerdings ist trotz einer Vielzahl neu beschriebener Fluoreszenzproteine die Zahl unterschiedlicher und tatsächlich unterscheidbarer Marker auf eine Handvoll beschränkt 15. Praktisch bedeutet dies zum Beispiel, Jahrgang Nr. 1/2012 LABORWELT

7 Einzelzell-Analyse Krebszellanalyse Abb. 1: (a) Nach dem additiven Farbmodell entstehen durch die Mischung der drei Grundfarben Rot, Grün und Blau die drei Farben Gelb, Cyan und Magenta sowie Weiß, wenn alle drei Grundfarben überlagern. (b) Erfolgt die Mischung stufenlos, können theoretisch unendlich viele Farbtöne generiert werden. (c) Drei lentivirale Vektoren, die jeweils ein Fluoreszenzprotein in einer der drei Grundfarben exprimieren, werden gleichzeitig zur Transduktion von Zellen in vitro verwendet. Je nachdem, durch welche Vektoren eine Zelle transduziert wurde, wird sie verschiedene Kombinationen der Fluoreszenzproteine exprimieren. (d) RGB-markierte Zelllinien HEK-293T, BON und FH-hTERT. Durch die klonale Markierung der Zellen ist das unterschiedliche Wachstumsverhalten der verschiedenen Zelllinien in vitro erkennbar. [Modifiziert, nach Nat. Med. 17 (2011), ] dass auf der Basis einer permanenten Zellmarkierung mit den vorhandenen Fluoreszenzproteinen zwar die Organregeneration als ganzes, nicht jedoch der tatsächliche Beitrag einzelner Zellklone visuell nachvollziehbar ist 16. Genau der Beitrag distinkter Zellklone zur normalen Gewebsregeneration und zur überschießenden Regeneration und dem Auswachsen maligner Tumoren war es, der uns interessierte vor allem im Rahmen eines Projektes des SFB841 Leberentzündung: Infektion, Immunregulation und Konsequenzen. Daher standen wir vor der Aufgabe, mit der vorhandenen, begrenzten Zahl unterscheidbarer Fluoreszenzproteine eine möglichst unbegrenzte Zahl unterschiedlicher Zellklone definitiv identifizierbar zu machen. Eine Lösung dieses Paradoxons ergab sich aus der additiven Farbenlehre. Danach lässt sich in einem dreidimensionalen Farbraum aus den drei Grundfarben (Rot, Grün und Blau, RGB) jede beliebige Mischfarbe generieren (Abb. 1a, b). Dieses Verfahren der Farbmischung aus den Grundfarben wird zum Beispiel auch in Fernsehern und Computerbildschirmen verwendet. Die Frage war, ob sich das RGB Prinzip auch auf die LeGO Vektor vermittelte Expression dreier Fluoreszenzproteine in lebenden Zellen anwenden lässt (Abb. 1c). Um dies zu testen, benutzten wir drei LeGO Vektoren, die für jeweils ein Fluoreszenzprotein kodierten: LeGO C2 für mcherry (Rot), LeGO V2 für Venus (Gelbgrün) und LeGO Cer2 für Cerulean (Blau). Die Transduktion der Zielzellen erfolgte gleichzeitig mit allen drei Vektoren mit zuvor berechneten identischen Mengen infektiöser Partikel (sog. MOI = Multiplizität der Infektion). Die MOI war dabei so eingestellt, dass mit jedem einzelnen der drei Vektoren ca. 50% WORKING WITH NANO-GOLD? TRY: PARTICULAR GOLD NANOPARTICLES! made by physical laser ablation: Î Î Î pure, ligand-free gold without citrate or other residues available in water and other solvents direct conjugation to your biomolecules in our labs: Î Î Î high conjugation efficiency high surface coverage particle sizes between 5 and 50 nm Particular GmbH Hannover, Germany info@particular.eu particular.eu

8 Krebszellanalyse Einzelzell-Analyse Abb. 2: (a) Zahlreiche RGB-markierte Lebertumoren sind nach der Transplantation RGBmarkierter BON-Zellen im Leberschnitt sichtbar. Die meisten Tumoren sind einfarbig, einige mehrfarbig. (b) Einfarbige Tumoren wurden explantiert und in vitro kultiviert. (c) Sekundäre Tumoren nach Retransplantation der Zellen aus den primären Tumoren. Alle sekundären Tumoren sind einfarbig. (d) Sekundäre Tumoren nach Retransplantation gemischter Zellen beider primärer Tumoren. Hier sind sowohl einfarbige als auch gemischte, zweifarbige Tumoren sichtbar. (e) Molekulare Analyse der sekundären Tumoren (aus c und d) durch Insertionsstellen-spezifische PCR, zum Nachweis der klonalen Identität. [Modifiziert, nach Nat. Med. 17 (2011), ]. aller Zellen transduziert wurden. Somit waren aus kombinatorischer Sicht acht verschiedene Gruppen transduzierter Zellen zu erwarten, die jeweils 12,5% aller Zellen umfassen sollten (Tab. 1) 17. Vier dieser Gruppen waren durch die Expression mindestens zweier unterschiedlicher Fluoreszenzproteine charakterisiert und ließen mithin die für das RGB marking notwendige Entstehung von Mischfarben erwarten (Tab. 1). Eine grundlegende Voraussetzung für die Vielfalt der generierten Mischfarben bestand darin, dass die zu mischenden Grundfarben in unterschiedlichen Intensitäten vorliegen. Beim RGB marking mit LeGO-Vektoren sollte dies durch zwei wichtige Parameter des Gentransfers gewährleistet werden: Erstens, kann bei Gentransferraten von mehr als 50% pro Vektor davon ausgegangen werden, dass in einzelnen Zellen die Zahl der Vektorinsertionen für jede Farbe zwischen eins und drei variiert 18, 19. Zweitens ist bekannt, Tab. 1: Bei einer Transduktionsrate von 50% je Farbe, sind die dargestellten Gruppengrößen zu erwarten. Vektoren pro Zelle Gruppengröße rot 12,5 % grün 12,5 % blau 12,5 % rot + grün 12,5 % rot + blau 12,5 % grün + blau 12,5 % rot + grün + blau 12,5 % nicht transduziert 12,5 % dass die Integrationsstelle eines Vektors einen signifikanten Einfluss auf die Expression des eingebrachten Transgens hat 19.Die entscheidende Frage war, ob diese beiden Parameter zusammengenommen nicht nur hochspezifisch für eine gegebene Zelle sind, sondern auch an alle Tochterzellen weitergegeben werden und somit einen klonalen Marker darstellen. Wie erste Analysen in vitro mit HEK293T- Zellen zeigten, erlaubte das RGB marking tatsächlich die Identifikation von Zellklonen anhand der spezifischen Farbe, die allen Zellen des Klons gemein war (Abb. 1d) 17. Dabei werden die verschiedenen Zellklone anhand ihrer individuellen Farbe im Fluoreszenzmikroskop direkt sichtbar gemacht, ohne dass die Zellintegrität zerstört werden muss (Abb. 1d). Damit ist eine Klonalitätsanalyse in sehr kurzer Zeit möglich. Im nächsten Schritt war die für die Anwendbarkeit des RGB marking entscheidende Frage der Farbkonstanz in vivo zu klären. Eines der von uns dazu benutzten Modelle basierte auf der seriellen Transplantation von RGB-markierten karzinogenen BON-Zellen. Wie erwartet hatten die RGB-markierten BON-Zellen in primären Rezipienten Lebertumoren gebildet, die in der Mehrzahl aus Zellen ein- und derselben Farbe bestanden (Abb. 2a) 17. Allerdings waren auch einige Mischtumoren nachweisbar (Abb. 2a) 17. Wir explantierten einige der monochromen Tumoren, vereinzelten die Zellen und nahmen diese in Kultur. Wie wir zeigen konnten, wiesen alle aus einem Tumor isolierten Zellen über den gesamten Beobachtungszeitraum hinweg dieselbe Farbe wie der Ursprungstumor auf (Abb. 2b) 17. Wurden diese Zellen in sekundäre Rezipienten transplantiert, entstanden erneut Tumoren, die durch die gleiche RGB-Farbe wie der Ausgangstumor charakterisiert waren (Abb. 2c) 17. Mischten wir für die Transplantation RGB-markierte Zellen, die von zwei unterschiedlichen Tumoren abstammten, entstanden in den Sekundärrezipienten sowohl monochrome Tumoren, die den beiden Ausgangstumoren entsprachen, als auch zweifarbige Tumoren, die aus Zellen beider Ausgangstumoren bestanden (Abb. 2d) 17. Folglich haben nicht die Zellen innerhalb eines Tumors in vivo ihre Farbe geändert, sondern mehrfarbige Tumoren sind aus mehreren Zellen verschiedener Farbe entstanden. Mit diesen sowie damit einhergehenden molekularbiologischen Untersuchungen (Abb. 2e) konnten wir nachweisen, dass das RGB marking eine klonale, langfristige und eindeutige Zellmarkierung in vivo ermöglicht 17. Insgesamt ist es uns gelungen, mit dem RGB marking eine neue Methode der klonalen Zellmarkierung zu entwickeln, die für unterschiedlichste Anwendungen sowohl in Modellen der regenerativen Medizin als auch der Kanzerogenese von großem Interesse sein dürfte. Literatur [1] Naldini, L. et al., Science 272 (1996), [2] Alexander, B.L. et al., Gene Ther. 14 (2007), [3] Singer, O., Verma, I.M., Curr Gene Ther. 8 (2008), [4] Baum, C. et al., Hum Gene Ther. 17 (2006), [5] Cornils, K. et al., Mol Ther. 17 (2009), [6] Zychlinski, D. et al., Mol Ther. 16 (2008), [7] Wu, X. et al., Science 300 (2003), [8] Wang, G.P. et al., Genome Res. 17 (2007), [9] Suerth, J.D. et al., J Virol. 