1.5 Phänokopien Variabilität als biologisches Grundphänomen

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1 18 1 Variabilität als biologisches Grundphänomen Zusammenhang sehen, daß eineiige (oder monozygote) Zwillinge in ihrem Erbmaterial identisch sind, während zweieiige (dizygote) Zwillinge sich genetisch genauso unterscheiden wie normale Geschwister (s.s. 150). Gewissermaßen können wir also monozygote Zwillinge hinsichtlich ihrer genetischen Konstitution (also ihres Genotyps) mit vegetativ vermehrten Pflanzen vergleichen (s.s. 9). Da wir davon ausgehen können, daß die Auswirkung von Umwelteinflüssen während der Entwicklung sowohl auf monozygote als auch auf dizygote Zwillinge grundsätzlich sehr ähnlich sein müssen, geben uns Vergleiche bestimmter Eigenschaften monozygoter und dizygoter Zwillinge die Möglichkeit, den Anteil der genetischen Komponenten bestimmter menschlicher Eigenschaften abzuschätzen. Hierauf muß später noch näher eingegangen werden (s.s. 151). unter bestimmten Umständen durch Milieueinflüsse imitiert werden können. Man spricht in diesem Fall von einer Phänokopie.! Phänokopien sind umweltbedingte, nichterbliche Nachahmungen von Phänotypen, die aber alternativ auch durch bestimmte erbliche Konstitutionen (Vorhandensein bestimmter Allele) hervorgerufen werden können. Wir wollen uns diese Situation an einem Beispiel aus der Humangenetik genauer betrachten. Um 1960 wurde das Medikament Thalidomid (Firmenproduktbezeichnung: Contergan ) (Abb. 1.7) bei Schlafstörungen häufig verschrieben. Allmählich fiel es auf, daß nach 1.5 Phänokopien Wir müssen uns vor Augen halten, daß wir aufgrund des Phänotyps eines einzelnen Organismus nicht entscheiden können, ob eine vorwiegend erblich oder eine vorwiegend umweltbeeinflußte Eigenschaft vorliegt. Vielmehr kann eine solche Entscheidung nur durch eine genetische Analyse verwandter Individuen beim Menschen also zum Beispiel durch Analyse eines Familienstammbaumes getroffen werden. Der Grund für diese Schwierigkeiten ist darin zu suchen, daß Merkmale, die gewöhnlich genetisch bedingt sind, H O N O O C N C O Thalidomid Abb Chemische Struktur von Thalidomid Abb Thalidomid-Embryopathie. Phänotyp eines Kindes mit Entwicklungsstörungen aufgrund der Einnahme von Thalidomid durch die Mutter während der Schwangerschaft. Das Medikament wurde während der Entwicklung der Gliedmaßen eingenommen (s. Tabelle 1.1) und verhinderte deren normale Entwicklung. (Aus Buselmaier u. Tariverdian 1991)

2 1.5 Phänokopien 19 Tabelle 1.1. Contergan -Schäden Entwicklungstag Mißbildung 21 Gehörlosigkeit, Facialislähmung, Augenmuskellähmung 23 Mißbildung des Daumens Fehlen oder weitgehender Verlust der Arme Nierenmißbildungen, Analatresie Armmißbildungen, Fehlen der Beine, Herzmißbildungen, Duodenalmißbildungen Beinmißbildungen, Herzmißbildungen 36 Triphalangie des Daumens, Analstenose Tage nach Konzeption, berechnet unter der Annahme, daß diese 14 Tage nach der Menstruation erfolgte. Es können Abweichungen bis zu 5 Tagen erfolgen. Aus Lenz W (1970) Medizinische Genetik. 2. Aufl. dtv und Thieme, Stuttgart Einnahme dieses Schlafmittels während früher Phasen einer Schwangerschaft häufig Kinder geboren wurden, die unvollständig entwickelte Gliedmaßen besaßen, also eine Entwicklungsstörung aufwiesen, die als Phocomelie bezeichnet wird (Abb. 1.8). Die nähere Untersuchung dieses Phänomens zeigte, daß Thalidomid in der Tat während einer eng begrenzten Periode der Embryonalentwicklung eine Anzahl unterschiedlicher Entwicklungsstörungen hervorzurufen vermag (Tabelle 1.1). Diese teratogene Wirkung des Medikamentes wird ausschließlich zwischen dem 21. und 36. Tag der Embryonalentwicklung beobachtet (s. Abb. 4.1). Das frühe