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1 EPOELISA medac Monoklonaler Enzymimmunoassay zur quantitativen Bestimmung von Erythropoietin (EPO) im Serum Deutsch/English 500VPDE/220703

2 HERSTELLER/MANUFACTURER medac Gesellschaft für klinische Spezialpräparate mbh Fehlandstraße 3 D20354 Hamburg VERTRIEB/MARKETING medac Gesellschaft für klinische Spezialpräparate mbh Geschäftseinheit Diagnostika Theaterstraße 6 D22880 Wedel Tel./Phone: ++49 / 4103 / Fax: ++49 / 4103 / BESTELLADRESSE/ORDERING ADDRESS Tel./Phone: ++49 / 4103 / Fax: ++49 / 4103 / Deutsch: S. 1 English: p. 13 Literatur/References: S./p VPDE/220703

3 EPOELISA medac Monoklonaler Enzymimmunoassay zur quantitativen Bestimmung von Erythropoietin (EPO) im Serum KatalogNr.: 500 NUR FÜR FORSCHUNGSZWECKE EINFÜHRUNG Im Knochenmark werden kontinuierlich rote Blutkörperchen gebildet. Die Proliferation und Differenzierung der erythrozytären Vorläuferzellen wird durch das Hormon Erythropoietin (EPO) gesteuert (4,6). EPO wird überwiegend in den Nieren und in geringem Maße in der Leber gebildet (1). Es ist ein relativ hitze und phunempfindliches Glycoprotein mit einem Molekulargewicht von 30 kd, bestehend aus 165 Aminosäuren und 4 Kohlenhydratseitenketten. Die Synthese von EPO wird durch Sauerstoffsensoren gesteuert, die unter anderem in der Niere lokalisiert sind. Der wichtigste Reiz für eine vermehrte Synthese des Hormons wird durch Gewebshypoxie hervorgerufen (2). Eine vermehrte EPOProduktion initiiert eine gesteigerte E rythropoese. Nach Beseitigung der Gewebshypoxie schließt sich der Regelkreis, indem die Bildung von EPO zurückgefahren wird. Die klassische und lange Zeit einzige Methode, EPO zu bestimmen, war die Verwendung der posthypoxischen polyzythämischen Maus im Invivo Bioassay. Diese international anerkannte Referenzmethode dient der Kalibrierung aller Meßergebnisse in Internationalen Einzeiten (miu/ml). Der InvivoBioassay ist zwar relativ spezifisch für EPO, seine Präzision ist jedoch gering. Außerdem ist er unempfindlich (Nachweisgrenze 25 miu/ml) und arbeitsintensiv (5). Im EPOELISA medac werden zwei monoklonale Antikörper zur quantitativen Bestimmung der EPOSpiegel im Serum eingesetzt (s. Testprinzip). Der EPOELISA ist gegen den 3 rd International Standard for EPO, rdna derived (41 st Meeting of the WHO ECBS, Oct. 1990) kalibriert. Im enserum vorliegende HumanAntiMausAntikörper (HAMA) führen in diesem ELISA nicht zu falsch positiven Ergebnissen. 500 VPDE/

4 TESTPRINZIP Mit AntiEPOAntikörper (Maus, monoklonal) beschichtete Mikrotiterplatte. EPO aus der enprobe bindet an den Antikörper. EPO EPO Der APgekoppelte AntiEPO Antikörper (Maus, monoklonal) bindet an das EPO. Es entsteht ein SandwichKomplex (P = Alkalische Phosphatase). EPO Inkubation mit pnppsubstrat (*). Stoppen der Reaktion mit Natronlauge. Die Auswertung erfolgt photometrisch VPDE/220703