84 (2010), [10] Weber, K. et al., Mol Ther. 16 (2008), [11] Weber, K. et al., Gene Ther. 17 (2010), [12] Barese, C.N., Dunbar, C.E., Hum Gene Ther. 22 (2011), [13] Giepmans, B.N. et al., Science 312 (2006), [14] Chalfie, M., PNAS USA, 106 (2009), [15] Shaner, N.C. et al., Nat Methods 2 (2005), [16] Vafaizadeh, V. et al., Stem Cells 28 (2010), [17] Weber, K. et al., Nat Med. 17 (2011), [18] Fehse, B. et al., Gene Ther. 11 (2004), [19] Kustikova, O.S. et al., Blood 102 (2003), Wir möchten uns bei vielen Kollegen bedanken, die uns mit Zellen und Konstrukten unterstützt haben: H. Wege (Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf) für FH-hTERT Zellen, R.Y. Tsien (Howard Hughes Medical Institute) mcherry cdna, A. Miyawaki (RIKEN) und T. Schroeder (Institute for Stem Cell Research) Venus cdna und D.W. Piston (Vanderbilt-Ingram Cancer Center) für Cerulean cdna. Durchflusszytometrie wurde in der FACS Sorting Core Unit des Universitätsklinikums Hamburg- Eppendorf durchgeführt. Konfokale Mikroskopie wurde mit Hilfe von O. Bruns (Heinrich-Pette-Institut Hamburg) in Zusammenarbeit mit dem Nikon Application Center Norddeutschland durchgeführt. Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB841 an B.F. und D.B.) und die Nachwuchsförderung des Forschungsförderungsfonds der Medizinischen Fakultät Hamburg (NWF-12/09 an K.W.). Korrespondenzadresse Prof. Dr. Boris Fehse Forschungsabteilung Zell- und Gentherapie Klinik für Stammzelltransplantation Onkologisches Zentrum UCCH UK Hamburg-Eppendorf Martinistr. 52, Hamburg Tel./Fax: / Jahrgang Nr. 1/2012 LABORWELT

9 Expertenpanel Krebszellanalyse Real-time Tumor-Imaging Bereits seit 60 Jahren träumen Krebschirurgen davon, Tumore spezifisch anzufärben und diese dann während der Operation besser sichtbar machen zu können. Denn ein verbessertes Erkennen und Entfernen des Tumorgewebes verspricht bessere Aussichten für die Patienten. Bisherige krebsspezifische Farbstoffe blieben indes meist im Tierversuchsstadium, weil ihre Eigenschaften nicht ohne weiteres auf den Menschen übertragen werden können und daher die Kosten klinischer Studien von mehr als 1 Mio. Euro als zu risikoreich galten. Zusätzlich erfassten Fluoreszenzkameras nicht nur die Fluoreszenz, die von den markierten Zellen ausging, sondern auch die Eigenfluoreszenz, Reflexion, Streuung etc. Angesichts der Zulassung der ersten klinischen Studien zum intraoperativen Tumor-Imaging befragte LABORWELT einen Farbstoff- und einen Kamera-Experten, was sich geändert hat und wohin die Entwicklung geht. Werner Scheuer Dr. Werner Scheuer, ist Forschungsleiter in der Abteilung pred, Discovery Oncology, bei Roche Diagnostics GmbH in Penzberg. LABORWELT Welche Methoden gibt es, Tumorzellen spezifisch zur Fluoreszenz anzuregen, und wo liegen ihre jeweiligen Stärken und Schwächen? Scheuer Die beste Methode, um spezifisch Tumorzellen zu identifizieren, ist der gezielte Einsatz von mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Antikörpern, die gegen ein Tumor-assoziiertes Zelloberflächen-Antigen gerichtet sind. Entsprechende Antikörper-Fluorophor-Konstrukte bilden die Grundlage des FACS-Verfahrens, das bereits seit Jahren eingesetzt wird, um Tumorzellen ex situ zu identifizieren. Zusätzlich werden diese Antikörper zur immunhistochemischen Untersuchung von Krebs in Gewebebiopsien eingesetzt. Das Krebsantigen sollte dabei funktionell am Wachstum des Primärtumors beteiligt sein und mit dem Schweregrad der Erkrankung korrelieren. Sogenannte Quantum dots weisen zwar exzellente (Fluoreszenz-) Eigenschaften auf, aber sie können sich in der Leber anreichern oder von Makrophagen aufgenommen werden und sind oft toxisch. Auch wurden Antikörper eingesetzt, die mit radioaktiven Isotopen markiert waren. Diese zeigten aber Nachteile wie eine geringe Auflösung und eine kurze Lebensdauer beziehungsweise Halbwertszeit. Um für den intraoperativen Einsatz geeignet zu sein, muss ein krebsspezifischer Marker besondere Anforderungen erfüllen. Physikochemisch sind insbesondere eine hohe Quantenausbeute, eine Emission im fernen Infrarotbereich, hohe Fluoreszenzstabilität und Lagerfähigkeit, Nichttoxizität sowie eine einfache und wirtschaftliche Produktion gefordert. Das Ankoppeln des Fluoreszenzlabels an den Antikörper sollte in einer Ein-Schritt- Reaktion erfolgen und nicht die Bindungskinetik an das Zielantigen stören. Zahlreiche Fluorophore müssen zudem optimiert werden, um Fluoreszenzbleaching zu vermeiden. Das Fluorophor-Antikörper-Konstrukt muss nach intravenöser Applikation eine optimale Serumstabilität aufweisen. Zudem ist seine Sicherheit in Cynomolgus-Makaken nachzuweisen. All dies erfüllen zwei an den Fluoreszenzfarbstoff IRDye800CW gekoppelte neue Antikörperkonstrukte, von denen einer unlängst die Zulassung für klinische Tests erhalten hat: der gegen das teils membrangebundene Antigen VEGF gerichtete Antikörper Avastin-IRDye800CW wird bereits ab diesem Herbst klinisch getestet. Danach sind auch Studien mit einem gegen den Her2/ neu-rezeptor gerichteten Antikörper Herceptin- IRDye800CW geplant. Sie sollen mikrodosiert (Faktor 100 unter minimaler Wirkkonzentration des therapeutischen Antikörpers) verabreicht werden. Gegenüber Labeling-Ansätzen, die auf die Spaltung fluoreszenzgelöschter Peptide durch Krebszellproteasen setzen, weisen die zugelassenen Label den Vorteil auf, nicht in die Zelle aufgenommen und dort möglicherweise abgebaut zu werden. Go van Dam Prof. Dr. Gooitzen van Dam, Principal Investigator, Forschungsgruppe Intraoperatives Optisches Imaging, Abt. Chirurgie, Univ. Groningen. LABORWELT: Wo liegen die Stärken und Schwächen der derzeitigen NIR-Fluoreszenz-Kamerasysteme, die zum intraoperativen Tumorimaging genutzt werden sollen? van Dam: Momentan gibt es nur ein einziges tatsächlich klinisch angewandtes Infrarot-Fluoreszenzkamerasystem, das Chirurgen in Kombination mit krebsspezifischen Fluoreszenzfarbstoffen hilft, zwischen Tumorgewebe und gesundem Gewebe zu unterscheiden. Es wurde von Vasilis Ntziachristos entwickelt, der am Helmholtz-Zentrum München und der Technischen Universität München forscht, und von unserer Gruppe im vergangenen Jahr erstmals an Patientinnen mit Eierstockkrebs getestet. Alle anderen Imaging-Systeme, die bisher mit demselben Ziel entwickelt wurden, sind videographische Systeme. Das Photodynamic Eye von Hamamatsu Photonics, das Fluobeam-System von Fluooptics aus Grenoble, das von der kanadischen Novadaq entwickelte Spy Imaging System oder das Artemis-System von O2view haben eines gemeinsam sie machen Videos, indem sie lediglich ein Bild aufnehmen, ohne das physikalische Verhalten des Lichtes im Gewebe zu berücksichtigen. Sie korrigieren nicht die Signalabschwächung, weder durch Streuung oder Absorption noch durch die Gewebeeigenschaften. Das waren genau die Herausforderungen, denen sich Vasilis gegenübersah, als er 2001/2002 mit der Entwicklung seines Systems begann: Lediglich eine Epifluoreszenzkamera zu montieren, war nicht genug. Denn ein Großteil der Signale ging infolge der Absorption des Blutes verloren, oder bedingt durch die Lichtstreuung an Fettgewebe. Von der physikalischen Seite her, also der In strumentation, unterscheiden sich die Kamerasysteme nicht wesentlich. Der maßgebliche Unterschied besteht in der Daten akquisition und -analyse. Das Fluoreszenzsignal wird beim multispektralen Imagingsystem mit Hilfe eines patentierten Algorithmus korrigiert, der die Gewebeeigenschaften berücksichtigt. In Maus-Modellen konnten wir mit dieser Imagingtechnik die Rate falsch-positiver und falsch-negativer Ergebnisse bereits erheblich verringern. Das aktuelle System erreicht dies durch die simultane Detektion multipler Wellenlängen, verbesserte Algorithmen und fortschrittene Graphic Processing Units (GPU). Eine gut durch den Chirurgen zu bedienende Software ermöglicht es, für jeden Patienten und seinen individuellen Tumor eine Kalibrierung durchzuführen und anschließend real-time-bilder aufzunehmen. Das System schafft damit die Grundlage dafür, Tumore schon während der Operation besser zu erkennen, besser zu entfernen und damit die Prognose der Patienten maßgeblich zu verbessern. In Pilotstudien im vergangenen Jahr haben wir bereits zeigen können, dass das System Eierstocktumore mit siebenmal höherer Auflösung erkennt als das menschliche Auge allein. In klinischen Studien, die in diesem Jahr an der Majo-Klinik in Rochester beginnen, soll dies an einer größeren Anzahl von Patienten statistisch untermauert werden. LABORWELT 13. Jahrgang Nr. 1/2012 9

