Untersuchung humaner Stammzellen aus dem adulten Knochenmark und der fetalen Leber

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1 Untersuchung humaner Stammzellen aus dem adulten Knochenmark und der fetalen Leber Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Fakultät für Biologie der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau vorgelegt von Stefan Kaiser geboren in Bad Säckingen Dezember 2004

2 Diese Arbeit wurde in der Abteilung Innere Medizin I des Universitätsklinikums Freiburg unter der Leitung von PD Dr. Ursula Kapp angefertigt. Dekan: Prof. Dr. G. Fuchs Promotionsvorsitzender: Prof. Dr. K.-F. Fischbach Betreuer der Dissertation an der Fakultät für Biologie: Prof. Dr. A. E. Sippel Betreuerin der Dissertation in der Abteilung Innere Medizin I: PD Dr. U. Kapp Coreferent: Prof. Dr. C. Peters Drittprüfer: PD Dr. D. Meyer Tag der Verkündung des Prüfungsergebnisses:

3 Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung Stammzellen Hämatopoetische Stammzellen und CD Mesenchymale Stammzellen Transdifferenzierung und Stammzellplastizität Fetale Leber als Quelle für hämatopoetische und mesenchymale 15 Stammzellen 1.6 Immundefiziente Mausstämme als Modellsysteme für die 18 Stammzellforschung 2 Zielsetzung und Fragestellungen Mesenchymale Stammzellen aus adultem humanem Knochenmark Fetale Leber als Ausgangsmaterial zur Gewinnung von mesenchymalen 24 und hämatopoetischen Stammzellen 2.3 Anwendung von Mausmodellen zum Nachweis von multipotenten, 24 adulten, humanen Stammzellen 3 Material und Methoden Material Geräte Gebrauchswaren Medien Zytokine, Mediumzusätze und Differenzierungsfaktoren Antikörper Molekularbiologische, immunologische und Färbungs-Kits Enzyme Oligonukleotide Sonstige Reagenzien und Chemikalien Puffer und Lösungen EDV-Programme Bakterien Mausstämme 35 2

4 Humanes Zellmaterial Knochenmark Plazentarestblut Fetale Leber Endothelzellen Fibroblasten Methoden Zellbiologische Methoden Isolierung von mononukleären Zellen aus humanem 37 Knochenmark Isolierung von mononukleären Zellen aus Nabelschnurblut Kultivierung von mesenchymalen Stammzellen Kultivierung von Endothelzellen Kultivierung von hämatopoetischen Stammzellen aus fetaler 39 Leber Einfrieren und Auftauen von Zellen Immunomagnetische Zellseparation Durchflußzytometrie Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung In vitro Differenzierung von mesenchymalen Stammzellen Alkalische Phosphatase Färbung Oil Red O Färbung Chromosomenpräparation Fluoreszenz in situ Hybridisierung Retroviraler Gentransfer Mausexperimente Transplantation von Stammzellen in NOD/SCID- und 52 PNOD/SCID-Mäuse Gewinnung von peripherem murinem Blut Gewinnung von murinem Blutserum Messung des IgG-Gehaltes im murinen Blutserum Differentialblutbild Zytotoxizitätstest Präparation von murinen Blutzellen für die FACS-Analyse 54 3

5 Limited dilution assay in der NOD/SCID-Maus Molekularbiologische Methoden Bakterienkultur Bakterientransformation Plasmid-Präparation Restriktionsverdau von Plasmid-DNA Agarose-Gelelektrophorese Isolierung genomischer DNA RNA-Isolation Bestimmung des RNA-Gehaltes Reverse Transkription PCR Southern Blot Statistik 61 4 Ergebnisse Mesenchymale Stammzellen aus Knochenmark In vivo Phänotyp Zellsortierungen nach CD Zellsortierungen nach CD34 und CD Bestimmung des Ploidiegrades von MSC aus der CD34 + und CD34 + CD45 + Fraktion Differenzierungspotenzial Endotheliales Differenzierungspotenzial unseparierter MSC Endotheliales Differenzierungspotenzial von MSC aus den Subfraktionen CD45 + CD34 + und CD45 - CD Hämatopoetisches Differenzierungspotenzial Transduktion von mesenchymalen Stammzellen mit CD Bestimmung der Transduktionseffizienz Transduktion mit CD Differenzierungspotenzial von CD34-transduzierten MSC Repopulationsverhalten von CD34-transduzierten humanen MSC in der NOD/SCID-Maus

6 4.2 Humane fetale Leber als Ausgangsmaterial zur Gewinnung von 89 mesenchymalen und hämatopoetischen Stammzellen Isolierung mesenchymaler Stammzellen aus fetaler Leber Langzeitexpansion humaner hämatopoetischer Stammzellen aus 94 fetaler Leber Kurz- und Langzeitrepopulationsverhalten von SRC aus 94 expandierter fetaler Leber Ermittlung der Frequenz von SRC in nicht expandierter 98 fetaler Leber Ermittlung der Frequenz von SRC in expandierter fetaler 99 Leber Ermittlung der Expansionsrate von in vitro expandierten SRC 101 aus fetaler Leber 4.3 Charakterisierung der PNOD/SCID-Maus Zytotoxizitätstest Analyse von Milz, Knochenmark und peripherem Blut Serum-IgG Gehalt Repopulationsverhalten von SRC in der PNOD/SCID-Maus Diskussion Mesenchymale Stammzellen aus adultem Knochenmark In vivo Phänotyp mesenchymaler Stammzellen Differenzierungspotenzial mesenchymaler Stammzellen CD34-transduzierte mesenchymale Stammzellen Plastizität und Bedeutung mesenchymaler Stammzellen aus dem 117 Knochenmark 5.2 Stammzellen aus fetaler Leber Fetale Leber als Quelle für mesenchymale Stammzellen Langzeitexpansion humaner hämatopoetischer Stammzellen aus 120 fetaler Leber 5.3 Charakterisierung der PNOD/SCID-Maus Zusammenfassung 125 5

7 7 Literatur Anhang Abkürzungen CD-Antigene Publikationen und Kongreßbeiträge Lebenslauf Danksagung 147 6

8 1 Einleitung 1.1 Stammzellen Als Stammzellen werden im allgemeinen diejenigen Zellen eines Organismus bezeichnet, die die Fähigkeit besitzen, durch Zellteilung zwei verschiedene Typen von Nachkommen zu erzeugen. Der eine Typus eines Nachkommen ist eine Tochterzelle, welcher das identische Abbild der Mutterzelle darstellt. Diese Tochterzelle besitzt exakt die gleichen Eigenschaften wie die Mutterzelle. Der Vorgang, bei welchem diese Art von Nachkommenschaft erzeugt wird, wird als Selbsterneuerung bezeichnet. Der zweite Typus eines Nachkommens, der bei der Teilung einer Stammzelle entstehen kann, ist eine Tochterzelle, deren Eigenschaften mit denjenigen der Mutterzelle nicht mehr identisch sind. In der Regel ist diese Tochterzelle eine reifere Zelle, deren Eigenschaften sie zu spezifischen Aufgaben im Organismus befähigt, zu welchen die Mutterzelle nicht befähigt war. Der zweite entscheidende Unterschied zwischen der Mutterzelle und der Tochterzelle von diesem Typus ist, daß die Tochterzelle die Eigenschaft der Selbsterneuerung nicht mehr besitzt. Der Vorgang, bei welchem dieser Typus einer Tochterzelle entsteht wird als Differenzierung bezeichnet. Die Fähigkeit der Selbsterneuerung und der Differenzierung sind somit die beiden Kriterien, welche alle Stammzellen verbindet. Eine weitere Unterteilung der Stammzellen kann durch die Klassifizierung des Differenzierungspotenzials erfolgen. 1 So werden Stammzellen, welche die Fähigkeit besitzen, eine Nachkommenschaft zu erzeugen, welche alle embryonalen und extraembryonalen Zelltypen einschließt, als totipotent bezeichnet. Extraembryonale Strukturen, wie beispielsweise die Plazenta, werden vom Trophoektoderm gebildet. Das Trophoektoderm und die innere Zellmasse, aus welcher sich der eigentliche Embryo entwickelt, sind die beiden Zellgruppen, die aus den ersten Furchungsteilungen hervorgehen. Ab dem Zeitpunkt, an welchem die Auftrennung in diese beiden Zellgruppen stattgefunden hat, dem Stadium der Blastocyste, finden sich innerhalb der inneren Zellmasse nur noch Zellen, die dazu befähigt sind, durch Teilung und Differenzierung alle Zelltypen des eigentlichen Embryos, nicht aber extraembryonale Strukturen, zu erzeugen. Die Differenzierungsfähigkeit dieser Zellen wird folglich nicht mehr als totipotent, sondern als pluripotent bezeichnet. Pluripotente murine Zellen wurden erstmals durch in vitro Kultivierung von Zellen der inneren Zellmasse der Blastocyste gewonnen, jedoch ist es bisher noch unklar, ob alle Zellen der inneren Zellmasse pluripotent sind oder nur einzelne Zellen innerhalb der inneren Zellmasse. 2,3 7

9 Bisher konnten pluripotente Zellen zweifelsfrei nur aus embryonalem Gewebe isoliert werden. Stammzellen, welche in adulten Geweben lokalisiert sind, werden durch drei weitere Begriffe klassifiziert, die weniger exakt definiert sind und oftmals von verschiedenen Autoren unterschiedlich verwendet werden. So werden im allgemeinen Zellen, welche zwar nicht in alle Zelltypen des adulten Organismus, jedoch in viele verschiedene Zelltypen differenzieren können, als multipotent bezeichnet. Oligopotente Stammzellen können in zwei oder mehrere Zelltypen differenzieren, während eine unipotente Stammzelle oder Progenitorzelle nur dazu befähigt ist, einen ausgereiften Zelltyp hervorzubringen. Adulte Stammzellen existieren in einer Vielzahl von Organen. Gewebespezifische Stammzellen konnten beispielsweise in den Darmkrypten des Verdauungstraktes, in der Epidermis der Haut, in der Leber, im Herzmuskel oder im Nervensystem gefunden werden. 4-7 Die Aufgabe der adulten Stammzellen in den jeweiligen Geweben ist die Nachbildung und Bereitstellung neuer Zellen als Ersatz für absterbende Zellen. Besonders auffällig ist diese Notwendigkeit in Geweben und Organen mit hohem Zellumsatz wie der Haut, dem Darmepithel oder dem Blut. 1.2 Hämatopoetische Stammzellen und CD34 Die bis heute am ausgiebigsten und besten erforschten Stammzellen sind zweifelsohne die hämatopoetischen Stammzellen. Dies liegt zum einen an der leichten Zugänglichkeit dieser Zellen, zum anderen an der Tatsache, daß viele Erkrankungen des Menschen wie Leukämien, aplastische Anämien, Lymphome, Myelodysplasien oder angeborene Stoffwechselerkrankungen mit dem Blut und somit der Hämatopoese und den dafür verantwortlichen Stammzellen in Zusammenhang stehen. 8 Die Hämatopoese im adulten Menschen findet in den drei Organen Milz, Thymus und Knochenmark statt, wobei in den ersten beiden Organen die Ausreifung von Lymphozyten stattfindet, während die hämatopoetischen Stammzellen unter normalen Bedingungen beim Erwachsenen nur im Knochenmark anzutreffen sind. Alle im adulten Säugetierorganismus zirkulierenden Blutzellen haben ihren Ursprung in einer Population von multipotenten Stammzellen. Das klassische Modell der Hämatopoese geht von einem hierarchischen System aus, an dessen Spitze multipotente hämatopoetische Stammzellen stehen Die sich stetig erneuernden hämatopoetischen Stammzellen bringen myeloide und lymphoide Stammzellen hervor, welche über mehrere Zwischenstufen alle ausgereiften Zellen des hämatopoetischen Systems erzeugen (Abb. 1). 13 Im Gegensatz zum murinen hämatopoetischen System ist es ungleich schwieriger die Biologie von humanen hämatopoetischen Stammzellen zu erforschen. Da am lebenden Menschen nur eingeschränkt Untersuchungen durchgeführt werden können, bedient man sich in vitro Experimenten wie 8