5 PACKUNGSINHALT KAT.NR.: Mikrotiterplatte: 12 Teststreifen à 8 Vertiefungen (mit Halterahmen und Trockenmittelpappe im Aluminiumbeutel vakuumverschweißt), brechbar, Rundboden, beschichtet mit AntiEPOAntikörper, monoklonal (Maus) und BSA, gebrauchsfertig. 2. Standards: 6 Fläschchen à 1,0 ml, rekombinantes EPO, gebrauchsfertig, enthalten BSA, Phenol, ProClin TM 300 und Gentamycinsulfat. 2a. Standard 1: 160 miu/ml 2b. Standard 2: 80 miu/ml 2c. Standard 3: 40 miu/ml 2d. Standard 4: 10 miu/ml 2e. Standard 5: 2,5 miu/ml 2f. Standard 6: 1,25 miu/ml 3. Kontrolle: 2 Fläschchen à 0,5 ml, humanes Serum, lyophilisiert. 4. Konjugat: 1 Röhrchen à 0,25 ml AntiEPOAntikörper, monoklonal (Maus), APkonjugiert (41x), enthält FKS und Natriumazid (< 0,1%). 5. Waschpuffer: 1 Flasche à 100 ml (10x), enthält Natriumazid (< 0,1%). 6. Probenverdünnungspuffer: 1 Flasche à 100 ml, gebrauchsfertig, enthält BSA und Natriumazid (< 0,1%). 7. Konjugatverdünnungspuffer: 1 Fläschchen à 13 ml, gebrauchsfertig, enthält MausIgG und Natriumazid (< 0,1%). 8. Substrat: 1 Fläschchen à 10 ml, gebrauchsfertig, enthält p Nitrophenylphosphat und Diethanolamin, Xi, reizend, R 36, S VPDE/

6 1. LAGERUNG UND HALTBARKEIT Material/Reagenz Zustand Lagerung Haltbarkeit Testkit ungeöffnet C bis Verfalldatum Mikrotiterplatte geöffnet C im Beutel 4 Wochen mit Trockenmittelpappe Standards geöffnet C 4 Wochen Kontrolle gelöst C 2 Wochen Konjugat verdünnt RT 3 Stunden Waschpuffer verdünnt C 4 Wochen Probenverdünnungspuffer geöffnet C bis Verfalldatum Konjugatverdünnungspuffer geöffnet C bis Verfalldatum Substrat geöffnet C 4 Wochen Die Reagenzien sind nach Ablauf des angegebenen Verfalldatums nicht mehr zu verwenden. 2. ZUSÄTZLICH BENÖTIGTE REAGENZIEN UND MATERIALIEN 2.1. Aqua ad iniectabilia (H 2 O bidest.). Die Verwendung von entionisiertem Wasser kann zu Störungen im Testsystem führen ml 0,9%ige NaClLösung ml 3N NaOHLösung Mikroliterpipetten für entsprechende Volumina Saubere Glas oder Kunststoffgefäße zum Verdünnen von Waschpuffer, Konjugat und Proben Geeignete Vorrichtung zum Waschen der Mikrotiterplatte (z. B. Multistepper oder ELISAWaschgerät) Inkubator für 37 C MikrotiterplattenPhotometer mit Filtern für 405 und 490 oder nm VPDE/220703

7 3. ANSETZEN DER REAGENZIEN Alle Kitkomponenten müssen vor Testansatz auf Raumtemperatur gebracht werden. Ermitteln Sie die Anzahl der benötigten Mikrotitervertiefungen Mikrotiterplatte Der Aluminiumbeutel muß nach jeder Entnahme zusammen mit der Trockenmittelpappe wieder fest verschlossen werden. Lagerung und Haltbarkeit der nicht verwendeten Mikrotitervertiefungen s. Tabelle Waschpuffer 1 Teil Waschpuffer (10x) wird mit 9 Teilen 0,9% NaClLösung angesetzt (z. B. 50 ml Waschpuffer (10x) mit 450 ml 0,9% NaCl Lösung). Für acht Vertiefungen werden 20 ml Waschpuffer benötigt. Evtl. im Waschpuffer (10x) vorhandene Kristalle sind vor dem Ansetzen durch Erwärmen (max. 37 C) und/oder Rühren bei RT in Lösung zu bringen Kontrolle Rekonstitution mit 0,5 ml Aqua ad iniectabilia Konjugat Das Konjugat (41x) ist vor Verdünnung gut zu durchmischen. Verdünnung 1+40 mit Konjugatverdünnungspuffer (z.b. 75 µl Konjugat (41X) mit 3 ml Konjugatverdünnungspuffer). Für acht Vertiefungen werden 0,4 ml verdünntes Konjugat benötigt Stopplösung Pro Mikrotiterplatte werden etwa 5 ml einer 3N NaOHLösung benötigt. Diese ist nicht im Kit enthalten. Die Reagenzien einer Charge sind nicht mit Reagenzien anderer Chargen oder anderer Hersteller zu mischen. Nur bei exakter Einhaltung der Arbeitsvorschrift und bei Verwendung der Testkitspezifischen Reagenzien werden valide und reproduzierbare Ergebnisse erhalten. 500 VPDE/

