SERION ELISA antigen Candida

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1 YOUR GLOBAL PARTNER IN DIAGNOSTICS Hersteller Manufacturer Fabricant Fabbricante Institut Virion\Serion GmbH \ Friedrich-Bergius-Ring D Würzburg, Germany D , Telefon/: +49 (0) 9 31 / Fax/: +49 (0) 9 31 / / : dialog@virion-serionde Internet/: wwwvirion-serionde SERION ELISA antigen Candida SERION ELISA antigen Candida Gebrauchsanweisung - Deutsch Instructions - English Mode d emploi - Français Istruzioni per l uso - Italiano (Version/Versione/ 112/09-1) KAL200-1

2 SERION ELISA antigen Candida DE INHALTSVERZEICHNIS 1 ANWENDUNGSBEREICH 2 DIAGNOSTISCHE BEDEUTUNG 3 SERION ELISA antigen - TESTPRINZIP 4 INHALT UND ZUSAMMENSETZUNG 5 ZUSÄTZLICH BENÖTIGTE MATERIALIEN FR EN 6 LAGERUNG UND HALTBARKEIT 7 DURCHFÜHRUNG DES SERION ELISA antigen 71 Allgemeine Hinweise 72 Probenvorbereitung und Lagerung 73 Reagenzienvorbereitung 74 Übersicht - Testablauf 75 Manuelle Testdurchführung 76 Automatische Testdurchführung 77 Positivkontrolle / Richtigkeitskontrolle RU IT 8 TESTAUSWERTUNG 81 Ein-Punkt-Quantifizierung nach der 4PL-Methode 82 Testgültigkeitskriterien 83 Auswertung SERION ELISA antigen Candida 84 Quantifizierungsgrenzen 85 Grenzwertbereich 86 Interpretation der Ergebnisse 87 Referenzbereich gesunder Probanden 9 LEISTUNGSMERKMALE 91 Sensitivität und Spezifität 92 Präzision 10 SICHERHEITSMASSNAHMEN 101 Warnhinweise und Vorsichtsmaßnahmen 102 Entsorgung 11 LITERATUR vorliegende Version: V 112/09-1 Vorversion: --

3 Pos: 1 /Arbeitsanl eitung en ELISA antigen/gültig für alle Dokumente/ELISA antigen/allgemei ne Texte ELISA antigen/einl eitung " Enzymimmunoassay" C andi da Pos: 3 /Arbeitsanl eitung en ELISA antigen/gültig für alle Dokumente/ELISA antigen/allgemei ne Texte ELISA antigen/kapitelüberschrift " Anwendungsber 1 SERION ELISA antigen Candida Enzymimmunoassay zur Bestimmung von Candida Antigen für die in vitro-diagnostik Pos: 2 /Arbeitsanl eitung en ELISA antigen/gültig für nur ei n D okument/bestellnummer n/c andida antigen: Bestell SERION ELISA antigen Candida Best-Nr: ESR200 1 ANWENDUNGSBEREICH Pos: 4 /Arbeitsanl eitung en ELISA antigen/gültig für nur ei n D okument/anwendungsbereich/c andi da antigen: Der SERION ELISA antigen Candida ist ein qualitativer und quantitativer Immunoassay für den Nachweis von Candida Antigen in humanem Serum und Plasma Der Test dient zur Unterstützung bei der Erfassung von systemischen Candidosen Pos: 5 /Arbeitsanl eitung en ELISA antigen/gültig für alle Dokumente/ELISA antigen/allgemei ne Texte ELISA antigen/kapitelüberschrift "Diag nostische 1 2 DIAGNOSTISCHE BEDEUTUNG Pos: 6 /Arbeitsanl eitung en ELISA antigen/gültig für nur ei n D okument/di agnostische Bedeutung/Candida antigen: Diag nostische albicans ist ein ubiquitär vorkommender Hefepilz, der wie alle Candida ssp zur Familie der Sprosspilze zählt Neben der Hefeform, welche in erster Linie bei oberflächigen Infektionen auftritt, sind so genannte Pseudomyzelien eine weitere morphologische Erscheinungsform Die Ausbildung von Keimschläuchen sowie die Entwicklung der Pseudomyzelien treten überwiegend bei systemischen Mykosen auf Candida Sprosspilze produzieren und sezernieren eine Vielzahl von Enzymen, die den fakultativ pathogenen Mikroorganismen die Penetration von Blutgefäßen und Schleimhautbarrieren ermöglichen Meist werden Candida ssp über Schmierkontaminationen von Mensch zu Mensch übertragen Die Haupteintrittspforte ist der Mund-Rachen-Raum Bei Störungen der fungistatischen Eigenschaften der Hautoberfläche, die durch einen leicht sauren ph-wert und eine antagonistisch wirkende Standortflora vermittelt werden, können oberflächige, superfizielle Candidosen entstehen Systemische Mykosen gehen im Anschluss an eine Besiedlung der Schleimhäute vor allem vom Bereich des Gastrointestinaltraktes aus (Abb 1) Kolonisierung des Mund-Rachen-Raums Passage des Magenlumens Übertritt in das Darmlumen Eintritt in die Blutbahn Übertritt in das Lymphsystem Persorption der Candida-Zellen Invasion einer Vielzahl von Organen Abbildung 1: Verlauf von Candida-Infektionen deutsch 2

4 Die Anheftung der Sprosspilze an Epithelien unterschiedlicher Schleimhäute erfolgt durch Adhärenzproteine und andere Strukturen der äußeren Zellhülle In der Übersicht sind die (hypothetischen) Schritte dargestellt, die im Falle schwerwiegender Grunderkrankungen zu disseminierten Infektionen führen können Eine exakte Abtrennung der Stadien ist dabei kaum möglich DE Generell können Candidosen in zwei große Gruppen eingeteilt werden, deren Hauptmerkmale in der nachfolgenden Tabelle zusammengefasst sind Candida-Infektionen oberflächig (superfiziell) Tiefenmykose (invasiv) Lokalisierung Haut, Schleimhäute Hauptorgane Immunkompetenz + +, -/- des Wirtes Risikofaktoren Schwangerschaft Diabetes AIDS Chemotherapie iatrogene Immunsuppression zentrale Venenkatheter Störungen der Hauteigenschaften Radiotherapie mangelnde Mundhygiene hochgradige Verbrennungen chirurgische Eingriffe klinischer Verlauf meist harmlos, keine Lebensgefahr oft lebensbedrohlich Therapie gut therapierbar stadiumabhängige Therapierbarkeit Tabelle 1: Charakteristika von Candida-Infektionen Die serologische Diagnostik bei Candida-Infektionen gestaltet sich als schwierig Einerseits können auch transiente Hefebesiedelungen eine Antikörperantwort induzieren, andererseits führen systemische Candida Mykosen bei immunsupprimierten Patienten häufig nur zu geringen Titerbewegungen Erschwerend kommt hinzu, dass es sich bei der Gruppe der Patienten mit hohem Mykoserisiko häufig um immunologische Problempatienten handelt und somit serologische Befunde einer besonderen Interpretation bedürfen Systemische Candida-Infektionen verursachen zudem kein typisches Krankheitsbild Beim aktuellen Stand der Candida Serologie kann nicht davon ausgegangen werden, dass die Ergebnisse verschiedener Testsysteme zur Antikörperbestimmung vergleichbar oder sogar austauschbar sind Die Spezifität der in einer Untersuchungsprobe nachgewiesenen Antikörper hängt entscheidend vom Testsystem (ELISA oder HAT) bzw von der verwendeten Antigenpräparation ab Beim HAT werden IgM Antikörper aufgrund ihres Agglutinationsverhaltens stärker erfasst als IgG Antikörper Dies macht die serologische Befundinterpretation noch komplexer, eröffnet aber auch die Möglichkeit einer differenzierteren Befundinterpretation So ermöglicht die Kombination von HAT und ELISA, selbst bei stagnierenden HAT Titern potentielle Veränderungen der Immunglobulinklassen-spezifischen Antikörperaktivität zu erkennen Derzeit bietet keine Nachweismethode allein die Möglichkeit einer umfassenden serologischen Diagnostik Zur optimalen Überwachung von Risikopatienten und zur Therapiesteuerung sollten deshalb mehrere Nachweismethoden kombiniert eingesetzt werden Der Antigennachweis mit SERION ELISA antigen Candida stellt dabei eine wichtige unterstützende Maßnahme dar deutsch 3