10 Krebszellanalyse Paperwelt DNA-Methylierung als Marker für die Chemotherapie-Resistenz Matthias P.A. Ebert, Marc Tänzer, M.A., Benjamin Balluff, M.Sc., Elke Burgermeister, Antje Karen Kretzschmar, David J. Hughes, Reimo Tetzner, Catherine Lofton-Day, Robert Rosenberg, Anke C. Reinacher-Schick, Karsten Schulmann, Andrea Tannapfel, Ralf Hofheinz, Christoph Röcken, Gisela Keller, Rupert Langer, Katja Specht, Rainer Porschen, Jan Stöhlmacher-Williams, Tibor Schuster, Philipp Ströbel, and Roland M. Schmid: TFAP2E- DKK4 and chemoresistance in colorectal cancer, N Engl J Med Jan 5;366(1):44-53 Dass die Inaktivierung von Transkriptionsfaktoren durch DNA-Methylierung einen Hinweis auf das Ansprechen auf eine Chemotherapie geben könnte, haben Ebert et al in einer retrospektiven Studie mit initial 78 Patienten mit fortgeschrittenem kolorektalen Karzinom gefunden. Wurde der Transkriptionsfaktor TFAP2-e infolge einer Hypermethylierung weniger exprimiert, nahmen zugleich die Expression des DKK4-Gens sowie die Therapieresistenz gegenüber dem Chemotherapeutikum 5-Fluoruracil (5-FU) zu. In vier weiteren Kohorten mit insgesamt 220 radio- oder chemotherapiebehandelten Patienten ließ sich der Zusammenhang erhärten. Es zeigte sich ein signifikanter Zusammenhang zwischen der TFAP2-e-Hypermethylierung und 5-FU-Therapieresistenz. Umgekehrt sprachen Patienten mit TFAP2-e-Hypomethylierung mit sechsfach erhöhter Wahrscheinlichkeit auf die Chemotherapie an. Prospektive Studien und die Untersuchung der funktionellen Rolle von Dkk4 im Wnt-Signalweg sollen nun helfen zu klären, ob sich die DNA-Methylierung zur Vorhersage des Therapieansprechens eignet. LABORWELT: Was sind Ihre wichtigsten Ergebnisse? Ebert: Wir konnten mit unserer Arbeit zeigen, dass das epigenetisch regulierte Gen TFAP2-e in einer Vielzahl von kolorektalen Karzinomen methyliert und damit inaktiviert vorliegt. Wir haben zudem Hinweise gefunden, dass diese Hypermethylierung Einfluss auf das Ansprechen dieser Tumore auf eine Chemotherapie mit 5-Fluoruracil nimmt. Mechanistisch scheint es die TFAP2-e-Methylierung zu einer stärkeren Expression des DKK4-Gens zu führen, das zum Wnt-Signalweg gehört. Diese Ergebnisse sind retrospektiv erhoben worden. Deshalb der Konjunktiv. Ich möchte ich keine falschen Hoffnungen wecken, bevor die Resultate nicht in einer prospektiven Studie bestätigt wurden. LABORWELT: Wie sind Sie experimentell vorgegangen? Ebert: Nachdem wir gesehen hatten, dass bei TFAP2-e bei etwa 50% der Patienten methyliert vorlag, haben wir uns mit dessen Funktion beschäftigt. Wir haben festgestellt, dass es keinen besonderen Einfluss auf Zellwachstum- und -teilung hat. Aber wenn wir die Zellen mit 5-Fluoruracil behandelt haben, konnten wir sehen, dass sie unterschiedlich reagiert haben, je nachdem ob das TFAP-Gen methyliert vorlag oder nicht. Wir haben dann einen Screen gemacht, indem wir das TFAP in Zellen überexprimiert haben und mittels Microarrays die Auswirkung auf verschiedene Kandidatengene untersucht haben. Dabei fiel das DKK4-Gen auf. Aus anderen Publikationen war von DKK4 bereits bekannt, dass das Gen möglicherweise eine Rolle bei der Chemotherapieresistenz spielt. In einem weiteren Schritt haben wir dann gezeigt, dass es einen engen Zusammenhang zwischen der TFAP2-e-Methylierung und der dadurch induzierten DKK4-Überexpression gibt. LABORWELT: Wissen Sie schon, wie häufig der Marker bei kolorektalem Karzinom und bei anderen Krebsarten vorkommt? Ebert: Die Häufigkeit der Methylierung in kolorektalen Karzinomen liegt nach unseren Ergebnissen bei etwa 50%. Wir sind dabei, dies auch in anderen Krebsarten zu untersuchen. LABORWELT: Was ist ihr Ziel dabei? Ebert: Wir beschäftigen uns ja primär mit der Frage, warum die Chemotherapie bei einem Patienten wirkt und bei dem anderen nicht. Man würde gerne bei der Vielzahl von Substanzen, die zur Verfügung stehen, für jeden Patienten die ideale Zusammensetzung von Wirkstoffen Prof. Dr. Matthias Ebert Prof. Dr. Matthias Ebert Jahrgang 1968, ist seit 2011 Direktor der II. Medizinischen Klinik des Universitätsklinikums Mannheim der Universität Heidelberg. Der gebürtige Münchener wurde 1995 an der Universität Ulm promoviert und habilitierte sich 2002 als Facharzt für Innere Medizin. Nach Spezialisierung auf das Gebiet Gastro enterologie erhielt der Heisenberg- Stipendiat ( ) einen Ruf auf eine Professur für Klinische und Molekulare Gastroenterologie an die TU München (2006). Drei Jahre später wurde er zum Direktor des Roman-Herzog-Krebszentrums München bestellt. Eberts wissenschaftliches Interesse gilt der Pathogenese und Progression des Magenkarzinoms sowie der klinischen und translationalen Onkologie, insbesondere der Biomarkeranalyse. Der Inhaber mehrerer Patente hat mehr als 100 wissenschaftliche Arbeiten veröffentlicht. finden, auf die dessen Tumor gut anspricht. Wir und viele andere Gruppen denken, dass Biomarker dabei hilfreich sein können. Unser Marker zeigt, dass epigenetisch regulierte Gene ein möglicher Ansatzpunkt für die Vorhersage des Therapieansprechens sind. Die Befunde müssen aber, wie gesagt, durch prospektive Studie, also an noch nicht behandelten Patienten, zunächst abgesichert werden. Wir sind dabei, eine entsprechende Forschungsförderung zu beantragen. Erst danach werden wir soweit sein, einen entsprechenden Test zu etablieren, der die Wahrscheinlichkeit auf 5-FU anzusprechen, vorhersagt. LABORWELT: Wie gehen Ihre Arbeiten jetzt weiter? Ebert: Wir untersuchen die Rolle der TFAP-Methylierung auch in anderen Tumoren, und wir schauen uns auch andere Chemotherapeutika an. Drittens planen wir mit verschiedenen Partnern die angesprochene prospektive Studie, und viertens, wollen wir weiter aufklären, welche funktionelle Rolle Dkk4 tatsächlich bei der Chemotherapieresistenz spielt Jahrgang Nr. 1/2012 LABORWELT

11 NEUE LÖSUNGEN FÜR DIE FLÜSSIGCHROMATOGRAPHIE NEUE LÖSUNGEN FÜR DIE EFFIZIENTE ANALYSE VON BIOPOLYMEREN TOYOPEARL & TSKgel MEDIEN MIT HOHER BINDUNGSKAPAZITÄT HOCHLEISTUNGSSÄULEN FÜR HILIC, RPC, IEC AND SEC EcoSEC ALL-IN-ONE SYSTEM FÜR SEMI-MICRO GPC/SEC TREFFEN SIE UNS VOM 17. BIS 20. APRIL AUF DER ANALYTICA 2012 IN MÜNCHEN, HALLE A2, STAND 223, UND NEHMEN SIE AN UNSEREM ECOSEC RACING GAME CONTEST TEIL ODER BESUCHEN SIE UNSERE INTERNETSEITE

12 Krebszellanalyse Mikrofluidik Isolierung zirkulierender Tumorzellen DI (FH) Markus Gusenbauer, Dr. Thomas Schrefl, Fachhochschule St. Pölten Die Analyse der Menge zirkulierender Tumorzellen im Blut ermöglicht die Kontrolle des Erfolges einer Krebstherapie sowie die Überwachung des Tumorwachstums. Doch die Konzentration der Zellen im Blut ist niedrig, so dass ihre Anreicherung oder Isolierung erforderlich ist. Mikrofluidik-Chips zur Isolierung zirkulierender Tumorzellen werden in naher Zukunft eine wichtige Rolle beim Therapiemonitoring von Krebserkrankungen spielen. In miniaturisierten Fluid-Kanälen bilden magnetische Partikel Ketten, deren Abstand sich durch gezielte magnetische Quellenfelder manipulieren lässt. Die so entstandene Struktur eignet sich als Filter zur Isolierung der zirkulierenden Tumorzellen. Der hier vorgeschlagene Chip kombiniert die mechanische und die biomagnetische Filterung. Mit Hilfe von Computersimulation kann der Chip entwickelt und optimiert werden. Im Blut zirkulierende Tumorzellen (circulating tumor cells, CTCs) können für eine effektive und zielgerichtete Behandlung von Krebserkrankungen von Nutzen sein. Sie lösen sich vom Primärtumor und gelangen in den Blutkreislauf. Von dort können sie auch weitentfernte Organe erreichen. Aus diesem Grund entstehen oft tödliche Metastasen auch nach erfolgreicher Beseitigung eines Krebsgeschwürs. Durch die erstmalige Beobachtung (1869) dieser den Tumorzellen ähnelnden Zellen ergab sich ein neues diagnostisches Potential 