8 4. UNTERSUCHUNGSMATERIAL 4.1. Der Test ist geeignet zur Untersuchung von Serum Eine Vorbehandlung der Seren, wie z. B. Inaktivierung, ist nicht erforderlich, sie sollten jedoch nicht mikrobiell kontaminiert und frei von Humanerythrocyten sein Die Seren und die Kontrolle werden initial in der Mikrotiterplatte 1 : 2 mit Probenverdünnungspuffer verdünnt. Es werden zunächst 25 µl Probenverdünnungspuffer pro Vertiefung vorgelegt. Anschließend erfolgt die Zugabe von je 25 µl enserum bzw. Kontrolle. Proben außerhalb des Meßbereiches können beliebig weiterverdünnt werden Wiederholtes Einfrieren und Auftauen kann zu EPOKonzentrationsabfällen in enproben führen und sollte daher vermieden werden. Ggf. sind die Proben vor dem Einfrieren zu aliquotieren und bei 18 C oder darunter zu lagern. 5.A. ARBEITSVORSCHRIFT 5.1. Die Verpackung der Mikrotiterplatte am ZIPVerschluß öffnen und die erforderliche Anzahl Mikrotitervertiefungen entnehmen (s. 3.1.). Die Mikrotitervertiefungen sind gebrauchsfertig und müssen nicht vorgewaschen werden Die Vertiefungen A1 und A2 dienen der Ermittlung des Blanks. Jeweils 50 µl Probenverdünnungspuffer in diese Vertiefungen pipettieren Jeweils 50 µl der Standards pro Vertiefung pipettieren. Wir empfehlen Doppelbestimmungen Jeweils 25 µl Probenverdünnungspuffer pro Vertiefung für Serumbestimmungen und Kontrollen pipettieren. Anschließend jeweils 25 µl Probe pro Vertiefung pipettieren. Wir empfehlen Doppelbestimmungen Die Mikrotitervertiefungen 60 min (± 2 min) bei 37 C (± 1 C) inkubieren (feuchte Kammer oder mit Folie abgeklebt) VPDE/220703

9 5.6. Nach Inkubation die Mikrotitervertiefungen dreimal mit jeweils 300 µl Waschpuffer waschen. Darauf achten, daß alle Vertiefungen beim Waschen gefüllt werden. Nach jedem Waschgang Waschlösung jeweils für 1 min in den Vertiefungen stehenlassen (soak time). Nach Beendigung des Waschvorganges Mikrotitervertiefungen auf Filterpapier ausklopfen. Nicht austrocknen lassen! Umgehend weiterverwenden! µl Konjugat in alle Vertiefungen pipettieren Erneut 60 min (± 2 min) bei 37 C (± 1 C) inkubieren (feuchte Kammer oder mit Folie abgeklebt) Nach Inkubation die Mikrotitervertiefungen 4x mit jeweils 300 µl Waschpuffer waschen (s. 5.6., soak time beachten) µl Substrat in jede Vertiefung pipettieren und 30 min ± 2 min bei 37 C (± 1 C) im Dunkeln inkubieren (feuchte Kammer oder mit Folie abgeklebt) Durch Zugabe von 50 µl Stopplösung in jede Vertiefung wird die Reaktion gestoppt. Als Ergebnis der EnzymSubstratReaktion entsteht das gelbe Endprodukt pnitrophenol, dessen Absorption auch ohne Zugabe von Stopplösung photometrisch bei 405 nm (Referenz: 490 nm oder 620 nm) bestimmt werden kann. Nach 30 Minuten Substratinkubation erfaßt man in der Regel den EPOKonzentrationsbereich 2,5160 miu/ml. Zur Feindifferenzierung des Meßbereiches 1,25 10 miu/ml kann die Substratinkubation auf 60 Minuten verlängert werden. Man erfaßt dann einen Meßbereich von 1,25 80 miu/ml (siehe S. 11). Mikrotitervertiefungen vor photometrischer Messung von unten abwischen und darauf achten, daß keine Luftblasen in den Vertiefungen vorhanden sind! 500 VPDE/

