Untersuchung der Proliferationshemmung von Brustkrebszellen durch Chloroquin in Kombination mit dem mtor-inhibitor Everolimus (RAD001).

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1 Aus der Klinik für Frauenheilkunde mit Poliklinik und Hebammenschule der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Direktor: Prof. Dr. M. W. Beckmann Untersuchung der Proliferationshemmung von Brustkrebszellen durch Chloroquin in Kombination mit dem mtor-inhibitor Everolimus (RAD001). Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg vorgelegt von Nicole Groh aus Zwickau

2 Gedruckt mit Erlaubnis der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Dekan: Referent: Korreferent: Prof. Dr. Dr. Jürgen Schüttler Prof. Dr. Peter A. Fasching Prof. Dr. Matthias W. Beckmann Tag der mündlichen Prüfung: 06. Juli 2011

3 Inhaltsverzeichnis 1 Zusammenfassung 1 2 Einleitung Brustkrebs Die p53- und IGF-1/PI3K/AKT/mTOR- Signaltransduktionswege mtor-inhibition durch RAD Das Quinolin Chloroquin Aufgabenstellung 11 3 Material und Methoden Zellkulturen Zellkulturmedium Medikamentöse Behandlung Cell Growth Assay Durchflusszytometrie (FACS Analysen) Fixierung der MCF-7 Brustkrebszellen Anfärbung mit Propidiumjodid Durchführung der Analyse Western Blot Protein Isolation aus den Zellkulturen Bradford Assay (Konzentrationsbestimmung der Zelllysate) Durchführung des Western Blot Materialien und Instrumentarien Chemikalien Puffer und Lösungen Enzyme Materialien und Instrumente Statistische Analyse 25 4 Ergebnisse Zellwachstumshemmung durch Chloroquin und RAD001 in MCF-7 Brustkrebszellen Verstärkter G1-Zellzyklusarrest durch Chloroquin und RAD001 26

4 4.3 Inhibition der mtor-kinase und dessen downstream Zielprotein S6K1 durch RAD001 und Chloroquin in MCF-7 Brustkrebszellen Reduktion der RAD001-induzierten AKT-Phosphorylierung und Aktivierung von p53 und p21 durch Chloroquin bei MCF-7 Brustkrebszellen Kein Zellzyklusarrest durch Chloroquin und RAD001 bei p53 mutierten MDA-MB-231 Brustkrebszellen 31 5 Diskussion 32 6 Literaturangaben 37 7 Abkürzungsverzeichnis 47 8 Danksagung 50

5 1 Zusammenfassung 1 1 Zusammenfassung Hintergrund und Ziele Brustkrebs ist die häufigste maligne Erkrankung bei Frauen in der westlichen Welt. Interaktionen zwischen den p53- und IGF-1/PI3K/AKT/mTOR- Signaltransduktionswegen scheinen eine wichtige Rolle in der Krebsentstehung zu spielen und moderne Forschungsansätze beschäftigen sich mit der Modifikation dieser Signaltransduktionswege. Everolimus (RAD001) ist ein Derivat des Rapamycin, ein Inhibitor der mtor- Kinase und wird bereits in Studien beim Mammakarzinom eingesetzt. Chloroquin ist ein p53-aktivator und Teil der viel versprechenden chemischen Familie der Quinoline, wie z.b. der pan-pi3k-inhibitor BEZ235. Eine Kombinationstherapie der beiden Substanzen Chloroquin und RAD001 stellt einen interessanten Ansatz in der Behandlung des Mammakarzinoms dar. Ziel dieser Arbeit war es daher, den Einfluss einer Kombinationsbehandlung aus Chloroquin und RAD001 auf das Zellwachstum von MCF-7 Brustkrebszellen zu untersuchen. Material und Methoden: Es wurden die Brustkrebszelllinien MCF-7 (luminal, p53 wt., ER pos.) und MDA- MB-231 (mesenchymal, p53 mut., ER neg.) verwendet. Die Zellen wurden mit Chloroquin (50 µm), RAD001 (20 nm) oder deren Kombination jeweils über einen Zeitraum von 8, 24 bzw. 72 Stunden behandelt und Zellproliferationsassays, Durchflusszytometrie (FACS) und Western Blots durchgeführt. Ergebnisse: In MCF-7 Brustkrebszellen führte die Kombinationsbehandlung mit Chloroquin und RAD001, im Vergleich zu den unbehandelten Zellen, zu einem reduzierten Zellwachstum und in den FACS-Analysen zeigte sich ein erhöhter G1- Zellzyklusarrest. In Western Blot Analysen konnte die Kombinationsbehandlung bei MCF-7 Brustkrebszellen zum einen eine Reduktion der RAD001-induzierten Phosphorylierung des Onkogens AKT an der Phosphorylierungsstelle Serin 473 und zum anderen eine verstärkte Phosphorylierung des Tumorsuppressors p53

6 1 Zusammenfassung 2 am Serin 15 hervorrufen. Darüber hinaus zeigte sich eine reduzierte Phosphorylierung der mtor-kinase und seines Zielproteins der proliferationsfördernden Kinase S6K1. Interessanterweise zeigte sich das Zellwachstum der p53-mutierten MDA-MB- 231 Brustkrebszellen nach Behandlung unbeeinflusst. Schlussfolgerungen: Moderne Therapieansätze modifizieren gezielt die p53- und IGF- 1/PI3K/AKT/mTOR-Signaltransduktionswege in Krebszellen. Chloroquin aktiviert den Tumorsuppressor p53 und stellt sich als viel versprechender Kombinationspartner des mtor-inhibitors RAD001 dar, da es die RAD001- induzierte AKT-Phosphorylierung abschwächt und somit diesen Resistenzmechanismus in Krebszellen aufzuheben scheint.

7 1 Zusammenfassung 3 Abstract Evaluation for additive suppression of breast cancer proliferation by Chloroquine in combination with the mtor-kinase Inhibitor RAD001. Introduction: Breast cancer remains the most prevalent cancer among women in the Western world, and multiple molecular pathways with impact on breast cancer progression have been identified in the last years. The p53- and PI3K/AKT/mTOR signalling cascades are two fundamental molecular pathways with modifications and interactions in tumor cells of many different cancer types including breast cancer. Therapeutical modifications of these pathways have been proven to exert anti-tumoral effects. The macrolide derivative of rapamycin RAD001 (everolimus) is an inhibitor of the serine-threonine kinase mtor, and has been developed as an antiproliferative drug with applications as an anticancer agent. The inhibition of mtor signalling by RAD001 leads to an increase of the oncogene AKT phosphorylation abrogating RAD001-induced antiproliferative effects and inducing resistance against RAD001 treatment. There is growing evidence that conflicting signals transduced by the oncogene AKT and the tumorsuppressor p53 are integrated via negative feedback between the two pathways. The anti-malarial Chloroquine (CQ) is a 4-alkylamino substituted quinoline and has been shown to up-regulate the tumor-suppressor p53 mediating breast cancer protective effects. In an attempt to improve RAD001 treatment and overcome RAD001-induced activation of the oncogene AKT, we focused our studies on the p53-activator Chloroquine with which we already had good scientific experience. Materials and Methods: We treated human MCF-7 (p53 wildtype, luminal) and MDA-MB-231 (p53 mutated, mesenchymal) breast cancer cells with Chloroquin (50 µm) and RAD001 (20 nm) for 8, 24 and 72 hours. Molecular and cell biological changes were analysed by Cell growth assays, flow cytometry and immunoblotting.

8 1 Zusammenfassung 4 Results: In MCF-7 breast cancer cells Chloroquine and RAD001 showed additive reduction of cell proliferation and induced increased G1 cell cycle arrest compared with the untreated cells. Chloroquine and RAD001 treatment showed inhibition of mtor and reduced activation of its downstream target gene S6K1 kinase. It further resulted in increased levels of the tumorsuppressors p53 and p21 and furthermore showed a reduction of RAD001-induced increase of AKT phosphorylation. Conclusion: Currently, there are few agents that have a proven ability to prevent and treat breast cancer and their mechanism of action remains often undetermined. Our data suggest that the p53-activator Chloroquine might exert at least parts of its anti-cancer effects through modifications of the PI3K/AKT/mTOR pathway. The Chloroquine effect of overcoming RAD001 resistance by reduction of the RAD001-induced activation of the oncogene AKT presents Chloroquine as an interesting combination partner for the mtor-inhibitor RAD001.