1. Lange war es jedoch nicht möglich, zirkulierende Tumorzellen erfolgreich aus dem Blutstrom zu extrahieren. Allein durch die Abschätzung der Zahl der im Blut zirkulierenden Tumorzellen können Rückschlüsse auf den Status der Tumorerkrankung gezogen werden. Eine genauere Analyse einzelner Zellen führt zusätzlich zu einem verbesserten Verständnis der Biologie der verschiedenen Krebsarten und Metastasen. Der geringe Anteil an erkrankten Zellen im Blut erschwert aber die erfolgreiche Filterung. Es befindet sich nur etwa eine zirkulierende Tumorzelle unter mehreren hundert Millionen Blutzellen. Exitierendende Extraktionsmethoden für zirkulierende Tumorzellen In den letzten Jahren hat die Krebszellforschung erhebliche Fortschritte gemacht, auch bei der Analyse zirkulierender Tumorzellen. Es ist bereits möglich, einzelne Zellen aus dem Blut zu filtern und zu analysieren. Der Aufwand sei es an Zeit oder an Geldmitteln ist aber meist noch enorm. Es werden verschiedenste Technologien ineinander geschachtelt, um mit einzelnen Zellen arbeiten zu können. Im Fall der zirkulierenden Tumorzellen heißt das, dass durch mehrere Filtervorgänge die Zahl der nicht gesuchten Blutzellen stetig verringert wird. Der einfachste Ansatz der Filterung ist physikalischer Natur. Dazu wird der Größen- und Elastizitätsunterschied zwischen entarteten und gesunden Zellen genutzt. Zirkulierende Tumorzellen sind normalerweise etwas größer und lassen sich weniger deformieren als zum Beispiel rote Blutkörperchen. Dieses Wissen führte unter anderem zu mechanischen Membranfiltern 2. Einige weiße Blutkörperchen überschneiden sich aber in der Größenbandbreite mit den CTCs. Das führt zu nicht-eindeutigen Ergebnissen in der Filterausbeute das Verhältnis zirkulierender Tumorzellen zu den restlichen Blutzellen wird also zwar minimiert, aber sie werden nicht vollständig voneinander getrennt. Eine weitere Möglichkeit zur CTC-Aufreinigung ist der Einsatz von Antikörper-beschichteten Oberflächen, an denen das Blut vorbeigeführt wird. EpCAM-Proteine (epithelial cell adhesion molecule) können Tumorzellen epithelialen Ursprungs gezielt einfangen, während Blutzellen nicht an den Faktor binden. Tumorzellen anderen Ursprungs können durch spezielle Bindungsfaktor-Cocktails 3 angereichert werden. Die Wahrscheinlichkeit, dass eine zirkulierende Tumorzelle die spezielle Oberfläche berührt, ist dabei entscheidend für die erfolgreiche Extraktion. Eine Lösung ist die Generierung von Mikrosäulen in den Kanälen des CTC-Chips. Durch sie wird ein großes Oberflächen- zu Volumenverhältnis 4 erzielt. Eine unregelmäßige Anordnung solcher Säulen erhöht die Kontaktwahrscheinlichkeit 3. Ein zweiter Ansatz, die Wahrscheinlichkeit des Aufeinandertreffens des Fängermoleküls mit einer CTC zu erhöhen, kommt ohne Mikrosäulen aus. Fischgrätenförmige Muster an Wänden der Kanäle des CTC-Chips führen zu genügend Turbulenzen, um Kolli sionen der Fängermoleküle mit den zirkulierenden Tumorzellen herbeizuführen 5. Um neuartige Antikörper für alle bekannten und noch unbekannten Tumorzellen zu finden, werden allerdings eine große Zahl an einzelnen zirkulierenden Tumorzellen benötigt. Erst nach erfolgreicher Charakterisierung aller Zellen kann eine optimale Ausbeute erfolgen. Das heißt aber, eine Affinitätsfilterung allein führt derzeit noch nicht zum gewünschten Resultat. Kombination von Vorteilen Abb. 1: Dynamischer Mikrofluidik-Chip. (a) Magnetische Partikel, (b) Kettenbildung und Erzeugen der Filterstruktur, (c) Mechanische und biomagnetische Filterung, (d) Ausspülen der Blutzellen und Isolation der Krebszellen. Durch unterschiedliche Abstände von funktionalisierten Mikrosäulen können die mechanische und Affinitäts-Filterung kombiniert werden 6. Dadurch wird eine hohe Filter Jahrgang Nr. 1/2012 LABORWELT

13 Mikrofluidik Krebszellanalyse effizienz erreicht. Unsere Forschungsgruppe an der Fachhochschule St.Pölten beschäftigt sich derzeit mit der Entwicklung eines Simulationstools für Microfluidik-Chips im Rahmen des Projekts Tunable microfluidic chips for isolating circulating cancer cells der Life Science Krems GmbH. In dieser Arbeit werden magnetische Teilchen mit Antikörpern funktionalisiert. Mit Hilfe eines externen Magnetfeldes können dann gezielt Filterstrukturen, zum Beispiel in CTC-Chips, erzeugt werden. Durch die Kombination von mechanischen Filterketten und den affinen Partikeln lässt sich eine besonders gute Filtereffizienz erzielen. Abbildung 1 zeigt den Ablauf einer Filterung von zirkulierenden Tumorzellen: a. Zu Beginn werden die oben erwähnten weichmagnetischen Partikel in einen Microfluid-Chip beliefert. Diese Teilchen sind mit speziellen Antikörpern beschichtet, an die die Tumorzellen sich anheften. b. Durch Anlegen eines magnetischen Gradientenfeldes bilden diese magnetischen Beads Ketten in genau definierten Positionen. Deren Abstände können durch Veränderung des Magnetfeldes gesteuert werden. c. Sobald diese Partikelketten in Position sind, beginnt die Zuleitung der Blutprobe. Durch die Kombination von Größenfilterung und Affinitätsbindung mit speziellen Antikörpern bleiben nur die zirkulierenden Tumorzellen haften. d. Diese können dann mit einem Mikroskop analysiert und für weitere Tests verwendet werden. Optimierung der Filtereffizienz durch Simulationen Abb. 2: (a) Computermodell eines roten Blutkörperchens. (b) Simulation der Deformation einer Brustkrebszelle an der Filterstruktur Wie auch in vielen anderen Bereichen können Computersimulationen das Verständnis von teuren, komplizierten oder schlecht erkennbaren Vorgängen verbessern. Alle derzeit verfügbaren Filtermethoden konnten bisher nur durch trial-and-error -Experimente entwickelt werden. Das führte zwar zu teilweise ansprechenden Resultaten, aber eine vollständige Trennung der Zellen konnte noch nicht erreicht werden. An der Fachhochschule arbeiten wir derzeit mit Hochdruck an einer Simulationsumgebung für einen vollständigen Filtervorgang zirkulierender Tumorzellen. Die Problemstellung verbindet Mikromagnetismus, Strömungs- und Zellularmechanik. EpCAM-behaftete weichmagnetische Partikel bewegen sich in einem magnetischen Gradientenfeld. Im Zusammenspiel mit Kräften der Blutströmung kann die genaue Position der magnetischen Partikel im Mikrofluid-Chip berechnet werden. Dadurch können, wie in Abbildung 1 gezeigt, Kettenstrukturen erzeugt werden. Das Zusammenspiel eines homogenen und des Gradientenfeldes emöglicht zudem die Variation der Filterabstände zwischen diesen Ketten 7. Das Modell der Blutzelle wird als eine Oberflächenmembran mit interagierenden Teilchen beschrieben 8. Ein spezielles Masse- Feder-System ermöglicht die genaue Nachbildung realer Strömungsbewegungen. Ein rotes Blutkörperchen besteht aus einem Zytoskelett und einer umschließenden Membran. Für die Computermodellierung wird nur die Membran zu Rate gezogen (Abb. 2a). 400 Oberflächenteilchen sind funktionell miteinander verbunden. Es wirken eine konstante Oberflächen- bzw. Volumenkraft, eine Federkraft und eine winkelabhängige Kraft. Mit einer optimalen Einstellung dieser vier Parameter kann ein nahezu reales Verhalten gesunder und kranker Blutzellen nachgestellt werden. Hauptaugenmerk werden auf das konstante Oberflächen und Volumen von Blutzellen gelegt. Den Rest erledigen Federkräfte zwischen den Teilchen und winkelabhängige Belastungen der Membranoberfläche. Zur Validierung werden die Modelle real durchgeführten Belastungsproben gegenübergestellt. Beispielsweise werden Blutzellen mit einer optischen Laserpinzette in die Länge gezogen 9. Das Verhältnis von Längen- zu Breitendurchmesser bei konstanter Kraft ist ein wichtiger Faktor für ein korrektes Modell. In ähnlicher Weise lassen sich Krebzellen simulieren. Abbildung 2b zeigt die Deformation einer Brustkrebszelle beim Durchgang zwischen zwei Ketten aus magnetischen Partikeln. Zusammenfassung und Ausblick Die Zahl der Technologien zur Isolierung von zirkulierenden Tumorzellen hat in den letzten Jahren stark zugenommen. Jede einzelne dieser Methoden scheitert aber derzeit noch an einer kompletten Trennung von den restlichen Blutzellen. Die Kombination von mechanischer und Affinitäts-basierter Filterung ermöglicht es, die Effizienz zu