5 Pos: 7 /Arbeitsanl eitung en ELISA antigen/gültig für alle Dokumente/ELISA antigen/t estprinzi p/t estprinzi p ELISA 1 Pos: 8 /Arbeitsanl eitung en ELISA antigen/gültig für nur ei n D okument/inhalt und Z usammensetzung/c andi da antigen: Inhalt und 1 3 SERION ELISA antigen - TESTPRINZIP Der ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) ist ein immunologisches Verfahren, das sich insbesondere in der Infektionsserologie zur Erfassung von Antikörpern und Antigenen bewährt hat Die Nachweisreaktion im vorliegenden Sandwich ELISA basiert auf der spezifischen Interaktion von Antikörpern und Antigenen Zu diesem Zweck wurden die Teststreifen der Mikrotiterplatten des SERION ELISA antigen mit spezifischen, gegen den Erreger gerichteten Antikörpern zur Bindung der in der Patientenprobe vorhandenen Antigene beschichtet Weitere, mit Peroxidase markierte Sekundärantikörper detektieren die so gebildeten Immunkomplexe Das Enzym katalysiert eine Reaktion, in deren Verlauf das farblose Substrat Wasserstoffperoxid und das Chromogen Tetramethylbenzidin in einen blauen Farbstoff umgewandelt werden Durch Zugabe der Stopplösung erfolgt ein Farbumschlag zu gelb Die Signalstärke des Reaktionsprodukts ist proportional zur Antigenkonzentration in der Probe und wird photometrisch erfasst deutsch 4

6 Pos: 9 /Arbeitsanl eitung en ELISA antigen/gültig für alle Dokumente/ELISA antigen/z usätzlich benötigte M ateriali en/zusätzlich benötigte M ateri 1 4 INHALT UND ZUSAMMENSETZUNG DE Testkomponenten Stück / Volumen Brechbare Mikrotiterstreifen mit je acht antikörperbeschichteten Einzelkavitäten (insg 96) MTP, 1 Testrahmen 12 Stück Standardserum STD, Candida albicans Antigen in Humanserum mit Zusatz von fötalem Kälberserum (FKS); negativ getestet für anti-hiv-ak, HBs-Ag (Hepatitis B-Virus-surface Antigen) und anti-hcv-ak; Konservierungsmittel: < 0,1 % Natriumazid Negatives Kontrollserum NEG, Humanserum mit Zusatz von fötalem Kälberserum (FKS); negativ getestet für anti-hiv-ak, HBs-Ag (Hepatitis B-Virus-surface Antigen) und anti-hcv-ak; Konservierungsmittel: < 0,1 % Natriumazid Anti-Candida albicans Konjugat (gebrauchsfertig) PODCR, Gegen Candida albicans gerichteter Antikörper konjugiert mit Meerrettich-Peroxidase, stabilisiert in proteinhaltiger Lösung mit Detergenz; Konservierungsmittel: 0,1 % ProClin 300 Waschlösungskonzentrat (ausreichend für 1500 ml) WASH, TRIS-gepufferte Natriumchlorid Lösung mit Tween 20; 30-fach konzentriert; Konservierungsmittel: < 0,1 % ProClin 300 Verdünnungspuffer SAMB, Saure Lösung ohne Konservierungsmittel Stopplösung STOP, 0,5 N Schwefelsäure TMB-Substratlösung (gebrauchsfertig) TMB, TMB-Wasserstoffperoxid-Substratlösung; Konservierungmittel: < 0,01% Kathon CG Qualitätskontrollzertifikat mit Standardkurve und Wertetabelle INFO, (Quantifizierung des Antigens in U/ml) 3 x 3 ml 2 x 3 ml 13 ml 2 x 25 ml 15 ml 13 ml 13 ml 2 Stück deutsch 5

7 Pos: 10 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/lager ung und H altbarkeit/lagerung und H altbar 1 5 ZUSÄTZLICH BENÖTIGTE MATERIALIEN - Übliche Laborausrüstung - Spektralphotometer für Mikrotiterplatten mit Filter, Wellenlänge 450 nm, empfohlene Referenzwellenlänge im Bereich von 620 nm nm (z B 650 nm) - Inkubator 37 C - Heizblock 110 C - feuchte Kammer - Aqua dest - Click-Clips (Best-Nr VT120) deutsch 6