und zudem zeitlich sehr begrenzte Wirkungsspektrum machte es natürlich zunächst schwierig, die Wirkung des Medikamentes zu erkennen und genauer zu analysieren, bis nach der Geburt von etwa 7000 betroffenen Kindern in den frühen 60er Jahren die Ursache von W. Lenz erkannt wurde: Eine einzige Tablette mit Thalidomid im kritischen Entwicklungszeitraum genügte, eine Mißbildung beider Arme und Beine hervorzurufen. Die Untersuchung der Thalidomidembryopathie macht uns auf ein weiteres praktisches Problem aufmerksam. Der teratogene Effekt ist nämlich in Tierexperimenten mit Mäusen und Ratten nicht nachweisbar. Allein bei Primaten sind begrenzte Effekte beobachtet worden, die im wesentlichen in einer reduzierten Anzahl von Neuronen in den Spinalganglien bestanden. Möglicherweise ist das sogar der primäre Effekt des Thalidomids. Es könnte sekundär einen Effekt auf die Induktionsprozesse ausüben, die zur Entwicklung der Gliedmaßen erforderlich sind. Wir wissen, daß die korrekte Innervation entscheidenden Einfluß auf die Differenzierung von Organen ausüben kann. Auf jeden Fall wird an diesem Beispiel die Problematik von Tierexperimenten und ihrer Interpretation hinsichtlich der Auswirkungen von Medikamenten auf den Menschen deutlich sichtbar. Uns interessiert in diesem Zusammenhang aber auch die Tatsache, daß einige der in Tabelle 1.1 beschriebenen Mißbildungen in gleicher Form auch als angeborene erbliche Defekte beobachtet werden können (Tabelle 1.2). Sie gleichen stark den Phänotypen des (dominanten) Oram-Holt- Syndroms und des Fanconi-Syndroms. Wir haben es also bei der Thalidomidembryopathie mit dem Beispiel einer Phänokopie einer Erbkrankheit zu tun, die durch das Medikament Thalidomid verursacht wird. Wenn wir die Ursachen für die Entstehung von Phänokopien verstehen wollen, müssen wir uns darüber bewußt sein, daß diese durchaus identisch mit den genetischen Ursachen für einen bestimmten Phänotyp sein können. Stellen wir uns einerseits vor, daß ein (erblicher) Phänotyp durch die permanente Inaktivierung eines Gens (also dessen Ausfall) verursacht wird, so ist es ebensogut auch vorstellbar, daß dasselbe Gen, obwohl in voll funktioneller Form im Genom vorhanden, durch äußere Einflüsse, etwa durch eine spezifisch darauf einwirkende chemische Verbindung, während des maßgeblichen Zeitraumes in seiner Funktion gestört wird. Das würde zu dem gleichen Phänotyp führen, wie er bei einem defekten Gen entsteht. Der einzige Unterschied ist, daß die umweltbedingte Inaktivität nicht erblich ist, so daß also alle Nachkommen einen normalen Phänotyp besitzen. Unter Thalidomideinfluß konnte in Einzelfällen eine diskordante Ausprägung von Entwicklungsdefekten bei Zwillingen beobachtet werden. Diese Beobachtung ist in Zusammenhang mit unseren vorangehenden Beobachtungen über Differenzen in den Ommatidienzahlen in Komplexaugen von Drosophila interessant. Wie bereits dort erörtert (s.s. 14), können während der Entwicklung geringfügige Differenzen in der

3 2 Vererbung als biologisches Grundphänomen Das Untersuchungsmaterial Gregor Mendels: Pisum sativum. (Tuschezeichnung: S. Erni, Luzern)

4 5.1 Dosiskompensation 197 Entwicklungsstadium Xist-Expression X-Inaktivierung Väterl. Imprinting wirksam X-Methylierung Oogonie Oocyte Oocyte, spät Zygote frühe Zellteilungen Morula Blastocyste Trophektoderm extraembryon. Gewebe primitives Endoderm Innere Zellmasse 5-Tage-Embryo 7-Tage-Embryo Soma Abb Verhalten des Säuger-X-Chromosoms im weiblichen Geschlecht. Im Trophektoderm (s. Abb. 5.6) ist ausschließlich das väterliche X-Chromosom inaktiv. Ein väterliches Imprinting besteht zwar bereits während der ersten Teilungen, kommt jedoch erst später funktionell zur Geltung. Im Männchen