10 beispielsweise long-term culture-initiating cell (LTC-IC) assays, durch welche primitive Zellen nachgewiesen werden können. Diese bringen auch noch nach fünf Wochen in vitro Kultivierung Kolonien-bildende Zellen (CFCs; colony-forming cells) hervor. 14,15 Da in vitro Versuche meist nur einen beschränkten Einblick in die Biologie der Stammzelle erlauben, werden zunehmend Tiermodelle bei der Erforschung der humanen hämatopoetischen Stammzellen eingesetzt. So sind die meisten Erkenntnisse, welche über den Phänotyp oder das Repopulationsverhalten menschlicher hämatopoetischer Stammzellen zusammengetragen wurden, das Ergebnis von Transplantationsexperimenten in immundefizienten Mäusen, fetalen Schafen oder letal bestrahlten Primaten Multipotente Stammzelle Abbildung 1: Hierarchisches System der Hämatopoese. Aus multipotenten hämatopoetischen Stammzellen, welche sich ständig selbst erneuern, gehen myeloide und lymphoide Stammzellen hervor, aus welchen sich über Differenzierungszwischenstufen die acht verschiedenen Blutzelltypen bilden. (verändert aus: Entwicklungsbiologie. Wolpert, Lewis. Heidelberg, Berlin: Spektrum Akademischer Verlag; 1999) 9

11 Eines der Hauptziele der Forschung mit humanen hämatopoetischen Stammzellen ist die Charakterisierung und Isolierung von möglichst frühen Stammzellen und deren in vitro Kultivierung und Expansion. Hämatopoetische Stammzellen exprimieren die allermeisten Oberflächenmoleküle, welche auf ausgereiften hämatopoetischen Zellen zu finden sind und daher auch als linienspezifische Marker bezeichnet werden, nicht. Im Gegensatz zu den ausgereiften hämatopoetischen Zellen exprimieren Stammzellen das Oberflächenmolekül CD Die Entdeckung von CD34 war das Ergebnis der Entwicklung eines Antikörpers, welcher eine Subfraktion von Knochenmarkzellen erkennen sollte, die ausgereifte Blutzellen ausschloß. 21 Die Expression von CD34 wird bei Ausreifung und Differenzierung der Zellen herunterreguliert und kann daher zur Selektion von relativ frühen hämatopoetischen Stammzellen herangezogen werden. 22 Über die genaue Funktion von CD34 ist nur sehr wenig bekannt. Sowohl Hinweise für eine Funktion als Regulator bei der Zelladhäsion als auch bei der Differenzierung von hämatopoetischen Stammzellen wurden beschrieben. 23,24 Nichtsdestotrotz hat die Entdeckung dieses Moleküls die Forschung mit hämatopoetischen Stammzellen stark beeinflusst und beschleunigt. 25 Die Expression von CD34 wurde sehr schnell der entscheidende Marker als Basis für die Bestimmung der Anzahl, der Isolation und Manipulation von Stammzellen in hämatopoetischem Material. 20 Das Oberflächenmolekül CD34 findet sich allerdings nicht nur auf hämatopoetischen Stamm- und Progenitorzellen, sondern auch auf endothelialen Zellen und einigen Fibroblasten. 26,27 Diese Tatsache weist darauf hin, daß CD34 keine spezifische Aufgabe bei der Hämatopoese erfüllt. Diese Annahme wird auch durch Versuche mit CD34-knock-out-Mäusen untermauert, in welchen gezeigt werden konnte, daß die Hämatopoese durch das Fehlen von CD34 in diesen Tieren nicht beeinträchtigt war Mesenchymale Stammzellen Neben den hämatopoetischen Stammzellen beherbergt das Knochenmark auch Stammzellen, die sich in nicht hämatopoetische Zelltypen differenzieren lassen. Diese Stammzellen werden je nach Autor und Isolierungsmethode als mesenchymale Stammzellen (mesenchymal stem cells; MSC), mesodermale Progenitorzellen (mesenchymal progenitor cells; MPC), adulte Knochenmarkstroma-Stammzellen (adult bone marrow stromal stem cells; BMSSC) oder stromale Knochenmarkszellen (marrow stromal cells, MSC) bezeichnet Diese Zellen, im weiteren Text als mesenchymale Stammzellen bezeichnet, sind adhärent wachsende Zellen mit fibroblastenartigen Ausläufern (Abb. 2). Sie können nach einem von Fridensthein etablierten Verfahren aus Knochenmarkaspiraten isoliert und expandiert werden. 34 Dabei 10

12 werden zunächst die mononukleären Zellen aus dem Ausgangsmaterial durch Dichtegradientenzentrifugation herausisoliert und in Kultur gebracht. Humane mesenchymale Stammzellen wachsen im Gegensatz zu hämatopoetischen Zellen adhärent und lassen sich somit durch mehrmaliges komplettes Entfernen des Kulturmediums von den mobilen hämatopoetischen Stammzellen abtrennen. Durch Differenzierung und anschließende linienspezifische Färbungen und RT-PCR lassen sich die MSC, die sich morphologisch nicht von den nicht differenzierbaren Fibroblasten unterscheiden, als MSC bestimmen.35 Abbildung. 2: Mesenchymale Stammzellen aus humanem Knochenmark nach mehrwöchiger in vitro Expansion. Lichtmikroskopische Aufnahme bei 100facher Vergrößerung. Abbildung 3: In vitro Differenzierung von humanen MSC. Die linke Aufnahme zeigt in Adipozyten differenzierte MSC. Deutlich erkennbar sind die gelblichen Lipidvesikel. Die rechte Aufnahme zeigt in Osteoblasten differenzierte MSC in einer alkalischen Phosphatase Färbung. Osteodifferenzierte Zellen sind durch eine abgeflachte, ausgefranste und im Gegensatz zu undifferenzierten Zellen weniger spindelförmige Struktur gekennzeichnet. Lichtmikrospische Aufnahmen bei 100-facher Vergrößerung. 11

13 Mesenchymale Stammzellen können in vitro unter definierten Bedingungen in Osteoblasten, Adipozyten, Chondrozyten, Muskelzellen, Vorläufer von Neuronen und in die Blutzellbildung unterstützende Stromazellen differenziert werden (Abb. 3 und 4). 29,35-38 In vivo Untersuchungen im Schafmodell ergaben, daß humane MSC, in fetale Schafe gespritzt, in der Lage sind, im nahezu gesamten Schaforganismus anzuwachsen und in den jeweiligen Organen spezifische Differenzierungen zu durchlaufen. 39 Mesenchymale Stammzelle Osteoblast Chondroblast Myoblast Stromaler Fibroblast Präadipozyt Osteozyt Chondrozyt Myozyt Stromazelle Adipozyt Abbildung 4: Differenzierungspotenzial von mesenchymalen Stammzellen. Das Schaubild stellt die Differenzierungslinien dar, in welche humane MSC aus Knochenmark bisher differenziert werden konnten. (verändert aus: Mesenchymal stem cells of human adult bone marrow. Pittenger Mark und Marshak Daniel in: Stem cell biology. Marshak Daniel, Gardner Richard und Gottlieb Daniel, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2001) 12

14 Über zwei Wochen in vitro expandierte MSC zeigen eine relativ einheitliche Morphologie und exprimieren eine Reihe verschiedener Oberflächenmarker wie beispielsweise SH2 (CD105), SH3 (CD73), CD29, CD44, CD71 sowie den auch auf hämatopoetischen Zellen vorhandenen Marker CD90. 32,35,40,41 Negativ sind MSC im Gegensatz dazu bezüglich des auf hämatopoetischen Zellen vorhandenen Oberflächenmoleküls CD45 und des auf hämatopoetischen Progenitoren zu findenden Moleküls CD34. Somit ist eine Abgrenzung der MSC von hämatopoetischen Zellen durch Analyse des Expressionsprofils bezüglich der zuvor genannten Marker relativ gut möglich. Da aber bisher kein für MSC spezifischer Marker ermittelt werden konnte und viele der von MSC exprimierten Oberflächenmoleküle auch auf ähnlichen Zelltypen wie beispielsweise Fibroblasten zu finden sind, ist eine eindeutige Bestimmung von MSC nur durch Differenzierung in mindestens zwei Bindegewebszellrichtungen (Adipozyten, Osteoblasten oder Chondrozyten) möglich. MSC scheinen nicht auf das Knochenmark beschränkt zu sein. So konnten Zellen mit ähnlichem Differenzierungspotential auch im Fettgewebe, der Plazenta sowie, wenn auch nur in viel geringerer Frequenz als im Knochenmark, im Nabelschnurblut nachgewiesen werden Eine Isolierung der Zellen aus peripherem Blut hingegen gelang bisher noch nicht. Im Jahr 2001 wurde erstmals von einer weiteren adhärent wachsenden, adulten Stammzelle aus dem Knochenmark berichtet. 49 Die von der Arbeitsgruppe um C. Verfaille beschriebenen Zellen, welche als MAPC (multipotent adult progenitor cells) bezeichnet werden, besitzen neben der Fähigkeit, in die mesenchymalen Linien zu differenzieren, auch das Potenzial, in endotheliale Zellen und Hepatozyten zu differenzieren. 50,51 Für murine Zellen dieses Typs konnte gezeigt werden, daß sie, wenn sie als Einzelzelle in frühe Blastocysten injiziert werden, sich in den Organismus des wachsenden Individuums integrieren und im adulten Organismus anschließend Abkömmlinge dieser einen Zelle in den meisten, wenn nicht in allen Organen, zu finden sind. 52 MAPC werden durch Depletion der CD45 + und Glycophorin A + Zellen, sowie durch Kultivierung in einem spezifischen Medium in mit Fibronectin beschichteten Kulturflaschen selektiert. Ihre Frequenz im Knochenmark scheint deutlich geringer zu sein als diejenige von MSC. MAPC wird die Fähigkeit zugesprochen, ohne Einbüßen des Differenzierungspotenzials nahezu unbegrenzt in vitro expandiert werden zu können. Ob es sich bei MAPC um komplett andere Zellen als bei MSC handelt oder ob MAPC eine besonders frühe und unreife Subfraktion innerhalb der mesenchymalen Stammzellen darstellt, ist bis jetzt unklar. 13