8 6 LAGERUNG UND HALTBARKEIT DE Reagenz Lagerung Haltbarkeit Mikrotiterstreifen (mit Antikörper beschichtet) Kontrollseren / Standardseren ungeöffnet nach Anbruch bei 2 8 C in Gegenwart von Trockenmittel und wieder verschlossen gelagert Die unbenutzten Kavitäten sollen trocken und luftdicht im verschlossenen Aluminiumbeutel gelagert werden nach Anbruch bei 2 8 C Konjugat Gebrauchsfertige Lösung bei 2 8 C Kontaminationen sind u a durch den Gebrauch steriler Pipettenspitzen unbedingt zu vermeiden bis Verfallsdatum; Mindesthaltbarkeit: 4 Wochen Haltbarkeit bei sachgerechter Lagerung: bis zum Verfallsdatum bis Verfallsdatum; 24 Monate ab Herstellungsdatum bis Verfallsdatum; 18 Monate ab Herstellungsdatum Verdünnungspuffer ungeöffnet nach Anbruch bei 2 8 C Eingetrübte Lösungen bitte verwerfen bis Verfallsdatum; 24 Monate ab Herstellungsdatum 6 Monate Waschlösung Konzentrat nach Anbruch bei 2 8 C Gebrauchsverdünnung bei 2 8 C Gebrauchsverdünnung bei Raumtemperatur Behälter für Gebrauchsverdünnung regelmäßig reinigen! Eingetrübte Lösungen bitte verwerfen bis Verfallsdatum; 24 Monate ab Herstellungsdatum 2 Wochen; 1 Woche Substrat Gebrauchsfertige Lösung bei 2 8 C, lichtgeschützt gelagert Kontaminationen sind u a durch den Gebrauch steriler Pipettenspitzen unbedingt zu vermeiden Bei stärkerer Blaufärbung (Extinktion bei 650 nm gegen Aqua dest > 0,2 OD) bitte verwerfen bis Verfallsdatum; 24 Monate ab Herstellungsdatum Stopplösung nach Anbruch bei Raumtemperatur bis Verfallsdatum Pos: 11 /Arbeitsanleitungen ELISA antigen/gültig für alle Dokumente/ELISA antigen/testdurchführung/überschrift: 1 deutsch 7

9 Pos: 12 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testdurchführ ung/allgemei ne Hinweise ELISA antig 2 7 DURCHFÜHRUNG DES SERION ELISA antigen 71 Allgemeine Hinweise Für die sachgemäße Anwendung des SERION ELISA antigen sind ausschließlich die SERION ELISA antigen Komponenten zu verwenden Letztere können nicht durch Reagenzien anderer Hersteller ersetzt werden Die Standard- und Kontrollseren sowie das Konjugat des SERION ELISA antigen sind chargenspezifisch für jeden Testkit optimal eingestellt und können nicht in anderen Chargen eingesetzt werden Verdünnungspuffer, Waschlösung, Substratlösung und Stopplösung können mit allen SERION ELISA antigen chargen- und kitunabhängig angewendet werden Unter Voraussetzung einer sachgerechten Lagerung sind alle Komponenten des SERION ELISA antigen ungeöffnet bis zum angegebenen Verfallsdatum (siehe Etikett) verwendbar Die Reagenzien sollen nicht über das Verfallsdatum hinaus benutzt werden Die unsachgemäße Verdünnung der Reagenzien kann zum Verlust an Nachweisempfindlichkeit führen Die Testreagenzien sollen während der Lagerung und Inkubation vor hellem Licht geschützt werden Nach Gebrauch sind die Komponenten gut zu verschließen, um deren Austrocknung und Kontamination zu vermeiden Der Verschlussbeutel für die Kavitäten der Mikrotiterplatte soll nur an der Schweißnaht aufgeschnitten werden, um ein Wiederverschließen zu gewährleisten Bei Beschädigung sowie nach unsachgemäßem Verschließen des Verschlussbeutels zur Aufbewahrung der nicht benutzten Kavitäten sollen die Mikrotiterstreifen nicht mehr verwendet werden Um Kontamination zu vermeiden, sollten immer aseptische Techniken zur Entnahme von Reagenzienaliquots angewendet werden Zur Vermeidung verfälschter Ergebnisse darf die Pipettenspitze bei der Konjugatpipettierung keinesfalls den oberen Rand der Kavitäten berühren und benetzen Beim Verschließen der Fläschchen ist darauf zu achten, wieder den entsprechenden, zur Flasche gehörenden Deckel einzusetzen Insbesondere die TMB-Substratlösung ist empfindlich gegenüber oxidierenden Substanzen und Schwermetallionen Sie ist ständig lichtgeschützt aufzubewahren Die TMB-Substratlösung ist unter möglichst geringer Lichteinwirkung kurz vor Gebrauch zu öffnen Diese Lösung ist schwach blau-grün gefärbt Der Hautkontakt mit Substrat und Stopplösung ist zu vermeiden! Die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse ist u a von der sorgfältigen Mischung der angesetzten Reagenzien abhängig Aus diesem Grund sollen die Behältnisse von Kontrollseren und Konjugaten vor Entnahme gut geschüttelt werden Auch die Probenverdünnungen sollen vor dem ersten Pipettierschritt mit einem Monomixer (z B Vortex) gut durchmischt werden Weiterhin ist auf eine sorgfältige Pipettierung und die Einhaltung der vorgegebenen Inkubationszeiten und -temperaturen zu achten Große Zeitdifferenzen zwischen der Pipettierung der ersten und der letzten Kavität bei der Zugabe von Proben- und deutsch 8

10 Pos: 13 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für nur ein Dokument/T estdurchführung/pr obenvor ber eitung und Lagerung/Candida antigen: Probenvorbereitung und Lager 2 Pos: 14 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für nur ein Dokument/T estdurchführung/pr obenver dünnung/candida antigen: 3 Kontrollseren, Konjugat und Substrat führen zu unterschiedlichen Inkubationszeiten, welche die Präzision und Reproduzierbarkeit der Messwerte beeinflussen können DE Nur die strikte Einhaltung der Arbeitsvorschrift gewährleistet korrekte Ergebnisse Der SERION ELISA antigen kann nur ausgewertet werden, wenn die chargenspezifischen Validitätswerte des im Kit enthaltenen Qualitätskontrollzertifikates erfüllt wurden Korrektes Waschen verhindert Testunspezifitäten Aus diesem Grund sollten die Gebrauchsanleitungen der verwendeten Waschgeräte befolgt werden Wichtig sind die gleichmäßige Befüllung der Kavitäten der Flachbodenplatten mit Waschlösung und deren vollständige Entfernung, um unkontrollierbare Verdünnungseffekte auszuschließen Schaumbildung ist in jedem Fall zu vermeiden! Die Beschriftung der Mikrotiterstreifen mit den Kürzeln des Erregers in Kombination mit dem Kürzel AG für SERION ELISA antigen sollte nicht zerkratzt werden, um ein Verwechseln zu vermeiden 72 Probenvorbereitung und Lagerung Lipämische, hämolytische sowie ikterische Proben (Serum oder Plasma) sollten nur unter Vorbehalt eingesetzt werden Bakteriell kontaminierte Proben sollten nicht verwendet werden Geeignete Untersuchungsmaterialien sind nach Standardlabortechniken gewonnene Seren oder Plasmen (EDTA, Citrat, Heparin) deutsch 9