9 2 Einleitung 5 2 Einleitung 2.1 Brustkrebs Das Mammakarzinom ist die häufigste Tumorneuerkrankung bei Frauen, mit über Fällen pro Jahr in den Vereinigten Staaten [67]. In Deutschland liegt die Inzidenz bei ungefähr Neuerkrankungen pro Jahr [51]. Außerdem führt Brustkrebs auch zu den meisten durch Krebs verursachten Todesfällen, mit über Fällen jährlich weltweit. Eine von acht Frauen wird in ihrem Leben an Brustkrebs erkranken [67]. Die Inzidenz wird von Alter, Genen, Strahlungseinwirkung, Ernährung, Volkszugehörigkeit und Reproduktionsanamnese beeinflusst. 2.2 Die p53- und IGF-1/PI3K/AKT/mTOR- Signaltransduktionswege Drei große Signaltransduktionswege spielen in der Zelle eine kritische Rolle im Lesen und Integrieren von wichtigen zellulären Signalen: der p53- Signaltransduktionsweg, der IGF-1/AKT- Signaltransduktionsweg und der mtor- Signaltransduktionsweg. Eine Vielzahl von Studien weist darauf hin, dass diese eine zentrale Rolle bei der Krebsentstehung spielen könnten [95, 123] (Abbildung 1). Im Folgenden möchten wir auf diese Signalwege als p53- und IGF-1/PI3K/AKT/mTOR-Signaltransduktionswege verweisen. Der p53-signaltransduktionsweg ist in zahlreiche zelluläre Reaktionen involviert, welche durch verschiedenste Zellnoxen wie DNA-Schäden, Telomerverkürzung, Hypoxie, Hitze- oder Kälteschock, Entzündung oder Onkogenaktivierung durch Mutationen induziert werden [139]. Diese Zellnoxen bewirken zahlreiche zelluläre Reaktionen und haben unter anderem zur Folge, dass p53 durch posttranslationale Modifikationen aktiviert wird [8]. Verschiedene Effekte wie Zellzyklusarrest, Apoptose, Autophagie und Zellalterung werden daraufhin in der Zelle angeregt [85, 76, 84, 106, 59, 134]. Der IGF-1/PI3K/AKT/mTOR-Signaltransduktionsweg ist dagegen für das Zellüberleben essentiell. Wenn der Wachstumsfaktor IGF-1 (insulin-like growth factor 1) an seinen zellmembranständigen Rezeptor IGF-1R bindet, löst dies

10 2 Einleitung 6 durch einen Konzentrationsanstieg von lipidartigen Signalmolekülen eine Signalkaskade aus. Über die Phosphatidylinositol 3-Kinase (PI3K) erfolgt unter anderem eine Aktivierung von Proteinkinasen. Dazu gehört z.b. AKT (auch bekannt als Proteinkinase B), welches erst durch Phosphorylierung von Threonin 308 und Serin 473 vollständig aktiviert wird [22] (Abbildung 1). AKT wird als zentrale Schaltstelle in diesem Netzwerk betrachtet [39]. Über verschiedene Effektoren, wie z.b. TSC 1/2 (tuberous sclerosis complex 1/2), GSK3 (Glykogen-Synthase-Kinase 3) oder FOXO (Forkhead-Box- Transkriptionsfaktoren) werden unzählige intrazelluläre Operationen von AKT ausgeführt [26]. Über die Hemmung des TSC 1/2 Komplexes kann AKT mtor aktivieren [45, 65]. Gleichzeitig konnte nachgewiesen werden, dass eine AKT- Aktivierung zu einer Senkung des p53-spiegels führt und umgekehrt [48, 102]. Heute wird versucht, durch gezielte Hemmung von AKT das Wachstum maligner Zellen zu verhindern [132]. Das direkte Downstream-Protein von mtor, S6K1, eine Serin-/Threonin- Kinase, spielt ebenfalls eine entscheidende Rolle bei der Vermittlung der Zellzykluskontrolle, des Zellwachstums und des Zellüberlebens [53, 72, 83]. Das kodierende Gen weist in 10-30% aller Brustkrebszelllinien und primären Mammakarzinome Mutationen auf [31, 16]. Eine Überexpression des Gens für S6K1 kann in 10% der primären Mammakarzinome und erhöhte RNA-Level in fast 40% der Tumoren gefunden werden [152, 15]. Diese Überexpression könnte von prognostischer Bedeutung für das Mammakarzinom sein [15]. Verschiedenste Experimente haben gezeigt, dass es eine ausgeprägte Kommunikation und Koordination zwischen all diesen Signalwegen gibt. P53, PTEN, IGF-1, TSC2, PI3K, AKT, MDM2, AMP-Kinase und mtor sind die Vermittler in diesem Signalnetzwerk. Da deren Gene zu denjenigen Tumorsuppressor- bzw. Onkogenen gehören, die am häufigsten in neoplastischen Zellen verändert sind, kommt ihnen eine überaus große Bedeutung zu [42, 69] (Abbildung 1). Eine klinische Relevanz bei der Brustkrebsentstehung konnte dem IGF- 1/PI3K/AKT/mTOR-Signaltransduktionsweg zugeschrieben werden [44]. Es

11 2 Einleitung 7 wurde unter anderem ein Zusammenhang zwischen Mutationen im PI3KCA mit funktionellem PTEN-Verlust und einer schlechteren Prognose von Brustkrebspatienten festgestellt [19]. IGF1 IGFBP3 IGF1-R IGF2 ATM P PI3K ATM p53 P Ser 15 PIP3 PTEN p53 P Ser 15 P Ser 2448 mtor TSC 1/2 AKT P Ser 473 MDM2 p70s6k P Thr 389 P Thr 421/ Ser 424 Apoptose p21 Zellzyklus Zellzyklus Abbildung 1: Zelluläre Signalkaskaden (modifiziert nach Levine et. al [85]) 2.3 mtor-inhibition durch RAD001 Das Signalprotein mtor (mammalian target of rapamycin) ist in ein zelluläres Netzwerk eingebaut, dass das Zellwachstum begünstigt. Es ist eine der zentralen zellulären Kontrollstellen von Tumorwachstum und Angiogenese. Der IGF-1/PI3K/AKT/mTOR-Signaltransduktionsweg reagiert auf unterschiedliche Signale wie Hormonstimulation, Stresssignale, DNA-Schäden sowie energiereiche Verbindungen und Sauerstoff [25, 34]. mtor gehört zusammen mit dem ataxia telangiectasia mutated protein (ATM), dem RAD3-ähnlichem Protein (ATR) und der DNA-abhängigen Proteinkinase (DNA-PK) zur Familie der Phosphatidylinositol-3OH Kinase (PI3K) ähnlichen Proteinkinasen, die an der Zellantwort auf DNA-Schäden beteiligt sind [70, 71]. mtor ist ein zentraler metabolischer Sensor der das Zellwachstum reguliert, indem es die mrna- Übersetzung, die Ribosomenbiogenese, die Zelldifferenzierung und den Metabolismus steuert [49, 114, 153]. mtor ist ubiquitär und bildet zwei unterschiedliche Komplexe in der Zelle, zum einen den mtor-raptorkomplex