erhöhen. Für eine eindeutige Diagnose fehlt es aber an der Genauigkeit der erwähnten Mechanismen. Aufgrund der methodenabhängigen Ausbeute ist ein Vergleich verschiedener Technologien schwer möglich. Unser Team entwickelt derzeit eine Simulationsumgebung, um die Isolaterung zirkulierender Tumorzellen zu optimieren. Diese Resultate werden wichtige Erkenntnisse für den Bau zukünftiger lab-on-a-chip -Methoden liefern. Es werden dringend große Mengen an einzelnen Tumorzellen benötigt, um molekularbiologische Untersuchungen durchführen zu können. Der Bildung von Metastasen kann nur durch ausreichendes Wissen über die zirkulierenden Tumorzellen entgegengewirkt werden. Danksagung Die Autoren bedanken sich für aufschlussreiche Diskussionen mit Dr. Martin Pecherstorfer, Dr. Martin Brandl, Dr. Hubert Brückl und Dr. Ivan Cimrak und für die finanzielle Unterstützung der Life Science Krems GmbH. Literatur [1] Ashworth, T. R (1869). A case of cancer in which cells similar to those in the tumours were seen in the blood after death. Australian Medical Journal 14: [2] Lu B, Xu T, Zheng S et al. (2010) Parylene membrane slot filter for the capture, analysis and culture of viable circulating tumor cells. Proceedings of the IEEE 23rd International Conference on Micro Electro Mechanical Systems (MEMS): [3] Dickson MN, Tsinberg P, Tang Z et al. (2011) Efficient capture of circulating tumor cells with a novel immunocytochemical microfluidic device. Biomicrofluidics 5: [4] Nagrath S, Sequist LV, Maheswaran S et al. (2007) Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology. Nature 450: [5] Stott SL, Hsu CH, Tsukrov DI et al. (2010) Isolation of circulating tumor cells using a microvortex-generating herringbone-chip. Proc Natl Acad Sci USA 107: [6] Maimonis PJ, Merdek K, Dietenhofer K et al. (2010) Affinity and size capture of circulating tumor cells: a platform for increased sensitivity. Fourth AACR International Conference on Molecular Diagnostics in Cancer Therapeutic Development, Sep 27 30:B5 [7] Gusenbauer, Markus, Kovacs, Alexander, Reichel, Franz, Exl, Lukas, Bance, Simon, Özelt, Harald, and Schrefl, Thomas: Self-organizing magnetic beads for biomedical applications, Journal of Magnetism and Magnetic Materials 324(6), volume 324, , 2012 [8] M. Dupin, I. Halliday, C. Care, L. Alboul, Modeling the flow of dense suspensions of deformable particles in three dimensions, Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 75 (2007) [9] S. Henon, G. Lenormand,A. Richert,F. Gallet,A new determination of the shear modulus of the human erythrocyte membrane using optical tweezers (1999).doi:16/ S (99) Korrespondenzadresse Dr. Thomas Schrefl Fachhochschule St. Pölten Matthias-Corvinus-Straße St. Pölten, Österreich Tel.: Fax: thomas.schrefl@fhstp.ac.at LABORWELT 13. Jahrgang Nr. 1/

14 Krebszellanalyse Krebsmarker Validierung neuer Protein- Biomarker im Kampf gegen Prostatakrebs Dr. Kathrin Endt, Dr. Ralph Schiess, ProteoMediX AG, Schlieren, Schweiz Prostatakrebs zählt zu den am häufigsten diagnostizierten Krebsarten bei Männern und ist bei diesen nach Lungen- und Darmkrebs die dritthäufigste Todesursache. Im Jahr 2008 wurde weltweit bei circa Männern Prostatakrebs diagnostiziert, und erlagen dieser Erkrankung. Dabei waren rund 30% der Betroffenen älter als 50 Jahre. Für eine erfolgreiche Behandlung von Prostatakrebs sollte die Erkrankung in einem möglichst frühen Stadium detektiert werden. Daher bemühen sich Forscher mit großer Anstrengung, bereits existierende Diagnosemöglichkeiten qualitativ zu verbessern und neue prognostische oder diagnostische Biomarker zu entdecken sowie zu validieren. Heute gängige Untersuchungsmethoden zum Nachweis des Prostatakarzinoms beinhalten die Bestimmung des PSA-Wertes im Patientenblut und eine Tastuntersuchung der Prostata. Der PSA-Wert bezieht sich dabei auf das sogenannte prostataspezifische Antigen ein Protein, welches bei Prostatakrebs, aber auch bei Entzündungen oder einer Vergrößerung der Prostata vermehrt im Blut gemessen werden kann. Liefern sowohl die Tastuntersuchung als auch ein erhöhter PSA-Wert Hinweise für einen Verdacht auf Prostatakrebs, wird oft ein invasiver Eingriff eine Biopsie durchgeführt. Allerdings birgt der PSA-Test den großen Nachteil einer sehr hohen Rate an falsch-positiven Prostatakrebs- Diagnosen (bis zu 75%), was häufig eine unnötige Biopsie mit Nebenwirkungen wie Blutungen und Inkontinenz zur Folge hat. Bis heute wurde zudem kein optimaler PSA-Schwellenwert definiert. Eine Senkung dieses Wertes birgt die Gefahr, dass insignifikanter Krebs behandelt wird, welcher im natürlichen Lebensverlauf nur mit sehr geringer Wahrscheinlichkeit lebensbedrohlich würde. Überbehandlung ist somit eines der größten Risiken bei der Prostatakrebs- Diagnose 1, 2. Aus diesem Grund ist die Suche und Validierung von weiteren Markern, welche die Spezifität der Prostatakrebs-Diagnose verbessern und eine Aussage über die Aggressivität ermöglichen, unabdingbar. Mit Hilfe der quantitativen Massenspektrometrie konnten wir nun neue, sehr spezifische Biomarker im Serum von Prostatakrebspatienten ermitteln. Quantitative Massenspektrometrie als Biomarker-Screening-Strategie Molekulare und genetische Biomarker spielen eine entscheidende Rolle in der klinischen Onkologie. Sie erlauben Prognosen darüber, ob eine Person Krebs entwickeln wird, oder geben Hinweise auf das jeweils vorliegende Krebsstadium. Zudem helfen diagnostische Biomarker dem Mediziner bei der Entscheidung über Behandlungsoptionen und bei der Identifizierung von Subpopulationen, die auf eine bestimmte Therapie ansprechen 3, 4. Eine der größten Herausforderungen ist dabei das Auffinden von Biomarkern im Blut oder anderen Körperflüssigkeiten mittels nicht-invasiver Detektionsmethoden, um eine patientenspezifische medizinische Vorsorge und Behandlung für Krebserkrankungen anbieten zu können. Um neue prognostische und diagnostische Proteinbiomarker im Serum von Krebspatienten zu identifizieren, nutzen Wissenschaftler das mittlerweile enorme Wissen über genetische Veränderungen (Mutationen), die oft Veränderungen in Signalwegen zur Folge haben, welche die Entstehung von Krebs begünstigen. Mittels Proteomanalysen, die auf quantitativer Massenspektrometrie basieren, konnte kürzlich gezeigt werden, dass Prostatakrebsspezifische Mutationen zu einem gesteigerten Vorkommen von Proteinbiomarken im Serum führen 5. Eine Inaktivierung des PTEN (Phosphatase und Tensin-Homolog)-Gens führt dabei zu einem veränderten Phosphatidylinositol-3-Kinase- (PI3K)-Signalweg 6, welcher eine veränderte Produktion von Oberflächenproteinen und sekretorischen Proteinen des Prostatagewebes nach sich zieht 7. Mit Hilfe eines Mausmodells, das durch den Verlust des Tumorsuppressor- Gens PTEN im Prostataepithelium charakterisiert ist, konnten unter Anwendung massenspektrometrischer Screening-Strategien 8 Proteine mit unterschiedlichen Expressionsmustern in gesundem und krankem Gewebe von Mäusen identifiziert werden 6. Diese in der Maus identifizierten potentiellen Biomarkerkandidaten wurden anschließend im Serum von 77 Patienten mit lokalem Prostatakrebs sowie einer Kontrollgruppe (66 Personen mit einer gutartigen Prostatavergrößerung) gemessen. Eine Untersuchung des Prostatagewebes von Prostatakrebspatienten ergab, dass PTEN- Defekte in mehr als 70% aller Fälle eine Rolle spielen. Somit konnte auch die Relevanz des Mausmodells bestätigt werden. Neue prognostische und diagnostische Biomarker Abb. 1: Sechs charakteristische Kennzeichen für Krebs 10. Die vier Serumbiomarker HYOU1, ASPN, CTSD und OLFM4 decken vier Bereiche der sechs Hauptmerkmale verschiedener Tumorstadien ab (abgeänderte Zeichnung von Hanahan et al., 2011). Der Datensatz an gemessenen Proteinen im menschlichen Blut konnte nun genutzt werden, um geeignete Biomarkerkandidaten zu selektieren und somit Vorhersagemodelle aufzubauen, welche beispielsweise eine Unterscheidung zwischen einem normalen oder anomalen PTEN-Status erlauben. Mit Hilfe von histologischen Gewebeuntersuchungen konnten die biologischen Eigenschaften des Tumors und seine Bösartigkeit genauer bestimmt werden. Dadurch konnte bei einem Jahrgang Nr. 1/2012 LABORWELT

