Herausgegeben von Alfred Nordheim und Rolf Knippers

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1 Molekulare Genetik Herausgegeben von Alfred Nordheim und Rolf Knippers Mit Beiträgen von Alfred Nordheim, Rolf Knippers, Peter Dröge, Gunter Meister, Elmar Schiebel, Martin Vingron, Jörn Walter 10., vollständig überarbeitete und erweiterte Auflage 620 Abbildungen Georg Thieme Verlag Stuttgart New York

2 Inhaltsverzeichnis Teil 1 Grundlagen 1 Lebensformen: Zellen mit und ohne Kern Prokaryoten Eukaryoten Literatur 27 DNA: Träger der genetischen Information Bausteine: Nucleotide. DNA-Helices: Flexibilität Einige wichtige Methoden zur Unter suchung von DNA Der Sedimentationskoeffizient oder S-Wert Isopyknische oder Gleichgewichtszentrifugation Enzyme als Hilfsmittel: Deoxyribo Natürliche DNA-Moleküle 37 Endonucleasen, Exonucleasen 46 Restriktionsendonucleasen RNA: Überträger und Regulator der genetischen Information 51 Gunter Meister Zelluläre Funktionen von RNAs Aufbau und räumliche Faltung von RNA-Molekülen Literatur RNA-Klassen Proteine: Funktionsträger der Zelle Tertiärstruktur: komplexere Faltung der Aminosäurekette Primärstruktur: Sequenz der Amino säuren Proteindomänen Aminosäuren 57 Peptidbindung 58 Wechselwirkungen zwischen Amino säureseitenketten Quartärstruktur: Aufbau aus Unter einheiten Proteinfaltung Sekundärstruktur: a-helix und ß-Faltblatt Literatur a-helix 61 ß-Faltblatt 61

3 .. Transkription, Translation und der genetische Code Transkription: die Synthese von RNA RNA-Polymerase Genanfang: der Promotor... Ereignisse am Promotor Elongation der RNA-Kette... Termination Stabile und nicht stabile RNA Ribosomen: eine kurze Beschreibung Proteinsynthese: Genauigkeit des Starts Elongation: die programmierte Verknüp Geschwindigkeit und Genauigkeit der Besonderheiten der Translation bei Bakte Transfer-RNA (trna) und die Aktivie rung von Aminosäuren Struktur der trna.. Beladung der trna. Translation: Ribosomen und Protein synthese Wobble" bei der Erkennung von Codon Der genetische Code in der Zelle Selenocystein und Pyrrolysin Verwendung von Codewörtern Escherichia coli und der Bakteriophage Lambda: Gene und Genexpression Exkurs: Bakteriophagen Vermehrung von Bakterien Ausblick Die DNA als Nucleoid Nucleoidassoziierte Proteine IUI Organisation bakterieller DNA Das Genom Die biologische Genkarte und das F-Plasmid F'-Plasmide Konjugation und Genkartierung Grundlagen bakterieller Cenregulation Regulons: Gengruppen unter gemein samer Kontrolle III Beispiel: Hitzeschock-Gene 111 Alternative o-faktoren 113 Stringente Kontrolle 113 Negative und positive Genregulation: das /ae-operon als Bezugssystem 118 Die Genprodukte 118 Mutanten mit veränderter Genregulation 119 Das Jacob-Monod-Modell 120 Der Lac-Repressor 121 Positive Regulation: das CRP-Protein Der Bakteriophage Lambda und seine Gene Das Lambda-Genom Proteincodierende Gene Kontrollelemente Integration und Exzision Expression der Lambda-Gene Frühe Transkription Entscheidung zwischen Lyse und. Lysogenie. Der Cll-Aktivator Der Lambda-Repressor Transkription des /nt-gens Induktion und lytischer Infektionsweg... Wege der Lambda-Replikation Das Ende des lytischen Infektionswegs... Entstehung der Phagenpartikel Am Ende des lytischen Infektionswegs Literatur