11 Pos: 15 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testdurchführ ung/probenl agerung ELISA antig 3 Pos: 16 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testdurchführ ung/r eagenzienvorbereitung ELISA Probenvorbereitung Vor Testbeginn die Proben (Patientenproben, Standard und Negativkontrolle) (V 1 ) in Verdünnungspuffer (V 2 ) verdünnen: V 1 + V 2 = 3+1 je 300 µl Probe (V 1 ) zu je 100 µl Verdünnungspuffer (V 2 ) Nach jeder Verdünnung und vor dem Pipettierschritt sollten die Proben mit einem Monomixer (z B Vortex) gut durchmischt werden, um eine homogene Lösung herzustellen Im Anschluss werden die Proben 10 Min bei 110 C (+/- 5 C) erhitzt Es ist unbedingt darauf zu achten, dass sowohl die Zeit als auch die Temperatur eingehalten werden! Standardreaktionsgefäße sind für die Thermolyse nicht geeignet Wir empfehlen Safe- Lock Reaktionsgefäße bzw Reaktionsgefäße mit Drehverschluss Bei Verwendung von Heizblockthermostaten sollte die eingestellte Temperatur von 110 C (+/- 5 C) mit einem geeichten Thermometer überprüft werden Bei Diskrepanzen ist das Heizblockthermometer entsprechend zu justieren Die gerätespezifische Vorheizdauer ist zu berücksichtigen Während der Thermolyse bildet sich ein weißer, fester Niederschlag Die Probe wird anschließend mit einer auf 4 C vorgekühlten Tischzentrifuge für 10 Min bei g zentrifugiert und der klare Überstand für den weiteren Testablauf verwendet 722 Probenlagerung Die so behandelten Proben sollten nicht länger als 24 Stunden bei 2 8 C aufbewahrt werden Unbehandelte Patientenproben sollten nicht länger als 7 Tage bei 2 8 C aufbewahrt werden Eine längere Lagerung der Proben ist bei -20 C möglich Mehrmaliges Auftauen und Wiedereinfrieren soll vermieden werden deutsch 10

12 73 Reagenzienvorbereitung Alle Testreagenzien müssen vor dem Testansatz auf Raumtemperatur erwärmt werden DE 731 Mikrotiterstreifen Die Teststreifen bzw Kavitäten sind zusammen mit einem Trockenmittel verpackt Nicht benötigte Teststreifen bzw Kavitäten sollten wieder mit dem Trockenmittel im Aluminiumbeutel luftdicht eingeschlossen werden 732 Kontrollseren / Standardseren Kontroll- und Standardseren müssen mit Probenpuffer verdünnt und anschließend denaturiert werden Bei jedem Testlauf müssen unabhängig von der Anzahl der eingesetzten Teststreifen Kontrollseren in Einfach-, Standardseren in Doppelbestimmung mitgeführt werden 733 Konjugat (gebrauchsfertig) Kontaminationen des gebrauchsfertigen Konjugats sind u a durch den Gebrauch steriler Pipettenspitzen unbedingt zu vermeiden 734 Waschlösung Das Waschlösungskonzentrat (V 1 ) ist im Verhältnis 1:30 mit Aqua dest auf ein Endvolumen (V 2 ) zu verdünnen Beispiel: Waschlösungskonzentrat (V 1 ) Endvolumen (V 2 ) 25 ml 750 ml 1 ml 30 ml 735 TMB-Substratlösung (gebrauchsfertig) Kontaminationen der gebrauchsfertigen Substratlösung sind u a durch den Gebrauch steriler Pipettenspitzen unbedingt zu vermeiden Die TMB-Substratlösung ist schwach blau-grün gefärbt; stark gefärbte Lösungen (Extinktion bei 650 nm gegen Aqua dest > 0,2 OD) bitte verwerfen 736 Stopplösung (gebrauchsfertig) Pos: 17 /Arbeitsanleitungen ELISA antigen/gültig für alle Dokumente/ELISA antigen/testdurchführung/testablauf/überschrift 2 deutsch 11

13 Pos: 18 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testdurchführ ung/t establauf/testablauf Candida Pos: 19 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für nur ein Dokument/T estdurchführung/testdurchführ ung/c andi da antigen: Manuelle Testdurchführ Übersicht - Testablauf SERION ELISA antigen Candida quantitativ Vorbereitung der Proben, des Kontroll- und Standardserums Probenverdünnung (Patientenproben, Kontroll- und Standardserum) 300 µl Probe µl Verdünnungspuffer INKUBATION 10 Min / 110 C ZENTRIFUGATION 10 Min / g / 4 C Überstand abnehmen, Pellet verwerfen Pos: 26 /Arbeitsanleitungen/Gültig für alle Zugabe der Überstände (je 100 µl) INKUBATION 60 Min / 37 C feuchte Kammer WASCHEN (5 x 300 µl DIL WASH ) Zugabe der Konjugatlösung PODCR (100 µl) INKUBATION 60 Min / 37 C feuchte Kammer WASCHEN (5 x 300 µl DIL WASH ) Zugabe der Substratlösung TMB (100 µl) INKUBATION 30 Min / 37 C feuchte Kammer Zugabe der Stopplösung STOP (100 µl) EXTINKTIONSMESSUNG bei 450 nm (Ref 650 nm) deutsch 12

14 Pos: 20 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testdurchführ ung/automatische T Manuelle Testdurchführung DE 1 Vorbehandlung der Proben (Patientenproben, Standard- und Kontrollserum) wie beschrieben 2 Erforderliche Anzahl Kavitäten in den Testrahmen einsetzen und Protokollblatt anlegen 3 Je 100 µl der Überstände von Standard (Doppelansatz) sowie von Negativkontrolle und Patientenproben in die benötigten Kavitäten der Teststreifen pipettieren Eine Kavität für den Substratleerwert (Blank) freilassen, z B: Candida antigen quantitativ Kavität A1 Kavität B1 Kavität C1 Kavität D1 Substratleerwert (Blank) Negative Kontrolle Standardserum Standardserum Kavität E1 Patientenprobe 1 4 Probeninkubation für 60 Minuten (+/- 3 Min) bei 37 C (+/- 1 C) in der feuchten Kammer 5 Am Ende der Inkubationszeit die Kavitäten waschen (mit Waschgerät oder manuell): - Inkubationsflüssigkeit aus den Kavitäten absaugen oder ausschütten - in jede Kavität 300 µl Waschlösung füllen - Waschlösung absaugen oder ausschütten - Vorgang 4 x wiederholen (also insgesamt 5 x waschen) - die Platte auf Papiertüchern ausklopfen 6 Konjugatzugabe Je 100 µl des gebrauchsfertigen Konjugats in die entsprechenden Kavitäten pipettieren (ohne Substratleerwert) 7 Konjugatinkubation für 60 Minuten (+/- 3 Min) bei 37 C (+/- 1 C) in der feuchten Kammer 8 Am Ende der Inkubationszeit die Kavitäten waschen (wie oben) 9 Substratzugabe Je 100 µl gebrauchsfertige TMB-Substratlösung in alle Kavitäten (auch Substratleerwert) pipettieren 10 Substratinkubation für 30 Minuten (+/- 1 Min) bei 37 C (+/- 1 C), lichtgeschützt in der feuchten Kammer 11 Stoppen der Reaktion Je 100 µl Stopplösung in alle Kavitäten pipettieren Mikrotiterplatte zum Mischen leicht schütteln 12 Extinktionsmessung Innerhalb 60 Minuten bei 450 nm gegen den Substratleerwert messen; Referenzwellenlänge im Bereich zwischen 620 nm und 690 nm (z B 650 nm) deutsch 13