12 2 Einleitung 8 (auch genannt mtorc1), der den eigentlichen Rapamycin empfindlichen Teil darstellt, und den Rictorkomplex (mtorc2) [66, 54, 4, 35, 49, 88]. Neben dem Erkennen von Wachstumssignalen über IGF-1/PI3K/AKT/mTOR ist der Raptorkomplex auch in der Lage, auf Nährstoffgehalt im Medium zu reagieren [72]. Der Rictorkomplex ist hauptsächlich an der Organisation des Zytoskeletts beteiligt [113, 115, 61]. Der Raptorkomplex könnte sich als bedeutender Angriffspunkt für eine medikamentöse Hemmung des Zellwachstums erweisen. Die Hemmung von mtor durch Rapamycin und seine Analoga (z.b. RAD001) ist eine viel versprechende Strategie in der Krebsbehandlung [137, 101]. Eine Hemmung von mtor blockiert die Wirkung seiner downstream-proteine, wozu unter anderem das eif-4e-binding-protein und die S6K1 Kinase (S6K1) gehören [58]. Beide spielen eine Rolle bei der Translationsregulation von mrnas, die für Proteine kodieren, welche für das Fortschreiten der G1-Phase bis zur S-Phase mitverantwortlich sind. Das Ausmaß der Hemmung von S6K1 kann auch als Marker für die Arzneimittelwirksamkeit von Substanzen, wie unter anderem RAD001, betrachtet werden [117]. DNA-schädigende Wirkstoffe wie Etoposid, Cisplatin oder Mitomycin A inaktivieren den IGF-1/PI3K/AKT/mTOR-Signaltransduktionsweg, was an der Dephosphorylierung von S6K1 und 4E-BP1 zu erkennen ist [129]. Ionisierende Strahlung dagegen führte bei Fibroblasten der Brustdrüse und embryonalen Fibroblasten zu einer mtor Aktivierung [127]. Die S6K1 Aktivität wird durch multiple Phosphorylierungsvorgänge kontrolliert. Dabei stellt die Phosphorylierung von Threonin 229 und Threonin 389 den kritischen Punkt für die Kinasefunktion dar. Die Phosphorylierungsstellen Serin 411, Threonin 421 und Serin 424 liegen innerhalb eines Serin-Prolin reichen Bereiches in der Pseudosubstratregion [107, 130, 126, 108]. Der bekannteste mtor-inhibitor ist das 1975 entdeckte Rapamycin (Sirolimus, Rapamune ), ein aus Streptomyceten gewonnenes Makrolidantibiotikum [118, 136]. Es wird heute als Immunsuppressivum u.a. nach Nierentransplantationen eingesetzt. Da es durch die mtor-inhibition antiproliferative Eigenschaften in vielen Zellen besitzt, wurde es schnell für die Krebsforschung interessant und

13 2 Einleitung 9 es gelang der Nachweis des antiproliferativen Effekts bei verschiedenen Malignomen, u.a. auch bei Brustkrebs [86]. Ein Derivat von Rapamycin ist das halbsynthetische, für die orale Einnahme bestimmte RAD001 (Everolimus, Afinitor ), dessen antiproliferativer und antineoplastischer Effekt momentan in vielen Studien erforscht wird. Auf zellulärer und molekularer Ebene wirkt es sowohl immunsuppressiv als auch antiproliferativ [18]. Es greift in die interleukin- und wachstumsfaktorenabhängige Zellproliferation ein, indem es mit hoher Affinität an ein intrazelluläres Rezeptorprotein, das Immunophilin FKBP-12, bindet [23, 32]. Der daraus resultierende RAD001/FKBP-12 Komplex bindet an mtor und verursacht dabei eine Hemmung der Signalkaskade [1]. Tiermodelle zeigten, dass RAD001 oral appliziert gut toleriert wird und ein potenter Hemmer des Tumorwachstum ist [20]. Neueste Daten weisen darauf hin, dass RAD001 als Kombinationspartner zum Aromataseinhibitor Letrozol in östrogenpositiven Mammakarzinomen, bei neoadjuvantem Therapieversuch, dessen Wirkung verstärkt [17]. Als Afinitor wurde RAD001 (Everolimus) im August 2009 zur Behandlung des metastasierten Nierenzellkarzinoms zugelassen, da bewiesen werden konnte, dass es das progressionsfreie Überleben verlängert sowie das Tumorprogressionsrisiko senkt [96]. Bei dieser Tumorentität hat sich bereits ein breiter, routinemäßiger Einsatz etabliert. Allerdings wurde auch festgestellt, dass die mtor-inhibition durch Rapamycin oder seine Derivate (RAD001) eine IGF-1R abhängige Aktivierung von AKT, vor allem durch Phosphorylierung an Serin 473, im Sinne einer negativen Rückkopplung zur Folge haben kann [141]. Dies wiederum kann bei der Brustkrebsbehandlung mit Tamoxifen und/oder Goserelin ein schlechteres Ansprechen auf die antiendokrine Therapie verursachen [104, 125]. Ein interessanter Ansatz wäre, nicht nur mtor, sondern auch AKT zu inhibieren, um das Wachstum von Brustkrebszellen zu unterbinden und diese solange wie möglich sensibel für eine mtor Inhibitor- und Antihormontherapie zu machen. Aktuelle Studien weisen zusätzlich darauf hin, dass RAD001 auch die Osteoklastenaktivität senkt, was ein viel versprechender Ansatz bei

14 2 Einleitung 10 Knochenmetastasen oder zur Vermeidung von Aromatasehemmer-induzierter Osteoporose wäre [75]. 2.4 Das Quinolin Chloroquin Das synthetische Alkaloid Chloroquin (CQ) ist ein Quinolin-Derivat mit Substitution an C4 und einem an der Position 7 seines Ringes substituiertes Chlor (Abbildung 2). Abbildung 2: Strukturformel von Chloroquin Chloroquin wird neben der Malariaprävention [135, 146, 103] in der Therapie der rheumatischen Arthritis [131, 10, 11] sowie des systemischen Lupus erythematodes eingesetzt [81, 93, 151, 150]. Bei längerer Anwendung treten insgesamt wenige Nebenwirkungen auf, retinale Probleme können allerdings beobachtet werden [112]. Bekannte zelluläre Effekte von Chloroquin beinhalten die Modulation der lysosomalen Aktivität [5, 41, 147, 91] und es verursacht nichtkovalente Bindungen in der DNA [94]. Dies kann ein möglicher Angriff auf die Struktur der DNA sein, welcher die DNA-Polymerase und andere DNA-Bindungsproteine in ihrer Funktion hindert [149, 33, 40, 52]. Es ist bekannt, dass Chloroquin in der Lage ist ohne die Induktion von DNA Brüchen chromosomale Strukturen zu modifizieren. Der Mechanismus dieser Modifikationen ist dabei nur teilweise verstanden [78, 79, 80]. Erste Hinweise, dass Chloroquin nicht nur zur Behandlung von Malaria und rheumatischen Erkrankungen, sondern auch in der Krebsbehandlung verwendet werden kann, zeigte eine neue Studie, in der die Gabe von Chloroquin die Lymphomgenese in einem Mausmodel signifikant reduzierte [89]. Loehberg et al. konnten im Rattenmodell zeigen, dass Chloroquin die N-