10 Empfohlenes Pipettierschema: A Blank Blank 1 1 B Std. 160 miu/ml Std. 160 miu/ml 2 2 C Std. 80 miu/ml Std. 80 miu/ml 3 3 D Std. 40 miu/ml Std. 40 miu/ml 4 4 E Std. 10 miu/ml Std. 10 miu/ml 5 5 F Std. 2,5 miu/ml Std. 2,5 miu/ml 6 6 G Std. 1,25 miu/ml Std. 1,25 miu/ml 7 7 H Kontr. Kontr B. TABELLE ZUR ARBEITSVORSCHRIFT Probenverdünnungspuffer Standards Kontrolle Probe Blank (A1/A2) 50 µl Standards Kontrolle Probe 50 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 60 min bei 37 C inkubieren, 3 x mit 300 µl Waschpuffer waschen, nach jedem Waschen 1 min inkubieren Konjugat 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 60 min bei 37 C inkubieren, 4 x mit 300 µl Waschpuffer waschen, nach jedem Waschen 1 min inkubieren Substrat 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 30 min bei 37 C im Dunkeln inkubieren Stopplösung 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl Photometrische Auswertung bei 405 nm (Ref. 490 nm oder nm) 8 500VPDE/220703

11 6. TESTBEURTEILUNG (VALIDITÄT) * Die photometrische Auswertung erfolgt bei einer Wellenlänge von 405 nm (Referenzwellenlänge 490 oder nm). * Die OD des Blanks wird von allen ODWerten subtrahiert. * Der Sollwertbereich der Kontrolle ist dem jeweiligen chargenspezifischen Datenblatt zu entnehmen. * Validitätskriterien Der ODMittelwert des Blanks muß 0,25 betragen. Die Konzentration der Kontrolle muß innerhalb des chargenspezifischen Sollbereiches liegen (siehe chargenspezifisches Datenblatt). Sind die genannten Validitätskriterien nicht erfüllt, muß der Test wiederholt werden! * Standardkurve und Quantifizierung der Meßergebnisse Die ODWerte der Standards werden gegen die Konzentration aufgetragen. Für die Standardkurve wird empfohlen, eine lineare Regressionsanpassung durchzuführen. Für die ODWerte der Proben können die Konzentrationen aus der Standardkurve abgelesen werden. Die Konzentrationen sind mit dem Verdünnungsfaktor 2 zu multiplizieren. Der Meßbereich erstreckt sich von 1, miu/ml. Proben mit Konzentrationen unterhalb des Meßbereiches sind als < 1,25 miu/ml zu bewerten. Proben oberhalb des Meßbereiches sind als > 160 miu/ml zu bewerten. Diese dürfen nicht extrapoliert werden, sondern sollten in höherer Verdünnung wiederholt getestet werden. Die Meßergebnisse sind dann mit dem jeweiligen Verdünnungsfaktor zu multiplizieren. 500 VPDE/

12 Beispiel einer Standardkurve: 3,0 2,5 2,0 60 Minuten 30 Minuten OD 1,5 1,0 0,5 0, miu/ml 7. LEISTUNGSMERKMALE Die nachfolgenden Leistungsmerkmale wurden von uns im Rahmen der Evaluierung ermittelt. 7.A. NORMBEREICH * Im Rahmen der Erprobung wurden 100 Seren von Blutspendern gemessen. Der EPOMittelwert wurde mit 7,3 miu/ml bestimmt. 95% der Proben lagen im Bereich 4 24 miu/ml. * Jedes Labor sollte seinen eigenen Referenzbereich erstellen, da die EPOSpiegel durch äußere regionale Bedingungen beeinflusst werden können VPDE/220703