15 Pos: 21 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testdurchführ ung/positi vkontrolle / Richtig 2 Pos: 22 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testauswertung/kapitelüberschrift: T ESTAU SWERTUN G Automatische Testdurchführung Die SERION ELISA sind validiert für die Anwendung auf Immunomat TM und Gemini und geeignet für die Anwendung auf baugleichen Automaten Die automatische Prozessierung erfolgt analog zur manuellen Bearbeitung Bitte beachten Sie, dass unter speziellen Arbeitsbedingungen laborinterne Anpassungen der Inkubationszeiten notwendig sein können 77 Positivkontrolle / Richtigkeitskontrolle Zur periodischen Überprüfung der Untersuchungsmethode im Rahmen des laborinternen Qualitätsmanagements empfehlen wir die Anwendung unserer SERION ELISA control Die Positivkontrollen dienen als Richtigkeitskontrollen sowie zur Überprüfung der Präzision der angewandten Methode Der Gebrauch ist in einer separaten Arbeitsanleitung beschrieben deutsch 14

16 Pos: 24 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testauswertung/t estg ültig keitskriteri 2 8 TESTAUSWERTUNG SERION ELISA antigen Candida Pos: 23 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testauswertung/t estauswertung: Ein- Punkt- Quantifizier Ein-Punkt-Quantifizierung nach der 4PL-Methode DE Die größtmögliche Genauigkeit der Zuordnung von Messsignalen zu quantitativen Werten bieten nichtlineare Funktionen, die sigmoidale Kurven direkt, ohne jede weitere Transformation, der OD-Skala anpassen Die Konzentrationsbestimmung des Antigens im SERION ELISA antigen erfolgt nach dem 4-Parameter logistic-log-modell (4PL), dessen mathematische Funktion durch folgende Formel beschrieben wird: OD = A e D - A B(C - ln Konz) Die Parameter A, B, C und D geben den Kurvenverlauf exakt wieder und definieren 1 die untere Asymptote Parameter A 2 die Steigung der Kurve im Wendepunkt Parameter B 3 den Wendepunkt der Kurve Parameter C 4 die obere Asymptote Parameter D Die Institut Virion\Serion GmbH (Würzburg) ermittelt für jede Kitcharge die Standardkurven in mehrfachen Testläufen unter Einhaltung optimaler Bedingungen Auf diese Weise entfällt die kosten- und zeitintensive Konstruktion der Standardkurve durch den Anwender Zur Auswertung der Testläufe wird jedem SERION ELISA antigen ein chargenspezifisches Qualitätskontrollzertifikat mit Standardkurve und Wertetabelle beigelegt Die Software SERION evaluate sowie die Microsoft Excel-basierte Auswertehilfe SERION activity werden auf Anfrage gerne zur Verfügung gestellt Zum Ausgleich von Testschwankungen und um die Qualität des Testlaufes zu überprüfen, wird das so genannte Standardserum mitgeführt Diesem Standardserum werden in der Qualitätsendkontrolle ein Sollwert sowie ein Gültigkeitsbereich zugeordnet, innerhalb dessen Grenzen eine sichere und zuverlässige Bewertung der Testergebnisse garantiert wird deutsch 15

17 Pos: 26 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testauswertung/nichtautomatisi erte Auswertung ELISA Testgültigkeitskriterien - Der Substratleerwert sollte einen OD-Wert < 0,25 aufweisen - Die negative Kontrolle muss in der Testauswertung als negativ bewertet werden - Bei quantitativen SERION ELISA antigen muss der OD-Mittelwert des Standardserums nach Abzug des Substratleerwertes innerhalb des Gültigkeitsbereiches liegen, welcher auf dem chargenspezifischen Qualitätskontrollzertifikat angegeben ist - Die OD-Werte des Standardserums dürfen nicht mehr als 20 % differieren Sind diese Kriterien nicht erfüllt, ist der Testlauf ungültig und muss wiederholt werden antigen/testauswertung/auswertung: Pos: 2 ELISA antigen/gültig für 8\mod_ _6doc alle 83 Auswertung SERION ELISA antigen Candida 831 Nichtautomatisierte Auswertung Zur Auswertung der Testläufe wird jedem SERION ELISA antigen ein chargenspezifisches Qualitätskontrollzertifikat mit Standardkurve und Wertetabelle beigelegt Der Substratleerwert (Blank) muss vor den Auswertungen von allen Messergebnissen abgezogen werden Pos: 27 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testauswertung/t estauswertung Methode 1: Qualitative Auswertung Zur Festlegung des cut-off Bereiches in OD multipliziert man den Mittelwert der gemessenen OD des Standardserums mit dem angegebenen Zahlenwert auf dem Qualitätskontrollzertifikat (siehe Formeln für spezielle Auswertesysteme), z B: OD = 0,502 x MW(STD) bei oberer cut-off Grenze OD = 0,352 x MW(STD) bei unterer cut-off Grenze Wird beispielsweise ein Extinktionmittelwert des Standardserums von OD 0,970 gemessen, ergibt sich ein cut-off Bereich von OD 0,341 bis 0,487 Methode 2: Stufenlose Bestimmung der Antigenaktivitäten mittels Standardkurve: Pos: 39 /Ar bei tsanl eitungen/gültig für alle Dokumente/Testauswertung/T estauswertung: M ethode 2 (für alle T Testschwankungen, die von Tag zu Tag sowie von Labor zu Labor auftreten können, so genannte Interassay-Varianzen, werden durch Multiplikation des aktuellen Messwerts der Patientenproben mit dem Korrekturfaktor F ausgeglichen: F = OD-Sollwert (des Standardserums) OD-Tageswert (des Standardserums) deutsch 16