4 DNA im Zellkern: Chromatin und Chromosomen. Elmar Schiebel Der Zellkern Modifikation von Histonen 151 Posttranslationale Modifikation von Histonen Veränderungen des Chromatins durch Histonmodifikationen Einige wichtige Nicht-Histonproteine Chromatinfasern Das Chromatin Chromosomen Chromosomen des Menschen Chromosomensätze Polytäne Chromosomen Teil 2 Molekulare Dynamik chromosomaler DNA 8 DNA-Replikation: Verdopplung der genetischen Information Peter Dröge Topologische Probleme während der Re 8.2 Molekulare Grundlagen der Replikation 163 plikation 181 Topoisomerasen 181 Typ-I-DNA-Topoisomerasen Erste Hinweise auf semikonservative Replikation Allgemeine Polymerisationsreaktion von Deoxynucleotiden Prokaryotische DNA-Polymerasen und wichtige replikative Hilfsproteine DNA-Polymerase I Typ-ll-DNA-Topoisomerasen 184 Topologische Probleme während der Initiation und der Elongation 185 Topologische Probleme während der Termination 187 Andere Probleme während der DNA- Replikation 187 DNA-Polymerase II DNA-Polymerase III A 169 Replikation des eukaryotischen Genoms 188 Primase DNA-Ligasen DNA-Helikasen Eukaryotische DNA-Polymerasen Drei Phasen der DNA-Replikation Replikationsstartpunkte 188 Aktivität von Replikationsstartpunkten 188 Replikation und Strukturen des Zellkerns 190 Nucleotidsequenzen von Replikationsstartpunk Replikation des bakteriellen Genoms. Die Initiation bakterieller DNA- Replikation Elongationsphase bakterieller DNA- Replikation Beendigung (Termination) der bakteriel len DNA-Replikation Regulation der Initiation bakterieller Replikation ten 190 Initiation eukaryotischer Replikation 190 Elongationsphase eukaryotischer Replika tion 192 Termination eukaryotischer Replikation Telomere 193 Telomerasen 194 Replikation im Chromatin 196 ichwer zu replizierende Genomabschnitte 197 Literatur 197 1

5 Segregation der Chromosomen: Zellzyklus, Mitose und Meiose Elmar Schiebel 199 Zellzyklus 199 Zellzyklusphasen 199 DieC,-Phase 201 DieS-Phase 201 DieG2-Phase 201 Die Mitose 202 Molekulares Verständnis des Zellzyklus Zellzyklusgene 204 G^S-Übergang 206 Lizenzierung der DNA-Replikation in dertelophase/g,-phase 207 Regulation der DNA-Replikation 207 Der Cohesinkomplex 207 Der Eintritt in die Mitose Kontrollpunkte des Zellzyklus Zusammenbau der mitotischen Spindel Der Übergang von Metaphase zur Anaphase... Der Spindelkontrollpunkt (spindle assembly Checkpoint, SAC) Cytokinese Defekte bei Chromosomentrennung und Cytokinese 9.3 Meiose Zellzyklusregulation der Meiose Meiose I Meiose 11 Literatur Der Condensinkomplex 208 Rekombination der DNA Peter Dröge Illegitime Rekombination. Homologe Rekombination Bewegliche genetische Elemente bei Bak terien Grundlagen der homologen Rekombinati on 221 Homologe Rekombination in prokaryotischen Zellen 222 Das RecA-Protein und der DNA-Strangaustausch 222 Das RecBCD-Enzym 225 Bewegliche Holliday-Strukturen und Genkonver sion 226 Homologe Rekombination in eukaryotischen Zellen 227 Meiotische Rekombination 228 Genkonversionen in Eukaryoten 229 Ortsspezifische Rekombination Grundlagen der ortsspezifischen Rekom 230 bination 230 Ortsspezifische Rekombination in prokaryotischen Zellen 230 Insertionssequenzen (IS-Elemente) Transposons Transponierbare Bakteriophagen Ablauf der Transposition Konsequenzen der Transposition: Veränderun gen im Genom Bewegliche genetische Elemente bei Euka ryoten Äc/Ds-Transpositionen in Pflanzen Tcl/mor/ner-Transpositionen P-Element Transpositionen im Drosophila-Genom Ortsspezifische Transpositionen in Immunzellen Retrotranspositionen Retroviren: ein Überblick Retroviren: Struktur und Vermehrung Retroviren: Integration Retrotransposons Literatur Mutationen, DNA-Schädigungen und DNA-Reparatur Peter Dröge Arten von Mutationen. Chromosomen-Mutationen Allgemeine Grundlagen 250 Punktmutationen