13 Graphik Blutspender: Anzahl miu/ml ALLGEMEINE HANDHABUNGSHINWEISE * Reagenzienflaschen und deren Verschlüsse nicht vertauschen, um Kreuzkontamination zu vermeiden. * Sofort nach Gebrauch die Reagenzflaschen wieder fest verschliessen, um Verdunstung und mikrobielle Kontamination zu vermeiden. * Nach Gebrauch sind die Reagenzien sofort wieder, entsprechend den vorgeschriebenen Lagerungsbedingungen, zu lagern, um die angegebene Haltbarkeit zu gewährleisten. * Um Verwechslungen mit Reagenzien anderer Testsysteme oder Chargen zu vermeiden, sollten alle Kitkomponenten einer Testpackung nach dem Gebrauch zusammen in der Originalpackung gelagert werden (siehe auch 3.). 500 VPDE/

14 SICHERHEITSHINWEISE * Die Reagenzien humanen Ursprungs wurden auf HBsAg, AntiHIV 1/2 und AntiHCV untersucht und für nicht reaktiv befunden. Dennoch sollten diese Reagenzien wie auch jene, die Bestandteile tierischer Herkunft enthalten (siehe Packungsinhalt), als potentiell infektiös behandelt werden, um das Risiko einer Ansteckung zu vermeiden. * 3N NaOH, die als Stopplösung benötigt wird, ist ätzend und kann schwere Verätzungen verursachen. Bei der Arbeit geeignete Schutzkleidung, Schutzhandschuhe und Schutzbrille/Gesichtsschutz tragen. Bei Haut und Augenkontakt muß sofort gründlich mit Wasser gespült werden. Bei Berührung mit den Augen ist ein Arzt zu konsultieren. Beschmutzte bzw. getränkte Kleidung sofort ausziehen. * R 36: Reizt die Augen. * S 26: Bei Berührung mit den Augen sofort gründlich mit Wasser abspülen und Arzt konsultieren. * S 60: Dieses Produkt und sein Behälter sind als gefährlicher Abfall zu entsorgen. ENTSORGUNGSHINWEISE Die in diesem Produkt enthaltenen Chemikalien und Zubereitungen sowie die bei der Anwendung dieses Produktes anfallenden Reste sind in der Regel Abfälle, die einer ordnungsgemäßen Entsorgung zugeführt werden müssen. Die Entsorgung solcher Abfälle unterliegt den nationalen abfallrechtlichen Gesetzen und Verordnungen. Die zuständige Behörde oder Abfallbeseitigungsunternehmen informieren über die Entsorgung von Sonderabfällen. Ausgabedatum: VPDE/220703

15 EPOELISA medac Monoclonal enzyme immunoassay for the quantitative detection of Erythropoietin in serum Catalogue No.: 500 FOR RESEARCH USE ONLY INTRODUCTION Red blood cells are continuously produced in the bone marrow. The proliferation and differentiation of the erythroid progenitor cells are controlled by the hormone erythropoietin (EPO) (4, 6). EPO is mainly produced in the kidney and, to a much lower extent, in the liver (1). EPO is a glycoprotein which is relatively insensitive to heat and ph. Its molecular weight is 30 kd. EPO consists of 165 amino acids and 4 carbohydrate side chains. The synthesis of EPO is managed by oxygen sensors which are also located in the kidney. The most important stimulus for an increased synthesis of the hormone is induced by hypoxia of the tissue (2). An increased EPO production initiates an increased erythropoesis. The production of EPO is reduced to a normal level after the hypoxia is overcome. The classic and for a long time the only method for EPO detection has been the in vivo bioassay with the use of the posthypoxic polycythaemic mice. This is an international reference method for the calibration of all measured results in International Units (miu/ml). The in vivo bioassay is relatively specific for EPO. However, its precision is low. Furthermore, the assay is insensitive (detection limit 25 miu/ml) and labor intensive (5). The EPOELISA medac is based on two monoclonal antibodies which are used for the quantitative detection of EPO levels in serum (see test principle). The EPOELISA medac is calibrated against the 3 rd International Standard for EPO, rdna derived (41 st Meeting of the WHO ECBS, Oct. 1990). If patients sera contain human antimouseantibodies (HAMA), these will not cause false positive results. 500 VPDE/