15 1.4 Transdifferenzierung und Stammzellplastizität Bereits im frühen Embryonalstadium laufen in den durch die Furchungen entstandenen Zellen des Blastocystenstadiums Prozesse ab, die eine Aufteilung in drei zukünftige Gewebetypen, die sogenannten Keimblätter, bewirken. Aus dem Mesoderm entwickeln sich später Muskeln, Knorpel, Knochen, Herz, Blut und Niere. Das Entoderm bringt die inneren Organe Darm, Lunge und Leber hervor, während aus dem Ektoderm die Epidermis und das Nervensystem entstehen. Die bisherige Theorie geht davon aus, daß jedes Gewebe oder Organ im adulten Organismus seine gewebespezifischen Stammzellen enthält, welche über ein hierarchisches System - wie dies am Beispiel der Hämatopoese experimentell gezeigt werden konnte - alle Progenitoren und Vorstufen sowie die ausgereiften Zellen des jeweiligen Gewebes hervorbringen. Lange Zeit herrschte die allgemeine Meinung vor, daß multipotente Stammzellen aus einem bestimmten Gewebe nicht dazu fähig sind, Zellen eines anderen Gewebes zu erzeugen. In den letzten Jahre mehren sich Berichte, die darauf hinweisen, daß Zellen eines Gewebes sich in Zellen eines anderen Gewebes umwandeln können. Dieser Vorgang, welcher mit dem Verlust von gewebespezifischen Eigenschaften und der Ausbildung von Kennzeichen eines anderen Gewebes einhergeht, wird als Transdifferenzierung bezeichnet. 1 In einer Reihe von Studien konnte beispielsweise gezeigt werden, daß Knochenmarkzellen nach Transplantation zu einem unterschiedlichen Ausmaß in nicht hämatopoetischen Geweben des Rezipienten zu finden sind. So konnten nach hämatopoetischer Transplantation Zellen mit Herkunft vom Spender und Expression von organspezifischen Markern in der Haut und dem Lungenepithel, im Pankreas, in der Leber, in Skelettmuskeln und weiteren Geweben gefunden werden Andererseits konnte gezeigt werden, daß neuronale Zellen, die in letal bestrahlte Empfängermäuse injiziert wurden, hämatopoetische Zellen bilden konnten. 58 Ähnliches konnte bei Experimenten, in welchen Muskelzellen transplantiert wurden, gezeigt werden. 59 Derartige Beobachtungen wurden mit dem Phänomen der Stammzellplastizität erklärt. Als Stammzellplastizität wird die Fähigkeit von gewebespezifischen Stammzellen bezeichnet, eine Nachkommenschaft zu erzeugen, die Eigenschaften eines anderen Gewebetypes besitzen. 60 Stammzellplastizität ist allerdings nur eine von mehreren Möglichkeiten, welche derartige Beobachtungen erklären könnten. Da Blut im gesamten Organismus zirkuliert, ist nicht auszuschließen, daß die Transplantate mit hämatopoetischen Stammzellen kontaminiert waren. Eine weitere Alternative ist die Existenz von sehr seltenen pluripotenten Stammzellen im adulten Organismus, welche nicht wie die multipotenten Stammzellen nur auf die Erzeugung von Zellen eines der Keimblätter beschränkt sind, eventuell im Organismus zirkulieren und in verschiedenen Gewebe 14

16 anwachsen können. Andere Studien erklären Plastizitätsphänomene mit Zellfusionen. So konnte gezeigt werden, daß transplantierte hämatopoetische Zellen im Rezipienten mit Neuronen, Herzmuskelzellen und Leberzellen fusionierten. 61 Welche der Erklärungen die richtige ist oder ob die aufgeführten Plastizitätshinweise auf verschiedene Ursachen zurückzuführen sind, müssen künftige Untersuchungen zeigen. Zudem besteht die Möglichkeit, daß manche Ergebnisse auch auf die künstlichen Bedingungen des gewählten Versuchaufbaus zurückzuführen sind und in der beobachteten Art und Weise im natürlichen Organismus gar nicht auftreten. 1.5 Fetale Leber als Quelle für hämatopoetische und mesenchymale Stammzellen Die Entwicklung des hämatopoetischen Systems im Menschen beginnt im Dottersack des Föten in der vierten Woche der Entwicklung. Ab der fünften Woche verlagert sich die Hämatopoese langsam in die Leber, welche während dem ersten und dem größten Teil des zweiten Trimesters der Embryonalentwicklung das Hauptorgan der Hämatopoese darstellt. Im weiteren Verlauf der Entwicklung verlagert sich die Blutbildung kontinuierlich bis zur Geburt in das Knochenmark, dem endgültigen Ort der Hämatopoese (Abb. 5). 62 Erythroide Zellen machen den Großteil der hämatopoetischen Zellen in der fetalen Leber aus. Sie enthält jedoch auch myeloide sowie lymphoide Vorläuferzellen. 63 In mehreren Arbeiten konnte gezeigt werden, daß fetale Leber auch hämatopoetische Stammzellen enthält. So konnte humanes Engraftment durch repopulierende Zellen aus fetaler Leber nach Xenotransplantation sowohl in immundefizienten NOD/SCID-Mäusen als auch in fetalen Schafen nachgewiesen werden. 64,65 Da hämatopoetische Stammzellen für das Engraftment nach myeloablativer Behandlung verantwortlich sind, aber andererseits in den hämatopoetischen Geweben nur in sehr geringer Frequenz vorkommen (im NOD/SCID-System ungefähr 1 SCID-repopulierende Zelle (SRC) in 1x10 6 mononukleären Zellen in Plazentarestblut; geringere Frequenzen in adultem Knochenmark und mobilisiertem peripherem Blut), ist eines der wichtigsten Ziele der experimentellen Hämatologie die Entwicklung von Protokollen zur Anreicherung bzw. Expansion dieser Zellen. 66 Bei der Entwicklung solcher Protokolle kommt es darauf an, daß nicht nur eine numerische Vervielfachung der Ausgangszellzahl erfolgt. Die Erfüllung der folgenden Kriterien ist bei einer erfolgreichen in vitro Expansion unerlässlich: (1) Der expandierte Zellpool muß weiterhin auch Zellen enthalten, die zur Selbsterneuerung und Differenzierung in alle Zellinien des hämatopoetischen Systems befähigt sind. (2) Zusätzlich 15

17 müssen diese Zellen weiterhin die Fähigkeit besitzen, nach Transplantation einen Organismus effizient zu repopulieren. 67 In der Vergangenheit wurde eine Vielzahl von Protokollen zur in vitro Expansion von hämatopoetischen Stammzellen entwickelt, jedoch nur wenige Studien erfüllten die zuvor genannten strengen Kriterien. Bhatia et al konnten zeigen, daß sich SRC aus der CD34 + CD38 - Fraktion hämatopoetischer Zellen aus Plazentarestblut während vier Tagen in Serum-freien Kulturen um das zwei- bis vierfache vermehren liesen. Nach neun oder mehr Tagen Kultivierung im Expansionsmedium liesen sich jedoch keine SRC mehr nachweisen. 68 Die Gruppe um Wanda Piacibello beschreibt hingegen ein Expansionsprotokoll, bei dem ausgehend von CD34 + Zellen aus Plazentarestblut während neun bis zehnwöchiger Kultivierung eine Vermehrung von SRC um das 70fache erreicht werden konnte % 50 Monate 3 6 Geburt 3 Mesenchym Leber Milz Knochenmark Abbildung 5: Prozentualer Anteil von Mesenchym, Leber, Milz und Knochenmark an der Hämatopoese während der menschlichen Embryonal- und Fetalentwicklung. 16

18 Die meisten Untersuchungen beschäftigen sich mit der Ermittlung von Protokollen zur Expansion von hämatopoetischen Stammzellen aus adultem Knochenmark oder Plazentarestblut. Abgesehen von der Schwierigkeit der Etablierung von effizienten Expansionsprotokollen, stellt sich bei beiden Transplantatquellen bei allogenen Transplantationen nach wie vor das Problem der Möglichkeit einer Graft-Versus-Host- Reaktion. Die allogene Stammzelltransplantation ist mittlerweile ein etabliertes Therapieverfahren für hämatopoetische Neoplasien, insbesondere akute Leukämien, chronisch myeloische Leukämien und myelodysplastische Syndrome. Für Patienten ohne familiären Stammzellspender ist inzwischen auch die fremd-allogene Transplantation etabliert. Aktuelle Studien zeigen, daß für ca. 30% der Patienten jedoch kein passender Spender gefunden werden kann. 70 Frühere Untersuchungen deuten daraufhin, daß fetale Leber eine alternative Quelle für hämatopoetische Transplantate darstellen könnte und möglicherweise frühere Stammzellen mit höherem Proliferationspotential und einem Prä-Immunstatus beinhaltet Die Untersuchung von hämatopoetischen fetalen Leberzellen als mögliche Quelle für hämatologische Transplantate könnte insbesondere für solche Patienten, für die kein HLAidenter Spender gefunden werden kann, von großer Bedeutung sein. Aufgrund der geringen Probengröße ist der klinische Einsatz bei adulten Patienten oder Kindern bisher noch nicht möglich. Vielversprechende Ergebnisse durch Einsatz von hämatopoetischen Zellen aus fetaler Leber wurden bisher bei pränatalen in utero Transplantationen zur Therapie von angeborenen Immundefekten, hämatologischen Erkrankungen und Stoffwechselstörungen erzielt. 73 Um hämatopoetische Stammzellen aus fetaler Leber auch bei Kindern und Erwachsenen zu einer klinischen Anwendung bringen zu können, ist es unbedingt notwendig, Protokolle zu entwickeln, die es ermöglichen, die geringe Ausgangszahl an Stammzellen vor Transplantation in den Patienten durch in vitro Expansion zu vermehren. Peters et al etablierten ein einfaches Stroma-freies Kultursystem, welches eine Langzeitexpansion von humanen hämatopoetischen Zellen aus fetaler Leber über mehr als sechs Monate ermöglicht. 75 Auch nach mehrmonatiger Expansion sind in diesen Kulturen CD34 + Zellen, Kolonie-bildende Progenitoren sowie Zellen mit charakteristischen Stammzelleigenschaften nicht nur immer noch nachweisbar, sondern auch stark vermehrt. Ähnlich wie in Knochenmarkkulturen finden sich in hämatopoetischen Kulturen von fetaler Leber bereits nach wenigen Tagen adhärent wachsende fibroblastenartige Zellen, welche durch langsame Proliferation nach und nach den gesamten Boden der Kulturflasche bedecken (Faes-van`Hull; persönliche Mitteilung). Diese Zellen besitzen eine ähnliche spindelförmige 17