6 Insertionen und Deletionen Alkylierte DNA-Basen und Reparatur 267 Reversionen und Suppressionen 254 Alkylierung von Basen Mutationen in eukaryotischen Zellen 254 Reparatur der Basenalkylierung 267 Mutationen in Körper- und Keimzellen Oxidative Basenschäden und Reparatur Rezessive und dominante Mutationen Unförmige Anheftungen an DNA 271 Komplementationstests DNA-Schäden durch ultraviolettes Licht Häufigkeiten von Mutationen 256 und ihre Reparatur Spontan auftretende Mutationen Hot Spots spontaner Mutationen Photoreaktivierung Nucleotid-Exzisionsreparatur bei Bakterien Reparatur durch Rekombination bei Bakterien Entstehung und Vermeidung von Mutationen bei der DNA-Synthese Nucleotid-Exzisionsreparatur bei Eukaryoten... Überschreitungen ohne Fehler und mit Fehlern Falscheinbauten von Deoxyribonucleotiden Induktion und Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen Korrekturlesen Falscheinbau von Ribonucleotiden in die DNA-Schäden durch Strahlen 277 DNA DNA-Schäden durch gebremste Replika Mismatch-Reparatur Entstehung von Indels tionsgabeln Reparatur von Doppelstrangbrüchen Mutationen durch Schäden von 11.6 Zusammenfassung. 280 DNA-Basen Literatur AP-Stellen und Reparatur. 264 Transläsionssynthese 265 Basenexzisionsreparatur 265 Teil 3 Gene und Genprodukte 12 Struktur eukaryotischer Gene 285 Alfred Nordheim Pol-lll-transkribierte Gene Definition des Cenbegriffs '.1 Struktur von Pol-Ill-Genen Promotoren für die RNA-Polymerase III Pol-l-transkribierte Gene Exons und introns Struktur der Pol-l-transkribierten Gene: rrna-gene Promotoren für die RNA-Polymerase I Pol-ll-transkribierte Gene Struktur der proteincodierenden Pol-IItranskribierten Gene Promotoren für die RNA-Polymerase II Regulatorische Elemente der Pol-II-Gene: Enhancer, Silencer Proximale regulatorische Elemente Distale regulatorische Elemente Nicht-proteincodierende Pol-II-transkribierte Gene Exon-Intron-Struktur proteincodierender Gene am Beispiel von Globin-Genen Eigenschaften von Exons und Introns Vorkommen von Introns in eukaryoti schen Genen Bedeutung von Introns CpG-lnseln Pseudogene 12.9 Repetitive DNA-Elemente Literatur 303 1

7 13 Eukaryotische Transkription: Funktion und Regulation der RNA-Polymerasen.. Alfred Nordheim Allgemeine Prinzipien der eukaryotischen Transkription 305 RNA-Polymerasen Funktion der RNA-Polymerasen Struktur der RNA-Polymerasen Drei Phasen der Transkription Generelle und regulatorische Transkrip tionsfaktoren Das Transkriptionssystem der RNA-Polymerase I Generelle Transkriptionsfaktoren der Pol 1 Regulation der Pol-l-vermittelten Tran skription 313 Das Transkriptionssystem der RNA-Polymerase II Generelle Transkriptionsfaktoren der Pol II TFIID TFIIA und TFIIB 318 TFIIE und TFIIF 318 TFIIH 318 TFIIS Interaktion von Transkriptionsfaktoren während der unterschiedlichen Phasen der Transkription 320 Zusammenbau des Präinitiationskomplexes (PIC) Initiation der Transkription 320 Elongationsphase der Transkription 321 Terminierung der Transkription 323 Regulation der Pol-II-vermittelten Tran skription 323 Das Transkriptionssystem der RNA-Polymerase III 324 Zusammenbau des Präinitiationskom plexes 325 Regulation der Pol-III-vermittelten Transkription 326 Regulation eukaryotischer Transkrip tion durch die Struktur des Chromatins 326 Strukturmotive von DNA-bindenden Proteinen 328 Homöodomäne 328 Basische Helix-Loop-Helix-Domäne (bhlh-domäne) 329 Basische Leucin-Zipper-Domäne (bzip- Domäne) 330 Zinkfingermotiv 331 Schleifenmotiv 332 Das Transkriptom der eukaryotischen Zelle Literatur Signalgesteuerte Genregulation. Alfred Nordheim Prinzipien der intrazellulären Signal übertragung 336 MAPK-Signalkaskade: Genaktivierung innerhalb von Sekunden 337 camp-signalgebung: CREB als Effektor des sekundären Botenstoffs camp 339 Aktindynamik: Kommunikation zwi schen Cytoskelett und Genom durch MRTF/SRF TGFß-Signalgebung: SMADs als regula torische Transkriptionsfaktoren Wnt-Signalkaskade: ß-Catenin als Transkriptionsfaktor Sauerstoff: HIFals Sensor und Tran skriptionsfaktor Steroide: nucleäre Hormonrezeptoren regulieren die Genexpression Signalgebung durch Abbau von Proteinen im Proteasom Cytokinsignalgebung Literatur JAK/STAT-Signalkaskade Aktivierung von NF-i<B