18 Pos: 28 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testauswertung/automatische 3 Pos: 29 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testauswertung/quantifizi 2 Dieses Verfahren ist notwendig, um das aktuelle Testniveau des Anwenders an die chargenspezifische Standardkurve anzugleichen bzw zu normalisieren Auf diese Weise werden Tageswertschwankungen korrigiert DE 1 Mittelwert aus den beiden Extinktionswerten des Standardserums bilden und prüfen, ob der ermittelte Wert im angegebenen Gültigkeitsbereich liegt 2 Berechnung des Faktors F: Der angegebene Sollwert des Standards wird durch den Mittelwert der Extinktion des Standardserums geteilt: F = Sollwert Extinktion Standardserum / Mittelwert Extinktion Standardserum 3 Alle Messwerte der Patientenproben werden mit F multipliziert 4 Über die korrigierten Messwerte können anhand der Standardkurve Antigenaktivitäten in IU/ml bzw U/ml abgelesen werden 832 Automatische Testauswertung mit der Software SERION evaluate Durch Eingabe der vier Parameter und des Sollwertes des Standardserums werden Antigenaktivitäten nach Prozessierung und Messung des SERION ELISA antigen durch das Auswerteprogramm SERION evaluate errechnet Falls ein Wert außerhalb des Gültigkeitsbereiches liegt, werden folgende Fehlermeldungen in englischer Sprache angezeigt: Standard values out of ranges in following groups: Group 1-24 bzw Standard value differ more than 20 % in following groups: Group 1-24 In diesen Fällen ist der Testlauf ungültig und muss wiederholt werden Die vier Kurvenparameter und der Sollwert müssen nur bei Chargenwechsel geändert werden (Parameter und Sollwert sind auf der Wertetabelle angegeben) Die korrekte Eingabe dieser chargenspezifischen Daten kann anhand der dem Standardserum zugeordneten Aktivität (in IU/ml bzw U/ml) überprüft werden Der erhaltene Mittelwert der Antigenaktivität muss mit der auf dem chargenspezifischen Qualitätskontrollzertifikat angegebenen Bewertung übereinstimmen Eine Messwertkorrektur erfolgt automatisch Im Ausdruck der Messergebnisse erscheint: Probenbezeichnung OD-Wert U/ml Bewertung deutsch 17

19 Pos: 30 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa 2 Pos: 31 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testauswertung/kapitelüberschrift: Inter pretati on der 2 Pos: 33 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testauswertung/kapitelüberschrift: R eferenzber eich gesunder Pr Quantifizierungsgrenzen Die Quantifizierungsgrenzen kennzeichnen den Bereich der zulässigen Wertelage Sie sind auf dem Kontrollzertifikat des SERION ELISA antigen angegeben Im Rahmen der Leistungsbewertungsstudie wurde die Verdünnungslinearität über diesen Bereich nachgewiesen Sollten Patientenproben Messwerte oberhalb dieses Bereichs erzielen, können die Proben in einer höheren Verdünnung analysiert werden Die erhaltenen Antigenkonzentrationen sind dann mit dem zusätzlichen Verdünnungsfaktor zu multiplizieren 85 Grenzwertbereich Der Grenzwertbereich des SERION ELISA antigen Candida ist auf dem Qualitätskontrollzertifikat angegeben und kennzeichnet den Bereich grenzwertiger Messergebnisse Die Bewertung einer Patientenprobe unterhalb des Grenzwertbereichs charakterisiert ein negatives Testergebnis; die Bewertung einer Patientenprobe oberhalb des Grenzwertbereichs wird als positives Testergebnis interpretiert Im Falle eines grenzwertigen Ergebnisses ist keine sichere Bewertung der Patientenprobe möglich In einem solchen Fall sollte der Test parallel mit einer, im Abstand von ein bis zwei Wochen entnommenen, neuen Serumprobe (Serumpaar) wiederholt werden 86 Interpretation der Ergebnisse Pos: 32 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für nur ein Dokument/T estauswertung/candi da antigen/candi da antig en: Interpr etation der Ergebni Ein positives Testergebnis im Patienten-Material weist auf eine Candida-Fungämie hin Die Interpretation der Ergebnisse kann nur in Zusammenhang mit dem klinischen Bild und anderen Nachweismethoden erfolgen Ein positives Ergebnis liegt vor, wenn mindestens 2,6 Units ermittelt werden Dieses Ergebnis in einer Probe bedeutet, dass darin die Menge an Mannan nachgewiesen werden kann, die mit 2,6 ng Protein des Candida-Erregers assoziiert ist Dabei kann es sich um lebende bzw um tote Erreger handeln Ein negatives Testergebnis schließt eine akute Infektion mit den entsprechenden Erregern nicht aus Besonders bei hohen anti-candida Antikörper-Titern kann es sein, dass die Antikörper das Antigen so stark maskieren, dass selbst durch die Denaturierungsschritte in der Probenvorbereitung das Antigen nicht erkannt wird Auch der Zeitpunkt der Probennahme während der Infektion, eine ungeeignete Probennahme, Probenvorbereitung oder Probenlagerung können ein negatives Testergebnis verursachen deutsch 18

20 Pos: 35 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/leistungsmer kmal e/kapitelüberschrift Leistungsmer 1 Pos: 38 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/leistungsmer kmal e/kapitelüberschrift Pr äzisi Referenzbereich gesunder Probanden DE Pos: 34 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für nur ein Dokument/T estauswertung/candi da antigen/candi da antig en: R efer enzbereich g esunder Die Untersuchung von Seren unselektierter Blutspender aus dem süddeutschen Raum mit dem SERION ELISA antigen Candida ergab folgende Verteilung: Von 103 untersuchten Blutspenderseren wurden 92 (89,3 %) mit dem SERION ELISA antigen Candida negativ bewertet, sechs Seren (5,8 %) lieferten einen positiven Befund und fünf Seren (4,9 %) wurden grenzwertig bewertet 9 LEISTUNGSMERKMALE antigen/leistungsmerkmale/kapitelüberschrift: 8\mod_ _6doc Pos: 36 /Arbeitsanleitungen Sensitivität für alle Dokumente/ELISA und 91 Sensitivität und Spezifität Pos: 37 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für nur Dokument/Leistungsmer kmale/candi da antig en/candi da antig en: Sensiti vität und In einer internen Studie zur Validierung des SERION ELISA antigen Candida wurden 148 Seren von erwachsenen Blutspendern bzw von 93 Patienten, die im Laufe einer intensivmedizinischen Behandlung Anzeichen einer systemischen Candidose zeigten, untersucht und mit den Ergebnissen eines kommerziell erhältlichen Antigennachweises verglichen Für die Berechnung der Sensitivität und Spezifität wurden die grenzwertig eingestuften Seren nicht berücksichtigt Leistungsmerkmale Sensitivität Spezifität SERION ELISA antigen Candida > 99,9 % 97,8 % In einer weiteren internen Studie wurden Kreuzreaktionen mit den Candida-Spezies Candida guillermondii, Candida glabrata, Candida krusei, Candida parapsilosis und Candida tropicalis im SERION ELISA antigen Candida festgestellt, so dass eine umfangreiche Candida Diagnostik gewährleistet ist Weiterhin wurde die Kreuzreaktivität von Hydroxyethylstärke (HES) untersucht, die als Plasmaexpander bei der Behandlung von Kreislaufschwächen (hypovolämischer, hämorrhagischer und septischer Schock) eingesetzt wird Trotz der molekularen Ähnlichkeit dieser Substanz mit Mannan konnte keine Kreuzreaktivität im SERION ELISA antigen Candida nachgewiesen werden deutsch 19

