Packungsbeilage. Chromogranin A ELISA IVD MAIER. analytik. Löhergasse Sinsheim. Germany

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1 MAIER analytik g m b h Packungsbeilage Chromogranin A ELISA IVD MAIER analytik g m b h Löhergasse Sinsheim Germany Tel.: 07261/ Fax.: 07261/ <8 C,; -12 C

2 Einführung Chromogranin A (CgA) kommt in der chromaffinen Granula, also in Katecholamine-speichernden Vesikeln der Nebenniere vor. Es ist 68 kda schwer und besteht aus 439 Aminosäuren mit einer Halbwertszeit von 18 Minuten bei Zirkulation im Körper. Die CgA-Konzentration spiegelt die exozystische, sympathoadrenale Aktivität und das Maß der Hormonausschüttung aus dem Nebennierenmark wider. Ein weiterhin beobachtetes Vorkommen ist in neuroendokrinen Zellen, Phäochromozytomen, Karzinoiden und allen Tumoren, die Peptidhormone sythetisieren, z.b. Hyperparathyreoidismus, C-Zell.Karzinom, Inselzelltumor, Hypophysentumor, Bronchialkarzinom /kleinzelliges, Oat-Cell- Typ), endokrine Zellen des Darms (enteroendokrine Zellen). Der hier entwickelte Test liefert mit einer Sensitivität von 83 % und einer Spezifität von 96 % ein sehr gutes diagnostisches Werkzeug zur Diagnose von Phäochromocytome. Aber auch zur Abklärung der Herkunft eines Tumors. So weisen hohe Spiegel auf die Herkunft aus den neuroendokrinen Geweben hin. Ein hoher CgA-Spiegel konnte auch bei Tumoren, die ihr Hormon nicht mehr bilden, z.b. Calcitonin Negative, CgA-positive C-Zell-Karzinome, Null-Zell-Adenome der Hypophyse, Inselzellkarzinome des Pankreas und Nebenschilddrüsenkarzinome

3 Testprinzip Anti-CGA ist an die Polystyrenwand gebunden. Die zu bestimmenden Seren werden in die Vertiefungen pipettiert. Während der Inkubationszeit binden das spezifische Antigen an den fixierten Antikörper Ungebundenes Material wird weggewaschen und ein Biotin gekoppelter Antikörper zugegeben. Ungebundene Antikörper werden weggewaschen und HRP markiertes Streptavidin wird zugegeben. Nach einer Inkubation mit nachfolgendem Waschschritt wird die Färbereaktion durch Zugabe von TMB gestartet. Nach einer Inkubation wird die Färbereaktion durch Schwefelsäure gestoppt und in einem Photometer bei 450 nm gemessen. STOPP Anti-CgA CgA aus der Probe Substratinkubation Streptavidin HRP Anti-CgA biotinyliert

4 Was wird benötigt? Benötigte Geräte: Vortex-Mixer Platereader Waage Multipette oder 8-Kanal Pipette 100 µl und 10 µl Pipette Zentrifuge Mikrotiterplattenphotometer mit Filter 450 nm (Referenzfilter 620 oder 690 nm) Zentrifuge 3000 x g Benötigte Materialen: Einwegröhrchen zum Einwiegen der Proben Laborübliche Glas- oder Plastikröhrchen (Einmalartikel) Meßzylinder (500 ml) 2 x 500 ml Becher oder Flaschen vorzugsweise aus Glas Bidestilliertes Wasser (aqua bidest.) ml 500 ml 500 Zentrifuge