15 2 Einleitung 11 methyl-n-nitrosourea (NMU)- induzierte Brustkrebsentstehung reduzieren konnte [87]. In einem BALB/c p53-null Brustepithel-Mausmodell zeigte sich dieser brustkrebsprotektive Effekt nicht, was eine p53 Abhängigkeit vermuten ließ [87]. Tatsächlich wurde beobachtet, dass Chloroquin die schützenden Effekte von E/P in Tieren imitieren konnte und eine Aktivierung von p53 in Brustepithelzellen verursachte [87] Darüber hinaus ist es von Bedeutung, dass die Mitglieder der Familie der Quinoline, wie das Chloroquin, den Zellzyklusarrest, die Apoptose und Differenzierung von Brustkrebszelllinien induzieren können [142, 156, 155, 92]. Im Zusammenhang mit unseren Studien ist es wichtig, dass Chloroquin das ATM-Protein über Autophosphorylierung an Serin 1981 aktivieren kann. ATM spricht auf DNA-Schäden und Chromatinmodifikationen an und kann zur Phosphorylierung von p53 an Serin 15 in Fibroblasten führen [13, 74]. Interessant ist daher, dass Loehberg et. al [87] auch in den humanen nichttumorösen MCF10A- Brustepithelzellen eine erhöhte Aktivierung des ATM- Proteins und eine verstärkte Phosphorylierung von p53 an Serin 15 durch Chloroquin zeigen konnte. Die Aktivierung des Tumorsuppressors ATM und des p53 durch Chloroquin kann daher von entscheidender Bedeutung sein, da ein Mangel an ATM und p53 die Anfälligkeit für Krebs erhöhen [14, 133, 110, 46, 28, 77, 105]. 2.5 Aufgabenstellung Bisherige in vitro Untersuchungen zeigten, dass sowohl RAD001 als auch Chloroquin viel versprechende potentielle Therapeutika des Brustkrebses darstellen [155, 62, 154, 20, 116, 124]. Diese Erkenntnisse lassen vermuten, dass es wirkungsvolle additive Effekte durch eine Kombinationsbehandlung mit RAD001 und Chloroquin in der Bekämpfung des Mammakarzinoms geben könnte und es daher sinnvoll ist, die Kombination beider Substanzen in einem Brustkrebszellmodell zu untersuchen. Erstes Ziel war es, den Einfluss von RAD001 sowie von Chloroquin auf die Zellproliferation von MCF-7 Brustkrebszellen zu untersuchen. Inwieweit kann eine Behandlung mit Chloroquin, RAD001, sowie deren Kombination einen

16 2 Einleitung 12 hemmenden Effekt auf das Wachstum dieser Zellen ausüben? Haben Chloroquin und RAD001 einen additiven Effekt? Zweites Ziel war es, die Effekte einer Kombinationsbehandlung mit RAD001 und Chloroquin auf den Zellzyklus der MCF-7 Brustkrebszellen mittels Durchflusszytometrie (FACS) genauer zu analysieren. Kann ein Zellzyklusarrest der MCF-7 Brustkrebszellen erreicht werden? Drittes Ziel war es, auf molekularer Ebene die zellulären Effekte von RAD001 und Chloroquin mit Hilfe von Immunoblot-Assays genauer zu charakterisieren. Können dadurch bedingte mögliche Modifikationen im p53- und IGF- 1/PI3K/AKT/mTOR- Weg aufgezeigt werden? Neben der luminalen MCF-7 Brustkrebszelllinie wurde auch die mesenchymale p53-mutierte MDA-MB-231 Brustkrebszelllinie im Hinblick auf die Effekte einer Kombinationsbehandlung mit RAD001 und Chloroquin und eine mögliche p53- Abhängigkeit untersucht.

17 3 Material und Methoden 13 3 Material und Methoden Im Folgenden werden die Durchführungen der angewendeten Methoden, wie u. a. Zellproliferationsassay, Durchflusszytometrie (FACS) und Western Blot beschrieben und die verwendeten Materialien aufgeführt und erläutert. 3.1 Zellkulturen Die MCF-7 Brustkrebszelllinie (ER positiv, p53 Wildtyp, luminal) leitet sich von einem humanen duktalen Adenokarzinom der Brust ab. Diese wurde 1970 aus einem malignen Pleuraerguss einer 69 jährigen Kaukasierin isoliert [121]. Die MDA-MB-231 Brustkrebszelllinie (ER negativ, p53 mutiert, mesenchymal) wurden aus einem metastasierenden Mammaadenokarzinom einer 51 jährigen kaukasischen Frau gewonnen [111]. Alle Zelllinien wurden von der American Type Culture Collection (ATCC, via LGC Promochem, Wesel, Deutschland) bezogen. 3.2 Zellkulturmedium Das Zellmedium, in welchem die Zelllinien wuchsen, bestand aus 10 % igem FCS, 1x Penicillin/Streptomycin, L-Glutamine (2 mm), 1x HEPES und 1x NEAA (Tabelle 1). Das Zellwachstum fand bei 37 C und in einer 5 % CO 2 Atmosphäre statt, dabei wurden die Zellen regelmäßig gemäß Standardprotokollen passagiert. Zellkulturen FCS L-Glutamin Ins/T P/S Hepes NEAA Medium 10 % FCS Medium ges. Volumen 20 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 170 ml 200 ml Tabelle 1: Zellkulturmedium

18 3 Material und Methoden Medikamentöse Behandlung Die Behandlung der Zellen erfolgte mit Chloroquin (50 µm), RAD001 (20 nm) oder deren Kombination jeweils über einen Zeitraum von 8, 24 bzw. 72 Stunden. Es wurde jedes Experiment dreimal durchgeführt. Die Konzentrationen des RAD001 entsprechen vorpublizierten Daten [23] und den Pilotexperimenten (cell growth assays) in der Dosisfindungsphase. Dies gilt auch für die angewandte Chloroquinkonzentration. Sie entspricht ebenfalls vorpublizierten Daten [87] und eigenen Erfahrungen. Für die Immunoblotassays wurden die Zellen vorher über 24 h in einem Medium mit reduziertem Serum (5 % charcoal stripped- FCS) inkubiert. Die Vorratslösung von Chloroquin enthielt 0,25 M Chloroquin in Wasser. Die endgültige Konzentration des Mediums lag beim Versuch bei 50 µm Chloroquin im DMEM-Medium. Zusätzlich wurden noch 5 % CS-FCS hinzugefügt. Bei RAD001 betrug die Konzentration der Vorratslösung 10mM RAD001 in 100% Ethanol. Hier lag die endgültige Konzentration des Mediums beim Versuch bei 20 nm RAD001 in DMEM- Medium + 5 % CS-FCS. Die Zellen wurden dazu in 100-mm Zellkulturplatten mit dem dazugehörigen Medium platziert. Die Zellen inkubierten entweder 8, 24 oder 72 Stunden nach der Behandlung mit RAD001 (20 nm) bzw. Chloroquin (50 µm), oder deren Kombination im Zellinkubator bei 37 C. 3.4 Cell Growth Assay Das Auszählen der Zellen erfolgte mit der Neubauer-Zählkammer nach Standardprotokollen. Dazu gab man 10 µl von den jeweiligen Zellen auf beiden Seiten zwischen die Kammer und dem darauf liegendem Glasplättchen. Als Nächstes wurden die Zellen unter dem Mikroskop gezählt, die Gesamtanzahl aus den fünf Feldern ermittelt und der dazugehörige Mittelwert gebildet. Dieser Wert wurde weiter durch 0,1 geteilt, da die Kammertiefe 0,1 mm beträgt. Der sich darauf hin ergebende Wert wurde dann noch auf Zellen/ml umgerechnet und zum Schluss auf das gesamte Volumen an Zellmedium angewandt, so dass man die genaue Anzahl der vorhandenen Zellen im Zellmedium erhielt.

19 3 Material und Methoden Durchflusszytometrie (FACS Analysen) Dieses Verfahren dient der quantitativen Bestimmung von intrazellulären Proteinen und Oberflächenmolekülen von Zellen Fixierung der MCF-7 Brustkrebszellen Die Zellverbände der wie oben behandelten MCF-7 Brustkrebszellen sowie deren Verbindungen zur Zellkulturschale wurden mit 0,0625 % Trypsin aufgelöst, nachfolgend mit 1x PBS gewaschen, in eisgekühltem 70 % Ethanol fixiert und anschließend bei -20 C gelagert Anfärbung mit Propidiumjodid Vor der Analyse wurden die Zellen zweimal mit 1x PBS gewaschen und in 1ml 1x PBS resuspendiert. Anschließend wurden die Zellen mit RNase A behandelt: 50 µl RNase A (vorrätige Konzentration 10 mg/ml, Promega) wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,5 mg/ml hinzugefügt und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Zum Schluss wurde zu jedem Röhrchen 40 µl einer Propidiumjodid-Lösung bis zu einer Endkonzentration von 50 µg/ml hinzugefügt Durchführung der Analyse Die Analyse wurde gemäß Standardprotokollen mit einem FACScalibur flow cytometer durchgeführt. Die Extinktion von Propidiumjodid liegt bei nm, die Emission bei 630 nm. 3.6 Western Blot Protein Isolation aus den Zellkulturen Alle Schritte, die nachfolgend beschrieben werden, wurden bei 4 C durchgeführt. Zuerst wurde das Medium von den Zellkulturen abpipettiert, danach wurden diese zweimal mit 1x PBS gewaschen und 150 µl CER1 (mit Proteinaseinhibitoren) zugegeben. Als Nächstes wurden die Zellen von den 100-mm Zellkulturplatten abgekratzt, das Zelllysat abpipettiert und