19 Morphologie und ein ähnliches Wachstumsverhalten wie mesenchymale Stammzellen aus dem Knochenmark. Möglicherweise handelt es sich bei diesen Zellen ebenfalls um nicht hämatopoetische Zellen mit mesenchymalem Differenzierungspotenzial. 1.6 Immundefiziente Mausstämme als Modellsysteme für die Stammzellforschung Da im Gegensatz zu anderen Vertebraten die Erforschung von hämatopoetischen Stamm- und Progenitorzellen beim Menschen in vivo nur sehr schwer oder gar nicht möglich ist, beschränkte sich die hämatopoetische Stammzellforschung mit humanem Material lange Zeit auf in vitro Untersuchungen. Mit in vitro Assays in Form von Langzeitkulturen können beispielsweise die Anzahl von Progenitoren in zu untersuchenden Proben sowie deren Proliferationsvermögen und die Differenzierungsfähigkeit in die myeloide Linie sowie B- und T-Zellen bestimmt werden. 14,76-78 Das Problem bzw. die Frage, die sich dabei immer stellt, ist, inwieweit sich die unter den mehr oder weniger künstlichen Bedingungen der in vitro Zellkultur gemessenen Ergebnisse auf den lebenden Organismus übertragen lassen. Überdies kann eine der wichtigsten Eigenschaften, die eine humane hämatopoetische Stammzelle besitzen muß, nicht in vitro getestet werden: Eine funktionelle hämatopoetische Stammzelle muß die Fähigkeit besitzen, einen Empfänger nach Myeloablation zu repopulieren. 67,79 Daher beschäftigen sich Forscher schon seit vielen Jahren mit der Entwicklung von in vivo Modellen zur Erforschung der menschlichen Hämatopoese. Neben der von Zanjani und Mitarbeitern etablierten, jedoch sehr aufwendigen Methode der Injektion von humanen hämatopoetischen Stammzellen in fetale Schafe, werden vor allem immundefiziente Mausstämme als Rezipienten von humanen Stammzellen bei Repopulationsexperimenten verwendet. 80,81 Immundefiziente Mausmodelle wurden ursprünglich als in vivo Modelle zur Analyse von immunregulatorischen Prozessen und zur Untersuchung der Pathogenese von Autoimmunerkrankungen verwendet. 82 Immundefiziente Mäuse werden darüber hinaus bei Xenotransplantationsexperimenten, in welchen das Wachstum und Verhalten von lymphoiden Tumoren analysiert wird, verwendet. 83 Des weiteren werden sie in großem Maßstab bei Untersuchungen zum Engraftment und Differenzierungsverhalten von allogenen und xenogenen Transplantaten eingesetzt. 79,84 Die Anfänge der Entwicklung von immundefizienten Mausstämmen für die Erforschung humaner hämatopoetischer Zellen reichen in die frühen 80er Jahre des letzten Jahrhunderts zurück. Bosma und Kollegen entwickelten einen Mausstamm, welcher eine autosomal rezessive Mutation im scid Gen besitzt. Die Mutation dieser als severe combined immundeficiency (SCID) bezeichneten Maus verhindert ein erfolgreiches DNA- 18

20 Rearrangement und somit die notwendige Neuanordnung von Immunglobulin- und T- Zellrezeptorgenen. Daraus wiederum resultiert ein Mangel an Lymphozyten, welcher dazu führt, daß sämtliche Immunfunktionen, die durch T- und B-Zellen vermittelt werden, ausgeschaltet sind. 81,82,85,86 Diese Immundefekte und die daraus resultierenden Konsequenzen bei diesem Mausstamm sind den Defekten sehr ähnlich, welche bei der bei Menschen auftretenden SCID-Erkrankung zu finden sind. 87 Aufgrund der stark reduzierten Immunfunktionen war dieser neue Maussstamm nicht nur als Modell für die SCID-Erkrankung, sondern auch als Modellystem für Xenotransplantationsexperimente mit humanen hämatopoetischen Transplantaten geeignet. SCID-Mäuse wurden und werden teilweise noch auf drei verschiedene Weisen eingesetzt, um das Engraftmentverhalten von humanen hämatopoetischen Stammzellen zu untersuchen. Das erste für diese Zwecke beschriebene Modell war die SCID-hu-Maus. Bei diesem Mausmodell werden humane Zellen aus fetaler Leber oder fetalem Knochenmark zusammen mit fetalem Thymusgewebe unter die Nierenkapsel einer nicht bestrahlten SCID-Maus verpflanzt. 88 Die Idee, welche hinter dieser Technik steckt, ist es, die transplantierten humanen Stammzellen mit einer humanen Mikroumgebung zu versehen, welche durch das fetale Thymusgewebe erzeugt wird. Beim zweiten auf der SCID-Maus basierenden Transplantationsmodell werden normale, nicht immundefiziente Mäuse mit einer letalen Strahlendosis bestrahlt und anschließend mit Knochenmarkzellen von SCID-Mäusen transplantiert. In diese so konditionierten Mäuse werden dann humane Stammzellen aus Knochenmark transplantiert. 89 Die dritte und am häufigsten angewandte Variante der SCID-Maus ist die direkte Injektion von humanen hämatopoetischen Stammzellen in subletal bestrahlte Tiere. Bei dieser erstmals im Jahre 1992 von Lapidot et al beschriebenen Methode erhielten die zu transplantierenden Individuen vor der Transplantation eine subletale Ganzkörperbestrahlung von cgy. 90 Ein wesentliches Problem bei dieser Variante des SCID-Maus Modells war der relativ geringe Grad des Engraftments, welcher sich zwischen 0,5 und 5% bewegte. Mindestens zwei verschiedene Faktoren wurden dafür verantwortlich gemacht. Zum einen benötigen hämatopoetische Stammzellen zur Proliferation und Differenzierung spezifische Zytokine. Es ist sehr wahrscheinlich, daß die von der murinen Umgebung produzierten Zytokine diese Funktion aufgrund der Unterschiedlichkeit zum humanen System nicht in ausreichender Form erfüllen können. Die zweite Erklärung für das niedrige Engraftment könnte eine kompensatorisch erhöhte Aktivität der angeborenen Immunkomponenten der SCID-Mäuse sein. Obwohl SCID-Mäuse keine funktionellen B- und T-Zellen besitzen, ist die Funktion ihrer Granulozyten und Makrophagen nicht beeinträchtigt. Darüber hinaus konnte gezeigt 19

21 werden, daß SCID-Mäuse eine erhöhte Aktivität von hämolytischem Komplement und natürlichen Killerzellen (NK-Zellen) aufweisen, welche das Wachstum von humanen Stammzellen während des Engraftmentprozesses hemmen könnten. 91 Im Jahre 1994 gelang es Shultz und Mitarbeitern durch Kreuzung von SCID-Mäusen mit NOD/Lt-Mäusen (NOD = non obese diabetic) einen neuen, noch stärker immundefizienten Mausstamm zu erzeugen. Die NOD/Lt-Maus ist ein Modellorganismus für Insulinabhängigen Diabetes, welcher durch T-Zellen vermittelt wird. NOD/Lt-Mäuse weisen eine verminderte Funktion der NK-Zellen sowie ein Fehlen von zirkulierendem Komplement auf Der neu erzeugte Mausstamm NOD/SCID vereinigte die Immundefizienzen beider Elternstämme den Mangel an lymphoiden Zellen der SCID-Maus sowie die Defekte der angeborenen Immunität der NOD/Lt-Maus. Darüber hinaus sind NOD/SCID-Mäuse nicht von Diabetes betroffen, da ihnen die zur Vermittlung der Erkrankung notwendigen T-Zellen fehlen. Die NOD/SCID-Maus ist mittlerweile eines der etabliertesten und am häufigsten benutzten immundefizienten Tiermodelle. Das Fehlen eines funktionsfähigen Immunsystems macht NOD/SCID-Mäuse für transplantierbare, humane Stamm- und Progenitorzellen, welche aus Plazentarestblut, fetaler Leber oder Knochenmark gewonnen werden können, empfänglich. Bei einem klassischen NOD/SCID-Assay werden angereicherte humane hämatopoetische Stammzellen in eine zuvor mit 375 cgy subletal bestrahlte Rezipientenmaus intravenös injiziert. Nach vier bis sechs Wochen lässt sich humanes Engraftment durch SCIDrepopulierende Zellen (SRC) in der Milz, im Knochenmark oder im peripheren Blut feststellen (Abb. 6). Humane hämatopoetische Zellen, welche nach vier bis sechs Wochen im Knochenmark von engrafteten NOD/SCID-Mäusen gefunden werden können, umfassen sowohl frühe Progenitorzellen als auch ausdifferenzierte Zellen der myeloiden Linie und lymphoiden B-Zellreihe. Eine komplette Differenzierung in alle Zelltypen des humanen hämatopoetischen Systems inklusive T-Zellen konnte bisher jedoch nicht konsistent gezeigt werden. Eine der wenigen noch vorhandenen funktionellen Komponenten des Immunsystems der NOD/SCID-Maus sind deren NK-Zellen. NK-Zellen eliminieren Zielzellen mit geringer oder fehlender Expression an MHC Klasse I Antigenen. 95 Kumar et al konnten zeigen, daß die Abstoßung von elterlichem Knochenmark bei Individuen der F1 Generation durch NK-Zellen vermittelt wird. Dieser Effekt weißt darauf hin, daß repopulierende Knochenmarkzellen ein mögliches Ziel für NK-Zellen darstellen. 96 Daher ist es denkbar, daß die noch vorhandene 20