16 TEST PRINCIPLE The plate is coated with antiepo antibodies (mouse, monoclonal). EPO EPO from the sample binds to the antibody. EPO APlabelled antiepo antibody (mouse, monoclonal) binds to EPO. A sandwich complex is formed (P = alkaline phosphatase). EPO Incubation with pnppsubstrate (*). The reaction is stopped by the addition of sodium hydroxide. The absorption is read photometrically VPDE/220703

17 KIT CONTENTS Cat. no.: Microplate: 12 x 8 well strips (with frame and desiccant, vacuum sealed in aluminium bag), breakable, Uform, coated with antiepo antibody, mouse monoclonal and BSA, ready to use. 2. Calibrators: 6 vials each with 1.0 ml, recombinant EPO, ready to use, contain BSA, phenol, ProClin TM 300 and gentamycin sulfate. 2a. Calibrator 1: 160 miu/ml 2b. Calibrator 2: 80 miu/ml 2c. Calibrator 3: 40 miu/ml 2d. Calibrator 4: 10 miu/ml 2e. Calibrator 5: 2.5 miu/ml 2f. Calibrator 6: 1.25 miu/ml 3. Control: 2 vials with 0.5 ml, human serum, lyophilized. 4. Conjugate: 1 vial with 0.25 ml antiepo antibody, mouse monoclonal, APconjugated (41x), contains FCS and sodium azide (< 0.1%). 5. Wash Buffer: 1 vial with 100 ml (10x), contains sodium azide (< 0.1%). 6. Sample Diluent: 1 vial with 100 ml, ready to use, contains BSA and sodium azide (< 0.1%). 7. Conjugate Diluent: 1 vial with 13 ml, ready to use, contains mouse IgG and sodium azide (< 0.1%). 8. Substrate: 1 vial with 10 ml, ready to use, contains p nitrophenyl phosphate and diethanolamine, Xi, irritant, R 36, S VPDE/

18 1. STORAGE AND STABILITY Material/Reagent State Storage Stability Test kit unopened C until expiry date Microplate opened C in bag 4 weeks with desiccant Standards opened C 4 weeks Control reconstituted C 2 weeks Conjugate diluted RT 3 hours Wash Buffer diluted C 4 weeks Sample Diluent opened C until expiry date Conjugate Diluent opened C until expiry date Substrate opened C 4 weeks Do not use reagents after expiry date. 2. REAGENTS AND MATERIALS REQUIRED BUT NOT PROVIDED 2.1. Water for injection (H 2 O redist.). Use of deionised water can disturb the test procedure ml 0.9% NaCl solution ml 3N NaOH solution Adjustable micropipettes Clean glass or plastic containers for dilution of Wash Buffer, Conjugate and specimen Suitable device for microplate washing (e.g. multistepper or ELISA washer) Incubator for 37 C Microplate reader with filters for 405 and 490 or nm VPDE/220703

19 3. PREPARATION OF THE REAGENTS Before starting the test procedure all kit components must be equilibrated to room temperature. Calculate the number of wells required Microplate The aluminium bag has to be tightly resealed together with the desiccant after each removal of wells. Storage and stability of the wells are indicated in table Wash Buffer Mix one volume of Wash Buffer (10x) with 9 volumes of 0.9% NaCl solution (e.g. 50 ml Wash Buffer (10x) with 450 ml 0.9% NaCl solution). 20 ml of diluted Wash Buffer are needed for eight wells. Crystals in the Wash Buffer (10x) have to be dissolved by warming (max. 37 C) and/or stirring at RT Control Reconstitution with 0.5 ml water for injection Conjugate Mix thoroughly before dilution. Mix 1 volume of Conjugate (41x) with 40 volumes of Conjugate Diluent (e.g. 75 µl Conjugate (41x) with 3 ml Conjugate Diluent). 0.4 ml of the diluted Conjugate are needed for eight wells Stop Solution Approximately 5 ml of a 3N NaOH solution are needed for the whole microplate. It is not included in the kit. Do not mix reagents from kits with different lots or manufacturers. Valid and reproducible results are only obtained if the test procedure is pecisely followed and test kitspecific reagents are used. 500 VPDE/