kommt das XIST-Gen während der Spermatogenese zur Expression, eine Inaktivierung des X-Chromosoms ist ausschließlich in männlichen Keimzellen zu beobachten, während eine Methylierung vollständig fehlt. Das Schema beruht auf Beobachtungen an Mäusen des inaktiven X-Chromosoms synthetisiert. Ihre Funktion ist bisher unbekannt, jedoch spielt sie wohl eine strukturelle Rolle im Kern, wahrscheinlich für die Chromatinkonstitution des inaktiven X- Chromosoms. Vergleiche mit der Beobachtung rein nukleärer Y-chromosomaler Transkripte in den Spermatocytenkernen von Drosphila drängen sich auf (s.s. 131). Auch für diese Transkripte werden Funktionen in der Chromatinorganisation vermutet. Auffallend ist es, daß die Struktur des menschlichen XIST-Locus der des entsprechenden Gens (Xist) der Maus sehr ähnlich ist. Das deutet auf eine evolutionär erhaltene Funktion dieses Gens hin, obgleich es nicht für ein Protein kodiert. In den letzten Jahren wurden noch weitere Gene ohne Protein-kodierte Funktionen gefunden (z.b. H19, 7H4, Lin4, Lin14, Xlsirt). Diese Gene kodieren RNAs, die sehr wahrscheinlich im einzelnen noch unbekannte strukturelle Funktionen ausüben. Die Irreversibilität X-chromosomaler Inaktivierung ist ein biologisch sehr interessantes Phänomen, dem wir schon in anderem Zusammenhang begegnet sind. Sie deutet nämlich an, daß im Zusammenhang mit der Inaktivierung des X-Chromosoms ein Signal auf chromosomalem Niveau niedergelegt wird, das über viele Zellgenerationen hin erhalten und wirksam bleibt. Wir haben diesen Regulationsmechanismus auf chromosomaler Ebene bereits als Imprinting kennengelernt (s.s. 141). Imprinting ist auch während der Embryonalentwicklung von Säugern zu beobachten (Abb. 5.5): Die väterlichen Chromosomen können von mütterlichen unterschieden werden, denn einige Gene werden zu unterschiedlichen Zeitpunkten aktiv, je nachdem, ob sie vom Vater oder der Mutter an den Embryo vererbt wurden. Auch das väterliche X- Chromosom kann im Embryo vom mütterlichen

5 6.2 Die Verdoppelung des Erbmaterials (Replikation) 223 A Semikonservative Replikation: G 1 -Phase Metaphase Metaphase des folgenden Zellzyklus B Schwesterchromatidenaustausch: Metaphase Metaphase des folgenden Zellzyklus Abb. 6.9A C. Nachweis der semikonservativen Replikation der DNA durch Taylor an Chromosomen der Hyazinthe (Bellevalia romana). Die damals neue Methode der Autoradiographie (s. Technikbox 2, S. 149) gab die Möglichkeit, die DNA der Chromosomen über mehrere Mitosen hinweg zu verfolgen und ihre Verteilung auf die Tochterchromatiden zu ermitteln. Auch Taylor verwendete, wie Meselson und Stahl, eine Isotopenmarkierung für seine Untersuchungen der Chromosomenverdoppelung. Allerdings gebrauchte er 3 H-Thymidin, das eine spezifische radioaktive Markierung der DNA gestattet und im Autoradiogramm leicht zu lokalisieren ist. Läßt man Zellen für einen Zellzyklus in 3 H-Thymidin-haltigem Medium wachsen, so wird die radioaktive Vorstufe während der S-Phase in die DNA eingebaut. A Betrachtet man die Metaphasechromosomen in der ersten folgenden Mitose, so findet man ausschließlich einheitlich radioaktiv markierte Chromatiden. Durch Behandlung mit Colchicin (Abb ) erreicht man, daß die beiden Chromatiden eines duplizierten Chromosoms im Centromerenbereich zusammenhängen bleiben. Nach einem weiteren Zellzyklus, der in nichtradioaktivem Medium durchlaufen wurde, zeigen die Chromatiden eine Differenzierung hinsichtlich der radioaktiven Markierung. Eine der Chromatiden ist, wie nach dem ersten Zellzyklus, radioaktiv. Die andere bleibt jedoch unmarkiert. Das kann nur bedeuten, daß die ursprünglich in radioaktivem Medium verdoppelte DNA einer Chromatide aus zwei Einzelsträngen