5 Was ist im Kit? Menge Artikel gebrauchsfertig 1 Stk Mikrotitterplatte (Mit Anti CGA beschichtet) gebrauchsfertig 5 x 1 ml 5 Standards (in wäßriger Lösung mit Thimerosal). gebrauchsfertig 2 x 1 ml Kontrollen Level 1 und 2 (in wäßriger Lösung mit Thimerosal.) gebrauchsfertig 250 µll Antikörper, biotinyliert (biotinylierter Antikörper in proteinhaltigem Phosphatpuffer mit Thimerosal ph 7,4) gebrauchsfertig 250 µl Konjugatkonzentrat (HRP markiertes Streptavidin in proteinhaltigem Phosphatpuffer mit Thimerosal) gebrauchsfertig 12 ml Substrat (TMB) gebrauchsfertig 15 ml Stopplösung (0,5 M Schwefelsäure) gebrauchsfertig 30 ml Assaypuffer (Phosphatpuffer mit Thimerosal und Detergenz ph 7,4) in 500 ml entionisertem Wasser lösen. 30 ml Konzentrat für den Waschpufferpuffer (Phosphatpuffer mit Natriumazid und Proteinzusatz ph 7,4) A W Konjugat Standards Kontrollen Assaypuffer Waschpuffer konzentrat Biotinylierter Antikörper AK Sub Stop Mikrotiterplatte Substrat Stopp

6 Was muss vor dem Testansatz gemacht werden? 1. Alle Reagenzien müssen auf Raumtemperatur gebracht werden. Dies geschieht am besten, in dem man mindestens eine Stunde vor dem Testansatz die Reagenzien aus dem Kühlschrank nimmt. 2. Waschpuffer muss aufgelöst werden: Der gesamte Inhalt des Waschpufferkonzentrat wird in 500 ml entionisiertem Wasser gelöst und gut gemischt W 500 ml 3. Vorbereitung der Serumproben: Serumproben, die zu hoch gemessen wurden oder mit Vorbefunden werden vorher mit dem Assaypuffer verdünnt. Probe im Vorbefund Verdünnung Volumen Probe Volumen Assaypuffer Ab 1200 µg/l 1/10 10 µl 90 µl > 5000 µg/l 1/50 10 µl 490 µl > µg/l 1/ µl 2490 µl Die Endverdünnung wird im Assay eingesetzt. Lagerung der Proben: Die Proben sollten tiefgefroren gelagert werden.

7 4. Verdünnen des biotinylierten Antikörpers (1/100): 500 ml Anzahl der Streifen Antikörper Waschpuffer 1 20 µl 2,0 ml 2 40 µl 4,0 ml 3 60 µl 6,0 ml 4 80 µl 8,0 ml µl 10,0 ml µl 12,0 ml µl 14,0 ml µl 16,0 ml µl 18,0 ml µl 20,0 ml µl 22,0 ml 5. Verdünnen des Konjugats (Streptavidin HRP) (1/100): 500 ml Anzahl der Streifen Konjugat Waschpuffer 1 20 µl 2,0 ml 2 40 µl 4,0 ml 3 60 µl 6,0 ml 4 80 µl 8,0 ml µl 10,0 ml µl 12,0 ml µl 14,0 ml µl 16,0 ml µl 18,0 ml µl 20,0 ml µl 22,0 ml

8 Lagerung, Haltbarkeit Aufbewahrung der Testkomponenten: Artikel wo Lagern? Wie lange? Mikrotitterplatte Kühlschrank Siehe Etikett Standards Gefriertruhe Siehe Etikett Kontrollen Level 1 und 2 Gefriertruhe Siehe Etikett Konjugat Kühlschrank Siehe Etikett Antikörper, biotinyliert Kühlschrank Siehe Etikett Substrat Kühlschrank Siehe Etikett Stopplösung Kühlschrank Siehe Etikett Konzentrat für den Waschpufferpuffer Kühlschrank Siehe Etikett Assaypuffer Kühlschrank Bis Verfallsdatum Kit Aufgelöster Waschpufferpuffer Kühlschrank 4 Wochen nach auflösen Probenmaterial und Probenhaltbarkeit: Die Haltbarkeit der Proben beträgt 12 Monate in tiefgefrorenem Zustand.