20 4. SPECIMEN 4.1. The test is suitable for serum Pretreatment of sera, e.g. inactivation, is not necessary. However, they should neither be contaminated with microorganisms nor contain any red blood cells Serum samples and the control have to be diluted 1:2 with Sample Diluent in the microplate. 25 µl of Sample Diluent are pipetted to each well. 25 µl of serum sample or control are added. Samples outside the measuring range can be diluted further Repeated freezing and thawing may cause a decrease of the EPO concentration in the serum samples and should therefore be avoided. Sera should be stored in aliquots and frozen at 18 C or less. 5.A. TEST PROCEDURE 5.1. Cut the aluminium bag above the zip fastener and take out the required number of microplate wells (see 3.1.). 18 Microplate wells are ready to use and do not have to be prewashed Add 50 µl Sample Diluent to wells A1 and A2 each for the determination of the blank Add 50 µl of standards to each well. Duplicates are recommended For the detection of serum samples and control 25 µl of Sample Diluent are pipetted to each well. 25 µl of serum sample are added. Duplicates are recommended Incubate the microplate wells for 60 min (± 2 min) at 37 C (± 1 C) in a humid chamber or sealed with incubation cover foil After incubation wash the microplate wells three times with 300 µl wash buffer per well. Pay attention that all wells are filled. After each filling the plate is incubated for 1 min (soak time). After washing tap microplate wells on filter paper. Do not allow the wells to dry out! Proceed immediately! 5.7. Add 50 µl conjugate to each well. 500VPDE/220703

21 5.8. Incubate again for 60 min (± 2 min) at 37 C (± 1 C) in a humid chamber or sealed with incubation cover foil After incubation wash the microplate wells four times with 300 µl wash buffer per well (see 5.6., note the soak time) Add 50 µl Substrate to each well and incubate for 30 min (± 2 min) at 37 C (± 1 C) in a humid chamber or sealed with incubation cover foil in the dark Stop the reaction by adding 50 µl of Stop Solution to each well. The alkaline phosphatase produces the yellow reaction product pnitrophenol. Its absorption can be measured photometrically at 405 nm (reference filter 490 nm or nm). One can also determine EPO concentrations at different time points without adding stop solution. After a substrate incubation of 30 minutes, a standard curve between 2.5 and 160 miu/ml is recorded. The substrate incubation time can be prolonged up to 60 minutes to get a fine differentiation of very low level values. After an incubation time of 60 minutes, a standard curve between 1.25 and 80 miu/ml is recorded (see page 22). Clean Microplate wells from underneath before the photometric reading and take care that there are no air bubbles in the wells! Recommended Pipetting Scheme: A Blank Blank 1 1 B Cal. 160 miu/ml Cal. 160 miu/ml 2 2 C Cal. 80 miu/ml Cal. 80 miu/ml 3 3 D Cal. 40 miu/ml Cal. 40 miu/ml 4 4 E Cal. 10 miu/ml Cal. 10 miu/ml 5 5 F Cal. 2.5 miu/ml Cal. 2.5 miu/ml 6 6 G Cal miu/ml Cal miu/ml 7 7 H Contr. Contr VPDE/

22 5.B. TABLE FOR THE TEST PROCEDURE Sample Diluent Calibrators Control Sample Blank (A1/A2) 50 µl Standards Control Sample 50 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl Incubate for 60 min at 37 C, wash 3 x with 300 µl Wash Buffer, incubate for 1 min after each filling Conjugate 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl Incubate for 60 min at 37 C, wash 4 x with 300 µl Wash Buffer, incubate for 1 min after each filling Substrate 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl Incubate for 30 min at 37 C in the dark Stop Solution 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl Photometric reading at 405 nm (Ref. 490 nm or nm) 6. CALCULATION OF RESULTS (VALIDITY) * Read OD values at 405 nm (reference wave length 490 or nm). * Subtract the OD value of the blank from all other OD values. * The nominal concentration range of the control is printed in the lotspecific data sheet. * Validity criteria The mean OD value of the Blank has to be The concentration of the Control has to be within the lotspecific nominal concentration range (see lotspecific data sheet). The run has to be repeated if the results do not meet the specification! VPDE/220703