besteht, die jeweils einen neuen, nunmehr radioaktiven komplementären Strang synthetisieren und dadurch zwei Chromatiden mit identischer genetischer Information hervorbringen. Jede der Chromatiden besteht nunmehr aus einem radioaktiven und einem nichtradioaktiven Strang. B und C Bei einer weiteren Verdoppelung in nichtradioaktivem Medium trennen sich diese Stränge, so daß eine unmarkierte und eine halbmarkierte Doppelhelix gebildet wird. In diesen Versuchen beobachtete Taylor auch Chromosomen, deren zwei Chromatiden nur in begrenzten Bereichen markiert waren. Hierbei waren in den beiden zusammengehörigen Chromatiden stets alternierende Regionen markiert. Taylor schloß hieraus, daß es sich um Austauschereignisse handelt, bei denen die beiden Chromatiden (Schwesterchromatiden) eines Chromosom Stücken austauschen (s.s. 525)

6 9 Molekulare Struktur eukaryotischer Chromosomen ÜBERBLICK Die Chromosomentheorie der Vererbung besagt, daß die Chromosomen die Träger der Gene sind. Bedeutet das, daß sie lediglich eine Ansammlung kettenartig aneinandergefügter Gene sind, oder haben sie noch andere Aufgaben zu erfüllen? Aus allen cytologischen Beobachtungen müssen wir schließen, daß Chromosomen übergeordnete Funktionen in der Zelle erfüllen müssen. Ihre offensichtliche Aufgabe besteht darin, für die geregelte Verteilung der Gene in Mitose und Meiose zu sorgen. Um diese zu garantieren, sind besondere Mechanismen für die Verteilung erforderlich. Diese Mechanismen machen Gebrauch von besonderen chromosomalen Domänen, den Centromerenbereichen. Centromere dienen als Ansatzpunkte für die Mikrotubuli des Spindelapparates, die die Chromosomen oder deren Untereinheiten, die Chromatiden, bei der Zellteilung auf die Tochterzellkerne verteilen. Auch bei der DNA-Replikation haben Chromosomen eine wichtige Aufgabe zu erfüllen. Der normale Replikationsmechanismus linearer DNA-Moleküle führt in jedem Replikationszyklus zu einer Verkürzung der DNA-Doppelhelix von den Enden her, da die RNA-Primer am Ende der DNA zwar entfernt, aber nicht durch DNA-Sequenzen ersetzt werden können. Diesem Problem wird von den Chromosomen durch die Entwicklung besonderer terminaler Domänen, der Telomeren, entgegengewirkt, für deren Instandhaltung besondere Mechanismen sorgen. Außerdem muß durch eine spezielle Struktur sichergestellt werden, daß die freien Enden der DNA im Chromosom nicht durch Exonukleasen abgebaut werden oder durch die Wirkung von Reparaturenzymen mit den freien Enden der DNA eines anderen Chromosoms verschmelzen. Weitere Eigenschaften der Chromosomen erlauben es, daß sie zeitweilig oder permanent inaktiviert werden können. Chromosomen sind also dynamische Strukturen, die strukturell und funktionell eng mit dem Stoffwechsel der Zelle verbunden sind und deren Bedeutung weit über das hinausgeht, was man für ein reines Depot von Genen erwarten würde. Trotz dieser allgemeinen Bedeutung der Chromosomen ist über ihre Feinstruktur wenig bekannt. Wie ist ein mehrere Zentimeter langes DNA-Molekül in einem nur wenige Mikrometer großen Zellkern untergebracht und wie erfolgt dessen Kompaktierung bzw. Entpackung in Mitose und Interphase? Wir wissen, daß die chromosomale DNA in einer ersten Verpakkungsstufe in der Form von kompakten Nukleosomen organisiert wird. Sie windet sich hierzu zweimal um einen Komplex aus Histonproteinen. Eine Kette derartiger DNA-Histonpartikel formt eine Chromatinfibrille von 10 nm Durchmesser. Diese Fibrille wird jedoch zusätzlich in Fibrillen höherer Ordnung organisiert, über deren Struktur wir im Einzelnen nur wenig wissen. In letzter Zeit hat man jedoch Einblicke in den molekularen Aufbau verschiedener chromosomaler Domänen und deren Proteinkomponenten erlangt.