22 NK-Zellaktivität in NOD/SCID-Mäusen das Überleben von frühen, unreifen humanen hämatopoetischen Stammzellen beeinträchtigt oder verhindert. In Experimenten mit Perforin-defizienten Mäusen konnte gezeigt werden, daß die Immunität, welche durch NK-Zellen vermittelt wird, von dem Molekül Perforin abhängt. 97,98 Nachdem sich die NK-Zelle an ihre Zielzelle gebunden hat, setzt sie Perforin aus den zytotoxischen Granulae frei. Das Perforin polymerisiert und erzeugt Poren in der Membran der Zielzelle. In Perforin-defizienten Mäusen finden sich normale Mengen an CD8 positiven Zellen und NKsubletale Ganzkörper- Bestrahlung (375 cgy) Intravenöse Injektion von humanen Stammzellen FACS, Southern-Blot Engraftment- Analyse: Knochenmark, Milz, peripheres Blut 4-6 Wochen Sekundärtransplantation Abbildung 6: Stammzellassay im NOD/SCID-Maus Xenotransplantationsmodell. Zur Analyse des Repopulationsvermögens humaner hämatopoetischer Stammzellen werden diese in einer Suspension intravenös in subletal bestrahlte NOD/SCID-Mäuse injiziert. Bei erfolgreicher Repopulation des Empfängertieres kann nach vier bis sechs Wochen mittels Durchflußzytometrie (FACS) oder Southern-Blotting humanes Engraftment im peripheren Blut, der Milz oder im Knochenmark festgestellt werden. 21

23 Zellen. Eine durch die NK-Zellen vermittelte Zytotoxizität ist hingegen nicht feststellbar. Die NK-Zellen dieser Mäuse können zwar aktiviert werden, jedoch können sie kein Perforin freisetzen. Daher ist der Tötungsmechanismus der NK-Zellen in diesen Mäusen ausgeschaltet. Ein Mäuseorganismus, welcher die Defekte der NOD/SCID und der Perforin-defizienten Maus aufweist, wäre in Bezug auf sein Immunsystems noch effektiver geschwächt und sollte ein noch besseres Engraftment von humanen Stammzellen ermöglichen. 22

24 2 Zielsetzung und Fragestellungen 2.1 Mesenchymale Stammzellen aus adultem humanem Knochenmark Das Hauptaugenmerk der Forschung mit humanen mesenchymalen Stammzellen richtet sich derzeit auf deren Differenzierungspotential bzw. die Plastizität dieser Zellen. Gegenwärtig werden dabei hauptsächlich die therapeutischen Möglichkeiten des Gewebeersatzes mit in vitro in die chondrogene bzw. osteogene Richtung differenzierten MSC untersucht Ausgangsmaterial sind bisher immer Zellen, welche aus Knochenmarksuspensionen durch Selektion auf Plastikadhärenz in einem spezifischen Medium isoliert werden. Diese Zellen zeigen nach ein- bis zweiwöchiger Kultivierung ein relativ einheitliches Bild bezüglich ihrer Morphologie und Expression von Oberflächenmarkern. So sind die Zellen nach in vitro Expansion positiv bezüglich der Marker CD73, CD105 (Endoglin) und CD90 (Thy-1), negativ hingegen sowohl bezüglich des Zelloberflächenmoleküls CD34, welches auf hämatopoetischen Progenitoren und Endothelzellen exprimiert wird, als auch bezüglich des hämatopoetischen Markers CD Im Gegensatz zum gut charakterisierten Phänotyp, den die Zellen nach in vitro Kultivierung zeigen, ist nur sehr wenig über den Phänotyp in vivo bekannt. Des weiteren ist auch unklar, ob eine nähere ontogenetische Verbindung zwischen hämatopoetischen und mesenchymalen Stammzellen existiert. Die Ko-Lokalisierung beider Stammzellen im gleichen Organ lässt einen näheren Zusammenhang vermuten. In Verbindung mit dieser Fragestellung ergibt sich somit auch die Frage, ob eine direkte gemeinsame Vorläuferzelle von hämatopoetischen und mesenchymalen Stammzellen im adulten Knochenmark existiert. In diesem Kontext sollte in dieser Arbeit zunächst der in vivo Phänotyp humaner mesenchymaler Stammzellen bezüglich der Marker CD34 und CD45 untersucht werden. Es sollte überprüft werden, ob mesenchymale Stammzellen aus der Fraktion der CD34 + bzw. der CD34 + CD45 + Zellen des menschlichen Knochenmarks, in welcher die hämatopoetischen Progenitoren zu finden sind, isoliert werden können. Des weiteren sollte analysiert werden, ob es möglich ist, mesenchymale Stammzellen in vitro durch Anwendung spezifischer Kulturbedingungen in Zellen mit hämatopoetischen bzw. endothelialen Eigenschaften zu differenzieren. Zusätzlich sollte in immundefizienten Mäusen das Engraftment- und Differenzierungspotential von MSC in vivo untersucht werden. 23

25 2.2 Fetale Leber als Ausgangsmaterial zur Gewinnung von mesenchymalen und hämatopoetischen Stammzellen Mesenchymale Stammzellen wurden bisher nicht nur im Knochenmark, sondern auch beispielsweise im Fettgewebe und im Nabelschnurblut gefunden. 43,45 Durch Analyse des Differenzierungspotenzials der in hämatopoetischen Kulturen von fetaler Leber nachweisbaren stromalen Zellen, sollte überprüft werden, ob es sich hierbei ebenfalls um mesenchymale Stammzellen handelt. Mit den hämatopoetischen Zellen aus diesem Material wurden stromafreie Langzeitkulturen angelegt. Die Arbeitsgruppe um Pierre Rollini und Serge Leyvraz vom Centre Puridisciplinaire d`oncologie (Lausanne, Schweiz) konnte in diesen in vitro Versuchen eine über sechs Monate anhaltende Langzeitexpansion von humanen hämatopoetischen Zellen aus fetaler Leber zeigen. 75 Der Nachweis der Stammzellen in den Expansionskulturen erfolgte über durchflußzytometrische Charakterisierung der Stammzellpopulationen und Kolonieassays. Der eindeutige Nachweis der Funktionalität von Stammzellen kann allerdings nur durch die Überprüfung des Repopulationsvermögens im Tiermodell gezeigt werden. 2.3 Anwendung von Mausmodellen zum Nachweis von multipotenten, adulten, humanen Stammzellen NOD/SCID-Mäuse können nach subletaler Bestrahlung mit humanen hämatopoetischen Stammzellen transplantiert werden. Das Knochenmark der Mäuse wird innerhalb weniger Wochen von den humanen Stammzellen repopuliert. 81 Daher sollte in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe Rollini/Leyvraz im NOD/SCID-Modell gezeigt werden, ob und in welchem Ausmaß sich SCID-repopulierende Zellen aus humaner fetaler Leber mit dem in Lausanne etablierten Protokoll über vier Wochen in vitro Expansion vermehren lassen. Humane Stammzellen differenzieren in der NOD/SCID-Maus sowohl in Zelltypen der myeloiden als auch der lymphoiden Zellreihe - eine komplette Ausdifferenzierung in alle Zelltypen inklusive ausgereifter T-Zellen findet jedoch nicht statt. Auch ist das Engraftment nach Transplantation von kleinen Zellzahlen in der Regel niedrig. Ein mögliches Hindernis, welches die humane Hämatopoese in der NOD/SCID-Maus beeinträchtigt, könnten die noch vorhandenen, funktionsfähigen Komponenten des murinen Immunsystems sein. Eine der wenigen noch vorhandenen Immunfunktionen der NOD/SCID-Maus sind NK-Zellen. Um das NOD/SCID-Modell für die Xenotransplantation von hämatopoetischen und auch 24

26 mesenchymalen Stammzellen zu optimieren, wurde versucht, einen noch stärker immundefizienten Mausstamm (PNOD/SCID) zu generieren. Mit diesem Ziel wurden NOD/SCID-Mäuse mit Perforin-defizienten Mäusen, welche keine funktionsfähigen NK- Zellen besitzen, gekreuzt. Es sollte speziell die Eignung des neuen Mausstammes als Modellorganismus zur Untersuchung des Repopulationsverhaltens von hämatopoetischen Stammzellen charakterisiert werden. Darüber hinaus sollte im Falle einer besseren Eignung des neuen Stammes für Repopulationsversuche untersucht werden, ob in PNOD/SCID- Mäusen eine Repopulation durch intravenös applizierte MSC aus humanem Knochenmark erreicht werden kann. 25

27 3 Material und Methoden 3.1 Material Geräte Bestrahlungsbox Werkhof Universitätsklinik Freiburg Bestrahlungsgerät CIS bio international IBL 637 Blutbild-Differenzierungszähler Hecht Brutschrank Heraeus Instruments Durchflußzytometer Becton Dickinson FacsCalibur Dako Cytomation Cyan ELISA-Reader Tecan Sunrise Einfrierbox Nalgene Fluoreszenzmikroskop Zeiss Fotokamera Olympus OM-4 TI Gelelektrophoresekammer IBI MPH Heißklebepistole Henkel Supermatic 200 plus Heizblock Roth Test Tube Thermostat Techne DM Block DB-20 Liebisch Hybridisierungsofen Vysis HYBrite Kühlschränke Siemens Öko Plus Liebherr Forma Scientific Lichtmikroskop Olympus CK2 Zeiss Axiovert 135 Magnetrührer KIKA Labortechnik RCT basic IKAMAG RCT Magnetzellseparierer Miltenyi Biotec MidiMACS Separator Mausinjektionsfixierer Werkhof Universitätsklinik Freiburg Mikrowellengerät Siemens Neubauer-Zählkammer Brand Neubauer Improved Bright-line Ohrknipser Best Yet Tag Co PCR-Gerät GeneAmp PCR System 2400, Perkin-Elmer 26

28 Pipetten Gilson Pipetman P2, P20, P200, P1000 Anthos New Line Biohit Proline 5-50 Pipettierhilfe Integra Biosciences Pipetboy acu ph-meter Knick Präparierbesteck Aesculap Rotlichtlampe EWT infrafit Schüttelinkubator New Brunswick Scientific Spektrophotometer Amersham Biosciences Gene Quant Pro Beckman DU 640 Sterilbank Heraeus LaminAir 2448 Thermomixer Eppendorf Thermomixer Comfort Vortexer Heidolph Waage Sartorius Basic Wasserbad Julabo UC Zellsortierer Cytomation MoFlo Zentrifugen Heraeus Sepatech Heraeus Biofuge 13 Heraeus Biofuge fresce Gebrauchswaren Combitips 5 ml, 25 ml Deckgläschen Einfrierröhrchen Einmalspritzen 2 ml, 5 ml, 20 ml Einweghandschuhe EDTA-Röhrchen 1 ml Feindosierungsspritzen 1 ml Glaskapillaren Impfnadeln Kanülen 100 Sterican 0,45 x 12 mm 1,10 x 30 mm Objektträger Eppendorf (Hamburg) Langenbrinck (Emmendingen) Corning (New York, NY, USA) Braun (Melsungen) Ansell (München) Sarstedt (Nürnberg) Braun (Melsungen) Biochrome (Cambridge, GB) Nunc (Roskilde, DK) Braun (Melsungen) Langenbrinck (Emmendingen) 27