21 Pos: 40 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/allgemeine T exte ELISA Präzision Pos: 39 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für nur ein Dokument/Leistungsmer kmale/candi da antig en/candi da antig en: Pr Die intraserielle Präzision wurde mit unterschiedlich reaktiven Seren im Mehrfachansatz (n = 20) innerhalb einer antigenbeschichteten Platte ermittelt Für die Bestimmung der interseriellen Präzision wurden Serumproben mit unterschiedlicher Reaktivität in 10 unabhängig voneinander durchgeführten Ansätzen geprüft Standardabweichung Variationskoeffizient (VK %) = x 100 Mittelwert SERION ELISA antigen Candida: Probe Mittlere Extinktion (OD) Intraassay (VK %) Mittlere Extinktion (OD) Interassay (VK %) negativ 0,223 9,6 0,225 7,3 grenzwertig 0,507 2,4 0,476 5,3 positiv 1,413 2,5 1,356 2,7 positiv 2,851 2,0 2,442 8,1 deutsch 20

22 Pos: 41 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/liter atur /Kapi tel überschrift: SICHERHEITSMASSNAHMEN DE 101 Warnhinweise und Vorsichtsmaßnahmen Der SERION ELISA antigen ist nur für die Anwendung durch Fachpersonal vorgesehen, welches die Arbeitstechniken einwandfrei beherrscht Für die Handhabung der Testreagenzien und der Patientenproben gelten die anerkannten Laborregeln: - Die Testpackung enthält Verdünnungen humaner Seren Obwohl alle eingesetzten Seren negativ auf anti-hiv-ak, HBs-Ag (Hepatitis B-Virus-surface Antigen) und anti- HCV-Ak getestet wurden, müssen sie als potentiell infektiös betrachtet werden - Nicht mit dem Mund pipettieren - In Bereichen, in denen mit Testreagenzien oder mit Patientenproben gearbeitet wird, nicht essen, trinken oder rauchen - Beim Umgang mit Testreagenzien und Patientenproben direkten Kontakt durch das Tragen von Laborkittel, Einweghandschuhen und Schutzbrille vermeiden Hände anschließend gründlich reinigen - Die Patientenproben und alle potentiell infektiösen Materialien sind nach der Testdurchführung zu dekontaminieren - Die Reagenzien sind unzugänglich für Kinder aufzubewahren 102 Entsorgung Bitte beachten Sie die jeweils geltenden gesetzlichen Vorschriften! deutsch 21

23 === Ende der Liste für T extmar ke Inhalt === 11 LITERATUR Pos: 42 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für nur ein Dokument/Liter atur/c andida antigen: [1] Fegeler, W (1992) Möglichkeiten einer differenzierten Candida-Serologie Pilzdialog 4, 61-2 [2] Fegeler, W, Kipp, F (2004) Candida- und Aspergillus-Antikörper-ELISA Erwartungs-werte positiver Antikörpernachweise aus Seren der klinischmykologischen Routine-diagnostik Mycoses 47, 41 7 [3] Fukazawa, Y (1989) Antigenic structure of Candida albicans Immunochemical basis of the serologic specificity of the mannans in yeasts Immunol Serol 47, [4] Jones, JM (1990) Laboratory Diagnosis of Invasive Candidiasis Clin Microbiol Rev 3, [5] Matthews, RC, Burnie, JP, Tabaqchali, S (1987) Isolation of Immunodominant Antigens from Sera of Patient with Systemic Candidiasis and Characterization of Serological Response to Candida albicans J Clin Microbiol 25, [6] Müllensiefen, M, Ringelmann, R (1991) Labor-Diagnostik systemischer Candidosen Lab med 15, [7] Repentigny, L (1989) Serological Techniques for Diagnosis of Fungal Infections Eur J Clin Microbio Infec 8, [8] Robert Koch-Institut (2008) Epidemiologisches Bulletin 29 [9] Ruhnke, M, Rosseau, S, Graf, B (2004) Invasive Pilzinfektionen auf der Intensivstationen Arzneimitteltherapie 22, [10] Rüchel, R, Debusmann, F (2008) Serologie in der Diagnostik von Mykosen Chemother J 17, [11] Sendid, B, Poirot, JL, Tabouret, M, Bonnin, A, Caillot, D, Camus, D, Poulain, D (2002) Combined detection of mannanaemia and antimannan antibodies as a strategy for the diagnosis of systemic infection caused by pathogenic Candida species Med Microbiol 51, [12] Sendid, B et al (2006) Candidaemia and antifungal therapy in a French University Hospital: rough trends over a decade and possible links Infect Dis 6, 80 [13] Tietz, H-J, Tausch, I (1993) Differenzierte Candidaserologie auf dem Prüfstand Pilzdialog 4, 55-6 [14] Walsh, TJ et al (1991) Detection of Circulating Candida Enolase by Immunoassay in Patients with Cancer and Invasive Candidiasis New Engl J Med 324, [15] Werle, E, Kappe, R, Fiehn, W, Sonntag, H-G (1994) Nachweis von Anti- Candida-Antikörpern der Klassen IgM, IgG und IgA mittels Enymimmunoassays in sequentiellen Serumproben hospitalisierter Patienten Mycoses 36, 71-8 [16] Zöller, L, Krämer, I, Kappe, R, Sonntag, HG (1991) Enzyme Immuno Assay for Invasive Candida Infections: Reactivity of somatic Antigens of Candida albicans J Clin Microbiol 29, deutsch 22

24 SERION ELISA antigen Candida EN CONTENTS 1 INTENDED USE 2 DIAGNOSTIC RELEVANCE 3 SERION ELISA antigen - TEST PRINCIPLE 4 KIT COMPONENTS EL EN 5 MATERIAL REQUIRED BUT NOT SUPPLIED 6 STORAGE AND STABILITY 7 TEST PROCEDURE SERION ELISA antigen 71 General Notes 72 Sample Preparation and Storage 73 Preparation of Kit Reagents 74 Overview - Test Procedure 75 Manual Test Procedure 76 Automated Test Procedure 77 Positive Control / Accuracy Control CS PT 8 TEST EVALUATION 81 Single-Point Quantification with the 4PL Method 82 Criteria of Validity 83 Calculation SERION ELISA antigen Candida 84 Limits of Quantification 85 Borderline Range 86 Interpretation of Results 87 Reference Range of healthy Individuals 9 PERFORMANCE CHARACTERISTICS 91 Sensitivity and Specificity 92 Reproducibility 10 SAFETY MEASURES 101 Statements of Warning 102 Disposal 11 REFERENCES current version No: V 112/09-1 previous version: --