15 Tab. 1: Vergleich der testspezifischen Eigenschaften des PSA-Tests mit einer kombinierten Messung von PSA und den vier Serumproteinmarkern (HYOU1, ASPN, CTSD, OLFM4). Ein kombinierter Test von PSA und den vier diagnostischen Biomarkern liefert eine deutlich erhöhte Spezifität von 79% und führt somit zu einer Reduktion von falsch-positiven Diagnosen. PSA Test (Goldstandard) Proteinmarker Genauigkeit 70 % 84 % Sensitivität 87 % 85 % Spezifität 45 % 79 % ist somit eine ideale nicht-invasive Methode, um die Anzahl an falsch-positiven Prostatakrebs-Diagnosen und somit unnötigen Biopsien zu verringern. Zudem bieten diese neuen diagnostischen Biomarker die Möglichkeit mit hoher Präzision, Stabilität und Reproduzierbarkeit Prostatakrebs detektieren zu können. Prospektive Validierungsstudien Eine momentane Limitierung der Anwendbarkeit und Aussagekraft des beschriebenen Diagnostik-Tests ist die Anzahl der analysierten humanen Proben und die ausschließlich retrospektiv durchgeführten Messungen. Daher soll zukünftig die Aussagekraft des auf der Messung des PSA-Wertes und der vier Proteinbiomarker basierenden Diagnostik-Tests in einer größeren Patientenstudie prospektiv getestet werden. Da Messungen, die auf der Technik von Massenspektrometern beruhen, nur bedingt für das Screenen einer großen Anzahl von Patientenseren geeignet sind, sollen die Proteinmessungen mit einer einfacheren Methode, dem sogenannten ELISA-Test, durchgeführt werden. Das schweizerische Start-Up Unternehmen ProteoMediX AG ist mit der Entwicklung eines solchen Tests beschäftigt und hofft, möglichst bald ein entsprechendes Produkt auf den Markt zu bringen. Bewahrheitet sich die Aussagekraft des neuen Diagnostik-Tests in den geplanten klinischen Studien, können unzähligen Männern unnötige Gewebeentnahmen und damit verbundene Komplikationen erspart werden sowie Unsicherheit und Angst, die mit einem erhöhten PSA-Wert einhergehen. Ferner kann dieser Test auch zu einer bedeutenden Senkung der Gesundheitskosten beitragen, da die Zahl falsch-positiver Diagnosen verringert wird. European Biotechnology Network PTEN-Gendefekt festgestellt werden, dass der Verlust des PTEN-Gens im Prostatagewebe mit einer beschleunigten Prostatakrebs- Progression und -Aggressivität einhergeht 9. Es besteht demnach eine kausale Verbindung zwischen der Bewertung der Aggressivität eines Tumorgewebes und der Funktionalität des PTEN-Gens. In diesem Kontext konnten mittels bioinformatischer Methoden eine Handvoll Proteinbiomarker im Serum von Prostatakrebspatienten aufgefunden werden, welche die beschriebene Korrelation zwischen PTEN- Verlust und Krebsprogression verdeutlichten und sich somit für die nicht-invasive Abklärung von Prostatakrebsstadien eignen. Unter den ermittelten krebsspezifischen Biomarkerkandidaten konnten neben den prognostischen Biomarkern auch vier Proteine im Blutserum identifiziert werden, die Biotechnology Network! Join the European eine zuverlässige Prostatakrebsdiagnose ermöglichen, wenn sie mit dem PSA-Test The European Biotechnology Network kombiniert werden. Mit Hilfe von bioinformatischen Filtern wurden folgende vier Proteine is dedicated to facilitating co-operation between professionals in biotech- identifiziert: Hypoxia up-regulated protein 1 Literatur (HYOU1), Asporin (ASPN), Cathepsin D (CTSD) nology and the life sciences all over und Olfactomedin-4 (OLFM4). Dabei decken [1] Schröder, F.H., et al., ERSPC Investigators, N Engl J Med 360 Europe. The network is run by the European Biotechnology Foundation, a die vier Proteine zwei Drittel der biologischen (2009), [2] Andriole, G.L., et al., PLCO Project Team, N Engl J Med 360 Hauptmerkmale in der Krebsentwicklung (2009), ab non-profit organisation based in Brussels. Do you want to know more about 10. CTSD ist zum Beispiel involviert in die [3] Tainsky, M.A. Biochim Biophys Acta (1796), Tumorinvasion und Metastasierung, OLFM4 [4] Ludwig, J.A., Weinstein, J.N., Nat Rev Cancer 5 (2005), verhindert den Zelltod, ASPN hilft einer Zelle, [5] Cima, I., Schiess, R., et al., Proc Natl Acad Sci USA 108 (2011), the advantages of a (free) membership? Just have a look at our website: Wachstumssuppressoren zu entgehen, und [6] Maehama, T., Dixon, J.E., J Biol Chem 273 (1998), HYOU1 induziert die Angiogenese (Abb. 1) Das Messen dieser vier Proteinmarker in [7] Mehrian-Shai, R., et al., Proc Natl Acad Sci USA 104 (2007), Kombination mit dem PSA-Test lieferte bei [8] Schiess, R., Wollscheid, B., Aebersold, R., Mol Oncol 3 (2009), ersten Messungen bereits eine sehr hohe Spezifität von 79%, das heißt, in fast 80% der Fälle [9] McMenamin, M.E., et al., Cancer Res 59 (1999), traf eine positive Vorhersage auch wirklich zu. [10] Hanahan, D., Weinberg, R.A., Cell 144 (2011), Verglichen mit der PSA-Messung allein, die im gemessenen Kollektiv eine Spezifität von 45% aufwies, bedeutet dieser Wert eine Steigerung Korrespondenzadresse European Biotechnology Foundation von rund 43% (Tab. 1). Dieses Ergebnis konnte in Rue d Egmont 15 einer weiteren unabhängigen Messung für 37 Ralph Schiess, CEO B-1000 Bruxelles, Belgique Probanden (14 Personen mit lokalem Prostatakrebs; 23 mit gutartiger Prostatavergrößerung) Wagistr. 23 ProteoMediX AG Tel: bestätigt werden. Ein auf dem PSA-Wert und CH-8952 Schlieren Fax dem Messen der vier Proteine basierender Test ralph.schiess@proteomedix.com info@european-biotechnology.org LABORWELT 13. Jahrgang Nr. 1/

16 European Biotechnology Network building transatlantic PartnershiPs in biotechnology 30 th March Brussels Join the European Biotechnology Network to explore how European biotechnology research can build US partnerships through the key funding mechanisms open on both sides of the Atlantic. Framework Programme Seven and Horizon 2020 from Europe combine with National Institutes of Health (NIH), Department of Defense (DOD) and the Bill and Melinda Gates Foundation from the US. Academia and industry from the US and Europe can fund partnerships through these programmes and accelerate technology and clinical/market application. The day brings together the European Commission and organisations active in European- US partnerships, from academia, SMEs and pharma, to showcase partnerships and the mechanisms behind them. In the memory of last year s inspirational keynote speaker, Ian Bathurst, the meeting supports Medicines for Malaria Venture (MMV) a Swiss-based publicprivate initiative whose donor, stakeholder and grantee network across the US and Europe is exemplary of the kind of partnership we hope toshowcase. Doing the business! 29 th March 2012 Building Transatlantic Partnerships is supported by Doing the business, an intensive 1 day workshop on the logistics of biotechnology business in the US. With just 15 places available, the day focuses beyond the technology, with factors for success, corporate partnering, investment and grants and effective integration into different market and biotech culture. Visit and click on our events to find out more and book your place! Please register now at through the event pages. Meeting supported by: Grünecker Patent- und Rechtsanwälte European Biotechnology Foundation Rue d Egmont 15 B-1000 Bruxelles, Belgique Tel: Fax info@european-biotechnology.org

