Molekularbiologische und naturstoffchemische Untersuchungen ausgewählter Bakterienstämme
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- Theodor Hartmann
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1 Molekularbiologische und naturstoffchemische Untersuchungen ausgewählter Bakterienstämme - Dissertation" zur Erlangung des Doktorgrades (Dr. rer. nat.) ' der. Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Rheinischen Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn vorgelegt von Doris Akkermann aus Leer Bonn 2004
2 Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung Polyketidsynthasen und nonnbosomale Peptidsynthetasen - Enzyme der 1 Sekundärstoffbiosynthese Polyketidsynthasen Nonnbosomale Peptidsynthetasen Chemie bakterieller Naturstoffe Marine Bakterien Myxobakterien 18 2 Zielsetzung der Arbeit 29 3 Material und Methoden Chemikalien und sonstige Materialien Chemikalien Enzyme Verwendete Reagenziensätze Plasmide Escherichia co/i-stämme (kompetente Zellen) Oligodesoxyribonukleotide (Primer) Medien Puffer und Lösungen Mikrobiologische Methoden Isolierung von Bakterienstämmen Isolierung mariner Bakterien Isolierung von Myxobakterien Kultivierung von Bakterienstämmen Kultivierung mariner Bakterien Kultivierung von Myxobakterien Wachstumskontrolle von Bakterienkulturen Zellernte 38
3 3.2.5 Stammhaltung und Konservierung der Bakterienstämme Molekularbiologische Methoden Bestimmung der Konzentration und des Reinheitsgrades von DNA Reinigung von PCR-Produkten DNA-Isolierung Isolierung genomischer DNA nach Neumann etal. (1992) Isolierung genomischer DNA mit dem DNeasy Tissue Kit 40 (Qiagen) Isolierung plasmidärer DNA nach einem Standardprotokoll 41 (Boiling Miniprep) Isolierung plasmidärer DNA mit Plasmidisolierungskits Agarose-Gelelektrophorese DNA-Extraktion aus Agarosegelen Restriktion von Plasmid-DNA Amplifizierung von DNA mit der Polymerasekettenreaktion Standard-PCR-Protokoll Standard-PCR-Programm Klonierung von PCR-Produkten Klonierung mit dem TOPO TA Cloning Kit Klonierung in den pgem-t-vektor und Transformation 45 \ne. colixl-1 Blue-Zellen Automatisierte SequenzierungfluoreszenzmarkierterDNA Chemisch-Analytische Methoden Extraktion Extraktion mariner Bakterien Extraktion von Myxobakterien Chromatographische Methoden Dünnschichtchromatographie (DC) Vakuumflüssigchromatographie(VLC) Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) Strukturaufklärung Kernresonanzspektroskopie Massenspektrometrie (MS) 50
4 HPLC/MS-Analysen GC/MS-Analysen Optische Drehung Biologische Testverfahren Agardiffusionstestauf antimikrobielle Aktivität Tyrosin-Kinase-Test HTV-1-Reverse Transkriptase-Test Artemia salina- & Caenorhabditis elegans-test 54 auf zytotoxische Aktivität Krebszelllinientest auf zytotoxische Aktivität 55 4 Ergebnisse Nachweis der genetischen Information für spezifische Biosyntheseenzyme PCR-Studien zur Detektion von potentiellen/jfo-genfragmenten 57 (Typ I) in marinen Bakterien Analyse der PCR-Produkte Homologievergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenzen 60 der PCR-amplifizierten Fragmente PCR-Studien zur Detektion von potentiellenpks (Typ II)- und nrps- 62 Genfragmenten in marinen Bakterien 4.2 Biologische und chemische Untersuchungen mariner Bakterien Halomonas marina AO Chemische Untersuchung weiterer mariner Bakterienstämme Biologische und chemische Untersuchungen von Myxobakterien Untersuchung auf biologische Aktivität Untersuchung des Metabolitenprofils mittels HPLC/MS Chemische Untersuchung ausgewählter Myxobakterienstämme MyxolO Myxo Myxo52 und Ten Belgien
5 5 Diskussion Untersuchungen mariner Bakterienstämme Screening Biologisch-chemisches Screening PCR-Screening Chemie ausgewählter mariner Bakterien Halomonas marina AO Psychroserpens sp. OU4-4 und Sulfltobacter sp. SFLA Untersuchungen myxobakterieller Stämme Screening Biologisch-chemisches Screening HPLC/MS-Screening Chemie ausgewählter Myxobakterien Zusammenfassung Literaturverzeichnis Anhang Ergebnisse der biologischen Tests - Marine Bakterienstämme HPLC/MS-Daten und *H- und 13 C-NMR-Spek1ren der isolierten Verbindungen 168
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