7 Molekulare Struktur und Regulation prokaryotischer Gene TECHNIK-BOX 15 Restriktionsanalyse von DNA und Southern Blotting ANWENDUNG: Charakterisierung von DNA-Sequenzen durch Kartierung von Restriktionsenzymschnittstellen; Ermittlung von Sequenzhomologien durch Hybridisierungsexperimente. VORAUSSETZUNGEN MATERIALIEN: Die Restriktionsanalyse von DNA erfolgt durch Endonukleasen, die DNA sequenzspezifisch hydrolisieren. Die Länge der Erkennungs- Sequenzen liegt, abhängig vom Enzym, meistens zwischen vier und sechs Nukleotiden. Durch die Wahl des Enzyms kann man die mittlere Fragmentlänge der geschnittenen DNA festlegen. METHODE: DNA-Moleküle (z.b. klonierte DNA-Fragmente oder Genom-DNA) werden in A Nylonmembran B C Agarosegel Transfer Parallelreaktionen mit unterschiedlichen Restriktionsenzymen geschnitten. Die Reaktionsprodukte werden auf Agarosegelen in nebeneinanderliegenden Spuren elektrophoretisch nach Größe aufgetrennt. Nach Inkubation mit Ethidiumbromid (einer interkalierenden Substanz, Abb , s.s. 513) lassensichdierestriktionsfragmente im UV-Licht sichtbar machen. Ihre Länge kann durch Vergleich mit Marker-DNA- Fragmenten errechnet werden. Durch Vergleich der Resultate von Restriktionsexperimenten mit einzelnen oder mehreren EnzymenlassensichdiePositionen von Restriktionsenzymschnittstellen relativ zueinander ermitteln. Es können so Restriktionskarten einer DNA- Sequenz erstellt werden. Nach alkalischer Denaturierung der zunächst noch doppelsträngigen Fragmente im Gel wird die DNA durch Diffusion auf Membranfilter übertragen, an denen sie irreversibel fixiert wird. Diese Filter werden mit markierten Nukleinsäuren hybridisiert. Hybride werden durch Autoradiographie (bei radioaktiven Nukleinsäuren und bei der Verwendung von fluoreszierenden Agenzien zur Markierung, z.b. AMPPD) oder durch Färbungen (bei DIG-markierten Nukleinsäuren und Reaktion mit enzymgekoppelten Antikörpern) erkannt. Diese Methode wird nach ihrem Erfinder Edwin Southern als Southern Blotting bezeichnet. Nylonmembran Hybridisierung Röntgenfilm Nylonmembran Autoradiographie Röntgenfilm Entwickeln Abb. A. Es ist die technische Ausführung eines Southern-Blottes dargestellt. B zeigt das Ergebnis eines solchen Versuches. Die Restriktionsfragmente sind im Gel im UV-Licht nach Anfärbung mit Ethidiumbromid zu erkennen (links). Nach Hybridisierung (rechts) reagieren solche Restriktionsfragmente (Pfeile im linken Bildteil), die mit der radioaktiv markierten DNA-Probe Sequenzhomologien aufweisen. Die Buchstaben E und H kennzeichnen Restriktionsverdaus mit Eco RI und Hind III. C Zeigt einen Southern-Blot genomischer DNA von Drosophila, bei der ein Männchen-spezifisches (also Y-chromosomales) Restriktionsfragment (Pfeil) zu sehen ist. Es handelt sich um repetitive DNA-Sequenzen, die größtenteils autosomal lokalisiert sind und daher in beiden Geschlechtern in gleicher Weise in Erscheinung treten.