20 3 Material und Methoden 16 anschließend in einen Eppendorftube überführt. Dann inkubierten die Zellen nochmals in CER1 für ca. 10 min auf Eis. Nun gab man in jeden Eppendorftube CER2 (Verhältnis Tabelle 2) hinzu und zentrifugierte alles bei 13,200 g und 4 C 5 min ab. Anschließend wurde der Überstand in separate Eppendorftubes pipettiert und bei -80 C gelagert. Zu den verbliebenen Pellets wurde dann NER hinzugegeben (Verhältnis Tabelle 2) und alles 1 bis 2 h auf Eis belassen, wobei die Eppendorftubes alle 10 min gevortext wurden. Zum Schluss wurde alles noch einmal 5 min bei 13,200 g und 4 C zentrifugiert. Der nun entstandene Überstand wurde wiederum abpipettiert und in beschriftete Eppendorftubes überführt, die ebenfalls bei -80 C gelagert wurden. Das verbliebene Pellet wurde verworfen. Komponenten des Zelllysatpuffer im CER1* CER2* NER* NaF NaVO 4 PMSF PI (1000x) Verhältnis 150 µl/ 10cm-Platte 5,5 µl/100 µl CER1 75 µl/ Pellet 10 µl/ 1 ml Puffer 10 µl/ 1 ml Puffer 10 µl/ 1 ml Puffer 1 µl/ 1 ml Puffer Tabelle 2: Puffer für Proteinlysate (*NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents von Fa. Pierce) Bradford Assay (Konzentrationsbestimmung der Zelllysate) Um die Konzentration der Zelllysate zu bestimmen wurde der Bradford Assay verwendet. Dieser ist eine der gebräuchlichsten kalorimetrischen Methoden zur Konzentrationsbestimmung von Proteinen. Der Test beruht auf einer Bindung des Farbstoffes Coomassie Brilliant Blue G-250 an Proteine in saurer Lösung, durch die Bindung wird das Absorptionsmaximum des Farbstoffes von 465 auf 595 nm verschoben. Anhand von Eichkurven lassen sich so Proteinkonzentrationen von wenigen mg in Flüssigkeiten bestimmen. Die

21 3 Material und Methoden 17 Farbreaktion ist abhängig vom Gehalt an aromatischen und an basischen Aminosäuren (z.b. Arginin) [24, 82]. Als Erstes wurden BSA (Bovines Serum Albumin) Standards mittels einer Verdünnungsreihe hergestellt (Tabelle 3). Als Grundstock diente dazu 10 mg/ml BSA. Im nächsten Schritt wurden jeweils 50 µl von jedem BSA Standard in einen separaten Eppendorftube pipettiert. Von jedem der Zelllysate (unbehandelt, CQ, RAD001, RAD001+CQ) wurden jeweils 2 µl in einen separaten Eppendorftube überführt und zusätzlich mit 48 µl ddh 2 O verdünnt. Als Letztes wurde sowohl zu den Lysaten, als auch zu den Standards noch 1500 µl Bradford Assay Reagenz hinzugegeben. Nach 5-45 min Ruhezeit bei Raumtemperatur konnte die Messung am Photometer bei 595 nm durchgeführt und die Konzentration der Lysate mit Hilfe der BSA Standardkurve ermittelt werden. Standard Verdünnung Verhältnis 2 mg/ml 400 µl 1:2 BSA(10 mg/ml)+1,6 ml H mg/ml 500 µl BSA 2 mg/ml 1: µl H 2 0 0,5 mg/ml 500 µl BSA 1 mg/ml 1: µl H 2 0 0,25 mg/ml 500 µl BSA 0,5 mg/ml 1: µl H 2 0 0,125 mg/ml 500 µl BSA 0,25 mg/ml 1: µl H 2 0 0,0625 mg/ml 500 µl BSA 0,125 mg/ml 1: µl H 2 0 Tabelle 3: BSA Standardherstellung Durchführung des Western Blot Der Western Blot ermöglicht eine Identifizierung und Quantifizierung spezifischer Proteine innerhalb eines Proteingemisches. Gewöhnlich erfolgt der

22 3 Material und Methoden 18 Nachweis mit Hilfe von Antikörpern, die spezifisch an antigene Epitope des Zielproteins, welches sich auf der Nitrozellulosemembran befindet, binden. Als Vorbereitung wurde der Ladepuffer hergestellt. Dazu wurde der Laemmli Sample Puffer von BioRAD im Verhältnis 200:1 mit β-mercaptoethanol gemischt und dieser 1:1 zu den Proteinproben hinzugefügt. Dabei wurde beachtet, dass immer 40 µg Protein pro Geltasche geladen wurde. Das Protein- Ladepuffergemisch wurde zunächst 5-10 min. bei 100 C erhitzt und danach in die jeweiligen Taschen des 10 % SDS-Gels überführt (Zusammensetzung Tabelle 4). Das Gel lief zuerst ca. 15 min bei 50 V und danach ca. eineinhalb Stunden bei 100 V, um die Proteine nach ihrer molekularen Masse zu trennen. Fließgel 7,5 % 10 % Aufschichtgel 6,0 % AA/Bis-AA AA/Bis-AA 500 1,5 M Tris- EDTA, ph 8, ,5 M Tris-EDTA, ph 6,8 SDS 10 % SDS 10 % dd Wasser dd Wasser 1350 APS 10 % 7 7 APS 10 % 40 TEMED 3 3 TEMED 8 Tabelle 4: Zusammensetzung des polyacrylamiden Fließ- und Aufschichtgels. Die Zahlen beziehen sich auf das Volumen (µl). AA = Acrylamide/Bisacrylamide, APS = Ammoniumpersulfat Im zweiten Schritt wurden die Proteine auf eine Nitrozellulosemembran bei 100 V für 2 h bzw. 30 V über Nacht transferiert. Dazu wurde der TGS- Transferpuffer verwendet. Die Membranen wurden eine Stunde bei Raumtemperatur mit 1x Blocking-Puffer () geblockt und anschließend die Immunoblotanalyse mit einem Gemisch aus Antikörper und 1x Blocking-Puffer durchgeführt (Tabelle 5). Die Membranen wurden mit der Antikörperlösung bei 4 C über Nacht bzw. zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Hinterher wurden sie jeweils dreimal 5 min mit 1x PBST gewaschen, bevor sie wiederum bei 4 C über Nacht bzw. zwei Stunden bei Raumtemperatur mit dem Sekundärantikörper (Mischungsverhältnis Tabelle 6) inkubiert wurden. Im Anschluss wurden die Membranen erneut gewaschen. Dies geschah zweimal 5 min mit 1x PBST und ein letztes Mal mit 1x PBS. Die Visualisierung erfolgte mit ECL Reagent (GE Healthcare) oder FEMTOGLOW

23 3 Material und Methoden 19 HRP Substrate (PJK GmbH, Kleinbittersdorf, Deutschland), sowie Kodak BioMax MS Filmen entsprechend der Herstellerangaben. Zur Quantifizierung der Banden benutzten wir Image J Bearbeitungs- und Auswertungssoftware V1.39S (NIH) ( Die Ergebnisse wurden danach in Bezug zu β-actin normalisiert. Antikörper Art Typ Firma Verdünnung phospho- p53 Hase monoklonal Cell-Signaling, 1:750 (Ser 15) Boston, MA p53 Antikörper Hase monoklonal Cell-Signaling 1:750 phospho- mtor Hase monoklonal Cell-Signaling 1:750 (Ser 2448) mtor Antikörper Hase monoklonal Cell-Signaling 1:750 phospho- AKT Hase monoklonal Cell-Signaling 1:750 (Ser 473) AKT Antikörper Hase monoklonal Cell-Signaling 1:750 phospho - S6K1 Hase monoklonal Cell-Signaling 1:750 (Thr 389/Thr 421/ Ser 424) S6K1 Antikörper Hase monoklonal Cell-Signaling 1:750 β-actin Maus monoklonal 1:1000 β-actin Hase monoklonal Cell-Signaling 1:1000 Tabelle 5: Antikörper Antikörper Art Typ Firma Verhältnis Goat-antirabbit Ziege monoklonal Cell 1:1000 HRP Signalling Goat-antimouse Ziege monoklonal 1:1000 HRP Tabelle 6: Sekundärantikörper und ihre Eigenschaften