29 MACS Separationssäulen Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach) Mikroschraubröhrchen Sarstedt (Nürnberg) Mullkompressen 5x5 cm Maimed (Neuenkirchen) OP-Maske 3M Health Care (Borken) Pasteurpipetten Brand (Wertheim) PCR-Röhrchen Sarstedt (Nürnberg) Perfusor-Einmalspritzen Braun (Melsungen) Pipettenspitzen 10 µl, 20 µl, 200 µl, 1000 µl Molecular Bioproducts (San Diego, CA, USA) Plastikpipetten 2 ml, 5 ml, 25 ml, 50 ml Corning (New York, NY, USA) Falcon BD (Le Pont de Claix, F) Polypropylen-Röhrchen 14 ml, 15 ml, 50 ml Greiner (Frickenhausen) Polypropylen-Röhrchen 225 ml Falcon BD (Le Pont de Claix, F) Polypropylen-Rundbodenröhrchen Falcon BD (Meylan Cedex, F) Polystyrol-Rundbodenröhrchen Falcon BD (Meylan Cedex, F) (= FACS-Röhrchen ) Reservoir-Gefäß Corning (New York, NY, USA) Safe-Lock Tubes 1,5 ml Eppendorf (Hamburg) (= Eppendorfröhrchen ) Skalpell zum Einmalgebrauch pfm (Köln) Slide Flasks Nunc (Roskilde, Dänemark) Sterilfilterflaschen 0,22 µm Millipore (Bedford, MA, USA) Zellkulturflaschen Nunc (Roskilde, DK) 25 cm 2, 75 cm 2, 175 cm 2, 225 cm 2 Zellkulturplatten 24er, 48er, 96er Nunc (Roskilde, DK) (= Wellplatten ) Zellsieb 40 µm, 70 µm, 100 µm Falcon BD (Le Pont de Claix, F) Medien Alpha-MEM Cambrex (Verviers, B) Fibroblast Basal + Growth Medium PromoCell (Heidelberg) Dulbeccos MEM (DMEM) Gibco (Paisley, GB) IMDM Gibco (Paisley, GB) MCDB 2001 Medium Sigma (Steinheim) 28

30 Mesenchymal Stem Cell Growth Medium RPMI Cambrex (Walkersville, MD, USA) Gibco (Paisley, GB) Zytokine, Mediumzusätze und Differenzierungsfaktoren 3-isobutyl-methyl-Xanthin (IBMX) Sigma (Steinheim) β-glycerophosphat Sigma (Steinheim) Dexamethason Sigma (Steinheim) epidermal growth factor (EGF) Sigma (Steinheim) fibroblast growth factor (FGF) R+D Systems (Wiesbaden) Flt3 Ligand (Flt-3) Cell Genix (Freiburg) Amgen a fetales Kälberserum (FCS) Seromed (Berlin) Holotransferrin Sigma (Steinheim) Humanalbumin 20% Baxter (Unterschleißheim) Humanplasma (Blutgruppe AB) Blutbank, Uniklinik Freiburg Indomethazin Sigma (Steinheim) Insulin Sigma (Steinheim) insulin-like growth factor (IGF) Sigma (Steinheim) insulin-transferrin-sodium selenite media suppl. Sigma (Steinheim) Interleukin 6 (Il-6) Cell Genix (Freiburg) Amgen a L-Ascorbinsäure Sigma (Steinheim) L-Glutamin Gibco (Paisley, GB) linoleic acid-albumin bovine serum albumin Sigma (Steinheim) low density lipoprotein (LDL) Sigma (Steinheim) megakaryocyte growth and Amgen development factor (MGDF) Natriumpyruvat Gibco (Paisley, GB) Penicillin/Streptomycin (P/S) Gibco (Paisley, GB) platelet derived growth factor (PDGF) Sigma (Steinheim) stem cell factor (SCF) Cell Genix (Freiburg) Amgen a R&D b stem cell growth factor (SCGF) tebu-bio (Offenbach) 29

31 Thrombopoietin (TPO) Cell Genix (Freiburg) vascular endothelial growth factor (VEGF) R+D Systems (Wiesbaden) 2-Mercaptoethanol Gibco (Paisley, GB) a für Versuche mit hämatopoetischen Zellen aus fetaler Leber b für HUVEC Antikörper a) Antikörper für die Durchflußzytometrie FITC anti human CD3 Immunotech (Marseille, F) FITC anti human CD14 Becton Dickinson (San Jose, CA, USA) FITC anti human CD15 Becton Dickinson (San Jose, CA, USA) FITC anti human CD20 Becton Dickinson (San Jose, CA, USA) FITC anti human CD34 Becton Dickinson (San Jose, CA, USA) FITC anti human CD36 Immunotech (Marseille, F) FITC anti human CD45 Immunotech (Marseille, F) FITC anti human CD90 Pharmingen (San Diego, CA, USA) PE anti human CD19 Becton Dickinson (San Jose, CA, USA) PE anti human CD31 Becton Dickinson (San Jose, CA, USA) PE anti human CD33 Becton Dickinson (San Jose, CA, USA) PE anti human CD38 Immunotech (Marseille, F) PE anti human CD44 Becton Dickinson (San Jose, CA, USA) PE anti human CD45 Immunotech (Marseille, F) PE anti human CD73 Becton Dickinson (San Jose, CA, USA) PerCP anti human CD45 Immunotech (Marseille, F) anti human CD105 Pharmingen (San Diego, CA, USA) APC anti mouse CD45R/B220 (RA3-6B2) Pharmingen (San Diego, CA, USA) FITC anti mouse Chemicon (Temecula, CA, USA) FITC anti mouse CD3 Pharmingen (San Diego, CA, USA) PE anti mouse CD49b/PAN-NK Cells BD Pharmingen (San Diego, CA, USA) PE anti mouse Ly GG (GR-1) Pharmingen (San Diego, CA, USA) FITC mouse IgG1 Immunotech (Marseille, F) FITC rat IgG2a κ isotype control Pharmingen (San Diego, CA, USA) PE rat IgM κ Isotype control BD Pharmingen (San Diego, CA, USA) PE mouse IgG 2a Immunotech (Marseille, F) 30

32 b) Antikörper zur immunomagnetischen Selektion Zur Isolierung und Anreicherung von CD34 + Zellen aus Nabelschnurblut wurde das CD34 Progenitor Cell Isolation Kit von Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach) verwendet Molekularbiologische, immunologische und Färbungs-Kits CEP 8 Spectrum Orange Vysis (Maurens-Scopont, F) High Speed Plasmid Maxi Kit Qiagen (Hilden) Leucocyte Alkaline Phosphatase Sigma Diagostics (St. Louis, MO, USA) Mouse serum IgG ELISA Kit Alpha Diagnostics (San Antonio, USA) Qiaprep Spin Miniprep Kit Qiagen (Hilden) Super Script II Gibco (Paisley, GB) Enzyme Enzyme wurden von NEB (Frankfurt) oder Invitrogen (Karlsruhe) bezogen Oligonukleotide Als PCR-Primer eingesetzte Oligonukleotide wurden vom Labor Dr. Igloi, Institut für Biologie III, Albert-Ludwigs-Universität Freiburg, synthetisiert. Tabelle 1: verwendete Oligonukleotide Name Sequenz ap2 up 5 TAC TGG GCC AGG AAT TTG AC 3 ap2 down 5 TGG TTG ATT TTC CAT CCC AT 3 FLK1 up 5 CTG GCA TGG TCT TCT GTG AAG CA 3 FLK1 down 5 AAT ACC AGT GGA TGT GAT GCG G 3 GAPDH up 5 TGC TAT GGT TTC AAC TGA ACC 3 GAPDH down 5 GTC GCT GTT GAA GTC AGA 3 Oligo19 5 GCA TCG CCT TCT ATC GCC TTC T 3 Oligo20 5 CCG GTC CTG AAC TCC TGG CCA C 3 Oligo32 5 AGC CCC TGC ACA CAT TAC TG 3 Osteopontin up 5 CTA CTT AGA CTA CTT GAC CAG TGA C 3 Osteopontin down 5 CTA GGC ATC ACC TGT GCC ATA CC 3 31

33 3.1.9 Sonstige Reagenzien und Chemikalien Aceton Agarose Albumin, bovin (BSA) Ammoniumchlorid-Lösung Ampicillin Biocoll Separating Solution Borgal Bromphenolblau Eindeckmittel Aquatex Vecta Shield Ethanol Chloroform Chloroquin Clinimax MACS PBS/EDTA Puffer Diethylpyrocarbonat Dimethylsulfoxid (DMSO) Dithiorethreitol DNA-Ladder (100 bp) EDTA Essigsäure Ethidiumbromid Ethanol Gelatine Glycerin Harnstoff Heißklebe-Patronen Pattex Hot HEPES Isoamylalkohol Fibronectin Forene (Isofluran) Isopropanol Kaliumchlorid Merck (Darmstadt) Invitrogen (Paisley, GB) Sigma (Steinheim) Stem Cell Technologies (Vancouver, BC, CDN) Sigma (Steinheim) Biochrom AG (Berlin) Intervet (Whitby, On, CDN) Sigma (Steinheim) Merck (Darmstadt) Vector Laboratories (Peterborough, GB) J.T.Baker (Deventer, NL) J.T.Baker (Deventer, NL) Sigma (Steinheim) Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach) Sigma (Steinheim) Sigma (Steinheim) Sigma (Steinheim) Gibco (Paisley, GB) Serva (Heidelberg) Merck (Darmstadt) Invitrogen (Karlsruhe) J.T.Baker (Deventer, NL) Sigma (Steinheim) Sigma (St. Louis, MO, USA) Merck (Darmstadt) Henkel (Düsseldorf) Sigma (Steinheim) Merck (Darmstadt) Sigma (Steinheim) Abbott (Wiesbaden) J.T.Baker (Deventer, NL) Merck (Darmstadt) 32

34 Liquemin N 5000 Luria Broth Base Methanol Natriumcitrat Natriumchlorid Natriumhydroxid Plätzchen Na 2 HPO 4 Oil Red O PBS Dulbecco`s Polybrene polyinosinic-polycytidylic acid Propidiumiodid Proteinkinase K Roti-Phenol Saccharose Salzsäure SDS TriPure Isolation Reagent Trizma Base Trypsin EDTA (1X) Trypsin EDTA für Endothelzellen (1X) Türks Lösung Xylenen Cyanole FF Hoffmann-la Roche (Grenzach-Wyhlen) Invitrogen (Paisley, GB) Merck (Darmstadt) Merck (Darmstadt) Merck (Darmstadt) Merck (Darmstadt) Merck (Darmstadt) Sigma (Steinheim) Gibco (Paisley, GB) Sigma (Steinheim) Sigma (St. Louis, Mo, USA) Sigma (Steinheim) Merck (Darmstadt) Roth (Karlsruhe) Sigma (Steinheim) Merck (Darmstadt) Serva (Heidelberg) Boehringer (Mannheim) Sigma (Taufkirchen) Gibco (Paisley, GB) Sigma (Taufkirchen) Merck (Darmstadt) Sigma (Steinheim) Puffer und Lösungen HBS NaCl 280 mm HEPES 50 mm Na 2 HPO 4 1,5 mm ph 7,05 DNA-Ladepuffer Harnstoff 7 M Saccharose 1,46 M EDTA 0,1 M + einige Körner Bromphenolblau und Xylenen Cyanole 33