23 * Calibration curve and quantification of the results The OD values of the Calibrators are plotted against the concentrations. For the calibration curve we recommend a linear regression approximation. The corresponding EPO concentrations of the mean OD values of the samples can be read from the calibration curve. The concentrations have to be multiplied with the dilution factor 2. The measuring range spans from miu/ml. Samples with concentrations below have to be interpreted as < 1.25 miu/ml. Samples above the measuring range have to be interpreted as > 160 miu/ml. These values must not be extrapolated. The samples have to be retested in higher dilutions. The measuring results have to be multiplied with the corresponding dilution factor. Example of a standard curve: minutes 30 minutes OD miu/ml 500 VPDE/

24 7. PERFORMANCE CHARACTERISTICS We determined the following performance characteristics during the evaluation. 7.A. NORMAL RANGE * 100 samples from blood donors were measured during the evaluation. The mean EPO concentration was detected with 7.3 miu/ml. 95% of the samples were detected in the concentration range 4 24 miu/ml. * Each lab should determine its own reference range because EPO levels may vary according to outer regional conditions. Graph blood donors: Number miu/ml GENERAL HANDLING ADVICES To avoid cross contamination do not exchange the vials and their screw caps. The reagents have to be sealed immediately after use to avoid evaporation and microbial contamination. After use, the reagents have to be stored as indicated to guarantee the shelf life VPDE/220703

25 After use, all components of the testkit should be stored in the original package, in order to avoid mixing up the reagents of other test systems or lots (see also 3.). HEALTH AND SAFETY INFORMATION The local occupational safety and health regulations have to be regarded. Reagents of human origin have been tested and found to be negative for HBsAg, for antibodies to HIV1/2 and to HCV. Nevertheless, it is strongly recommended that these materials as well as those of animal origin (see kit contents), should be handled as potentially infectious and used with all necessary precautions. 3N NaOH which is required for the stop solution is corrosive and may cause severe burns. Wear suitable protective clothing, gloves and eye/face protection. In case of contact with skin or eyes, wash immediately with plenty of water. In case of contact with eyes, seek medical advice. Take off immediately all contaminated clothing. R 36: Irritating to eyes. S 26: In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice. S 60: This material and its container must be disposed of as hazardous waste. DISPOSAL CONSIDERATIONS Residues of chemicals and preparations are generally considered as hazardous waste. The disposal of this kind of waste is regulated through national and regional laws and regulations. Contact your local authorities or waste management companies which will give advice on how to dispose hazardous waste. Date of issue: VPDE/

26 LITERATUR/REFERENCES Bauer, C. and A. Kurtz: Erythropoietin Production in the Kidney. NIPS 2, (1987). Golde, D.W. and J.C. Gasson: Blutbildende Hormone. Spektrum der Wissenschaften 9, (1988). Jacobs, K. et al.: Isolation and Characterization of Genomic and cdna Clones of Human Erythropoietin. Nature 313, (1985). Jelkmann, W.: Renal Erythropoietin: Properties and Production. Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 104, (1986). Jelkmann, W. and M. Wolff: Bestimmung der ErythropoietinAktivität im Serum. Dtsch. med. Wschr. 116, (1991). Kreuzfelder, E., H.U. Feldmann und R. Dermietzel: Erythorpoietin: Aktivator der ErythrozytenProduktion. Physis 11, (1988). Pagel, H. und W. Jelkmann: Erythropoietin. Dtsch. med. Wschr. 114, (1989). Wolff, M. and W. Jelkmann: Clinical Applicability of the Determination of Erythropoietin. In: Pagel/Weiss/Jelkmann (Eds): Pathophysiology and Pharmacology of Erythropoietin, , SpringerVerlag Berlin Heidelberg (1992) VPDE/220703

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