24 3 Material und Methoden Materialien und Instrumentarien In Tabelle 1-4 sind die in den durchgeführten Versuchen verwendeten Materialien und Instrumentarien aufgelistet Chemikalien Name β-mercaptoethanol Acrylamide 30 % (AA) Ammoniumpersulfate (APS) Bisacrylamide Blocking Buffer 10x Bradford Reagent Bromophenol Blue Charcoal-treated serum (CTS) Chloroform Chloroquin Dulbecco s Modified Eagle s medium (DMEM) Dulbecco s Phosphate Buffered Saline 10x EDTA Ethanol Fetal Calf Serum (FCS) Glycerol Glycine HEPES (2-(4-(2-Hydroxyethyl) -1-piperazinyl)-ethansulfonsäure) Insuline Isopropanol L-Glutamine Methanol Firma, Munich, Germany Bio-RAD, Hercules,USA Sigma -Aldrich Gibco, Karlsruhe,Germany Tabelle 7: Chemikalien

25 3 Material und Methoden 21 Name Non-essential amino acids (NEAA) NE-PER (nuclear and cytoplasmatic Extraction Reagents) PBS10x (Phosphate Buffered Saline) Penicillin / Streptomycin PI Cocktail PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid) Protein Marker V RAD mm in Ethanol 100 % Rainbow Marker Reprobe Western Blot Stripping Buffer Sodium Chloride Sodium fluoride A.C.S. reagent Sodium hydroxide Sodium orthovanadate Sodium-dodecyl-sulfate (SDS) SDS Loading Buffer TEMED (N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine) TGS 10x (Tris/Glycine/SDS Buffer) Transferin Trizma Base Tween 20 Western Blotting Detection Firma Pierce, Rockford, IL, USA Peqlab, Erlangen, Germany Novartis, Nürnberg, Germany Amersham Biosciences, Piscataway, USA Pierce Roth, Karlsruhe, Germany Bio-RAD, Hercules, USA Bio-RAD Gibco PJK GmbH, Kleinblittersdorf, Germany Tabelle 7 (fortgesetzt): Chemikalien

26 3 Material und Methoden Puffer und Lösungen Name Zusammensetzung PBS NaCl KCl Na 2 HPO 4 KH 2 PO 4 CaCl 2 MgCl 2 (6 H 2 O) Cell lysis buffer zur Proteinanalyse Tris-HCl ph 6.8 SDS Glycerol EDTA Triton X100 Na 3 VO 4 NaF PI-Cocktail PMSF SDS Running Buffer Trizma Base Glycine SDS TGS Transferpuffer 10xTGS Methanol dd Wasser SDS Sample Buffer Tris 6.8 SDS Glycerol Bromophenol blue β-mercaptoethanol mm 2.5 mm 0.8 mm 1.47 mm 0.9 mm 0.5 mm M 2 % 5 % 2 mm 0.1 % 1 mm 1.5 mm 1x 1 mm 25 mm 192 mm 0.1 % 100 ml 200 ml 700 ml 56 % 3 % 15 % % 25 % Tabelle 8: Puffer und Lösungen

27 3 Material und Methoden 23 Name Tris 6.8 Tris 8.8 PI cocktail (1,000 x) Zusammensetzung Trizma H 2 O EDTA ph 8.8, 0.5 M adjust ph to 6.8 with HCl H 2 O Trizma H 2 O EDTA ph 8.8, 0.5 M adjust ph to 8.8 with HCl H 2 O Pepstatin Leupeptin Chymostatin 12 g 84 ml 1.6 ml ad 200 ml g 250 ml 4 ml ad 500 ml 10 µg / µl 10 µg / µl 10 µg / µl Tabelle 8 (fortgesetzt): Puffer und Lösungen Enzyme Name Trypsin (vom Rinderpankreas) RNase A Firma Promega, Madison, Wisconsin/USA Tabelle 9: Enzyme

28 3 Material und Methoden Materialien und Instrumente Instrumente Zentrifugen Zellkultur Durchflusszytometrie Western Blot Andere Eppendorf 5415R centrifuge Heraeus Sepatech Megafuge 1.0R Hettich Rotixa 50 RS Sigma 3K 30 centrifuge Heraeus Hera Safe Tissue Culture Hood T25 flasks (TPP, Trasadingen, Switzerland) T75 flasks (TPP) 6-well plates (TPP) 12-well plates (TPP) Kottermann Waterbath Cell scraper (Greiner bio-one) Zelllifter (Fisher GmbH, Schwerte,Germany) FACScalibur flow cytometer (Becton Dickinson, USA) BioRad Mini Protean II Running Chamber BioRad Mini Protean II cell und cell 10 Glasplatten BioRad Mini Protean 3 System Glasplatten BioRad Model 1000/500 Power Supply Branson 2510 Sonicator Hoefer TE 62 Transfer Chamber Hoefer Transphor Power Lid TE 50X Nitrocellulose membrane (Amersham) Whatmann paper (Roth, Karlsruhe, Germany) FUJIFILM (Fujifilm Europe, Düsseldorf, Germany) Barnstead Nanopure Diamond H+P Varioklav Dampfsterilisator Scientific industries Vortex Genie 2 Tabelle 10: Material und Instrumente

29 3 Material und Methoden 25 Instrumente Pipetten und Pipetten P2 Gilson pipetman Pipettenspitzen P10 Eppendorf Research P20 Gilson pipetman P100 Gilson pipetman P200 Gilson pipetman P1000 Eppendorf Research Reguläre 10 µl Eppendorf ept.i.p.s./ Pipettenspitzen Sarstedt 200 µl Eppendorf ept.i.p.s µl Eppendorf ept.i.p.s. Filter 10 µl Sarstedt Biosphere / Pipettenspitzen Biozym Safeseal Tips premium 20 µl Biozym Safeseal Tips premium 100 µl Sarstedt Biosphere 200 µl Biozym Safeseal Tips premium 1000 µl Sarstedt Biosphere Tabelle 10 (fortgesetzt): Material und Instrumente 3.8 Statistische Analyse Die Unterschiede der MCF-7 Brustkrebszellen nach der Behandlung mit Chloroquin, RAD001 bzw. deren Kombination wurden mit dem Student T-Test untersucht, wobei eine Irrtumswahrscheinlichkeit von p<0,05 als statistisch signifikant betrachtet wurde. Die statistische Analyse wurde mit Hilfe der Microsoft Excel Software durchgeführt.