35 Lysispuffer Tris 0,1 M (zur Lyse von Schwanzspitzen) EDTA 5 mm SDS 0,2% NaCl 0,2 M Lysispuffer NH 4 Cl 0,15 M (zur Lyse von Erythrozyten) KHCO 3 1 mm EDTA 0,1 M TAE (50X) Tris 2 M Essigsäure 1 M EDTA 0,1 M TE Tris 10 mm EDTA 1 mm 20XSSC NaCl 3 M Natriumcitrat 0,3 M EDV-Programme Cell Quest Cell Quest Pro Endnote 7 Excel 97 L-Calc Photo Editor Power Point 97 Statistica Version 5 Summit Word 97 Becton Dickinson Becton Dickinson Thomson Microsoft Stem Cell Technologies Microsoft Microsoft StatSoft Inc. Dako Cytomation Microsoft Bakterien DH5α XL1 Blue Strain Competent Cells Invitrogen (Karlsruhe) Stratagene (La Jolla, CA, USA) 34

36 Mausstämme NOD/LtSz-scid/scid-Mäuse (NOD/SCID) wurden ursprünglich von Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, USA), C57/BL6-Mäuse von Elevage Janvier (Orleans, F) erworben. Beide Stämme werden seit einigen Jahren in der Tierhaltung des ZKF des Universitätsklinikums Freiburg gezüchtet. Perforin knock-out NOD/LtSz-scid/scid-Mäuse (PNOD/SCID) wurden von U. Kapp und D. Kägi (Ontario Cancer Institute, Toronto, On, CDN) durch Kreuzung von Perforin knock-out NOD-Mäusen (PNOD) und NOD/SCID-Mäusen erzeugt und vor einigen Jahre nach Freiburg transferiert, wo sie ebenfalls in der Tierhaltung des ZKF des Universitätsklinikums gezüchtet werden Humanes Zellmaterial Alle Versuche mit humanem Zellmaterial wurden mit Genehmigung der Ethikkommission der Universitätsklinik Freiburg durchgeführt Knochenmark Menschliches Knochenmark wurde von gesunden, freiwilligen Spendern im Alter zwischen 19 und 37 Jahren zur Verfügung gestellt und wurde in einer Menge von ml unter lokaler Anästhesie aus dem Beckenkamm entnommen Plazentarestblut Plazentarestblut (= Nabelschnurblut) entstammte dem Freiburger Plazentarestblutprogramm, von welchem Proben unterhalb eines Limits bezüglich Gewicht und Stammzellanteil zu Forschungszwecken bereitgestellt werden Fetale Leber Humanes fetales Lebergewebe wurde aus legalen Aborten der Schwangerschaftswochen gewonnen und von der Arbeitsgruppe Rollini/Leyvraz (Centre Puridisciplinaire d Oncologie, Lausanne, CH) zur Verfügung gestellt Endothelzellen Endothelzellen vom Typ HUVEC (human umbilical vein endothelial cells) wurden freundlicherweise von Frau Dr. M. Machein zur Verfügung gestellt. 35

37 Fibroblasten NHDF (normal human dermal fibroblasts) wurden von der Firma Promo Cell erworben. 36

38 3.2 Methoden Zellbiologische Methoden Alle Arbeiten mit eukaryotischen Zellen wurden unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Die Kultivierung der Zellen erfolgte in Brutschränken bei 37 C und einem Kohlendioxidanteil von 5%. Die Zellzahlbestimmung erfolgte mittels Neubauer-Zählkammern unter Verwendung von Türks Lösung (zur Lyse der Erythrozyten) bzw. Trypan Blau Färbelösung (zur Ermittlung des Anteils vitaler Zellen). Die Zellzahl wurde wie folgt berechnet: Zellzahl / ml = Zellzahl (4 Großquadrate) 4 x Verdünnungsfaktor x Isolierung von mononukleären Zellen aus humanem Knochenmark Humane Knochenmarkproben wurden spätestens 24 h nach der Punktion verarbeitet. Das mit Gerinnungshemmer Liquemin versetzte Knochenmark wurde mit isotoner Kochsalzlösung (PBS) im Verhältnis 1:3 gemischt und durch ein Zellsieb mit Maschenweite von 100 µm gefiltert. Zur Separation der mononukleären Zellen (MNC) von den übrigen Bestandteilen der Knochenmarksuspension wurde eine Dichtegradientenzentrifugation durchgeführt. Dazu wurden in 50 ml Proberöhrchen 15 ml Biocoll Separating Solution mit 30 ml Knochenmarksuspension überschichtet und bei RT und 560 g 25 min lang ohne Bremsfunktion zentrifugiert. Bei dieser Art der Dichtegradientenzentrifugation sammeln sich die MNC in der Interphase an, während Knochenstückchen, Erythrozyten und Granulozyten aufgrund ihrer höheren Dichte am Boden des Röhrchens sedimentieren (Abb. 7). Die MNC wurden anschließend mit einer 10 ml Pipette aus der Interphase abgesaugt und in PBS gewaschen. Dazu wurden die Zellen der Interphase mit 30 ml PBS verdünnt und bei 440 g 5 min lang zentrifugiert. Das Pellet wurde anschließend in 5 ml PBS resuspendiert. Zur Bestimmung der Zellzahl wurde ein Aliquot der Zellsuspension mit Türks Lösung 1:10 verdünnt und in einer Neubauerkammer ausgezählt. Bei sich anschließender Auftrennung der Zellen in Subfraktionen mittels FACS wurden die Zellen nach der Dichtegradientenzentrifugation zusätzlich mit Ammoniumchlorid behandelt, 37

39 indem die Zellsuspension im Verhältnis 1:4 mit Ammoniumchlorid-Lösung gemischt, 5 min lang auf Eis inkubiert und anschließend nochmals in PBS gewaschen wurde. KM-Suspension Zentrifugation RT 560 g 25 min ohne Bremsfunktion Interphase Dichtegradient Erythrozyten Zelltrümmer Granulozyten Abbildung 7: Dichtegradientenzentrifugation zur Isolierung von MNC. Der Dichtegradient wird mit KM-Suspension überschichtet und ohne Bremsfunktion abzentrifugiert. Die Fraktion der mononukleären Zellen positioniert sich in der Interphase oberhalb des Dichtegradienten, während Partikel mit höherer Dichte am Boden des Gefäßes sedimentieren Isolierung von mononukleären Zellen aus Nabelschnurblut Humane Nabelschnurblutproben wurden spätestens 48 h nach der Abnahme verarbeitet. Die Isolation von MNC aus Nabelschnurblut erfolgte auf gleiche Weise wie bei Knochenmark Kultivierung von mesenchymalen Stammzellen Die Isolation von mesenchymalen Stammzellen (MSC) beruhte auf der Selektion durch Plastikadhärenz in einem für MSC selektiven Expansionsmedium (Mesenchymal Stem Cell Basal Medium + Supplemente = Mesenchymal Stem Cell Growth Medium; MSCGM). Dieses Medium ermöglicht eine Expansion der Zellen unter Bedingungen, welche keine Differenzierung der Zellen induziert. MNC aus frischem Knochenmark wurden in einer Konzentration zwischen 10 6 bis 10 7 MNC/ml in MSCGM suspendiert. Die Zellsuspension wurde dann in einer Menge von 10 ml pro T75 Kulturflasche oder 25 ml pro T175 Kulturflasche für 24 bis 48 h kultiviert. Danach wurde das Medium komplett entfernt und durch neues Medium ersetzt. Anschließend erfolgte zweimal wöchentlich ein kompletter Mediumwechsel, durch welchen alle nicht adhärenten Zellen schrittweise herausgespült 38

40 wurden. Nach zwei bis drei Wochen erhielt man dadurch eine homogene konfluente Monolayer von MSC. Beim Erreichen der Konfluenz wurde das Medium komplett entfernt und die Zellen fünf Minuten lang mit PBS gewaschen. Anschließend wurde das PBS komplett entfernt und Trypsin-EDTA für Endothelzellen (1 ml/25 cm 2 Kulturflaschenfläche) zugegeben. Nach Inkubation mit Trypsin über 5 min bei 37 C im Brutschrank wurde das Trypsin durch Zugabe von MSCGM deaktiviert. Die abgelösten MSC wurden anschließend bei 440 g abzentrifugiert, das Pellet in MSCGM resuspendiert, die Zellen gezählt und in einer Dichte von Zellen/ cm 2 neu ausgepflanzt Kultivierung von Endothelzellen Endothelzellen (HUVEC) wurden in mit 1%iger Gelatinelösung beschichteten Kulturflaschen in IMDM mit folgenden Zusätzen kultiviert: FCS 10% Humanalbumin 10% SCF 50 ng/ml VEGF 50 ng/ml FGF 20 ng/ml SCGF 20 ng/ml Die Endothelzellen wurden beim Erreichen der Konfluenz gleichmäßig auf zwei neue Kulturflaschen verteilt. Dazu wurde zunächst das Medium gegen PBS gewechselt. Anschließend wurden die Endothelzellen mit Trypsin für Endothelzellen von der Zellkulturflasche abgelöst, bei 440 g abzentrifugiert und in neuem Medium resuspendiert Kultivierung von hämatopoetischen Stammzellen aus fetaler Leber Zellsuspensionen von frischem, humanem Lebergewebe wurden zweimalig in RPMI gewaschen und danach weggefroren. Zur Expansion von hämatopoetischen Stammzellen wurden die Zellen bei 37 C aufgetaut und in einer Konzentration von 10 5 lebenden nukleären Zellen (TNC)/ml in RPMI mit 8% AB Plasma, Flt-3 Ligand (50 ng/ml), Interleukin 6 (10 ng/ml), MGDF (10 ng/ml) und SCF (50 ng/ml) kultiviert. Die Expansion der Zellen erfolgte in T25 Kulturflaschen. Das Medium wurde zweimal wöchentlich gewechselt. 39