25 Pos: 1 /Arbeitsanl eitung en ELISA antigen/gültig für alle Dokumente/ELISA antigen/allgemei ne Texte ELISA antigen/einl eitung " Enzymimmunoassay" C andi da Pos: 5 /Arbeitsanl eitung en ELISA antigen/gültig für alle Dokumente/ELISA antigen/allgemei ne Texte ELISA antigen/kapitelüberschrift "Diag nostische 1 SERION ELISA antigen Candida Enzyme-immunoassay for determination of Candida Antigen for in vitro diagnostic use Pos: 2 /Arbeitsanl eitung en ELISA antigen/gültig für nur ei n D okument/bestellnummer n/c andida antigen: Bestell SERION ELISA antigen Candida Order Nr: ESR200 Pos: antigen/allgemeine 8\mod_ _18doc 3 /Arbeitsanleitungen Texte antigen/kapitelüberschrift 1 für alle Dokumente/ELISA 1 INTENDED USE Pos: 4 /Arbeitsanl eitung en ELISA antigen/gültig für nur ei n D okument/anwendungsbereich/c andi da antigen: SERION ELISA antigen Candida is a quantitative and qualitative immunoassay for the detection of Candida antigen in human serum or plasma The assay is recommended for the detection of systemic candidosis 2 DIAGNOSTIC RELEVANCE Pos: 6 /Arbeitsanl eitung en ELISA antigen/gültig für nur ei n D okument/di agnostische Bedeutung/Candida antigen: Diag nostische albicans is an ubiquitous yeast which, like all Candida species, belongs to the family of yeast-like fungi Apart from the yeast form which primarily causes superficial infections, so called pseudo mycelia are a further morphologic manifestation of yeast-like fungi Germ tubes and the development of pseudo mycelia mainly occur in cases of systemic mycosis Candida ssp produce and excrete a range of destructive enzymes that enable the facultative pathogen microorganisms to penetrate mucous membrane barriers and blood vessels barriers Candida ssp are primarily transmitted by smear contamination from person to person The primary portal of entry is the oral cavity Changes in the fungistatic properties of the skin, which are a consequence of a slightly acidic ph value and the antagonistic bacterial flora, can facilitate the establishment of superficial candidiasis of the skin surface Systemic mycosis results from colonization of mucous membranes, particularly in the gastrointestinal tract Candida ssp are able to adhere to the epithelia of a variety of mucosal membranes by adherence proteins and other cell surface structures The schematic below shows hypothetical steps that may lead to disseminated infections in cases of severe underlying conditions An exact description of the various stages is not practical (Fig 1) english 2

26 colonization of the nasopharyngeal tract passing of the stomach lumen transfer to the intestine lumen EN entry into blood circulation transfer to lymphoid system persorption of Candida - ssp EL EN Figure 1: invasion of multiple organs progression of Candida-infections Candidiasis can generally be classified into two major groups whose main characteristics are listed in the table below CS PT superficial Candida-infections deep mycosis (invasive) localization skin, mucosa prime organs immunocompetence of the host risk factors clinical progression + +,-/- pregnancy diabetes AIDS dysfunction of the skin deficient oral hygiene harmless in most cases, no danger of life chemo therapy iatrogene immune suppression central vein catheter radiotherapy high-grade burns surgery life-threatening in most cases therapy effective therapy effectiveness of therapy depends on stage of infection Table 1: Characteristics of Candida-infections english 3

27 Pos: 8 /Arbeitsanl eitung en ELISA antigen/gültig für nur ei n D okument/inhalt und Z usammensetzung/c andi da antigen: Inhalt und 1 The diagnosis of candidiasis on the basis of serological methods is not straight forward: On the one hand transient yeast colonization may induce an antibody response, on the other hand systemic Candida mycosis in immunosuppressed patients may only lead to minor changes in antibody activities Such situations make critical interpretation of serological findings necessary In addition, systemic Candida-infections may not cause typical symptoms Currently it is not possible to conclude that the results of different test systems for anti- Candida antibody detection are comparable or even exchangeable Specificity of detected antibodies significantly depends on the test system (ELISA or HAT) or on the antigen preparation used The detection of IgM antibodies with HAT is better than the IgG detection due to higher agglutination properties of IgM molecules HAT mainly detects antibodies against cell wall antigens of yeast-like fungi which makes serological interpretation even more complex but gives the opportunity for differentiation Changes in antibody concentrations may be detectable with ELISA but not with HAT, making a combination of the two techniques advantageous, eg in case of decreasing IgM antibody activity and simultaneously increasing IgG antibody activity Currently no single technique in isolation allows for a definitive serological diagnosis of candidiasis Surveillance of at risk patients and therapy control requires the use of a variety of methods including serology and antigen detection The SERION ELISA antigen Candida test is of particular help in such situations by detecting Candida specific antigen in patient samples Pos: 7 /Arbeitsanleitungen ELISA antigen/gültig für alle Dokumente/ELISA antigen/testprinzip/testprinzip ELISA 1 3 SERION ELISA antigen - TEST PRINCIPLE The ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) is an immunoassay, which is particularly suited to the determination of antibodies and antigens in the field of infectious serology The reaction is based on the specific interaction of antibodies with their corresponding antigen The test strips of the SERION ELISA antigen microtiter plate are coated with specific antibodies directed against the pathogen of interest If antigens in the patient s sample are present, they bind to the fixed antibody A secondary antibody, which has been conjugated with the enzyme peroxidase, detects and binds to the immune complex The colourless substrate hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) and the chromogen tetramethylbenzidine (TMB) are converted into a blue coloured product Addition of stopping solution changes the colour to yellow The signal intensity of this reaction product is proportional to the concentration of the antigen in the sample and is measured photometrically english 4

28 4 KIT COMPONENTS EN Test Components Pieces / Volume Break apart microtiter test strips each with eight antibody coated single wells, (altogether 96) MTP, 1 frame Standard serum STD, Candida albicans antigen in human serum supplemented with fetal calf serum (FCS); negative for anti-hiv Ab, HBs-Ag (Hepatitis B-Virus surface antigen) and anti-hcv Ab; preservative: < 01 % sodium azide 12 pieces 3 x 3 ml EL EN Negative control serum NEG, Human serum supplemented with fetal calf serum (FCS); negative for anti-hiv Ab, HBs-Ag (Hepatitis B-Virus surface antigen) and anti-hcv Ab; preservative: < 01 % sodium azide Anti-Candida albicans conjugate (ready-to-use) PODCR, Anti-Candida albicans antibody conjugated to horseradish-peroxidase; stabilised with protein stabilisation solution containing detergent; preservative: 01 % ProClin x 3 ml 13 ml CS PT Washing solution concentrate (sufficient for 1500 ml) WASH, TRIS-buffered salt solution with Tween 20; 30-fold concentrated; preservative: < 01 % ProClin x 25 ml Dilution buffer SAMB, Acid solution without preservative 15 ml Stopping solution STOP, 05 N sulfuric acid 13 ml TMB-substrate solution (ready-to-use) TMB, TMB-hydrogen peroxide substrate solution; preservative: < 001 % Kathon CG 13 ml Quality control certificate with standard curve and evaluation table INFO, (quantification of antigens in U/ml) 2 pieces Pos: 9 /Arbeitsanleitungen ELISA antigen/gültig für alle Dokumente/ELISA antigen/zusätzlich benötigte Materialien/Zusätzlich benötigte 1 english 5