17 Sequence Capture Zielgen-Anreicherung Auffinden einer Mutation für erblichen Gehörverlust mit Capture Arrays Genanreicherung II Dr. Burkhard Ziebolz, Roche Applied Science, Penzberg Erblicher Gehörverlust ist mit einer Häufigkeit von mindestens zwei Fällen auf Neugeborene die häufigste sensorische Funktionsstörung beim Menschen. Rund 70% der Erkrankungen sind nicht-syndromisch (NSHL), das heißt, es treten keine zusätzlichen Symptome auf. Zwischen 1% und 5% der NSHL-Fälle sind durch X-chromosomale Mutationen bedingt, die bislang vier NSHL-Genloci (DFNX) zugeordnet werden konnten. Im Zuge einer Familienstudie konnten Hübner et al. 1 eine X-chromosomal-dominant vererbte Form des fortschreitenden Hörverlustes der chromosomalen Region Xp22 (DFNX4) zuordnen. Mit Hilfe der gezielten Sequenz-Anreicherung durch Hybridisierung genomischer DNA der Mitglieder einer deutschen Familie auf NimbleGen Capture Arrays (Roche NimbleGen Inc., Madison), die die genomische Zielregion repräsentierten, identifizierten Hübner und Kollegen nun eine nonsense-mutationen im Gen für SMPX (small muscle protein, X-linked). Xp22 war bereits zuvor bei einer spanischen Familie als krankheitsrelevant angenommen worden, ohne dass aber eine ursächliche Mutation identifiziert werden konnte. Von Hübner et al. durchgeführte Sequenzanalysen bestätigten nun, dass auch hier eine Nonsense-Mutation in SMPX krankheitsrelevant ist. Weitere Studien ergaben, dass das mechanosensitive, Zytoskelett-assoziierte SMPX-Protein in den Stereocilien der Haarzellen und der Cochlea des Innenohrs von Mäusen exprimiert wird, die zur mechanosensorischen Transduktion beim Hörvorgang beitragen. Das Auftreten von Stopp-Codons in SMPX-Transkripten deutet darauf hin, dass es über einen nonsense-vermittelten mrna-abbau zum Funktionsverlust des SMPX-Proteins kommt. Die Forscher vermuten, dass SMPX zur Erhaltung der ständig unter mechanischem Stress stehenden Haarzellen des Innenohrs beiträgt. Zahlreiche Anwendungen des Next- Generation-Sequencings zielen auf die Untersuchung ganz bestimmter interessierender genomischer Regionen ab. Damit der Einsatz der Ultrahochdurchsatz- Instrumente wirtschaftlich wird, müssen deshalb die interessierenden Loci mittels PCR vervielfältigt werden, zumindest bei den Sequenzern der 2. Generation am Markt, die mittels Fluoreszenz-Readout die Sequenz bestimmen. Nicht amplifiziert wäre das Signal viel zu schwach, um detektiert zu werden. Die Amplifikation ist indes nicht trivial: Gilt es doch, alle zu sequenzierenden Abschnitte um genau denselben Faktor zu vervielfältigen. Diese aufwändige Probenvorbereitung die Targetgenanreicherung, die bei Single Molecule Sequenzieransätzen wegfällt, ist der eigentliche Flaschenhals bei der Next-Generation-Sequenzierung. Elution & PCR Hochparallele Sequenzierung auf Next Generation-Sequenzern Fragmentierung und Hybridisierung genomischer DNA an SeqCap TM -Microarrays, die Zielsequenzen enthalten Analyse der angereicherten Sequenzen Abb. 1: Ablauf der Targetsequenz-Anreicherung mit NimbleGen SeqCap TM -Arrays Suche nach der besten Automation Ein möglicher Ansatz, genomische Regionen anzureichern, ist die Hybridisierung gegen eine Bibliothek von DNA-Sonden auf einem Array. Wie leistungsfähig das zum Beispiel das von der NimbleGen Inc. entwickelte Verfahren ist, haben Hübner und Kollegen unlängst gezeigt. In einer Familienstudie konnten sie mittels sogenannter SeqCap-Microarrays ein Gen für die erbliche Innenohrschwerhörigkeit identifizieren und erste Hinweise auf dessen Funktionsweise finden (vgl Seite 17). Zur Serienreife entwickelt haben der US- Mikrofluidik-Experte Raindance und der Kunststoff-Spezialist Sony DADC Austria einen Mikrofluidikchip, der es ermöglicht, Millionen von Mikrotröpfchen herzustellen, in denen jeweils eine getrennte PCR-Reaktion abläuft (vgl. Seite 20). Eine Automation der PCR-Probenvorbereitung für Next-Generation-Sequencing-Anwendungen für den Genome Sequencer FLX (Roche Applied Science) bietet seit kurzem die Firma Hamilton Robotics an (siehe Seite 22). LABORWELT 13. Jahrgang Nr. 1/

18 Zielgen-Anreicherung Sequence Capture Laborwelt Hintergrund Prinzip der Schallübertragung im Innenohr Schall wird vom Trommelfell über die Gehörknöchelchen des Mittelohrs im sogenannten ovalen Fenster auf die Cochlea (Schnecke, im Bild blau) übertragen. Die Cochlea ist im Querschnitt in drei Röhren unterteilt: Die Scala vestibuli (oberer Gang) ist mit dem ovalen Fenster verbunden. Sie nimmt den Schalldruck auf und führt ihn bis zur Spitze der Cochlea, dem Helicotrema. Dort führt eine scharfe Kehre in die zurücklaufende Röhre, die Scala tympani (untere Röhre), die am runden Fenster des Innenohrs endet. Zwischen den beiden Röhren liegt die Scala media, die den sensorischen Apparat, das Corti-Organ (große Abbildung), enthält. Trifft Schall über das ovale Fenster ein, bildet sich eine Wanderwelle, deren Maximum bei hohen Frequenzen den vorderen Abschnitt, bei tiefen Tönen den dünneren, hinteren Abschnitt der Basilarmembran zum Schwingen anregt. Die Frequenzinformation wird so in eine Ortsinformation umgewandelt. Basilar- und Tektorialmembran werden nun gegeneinander verschoben. Dies stimuliert die äußeren Haarzellen (OHC), ihre Länge zu ändern, was die lokalen Bewegungen im Cortiorgan etwa 1000-fach verstärkt. Die so verstärkte Wanderwelle erregt nun lokal die inneren Haarzellen (IHC), die das sensorische Signal erzeugen. BC RC Derzeit sind vier X-chromosomale vererbte Loci (DFNX) kartiert, die mit dem Auftreten des nicht-syndromischen Gehörverlustes (NSHL) in Zusammenhang stehen. DFNX1 ist durch eine fortschreitende Beeinträchtigung des Hörvermögens gekennzeichnet und tritt typischerweise im Alter zwischen 5 und 15 Jahren bei Männern sowie bei Frauen um die 50 auf. Welche Rolle das bei DFNX1 mutierte PRPS1-Gen, das ein Enzym der Nukleotidbiosynthese kodiert, im Innenohr spielt, ist unklar 2. Ebenso fanden sich Mutationen 3 im Transkriptionsfaktor Pou3F4 bei Patienten mit DFNX2. Hierbei kommen die Kinder bereits mit stark eingeschränktem Hörvermögen (prälingualer Hörverlust) zur Welt, weil die Schallübertragung zwischen Mittel- und Innenohr gestört ist. Hübner et al. untersuchten einen dritten, postlingualen NSHL in einer großen deutschen Familie. Die Krankheit beginnt bei Jungen im Alter von 3 bis 7 Jahren, mit Hördefekten im oberen Frequenzband, schreitet aber progressiv bis zur Taubheit fort. Bei Frauen beginnt der Hörverlust zwischen dem 20. und 30. Lebensjahr und führt nach 10 bis 15 Jahren zu schweren Hörschädigungen, ohne dass zuvor Störungen der Schallweiterleitung aus dem Mittelohr oder eine Beeinträchtigung des Gleichgewichtssinnes zu bemerken wäre. Genomweite Kopplungsanalyse Eine genomweite Kopplungsanalyse (Gene Chip Human Mapping 10K Array, Affymetrix) deutete bei 11 der Familienmitglieder mit sehr hoher Wahrscheinlichkeit (LOD-Score 2.23) darauf hin, dass der Defekt sich in einer 17,5 Mb-Region auf dem Chromosomenabschnitt Xp22.12 befindet. Die Berechnung der LOD-Scores erfolgte mit dem Programm ALLE GRO 4 unter der Annahme einer dominanten Vererbung mit vollständiger Penetranz. Die Allelfrequenz der pathogenen Variante wurde auf 0,0001 gesetzt. Die mit MERLIN 5 konstruierten Haplotypen für SNP-Marker auf dem Chromosomenabschnitt Xp22.12 engten den Krankheits-Locus auf die Region zwischen rs und rs ein. Identifikation des ursächlichen Gens mit NimbleGen SeqCap TM Arrays Um die dem Hörverlust zugrundeliegende Genmutation zu identifizieren, wurden alle Exons und je 1KB der Promotoren der 88 proteincodierenden Regionen der Zielregion zweier betroffener Männer sowie bekannte mirnas mit dem Roche NimbleGen 385K Custom Sequence Capture Array angereichert (Dienstleister: ATLAS Biolabs GmbH) und sequenziert (Dienstleister: Cologne Center for Genomics). Der Chip repräsentierte dabei 96,3% der Zielsequenzen des Krankheitslocus. Insgesamt wurden die Targetgensequenzen um den Faktor 280 bzw. 284 angereichert, wie qpcr-kontrollen ergaben. Nach Elution der hybridisierten Sequenzen vom Array und Amplifikation wurden diese sequenziert (Illumina GA IIx) und lieferten 2,8286 Gb bzw. 2,6060 Gb Rohsequenz. Die Reads wurden mit der MAQ short read-alignment-software 5 gegen das humane Referenzgenom (Version hg19) kartiert. Einzelbasen-Variationen (SNPs) wurden mittels MAQ, Indels mittels dem BWA-Aligner 6 und SAM-Tool 7 analysiert. Auf diese Weise identifizierten Hübner und Kollegen bzw X-chromosomale Varianten in den beiden Personen. Zugleich wurden DNA-Proben weiterer betroffener Männer dieser Familie hinsichtlich hochpolymorpher Mikrosatelliten- Marker genotypisiert. Die Kopplungsregion konnte so auf eine 8,5 Mb-Region eingeengt werden, die nur noch 398 bzw. 347 single nucleotide-varianten (SNVs) enthielt. Diese wurden hinsichtlich ihrer evolutionären Konserviertheit und ihrer Auswirkungen auf die Proteinbiosynthese weiter analysiert. Nach Sanger-Sequenzierung des aussichtsreichsten Kandidaten einer nonsense-mutation des small muscle protein, X-linked (SMPX) zeigte sich, dass das Sequenzintervall den DFNX4-Locus enthielt. Dieser X-chromosomale Locus war 1996 bereits von Forschungspartnern von Hübner et al. in einer spanischen Familie kartiert worden 8 und steht in Zusammenhang mit dem Auftreten eines fortschreitenden, postlingualen Hörverlust. Bei Männern tritt die Erkrankung allerdings erst zwischen dem 5. und 7. Lebensjahr, bei Frauen erst im vierten Lebensjahrzehnt auf. Die retrospektive Analyse von SMPX in dieser Familie lieferte gleichfalls eine nonsense-mutation (c175 G>T) in der proteinkodierenden Sequenz. Ebenso wie die in der deutschen Familie identifizierte Mutation (c.109g>t) scheint diese über vorzeitige Stopp-Codons einen Jahrgang Nr. 1/2012 LABORWELT