41 Die Expansion hämatopoetischer Zellen aus fetaler Leber wurde freundlicherweise durch Eveline Faes-van`t Hull (Centre Puridisciplinaire d`oncologie, Lausanne, CH) durchgeführt Einfrieren und Auftauen von Zellen Zur längerfristigen Konservierung von lebenden Zellen wurden diese in spezifischen Einfriermedien (Tab. 2) eingefroren. Dazu wurden die Zellen zunächst abzentrifugiert und in 800 µl PBS resuspendiert (Ausnahme: Phoenix-ampho; diese Zellen wurden nach dem Zentrifugieren gleich in 1600 µl Einfriermedium resuspendiert). Die Zellsuspension wurde dann in ein Einfrierröhrchen überführt und mit 800 µl Einfriermedium gemischt. Der Einfriervorgang erfolgte in mit Isopropanol gefüllten Einfrierboxen, welche für 24 h in Gefrierschränken bei 80 C gelagert wurden. Die Verwendung von Einfrierboxen mit Isopropanol verlangsamt den Abkühlungsprozeß und wirkt sich daher schonend auf die Zellen aus. Nach 24 h bei 80 C wurden die Zellproben in flüssigen Stickstoff überführt. Zum Auftauen der Zellen wurden die Röhrchen im Wasserbad bei 37 C erwärmt und die aufgetaute Zellsuspension sofort in ein Komplettmedium gegeben. Zum Entfernen von DMSO und toter Zellen wurde nach 24 h ein Komplettwechsel des Mediums durchgeführt. Tabelle 2: Zusammensetzung der verwendeten Einfriermedien Zelltyp Zusammensetzung Stammzellen 77% PBS 8% HSA 15% DMSO Fibroblasten 95% Fibroblastenmedium 5% DMSO Phoenix-ampho 90% FCS 10% DMSO Immunomagnetische Zellseparation Prinzip der immunomagnetischen Zellseparation Bei der immunomagnetischen Zellseparation werden bestimmte Zellen aus Zellgemischen mit Hilfe von Magnetpartikeln, die mit spezifischen Antikörper behaftet sind, separiert. Zu Zellgemischen, aus welchen Subpopulationen bezüglich eines bestimmten Markers 40

42 herausisoliert werden sollen, werden Antikörper gegen spezifische Epitope von Oberflächenmarkern gegeben, welche ihrerseits direkt oder indirekt an magnetische Kleinstpartikel, auch als Microbeads bezeichnet, gebunden sind. Nach Inkubation der Antikörper und Auswaschen der ungebundenen Antikörper aus der Probe trägt man die Zellsuspension auf eine mit Stahlwolle gefüllte Säule auf. Die gefüllte Säule wird durch einen sie umgebenden Dauermagneten magnetisiert. Die mit Microbeads beladenen Zellen bleiben in der Magnetsäule hängen, während alle Zellen, an welche keine Microbeads gebunden sind, durch mehrmaliges Spülen mit Pufferlösung aus der Säule herausgewaschen werden. Die positiv selektierten und in der Säule gebundenen Zellen können nach dem Herausnehmen der Säule aus dem Magnetfeld ebenfalls mit Pufferlösung herausgespült werden. Der Reinheitsgrad der zu selektionierenden Fraktion kann durch Wiederholung des Separationsvorganges erhöht werden. Anreicherung von CD34 + Zellen aus Knochenmark und Nabelschnurblut Zur Anreicherung von CD34-positiven Zellen aus Knochenmark oder Nabelschnurblut wurden die aus frischen Proben isolierten MNC bei 440 g abzentrifugiert und in 500 µl MACS-Puffer (PBS/EDTA Puffer mit 0,5% humanem Serumalbumin) resuspendiert. Der Zellsuspension wurde dann zuerst FcR-Blocking Reagent und anschließend CD34 Microbeads in den vom Hersteller empfohlenen Konzentrationen zugegeben. Die Antikörperinkubation erfolgte 30 min lang bei 4 C im Dunkeln. Ungebundene Microbeads wurden anschließend durch Zugabe von 25 ml MACS-Puffer und 5 min Abzentrifugieren bei 440 g herausgewaschen. Das Zellpellet wurde dann in 4 ml MACS-Puffer resuspendiert, gefiltert und über eine zuvor mit MACS-Puffer benetzte MACS-Säule laufen gelassen. Die Säule wurde anschließend mit 10 ml Puffer gewaschen und aus dem Magnetfeld herausgenommen. Alle in der Säule verbliebenen, bezüglich CD34 positiven Zellen wurden dann mit 4 ml MACS-Puffer herausgespült. Der Selektionsvorgang wurde anschließend in identischer Weise mit einer zweiten MACS-Säule wiederholt Durchflußzytometrie Prinzip der Durchflußzytometrie Mit Hilfe der Durchflußzytometrie können Zellen in Suspension bezüglich ihrer Streulichtund Fluoreszenzeigenschaften untersucht werden. Das Prinzip dieser Methode besteht darin, Zellen in Suspension zu vereinzeln und einen Laserstrahl passieren zu lassen, um eine 41

43 Analyse des refraktierten Lichtes durchzuführen. Dies ermöglicht Aussagen über Größe, innere Zellstruktur (Granularität) sowie Fluoreszenzintensität der Einzelzelle, wobei die Fluoreszenz auf Eigenfluoreszenz der Zelle beruhen kann oder zusätzlich durch Markierung mit einem Fluorochrom induziert wird (Abb. 8). Ein FACS-Röhrchen mit der Zellsuspension wird unter die Stahlkapillare des Durchflußzytometers gesteckt. Durch Überdruck wird die Suspension über die Stahlkapillare in die aus Quarzglas bestehende Meßküvette gedrückt. Hierbei werden die Zellen von einem Trägerstrom umgeben, der dazu dient, den Probenstrom in der Küvette so einzustellen, daß die Zellen den Analysepunkt, an welchem der Laserstrahl den Flüssigkeitsstrahl trifft, einzeln durchlaufen. Dieses Prinzip bezeichnet man als Hydrodynamische Fokussierung. Abbildung 8: Prinzip der Durchflußzytometrie. Mit fluoreszierenden Antikörpern markierte Zellen werden in einer Trägerflüssigkeit vereinzelt und in einer Glaskapillare an einem Laser vorbeigeführt. Die Analyse des refraktierten Laserlichtes ermöglicht Aussagen über Größe (forward scatter), Granularität (side scatter) sowie Fluoreszenzintensität (PMT) der Einzelzelle. (aus: Immunobiology. Janeway, Charles A.; Travers, Paul; Walport, Mark; Shlomchik, Mark. New York and London: Garland Publishing; 2001) 42

44 Zur Anregung der Zellen wird ein Argon-Ionen-Laser verwendet, dessen Hauptlinie im blauen Wellenbereich bei 488 nm liegt. Wenn der Laserstrahl die Zelle trifft, kommt es zur Streuung des Laserlichtes und zur Aussendung von Fluoreszenzlicht. Diese beiden physikalischen Parameter können nun vom optischen System des Gerätes mit Hilfe von Photodetektoren erfaßt, in elektrische Signale transformiert und gegebenenfalls verstärkt werden. Vorwärtsstreulicht (forward scatter, FSC) ist ein Maß für die Zellgröße, während das Seitwärtsstreulicht (side scatter, SSC) hauptsächlich von der intrazellulären Granularität beeinflusst wird. Kanäle verschiedener Emissionspektren erlauben die Erfassung von Fluoreszenzfarbstoffen Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung Die Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (fluorescence activated cell sorting; FACS) basiert auf den gleichen Prinzipien wie die Durchflußzytometrie. Mit dem FACS-Sorter können die gleichen Parameter erfasst werden wie im Durchflußzytometer und zu sortierende Zellen können bezüglich dieser Parameter in definierte Subfraktionen separiert werden. Dazu wird jeder einzelne Tropfen, in welchem sich eine analysierte Zelle befindet, entsprechend der Oberflächencharakteristik unmittelbar nach der Analyse elektrisch aufgeladen. Der Tropfen erhält entweder eine positive oder eine negative Ladung, welche dann dazu dient, den Tropfen mit der in ihm befindlichen Zelle in einem Spannungsfeld entsprechend der Ladung nach links oder rechts abzulenken und in das jeweilige Auffangröhrchen für die entsprechende Fraktion zu befördern. Mit dieser Methode können simultan zwei distinkte Subfraktionen sortiert werden. Zur Sortierung von mononukleären Zellen aus frischem Knochenmark wurden diese 5 min lang bei 440 g abzentrifugiert und in einer Konzentration von 1x10 9 /ml in PBS resuspendiert. Danach wurden sterile Antikörper in einer Konzentration von 5 µl/10 6 MNC zugegeben. Nach einer Inkubationszeit von 20 min bei 4 C im Dunkeln wurden die ungebundenen Antikörper mit PBS herausgewaschen. Für die Zellsortierung wurden die Zellen dann in einer Konzentration von 2x10 7 Zellen pro ml in PBS resuspendiert und durch ein 100 µm Zellsieb gefiltert. Die Zellsortierung erfolgte durch einen Cytomation MoFlo Hochgeschwindigkeits- Zellsortierer. Tote Zellen und Zellaggregate, welche unspezifisch positive Signale erzeugen können, wurden durch ein spezielles Ausschlußverfahren aus der eigentlichen Sortierung ausgeschlossen. Dazu wurden in zwei Dotplot-Diagrammen Regionen gesetzt (Abb. 9). In einem ersten Diagramm, in welchem Granularität gegen die Größe der sortierten Partikel 43

45 aufgetragen waren, wurde eine Region gesetzt, welche nach der Dichtegradientenzentrifugation und Ammoniumchloridbehandlung übrig gebliebene Erythrozyten und Zelltrümmer ausschloß ( Lifegate ; R1). In einem zweiten Diagramm wurde die Größe der Zellen gegen das Integral der Zellgröße aufgetragen. Bei dieser Darstellung liegen alle einzelnen Zellen auf einer Geraden. Zwei oder mehrere Zellen, welche aneinander haften, liegen deutlich über oder unter dieser Geraden. Durch das Legen einer Sortierregion um diese Gerade (R2) wurden somit Zelldupletten oder Zellaggregationen ausgeschlossen. Sortierte Zellen der verschiedenen Fraktionen wurden in Polypropylen-Rundbodenröhrchen aufgefangen, anschließend 5 min lang bei 440 g abzentrifugiert, in MSCGM resuspendiert und in Kultur genommen. Abbildung 9: Ausschluß von toten Zellen und Dupletten bei Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung. Bei der Sortierung von fluoreszierenden Zellen wurden nur diejenigen einbezogen, welche innerhalb der Regionen R1 (linkes Diagramm) und R2 (rechtes Diagramm) lagen. Im linken Schaubild sind Größe (FSC) und Granularität (SSC) aufgetragen. Region R1 umschließt die Menge der lebenden Zellen ( Lifegate ). In den Bereichen links der Region R1 befinden sich Erythrozyten sowie tote Zellen und Zelltrümmer. Im rechten Schaubild ist das Integral der Partikelgröße gegen die Partikelgröße aufgetragen. Einzelzellen liegen bei dieser Darstellung auf einer Geraden. Punkte, welche oberhalb bzw. unterhalb dieser Geraden liegen, repräsentieren Zelldupletten oder Zellaggregate, welche durch die Region R2 ausgeschlossen werden. 44