8 Initiation 15 RIMA-Prozessierung 358 Alfred Nordheim Polyadenylierung am 3'-Ende mrna-editing Prozessierung von prä-rrna Koordination von Transkription und mrna-prozessierung Prozessierung von prä-mrima mrna-stabilität und Abbau 382 mrna-abbau durch destabilisierende Sequen Capping am 5'-Ende Spleißen 360 Grundlagen zum Spleißmechanismus 361 Komponenten des Spleißapparats: das Spleißosom, ein komplexer snrnp 363 Aufbau des Spleißosoms und Ablauf des Spleißens 364 Selbstspleißen 367 Alternatives Spleißen 371 zen 382 Qualitätskontrolle und Eliminierung geschädig ter mrna 383 Beispiele regulierter mrna-stabilität mrna-export aus dem Zellkern Prozessierung von prä-trna Literatur 388 trons-spleißen 374 Regulation des Spleißens Translation: Proteinsynthese in Eukaryoten. 390 Gunter Meister Das eukaryotische Ribosom Initiation der Translation in.. Eukaryoten Elongation, Termination und Ribosomen Ablauf der eukaryotischen Translation Regulation der eukaryotischen Translation. Gunter Meister Translation von sezernierten oder membranständigen Proteinen Regulation der eukaryotischen Translationsinitiation Komponenten 403 der Proteintranslokationsmaschinerie Regulation auf der Ebene der mrna Sequenz 398 Regulation von elf4e Regulation von eif2 400 Proteintranslokation 404 Nonsense-vermittelter mrna-abbau (NMD) IRES - ohne Cap-Struktur NMD-Komponenten 405 Identifizierung eines PTCs und der Mecha nismus des NMDs 405 NMD in der Hefe 406 Literatur 407 1

9 18 Regulatorische RNAs 409 Gunter Meister RNA-Interferenz (RIMAi) sirnas (short interfering RNAs) Mechanismen der RNA-Interferenz Cenregulation durch mikrornas MikroRNA-Gene Biogenese von mikrornas 412 Regulation der mirna-biogenese Funktion von mirnas Virale mirnas pirnas Das CRISPR-System: eine Verteidi gungslinie von Bakterien gegen Phagen Genomische Organisation eines CRISPR-Locus CRISPR-Aktivität und Phagenabwehr Lange, nicht-codierende RNAs (IncRNAs) IncRNA-Gene Dosiskompensation und IncRNAs Genomische Prägung {Imprinting) und IncRNAs HOTAIR und IncRNAs 419 Literatur Gene in Mitochondrien und Chloropl; DNA in Mitochondrien Mütterliche Vererbung mtdna des Menschen Expression mitochondrialer Gene Der genetische Code in Mitochondrien Replikation mitochondrialer DNA Mitochondriale Krankheiten Sequenzunterschiede mitochondrialer Genome Formen mitochondrialer DNA RNA-Editing in Mitochondrien 431 C-»U-Austausch in mitochondrialer RNA 431 en 422 Einfügen von Nucleotiden: RNA-Editing in Mito chondrien von Trypanosomen Evolution von Eukaryoten und Endosymbiosen DNA in Chloroplasten Allgemeine Merkmale der Chloroplasten- DNA Anordnung und Funktion der Gene auf derctdna Expression von Genen auf der ctdna 439 Literatur 440 Teil 4 Epigenetik 20 Epigenetische Mechanismen Jörn Walter Molekulare Grundlagen: Modifikation chromosomaler DNA und Proteine Histonmodifikationen und epigeneti sche Prozesse Histonmodifikationen als epigenetisches Gedächtnis Histonmodifikationen und Genomstruk tur Modelle der Vererbbarkeit von Histon modifikationen Epigenetische Steuerung der Entwicklung durch PRC-Komplexe Etablierung von ortsspezifischem Heterochromatin durch histonmodifizierende Enzyme 449