9 Auswertung Bei der Auswertung ist darauf zu achten, dass die folgenden Konzentrationen Verwendung finden. Standard Konzentration [µg/g]: Auswertung: Beispiel einer Standardkurve Die unten beschriebenen mathematischen Modelle können alternativ zur Auswertung benutzt werden. Wir empfehlen die Punkt zu Punkt Auswertung : 2,5 Kontroll e 1 Kontro Punkt-zu-Punkt-Auswertung Für die optische Dichte und für die Konzentration empfehlen wir eine lineare Ordinate bzw. Abszisse. 2 4-Parameter-Funktion Für die optische Dichte empfehlen wir eine lineare Ordinate und für die Konzentration eine logarithmische Abszisse (bei einer logarithmischen Abszisse muss für den Standard mit der Konzentration 0 ein Wert kleiner 1 eingegeben werden z. B. 0.01). Optische Dichte 1,5 Gewichtete Spline-Funktion Für die optische Dichte empfehlen wir eine lineare Ordinate und für die Konzentration eine logarithmische Abszisse (bei einer logarithmischen Abszisse muss für den Standard mit der Konzentration 0 ein Wert kleiner 1 eingegeben werden z. B. 0.01). 1 0, Konzentration [µg /g ]

10 Validierung Vor jeder automatischen Auswertung sollte stets eine Kontrolle der Doppelwerte auf Plausibilität ( Ausreißerkontrolle ) durchgeführt werden; falls dies nicht durch das verwendete Programm erfolgt, sollte die Kontrolle manuell durchgeführt werden. Die mitbestimmten Kontrollen sollten im folgenden Vertrauensbereich liegen: Kontrolle 1: Kontrolle 2: 125 ± 50 µg/g 250 ± 100 µg/gl Normalwert Wir empfehlen jedem Labor einen hauseigenen Normbereich zu erstellen, da es aufgrund der Präanalytik, wie Probentransport und Lagerung, zu anderen Ergebnissen kommen kann. Der von uns ermittelte Normalbereich ist anhand von Normalproben erfolgt. Unser Normbereich liegt bei < 200 µg/l

11 Allgemeine Hinweise Dieser Kit wurde nach der IVD Richtlinie 98/79/EG hergestellt und in den Verkehr gebracht. Dieser Testkit und alle darin enthaltenen Komponenten dürfen ausschließlich zu wissenschaftlichen Zwecken oder, wenn vermerkt zur in vitro-diagnostik verwendet werden. Reagenzien aus unterschiedlichen Kit-Chargen dürfen nicht verwendet werden. Für die Qualitätskontrolle sind die, für medizinischen Laboratorien erstellten Richtlinien zu beachten. Qualitätskontrollen sollten immer mit gemessen werden. Die charakteristischen Testdaten wie Inkubationszeiten, Inkubationstemperaturen und Pipettiervolumina der verschiedenen Komponenten wurden firmenintern festgelegt. Nicht mit dem Hersteller abgesprochene Veränderungen in der Testdurchführung können die Resultate beeinflussen. Der Hersteller übernimmt für die hierdurch entstandenen Schäden und Folgeschäden keine Haftung. Bei Gewährleistungsansprüchen ist das beanstandete Material mit schriftlicher Erklärung innerhalb von 14 Tagen zum Hersteller, der Firma Maier Analytik GmbH, zurück zu senden. Der Testkit ist nach Ablauf des auf die Packung aufgedruckten Verfalldatums nicht mehr zu verwenden. Hinweise zur Arbeitssicherheit Alle mitgelieferten Testkomponenten enthalten Thimerosal und Natruiumazid zum Schutz vor bakterieller Kontamination. Bitte alle Sicherheitsmaßnahmen ergreifen. Die Berührung mit der Haut sollte vermieden werden. Substrate für enzymatische Farbreaktionen sind als giftig und Karzinogen beschrieben. Jeder Kontakt mit der Haut und den Schleimhäuten sind zu vermeiden. Es sollte unter keinen Umständen mit dem Mund pipettiert werden. Während der Testdurchführung Einmalhandschuhe tragen. Die Stopplösung besteht aus H 2 SO 4 und muß mit Vorsicht behandelt werden. Sie verursacht bei Kontakt mit der Haut Verätzungen. Es sollte daher mit Schutzhandschuhen und Schutzbrille gearbeitet werden. Bei Kontakt mit der Säure muß die verätzte Stelle sofort mit viel Wasser gespült werden. Das für Kitkomponenten verwendete humane Material wurde auf HIV, Hepatitis B und Hepatitis C getestet und für negativ befundet. Dennoch wird empfohlen, die Kitkomponenten als Vorsichtsmaßnahme immer wie potentiell infektiöses Material zu behandeln. Entsorgung Für den Fall, dass der Kit beschädigt ist und Reagenzien ausgelaufen sind, sollten alle Sicherheitsvorkehrungen getroffen werden, die bei einem Umgang mit infektiösem, kanzerogenem und reizendem Material nötig sind. Bei der Entsorgung von nicht verwendeten Testkomponenten sollte die für klinische Laboratorien gültigen Richtlinien beachtet werden.