30 4 Ergebnisse 26 4 Ergebnisse 4.1 Zellwachstumshemmung durch Chloroquin und RAD001 in MCF-7 Brustkrebszellen Die MCF-7 Brustkrebszellen wurden über 24 h und 72 h mit Chloroquin (50 µm) und RAD001 (20 nm) behandelt und das Zellwachstum untersucht. (Abbildung 3). Dabei wurde jedes Experiment dreimal durchgeführt. Nach einer Behandlung mit RAD001, als auch mit Chloroquin, konnte eine Reduktion an vitalen MCF-7 Brustkrebszellen nachgewiesen werden. Dabei zeigte die Behandlung mit Chloroquin bereits nach 24h eine stärkere Reduktion der Zellen, als RAD001. Dieser Effekt war nach 72h noch deutlicher ausgeprägt. Besonders interessant ist, dass durch die Kombination aus Chloroquin und RAD001 eine nochmals verstärkte Senkung des MCF-7 Zellwachstums erreicht werden konnte. 120 Anteil vitaler Zellen in % unbehandelt RAD001 CQ CQ+RAD Stunden 72 Stunden Abbildung 3: Behandlung der MCF-7 Brustkrebszellen mit RAD001 (20 nm), CQ (Chloroquin) (50 µm) oder RAD001+CQ für 24 oder 72 h 4.2 Verstärkter G1-Zellzyklusarrest durch Chloroquin und RAD001 Um die zellzyklusbezogenen Ursachen, der wie oben dargestellten verstärkten Reduktion der MCF-7 Brustkrebszellen durch Chloroquin und RAD001 zu überprüfen, wurden FACS-Analysen durchgeführt. Wie Abbildung 4 zeigt, lag

31 4 Ergebnisse 27 der Anteil der Zellen, die nach 24 h iger Behandlung in der G1 Phase waren, in der Kontrollgruppe bei 50 %. In den Zellen die nur mit Chloroquin (50 µm) oder nur mit RAD001 (20 nm) behandelt wurden waren es jeweils 62 % bzw. 65% und bei den Zellen die mit einer Kombination aus Chloroquin und RAD001 behandelt wurden lag der Anteil bei 74%. In den MCF-7 Brustkrebszellen, die mit Chloroquin behandelt wurden, bestätigte sich ein verstärkter G1- Zellzyklusarrest im Gegensatz zu den unbehandelten Zellen (Abbildung 4). Ebenso bewirkte RAD001 in den MCF-7 Brustkrebszellen im Vergleich zu unbehandelten Zellen eine Verstärkung des G1-Zellzyklusarrestes. Es konnte durch die Kombination aus Chloroquin und RAD001, im Vergleich zur Therapie mit den Einzelsubstanzen, in den MCF-7 Brustkrebszellen eine Verstärkung des G1-Zellzyklusarrestes hervorgerufen werden. Zusammenfassend kann man sagen, dass Chloroquin und RAD001 den G1 Zellzyklusarrest in MCF-7 Brustkrebszellen nach 24h (und 72h, Daten werden nicht gezeigt) induzieren (sub G1 0 %) und dabei einen additiven Effekt in der Kombinationsbehandlung zeigen. unbehandelt CQ (50 µm) G1 50% G1 62%* S 18% S 10% G1 S G2 G2/M 20% G1 S G2 G2/M 18% RAD001 (20 nm) G1 65%* S 15% G2/M 14% RAD001+CQ G1 74%* S 8% G2/M 13% G1 S G2 G1 S G2 Abbildung 4: Verstärkter G1- Zellzyklusarrest durch RAD001 und Chloroquin in MCF- 7 Brustkrebszellen. FACS-Analysen mit MCF-7 Brustkrebszellen, welche mit RAD001 (20 nm) und Chloroquin (50 µm) behandelt wurden (24 Stunden) (* p<0.05 im Vergleich zu den unbehandelten Zellen).

32 4 Ergebnisse Inhibition der mtor-kinase und dessen downstream Zielprotein S6K1 durch RAD001 und Chloroquin in MCF-7 Brustkrebszellen Durch die Kombinationsbehandlung von Chloroquin und RAD001 war eine mtor-inhibition bereits nach acht Stunden nachweisbar. Auch in der Langzeitbehandlung nach 72 Stunden ist dieser Effekt weiterhin erkennbar. Interessant ist, dass die Kombinationstherapie eine stärkere Expressionshemmung hervorruft, als die alleinige Behandlung mit RAD001 (Abbildung 5). Die Effekte dieser Zellbehandlung waren auch beim direkten mtor- Zielprotein S6K1 zu beobachten, welches sich in seinen beiden Isoformen p70s6k1 und p85s6k1 darstellte [109, 107, 143]. Durch die Kombinationstherapie mit Chloroquin und RAD001 über acht Stunden konnte, sowohl bei den untersuchten Phosphorylierungsstellen an S6K1-Threonin 421/-Serin 424 und - Threonin 389, als auch beim Gesamtprotein der S6K1 Kinase, eine starke Aktivitätsreduzierung beobachtet werden, die sich sogar zum Teil in der Langzeittherapie über 72 Stunden noch steigerte (Abbildung 5). Zusammenfassend wurde ein mtor-inhibierender Effekt in den MCF-7 Brustkrebszellen durch Chloroquin, vor allem in Kombination mit RAD001, demonstriert. In den Western Blot-Analysen konnte gezeigt werden, dass die Phosphorylierung von mtor an Serin 2448 und die des mtor-zielgens S6K1 an Threonin 389 und Threonin 421/Serin 424 reduziert wurde.

33 4 Ergebnisse 29 8 Stunden 72 Stunden unbehandelt CQ RAD001 RAD001+CQ unbehandelt CQ RAD001 RAD001+CQ mtor-s2448-p 1.0 0,67 0,21 0,14 1,0 0,63 0,40 0,53 mtor 1,0 0,65 0,36 0,46 1,0 0,90 0,85 0,77 S6K1- Th421/S424-P 1,0 0, ,38 1,0 0,28 0, S6K1-Th389-P 1,0 1,05 0,45 0,10 1,0 0,13 0,08 0,07 S6K1 1,0 0,90 0,82 0,57 1,0 0,38 0,40 0,24 ß- Actin Abbildung 5: Immunoblot-Assay von MCF-7 Brustkrebszellen. Es wurden die Proteine mtor, S6K1, sowie deren Phosphorylierungsstellen mtor-serin 2448 und S6K1- Threonin 421/-Serin 424 und S6K1-Threonin 389 untersucht. Die Zellen wurden dabei 8 bzw. 72 Stunden mit CQ (Chloroquin), RAD001 und deren Kombination behandelt. 4.4 Reduktion der RAD001-induzierten AKT-Phosphorylierung und Aktivierung von p53 und p21 durch Chloroquin bei MCF-7 Brustkrebszellen Wie eingangs erwähnt, führt die Behandlung mit RAD001 zu einer Feedback- Hochregulierung von AKT [141, 104, 125]. Dies konnte in unseren Experimenten bestätigt werden. Wie in Abbildung 6 zu sehen, kam es nach der Behandlung der MCF-7 Brustkrebszellen mit RAD001 zu einer vermehrten Phosphorylierung von AKT an Serin 473. Weiterhin wurde versucht zu ermitteln, ob der RAD001 induzierte Anstieg der AKT-Phosphorylierungen verändert werden könnte [57]. Aus der Behandlung der MCF-7 Brustkrebszellen mit Chloroquin resultiert eine Reduktion des durch RAD001 induzierten Anstieges an AKT-Phosphorylierungen. Nach einer Behandlungszeit von acht Stunden mit Chloroquin konnte eine Reduktion des phosphorylierten AKT (Serin 473)

34 4 Ergebnisse 30 nachgewiesen werden, die sich auch in der Kombinationsbehandlung mit Chloroquin und RAD001 zeigte. Dies war nach einer Langzeitbehandlung über 72 Stunden ebenfalls deutlich ausgeprägt (Abbildung 6). In den Western-Blot-Analysen zeigte sich bei den MCF-7 Brustkrebszellen bereits nach acht Stunden unter Behandlung von Chloroquin eine deutliche Hochregulierung des Tumorsuppressorgens p53 an Serin 15, welche die zentrale Phosphorylierungsstelle des p53 darstellt. Die alleinige Behandlung mit RAD001 zeigte keine Steigerung der p53-phosphorylierung, wohl aber die Kombinationsbehandlung von Chloroquin und RAD001, die vor allem in der Langzeitbehandlung über 72 Stunden einen erhöhten Anstieg des phosphorylierten p53 erkennen ließ (Abbildung 6). 8 Stunden 72 Stunden unbehandelt CQ RAD001 RAD001 RAD001+ RAD001+ CQ CQ unbehandelt CQ RAD001 RAD001+ CQ AKT-S473-P 1.0 0,60 1,06 0,55 1,0 1,16 1,37 0,58 AKT 1,0 1,19 1,57 1,25 1,0 1,15 0,92 0,87 p53-s15-p 1,0 1,54 0, ,0 1,41 0,77 1,54 p53 1,0 1,09 0,98 1,89 1,0 1,20 0,87 1,30 p21 1,0 2,15 1,29 2,53 1,0 1,68 0,28 0,71 ß- Actin Abbildung 6: Durch die Behandlung von MCF-7 Brustkrebszellen mit CQ (Chloroquin), sowie dessen Kombination mit RAD001 nach 8 bzw. 72 Stunden, kam es zu einer Reduktion der durch RAD001 induzierten AKT-Phosphorylierung. Eine parallele Hochregulierung der Tumorsuppressorgene p53 und p21 konnte demonstriert werden.