19 Sequence Capture Zielgen-Anreicherung Porvair hairdryer Laborwelt DE 116.5x90_Layout 1 07/03/ :25 Page 1 ACHEMA Halle 4.2 E44 ANALYTICA Halle B2 215 mrna-abbau und damit Funktionsausfall des SMPX-Proteins zu verursachen. Gestützt wird diese Hypothese durch zwei weitere, unabhängige Familienstudien 9, die ebenfalls zeitgleich zeigen, dass SMPX das mutierte Gen bei der DFNX4-vermittelten Taubheit ist. Immunlokalisation von SMPX Immunlokalisationsstudien mit SMPX-Antikörpern ergaben, dass SMPX in verschiedenen Zellen des Innenohrs von Mäusen exprimiert wird (vgl. Hintergrund): Neben der Expression in nichtsensorischen Zellen wie Deiters- (DC), Böttcher- (BC) oder Pillar-Zellen (PC) zeigte sich auch eine schwache Expression in Haarzellen (ihc, ohc). Hübner et al. vermuten, dass SMPX zur Erhaltung der mechano-sensitiven Stereocilien auf den sensorischen Haarzellen der Cochlea erforderlich ist. Sie sehen gewisse Parallelen zur Funktion von SMPX in Muskelgewebe des Menschen Dort ist das 88 Aminsäuren-Protein in sogenannten Costameren lokalisiert mechano-sensitiven Proteinkomplexen die die Sarcolemmamembran vor Schäden durch mechanischen Stress bei der Muskelkontraktion schützen. Literatur [1] Huebner AK, Gandia M, Frommolt P, Maak A, Wicklein EM, Thiele H, Altmüller J, Wagner F, Viñuela A, Aguirre LA, Moreno F, Maier H, Rau I, Giesselmann S, Nürnberg G, Gal A, Nürnberg P, Hübner CA, del Castillo I, Kurth I. (2011): Nonsense mutations in SMPX, encoding a protein responsive to physical force, result in X-chromosomal hearing loss. Am J Hum Genet. 88(5):621-7 [2] Liu X, Han D, Li J, Han B, Ouyang X, Cheng J, Li X, Jin Z, Wang Y, Bitner-Glindzicz M, Kong X, Xu H, Kantardzhieva A, Eavey RD, Seidman CE, Seidman JG, Du LL, Chen ZY, Dai P, Teng M, Yan D, Yuan H. (2010): Loss-of-function mutations in the PRPS1 gene cause a type of nonsyndromic X-linked sensorineural deafness, DFN2. Am J Hum Genet. 86(1): [3] De Brouwer AP, van Bokhoven H, Nabuurs SB, Arts WF, Christodoulou J, Duley J. (2010): PRPS1 mutations: four distinct syndromes and potential treatment. Am J Hum Genet. 86(4): Review. [4] Gudbjartsson DF, Jonasson K, Frigge ML, Kong A. (2000): Allegro, a new computer program for multipoint linkage analysis. Nat Genet. 25(1):12-3. [5] Li, H., Ruan, J., and Durbin, R. (2008). Mapping short DNA sequencing reads and calling variants using mapping quality scores. Genome Res. 18, [6] Li, H., and Durbin, R. (2009). Fast and accurate short read alignment with Burrows- Wheeler transform. Bioinformatics 25, [7] Li, H., Handsaker, B., Wysoker, A., Fennell, T., Ruan, J., Homer, N., Marth, G., Abecasis, G., and Durbin, R.; 1000 Genome Project Data Processing Subgroup. (2009). The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics 25, [8] Del Castillo I, Villamar M, Sarduy M, Romero L, Herraiz C, Hernández FJ, Rodríguez M, Borrás I, Montero A, Bellón J, Tapia MC, Moreno F. (1996): A novel locus for nonsyndromic sensorineural deafness (DFN6) maps to chromosome Xp22. Hum Mol Genet. 5(9): [9] Schraders M, Haas SA, Weegerink NJ, Oostrik J, Hu H, Hoefsloot LH, Kannan S, Huygen PL, Pennings RJ, Admiraal RJ, Kalscheuer VM, Kunst HP, Kremer H. (2011): Next-generation sequencing identifies mutations of SMPX, which encodes the small muscle protein, X-linked, as a cause of progressive hearing impairment. Am J Hum Genet. 88(5): [10] Patzak D, Zhuchenko O, Lee CC, Wehnert M. (1999): Identification, mapping, and genomic structure of a novel X-chromosomal human gene (SMPX) encoding a small muscular protein. Hum Genet. (5): [11] Kemp TJ, Sadusky TJ, Simon M, Brown R, Eastwood M, Sassoon DA, Coulton GR. (2001): Identification of a novel stretch-responsive skeletal muscle gene (Smpx). Genomics. 72(3): [12] Geiger B, Bershadsky A. (2002): Exploring the neighborhood: adhesion-coupled cell mechanosensors. Cell Jul 26;110(2): Review. Korrespondenzadresse Dr. Burkhard Ziebolz Roche Diagnostics GmbH Nonnenwald Penzberg Tel.: Fax: burkhard.ziebolz@roche.com austria wirtschaftsservice Wir mixen die optimale Finanzierung Euro Management auf Zeit: Finanzierung von temporärer externer Beratung awsg.at/maz Die Vorzüge eines MiniVap Selbstverständlich würden Sie keinen Haartrockner verwenden, um chromatographische Proben in einer einzelnen Mikrotestplatte zu verdampfen. Sie haben wahrscheinlich aber auch keine Lust Schlange zu stehen, um einen großen Evaporator in Ihrer Abteilung für denselben Zweck zu benutzen. In diesem Fall brauchen Sie einen Porvair MiniVap. Das Gerät ist klein, schnell, flexibel und beeinträchtigt Ihre Proben nicht. 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20 Zielgen-Anreicherung Mikrofluidik Kunststoff-Know how: Basis für Lab-on-Chips zur Zielgen-Anreicherung Dr. Manfred Koranda, Sony DADC Austria AG, Salzburg Bereits vor zwei Jahren berichtete RainDance Technologies Inc. von einem skalierbaren Multiplex- PCR-Verfahren auf Basis seiner Mikrotröpfchen-Technologie, mit dem sich interessierende genomische Regionen vor Sequenzierung gezielt anreichern lassen (vgl. LABORWELT 3/2009). Dank dem Fertigungs-Know-how von Sony DADC steht nach zweijähriger Kooperation jetzt ein hochdurchsatzfähiger Chip zur Verfügung, der einen wirtschaftlichen Einsatz der Next Generation-Sequenzierung zur Untersuchung von krankheitsassoziierten Genen, SNPs, chromosomaler Hot Spots etc, ermöglicht. Neben der Targetgen-Anreicherung soll der Chip künftig auch zur Zellsortierung eingesetzt werden. RainDance nimmt durch die von Sony DADC produzierten Smart Consumables erfolgreich am Wettbewerb um den Hochdurchsatz-Markt für Life Sciences-Instrumente teil. Die auf Mikro-Tröpfchen basierende, highthroughput -fähige Kerntechnologie von Rain Dance, RainStorm TM, erzeugt Millionen aufeinanderfolgender Tröpfchen, die als distinkte Reaktionsräume fungieren und ein einzelnes Molekül, eine Zelle oder eine Reaktion umschließen können (Abb. 1). Bei der Targetgen-Anreicherung fungiert jedes Tröpfchen als Reaktionsraum, in dem genomische DNA auf ein Primerpaar trifft und mittels PCR amplifiziert wird. Dazu werden auf einem Mikrofluid-Chip zunächst Tröpfchen erzeugt, je Abb. 2: Das Herzstück der gezielten Genanreicherung durch Mikrotröpfchen- PCR: der HeatWave TM -Chip ein Tröpfchen mit genomischer DNA und mit Primer zusammengeführt, fusioniert und die Tröpfchen in PCR-Röhrchen gesammelt. Nach hochparalleler PCR in den Millionen Tropfen können die gezielt angereicherten DNA-Abschnitte sequenziert werden (vgl. Abb. 1). Das Flagschiff von RainDance ist das RDT ThunderStorm System eine vollautomatisierte Instrumenten-Plattform für das gezielte Next-Generation-Sequenzierung, die kompatibel mit allen marktgängigen Sequenzern ist und eine genaue Klassifizierung potentiell aller Abb. 1: Um interessierende genomische Loci hochparallel anzureichen, werden beim Rainstorm TM -Verfahren zunächst mit einem Netzmittel stabilisierte Tröpfchen von je 8 pl Volumen erzeugt, die PCR-Primerpaare (a) und genomische Template-DNA (b) enthalten. Je ein Tropfen der Bibliothek mit bis zu Primerpaaren und je ein Tropfen mit der genomischen DNA werden in separate Kanäle eines Mikrofluidikchips geladen, paaren sich dort und werden in einer Kammer (c) durch ein elektrisches Feld (schwarze Dreiecke = Elektroden) fusioniert. Die PCR-Tröpchen werden außerhalb des Chips in Standard-PCR Tubes gesammelt. Die enthaltene DNA wird anschließend in handelsüblichen Thermocyclern im Tropfen amplifiziert. Dies ermöglicht ein Multiplexing in einem PCR-Röhrchen, das mehreren hundert bis tausend Amplifikation unter den Bedingungen einer Singleplex-Reaktion entspricht Jahrgang Nr. 1/2012 LABORWELT