12 10 µl Standards, Kontrollen und Proben laut Pipettierschema in Platte 200 µl Assaypuffer den Testansatz 60 min bei Raumtemperatur inkubieren Waschen mit 4 * 250 µl Waschpuffer 4 x Biotinylierter Antikörper den Testansatz 60 min bei Raumtemperatur inkubieren Waschen mit 4 * 250 µl Waschpuffer 4 x 200 µl Konjugat in alle Vertiefungen den Testansatz 60 min bei Raumtemperatur inkubieren Waschen mit 4 * 250 µl Waschpuffer 4x 200 µl Substrat in alle Vertiefungen den Testansatz 30 min bei Raumtemperatur inkubieren 50 µl Stopplösung in alle Vertiefungen Die Färbung bei 450 nm messen.

13 Platte /Riegel Soll Protokollvordruck Assay: Kit Charge/ LOS: Darum: Es wurde folgendes zugegeben: LOS Stk 10 µl Standards, Kontrollen und Proben µl 200 µl Assaypuffer Den Testansatz mindestens 1h bei Raumtemperatur inkubieren Waschen mit 4 x 0,25 ml Waschpuffer 200 µl biotinylierter Antikörper Den Testansatz mindestens 1h bei Raumtemperatur inkubieren Waschen mit 4 x 0,25 ml Waschpuffer Start (Uhrzeit):......x...ml...x...ml Ende (Uhrzeit) µl Konjugat µl Den Testansatz mindestens 1 h bei Raumtemperatur inkubieren Waschen mit 4 x 0,25 ml Waschpuffer Start (Uhrzeit):......x...ml Ende (Uhrzeit) µl Substrat µl Den Testansatz 30 min bei Raumtemperatur inkubieren Start (Uhrzeit): µl Stopplösung µl Ende (Uhrzeit) A B C D E F G H

14 Assay Parameter 1. Antikörper an der Platte: Rabbit-Anti-human-CgA Biotinylierter Antikörper Rabbit-Anti-human-CgA Probenmaterial: Serum / EDTA Plasma Probenvolumen 10 µl Sensitivität (untere Nachweisgrenze): 14,6 µg/l Recovery : 98,7 % ± 6 % Linearität (r= Korrelationskoeffizient): r = 0,976 Intraassayvarienz: < 5,8 % Interassayvarianz: < 9,5 % Normbereich <200 µg/l Präzision: Das Präzisionsprofil wurde duch die Messung von jeweils 16 Replikanten jedes einzelnen Standards und Bestimmung des Variationskoeffizienten für jeden einzelnen Konzentrationswert. Die berechnung erfolgte anhand der optischen Dichten. Der mittlere Variationskoeffizient lag bei 6,7 %. OD S0 S1 S2 S3 S4

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