10 20.4 Regulatorische RNAs und epigeneti sche Prozesse 20.5 DNA-Methylierung Vorkommen und allgemeine Prinzipien Oxidierte Modifikationsformen von 5-Methylcytosin Auswirkung der DNA-Methylierung im Genom Welche Enzyme kontrollieren die DNA- Methylierung? Einfluss der DNA-Methylierung auf die genetische Information Methylierung der richtigen" DNA- Sequenzen RNA-abhängige DNA-Methylierung Epigenomforschung: ein Ausblick Literatur Epigenetische Kontrolle biologischer Prozesse Jörn Walter Epigenetische Kontrolle der X-chromosomalen Cendosis Cenomweite epigenetische Reprogrammierung und Entwicklungs 21.4 Cenomische Prägung. 467 prozesse in Säugetieren Genomische Prägung in der medizini Epigenetische Reprogrammierung im schen Genetik 470 frühen Embryo 460 Literatur Reprogrammierung in der Keimbahn 463 Teil5 Cenomik 22 Von der Genkarte zur Genomsequenz 475 Martin Vingron/Rolf Knippers Sequenzierung von Genomen Schrotschuss-Sequenzierung Hochdurchsatz-Sequenzierung Von der biologischen zur physikalischen Annotierung sequenzierter Genome Beispiele für Genomannotierungen Evolution von Genomen Funktionelle Genomik Martin Vingron Expressionsanalytik Funktionelle Analytik Transkriptomik 494 Chip-Technologie Tiling-Arrays Analyse der Genexpression durch RNA-Sequenzierung RNA-Analytik über quantitative RT-PCR 498 Computergestützte Analyse von Genexpres sionsdaten 498 Yeast two hybrid-system 499 Bestimmung der Bindungsstellen von Pro teinen im Chromatin 501 Systematischer Knock-down von Genen Literatur 504

11 24 Variabilität des Genoms Mikrosatelliten-Polymorphismen 24.2 Einzelnucleotid-Polymorphismen (SNPs) von Personen Mikrosatelliten in Genen: Trinucleotid folgen Retrotransposon-lnsertionspolymorphismen (RIPs) Teil 6 Schlüsseltechnologien 25 Bioinformatik Martin Vingron Sequenzierung und Genom-Assemblie rung Sequenzvergleich Cenvorhersage Dotplot und Alignment Datenbank-Recherche Hochdurchsatz-Sequenzierung und die Kartierung der Teilsequenzen Proteinstrukturvorhersage und Homo logiemodellierung Molekulare Evolution und phylogene tische Stammbäume 25.4 Information in Cenfamilien Literatur Regulatorische DNA-Elemente DNA-Analysen DNA-Sequenzierung Polymerasekettenreaktion (PCR) DNA-Sequenzierung nach der Ketten abbruch- oder Dideoxymethode 26.3 Gentechnik oder das Klonieren von Sequenziermethoden der nächsten DNA-Fragmenten 531 Generation Traditionelles Klonieren und Herstellung von Genombibliotheken cdna-klonieren PCR-Klonieren Expressionsanalytik durch RNA-Seq Literatur

12 27 Funktionelle Genomanalysen RNA-Interferenz: sirna/shrna-screens 543 Gunter Meister 27.4 Induzierte pluripotente Stammzellen (ips-zellen) 548 ]örn Walter 27.5 Proteomanalyse Knock-out-Technologie: homologe Rekombination im Genom der Maus.. Alfred Nordheim 545 Alfred Nordheim Literatur 550 Glossar einiger Begriffe aus der klassischen Genetik 552 Sachverzeichnis 554