35 4 Ergebnisse 31 Auch das dem p53 nachgeschaltete Zielgen p21 erfährt durch die Behandlung mit Chloroquin nach acht Stunden eine deutliche Hochregulierung. Dieser Effekt hält über 72 Stunden an. Während unter RAD001 Behandlung keine Steigerung nachzuweisen war, zeigte die Kombinationstherapie nach acht Stunden einen höheren Anstieg des p21, im Vergleich zur alleinigen Behandlung mit Chloroquin. In der Langzeitbehandlung über 72 Stunden war dieser Effekt jedoch nicht mehr erkennbar (Abbildung 6). 4.5 Kein Zellzyklusarrest durch Chloroquin und RAD001 bei p53 mutierten MDA-MB-231 Brustkrebszellen Die mesenchymale MDA-MB 231 Brustkrebszelllinie weißt ein mutiertes p53 auf. Abbildung 7 zeigt, dass Chloroquin und RAD001 in der MDA-MB-231 Brustkrebszelllinie keinen additiven Effekt in Bezug auf den G1 Zellzyklusarrest bewirken können, was auf eine mögliche p53-abhängigkeit hinweist. unbehandelt CQ (50 µm) G1 51% G1 50% S 19% S 23% G2/M 21% G2/M 23% G1 S G2 G1 S G2 RAD001 (20 nm) RAD001+CQ G1 53% S 21% G2/M 23% G1 57% S 21% G2/M 18% G1 S G2 G1 S G2 Abbildung 7: Kein signifikanter G1 Zellzyklusarrest konnte bei den p53 mutierten MDA-MB-231 Brustkrebszellen gezeigt werden. FACS-Analysen mit MDA-MB-231 Brustkrebszellen, welche mit RAD001 (20 nm) und Chloroquin (50 µm) behandelt wurden (24 Stunden).

36 5 Diskussion 32 5 Diskussion Im Fokus der Brustkrebsforschung und der Suche nach innovativen Therapiestrategien stehen seit einiger Zeit Quinoline, wie z.b. Chloroquin, sowie mtor-inhibitoren wie z.b. das RAD001. In dieser Arbeit wurde der bekannte mtor-inhibitor RAD001 mit Chloroquin kombiniert. In MCF-7 Brustkrebszellen führte die Kombinationsbehandlung mit Chloroquin und RAD001 zu einem reduzierten Zellwachstum und in den FACS-Analysen zeigte sich ein erhöhter G1-Zellzyklusarrest. In Western Blot Analysen konnte die Kombinationsbehandlung bei MCF-7 Brustkrebszellen zum einen eine Reduktion der RAD001-induzierten Phosphorylierung des Onkogens AKT an der Phosphorylierungsstelle Serin 473 und zum anderen eine verstärkte Phosphorylierung des Tumorsuppressors p53 am Serin 15 hervorrufen. Darüber hinaus zeigte sich eine reduzierte Phosphorylierung der mtor-kinase und seines Zielproteins der proliferationsfördernden Kinase S6K1. Interessanterweise zeigte sich das Zellwachstum der p53-mutierten MDA-MB- 231 Brustkrebszellen nach Behandlung unbeeinflusst, was auf eine mögliche p53-abhängigkeit hinweist. Der Phosphatidylinositol 3-Kinase (PI3K/AKT)-Signaltransduktionsweg ist für das Überleben der Zelle verantwortlich und wichtig für das normale Zellwachstum und die Zellteilung [27]. Zahlreiche Berichte haben dargestellt, dass die grundlegende Aktivierung des PI3K/AKT-Signaltransduktionsweges eng mit der Tumorentwicklung, dessen Aggressivität, dem erhöhten Auftreten von Metastasen und Resistenzen in der Krebstherapie korreliert [2, 6, 9, 12, 29, 97, 104, 128, 144]. Ein wichtiges Protein in diesem Signalweg ist die Protein Kinase B (AKT). Es wird bestätigt, dass durch die alleinige Behandlung der MCF-7 Brustkrebszellen mit RAD001 eine AKT-Phosphorylierung an Serin 473 stattfindet [141]. Sie ist wahrscheinlich eine der Hauptursachen für das Auftreten von Resistenzen in der Therapie mit RAD001 [104, 125]. Ebenso wird die Phosphorylierung von AKT an Serin 473 mit einer schlechten Prognose von Brustkrebs in Verbindung gebracht [104]. Interessant ist daher, dass durch die Behandlung mit Chloroquin die Phosphorylierung von AKT an Serin 473 deutlich reduziert werden konnte (vgl. Abbildung 6). Dieser Effekt spricht dafür,

37 5 Diskussion 33 dass Chloroquin einen Angriffspunkt auf dieses für die Krebstherapie wichtige Protein hat. Interessanterweise stellt sich in der Kombinationsbehandlung von Chloroquin und RAD001 eine signifikante Reduzierung der RAD001-induzierten Aktivierung von AKT dar. Basierend darauf könnte Chloroquin als sinnvoller Kombinationspartner für RAD001 fungieren, um das Auftreten von Therapieresistenzen in der Therapie mit RAD001 zu verhindern. Nicht nur dieser Effekt könnte von Nutzen sein. Es ist bekannt, dass Patienten, bei denen eine phosphoryliertes AKT nachgewiesen werden konnte, zusätzlich eine erhöhte Wahrscheinlichkeit haben einen Rückfall mit Fernmetastasen zu bekommen [104]. Auf dieser Basis könnte der Kombinationstherapie von Chloroquin und RAD001 nicht nur eine bedeutende Rolle in der Hemmung von AKT zukommen, sondern auch helfen, die Prognose von an Brustkrebs erkrankten Frauen deutlich zu verbessern. Vor allem da bisherige Studien zeigen, dass die Hemmung von AKT allein oder in Verbindung mit anderen therapeutischen Mitteln eine Zunahme der Apoptose ergibt und zur Strahlensensibilisierung, einem verringerten Tumorwachstum und zur Abnahme an Tumorresistenzen in der Chemotherapie führt [47, 7, 68, 73, 90, 145]. Neben AKT spielt auch der Tumorsuppressor p53 in der Zelle eine bedeutende Rolle. p53 nimmt eine zentrale Rolle in verschiedenen Signaltransduktionswegen ein, die für die Regulation des Zellenwachstums und der Apoptose wesentlich sind [139, 140]. In meinen Untersuchungen hatte die alleinige Behandlung mit RAD001 keinen steigernden Effekt auf die Aktivität von p53. Im Gegensatz dazu konnte unter der Behandlung mit Chloroquin eine Zunahme des phosphorylierten und somit aktivierten p53 dargestellt werden. Neu ist, dass auch in der Kombinationstherapie mit Chloroquin und RAD001 eine Aktivitätssteigerung von p53 erreicht werden konnte. Der dem p53 nachgeschaltete Zellzyklusinhibitor p21 [37] spielt eine wichtige Rolle bei der Aktivierung des p53-abhängigen G1 Zellzyklusarrestes [56, 98, 37, 36]. Auch hier konnte eine erhöhte Aktivität von p21 durch die Behandlung mit Chloroquin demonstriert werden, wobei dieser Effekt ebenfalls in der Kombinationstherapie mit RAD001 darstellbar war.

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